Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור התיקון שריטות מבחנה באמצעות הפיברוכדורים העיקריים עבור vivo העור הפצע הריפוי הטיפול בעכברים. שניהם מספר שיטות ברורות כדי להעריך בתוך מבחנה וריפוי פצעים vivo.
Abstract
ריפוי בפצע העור לקוי הוא דאגה משמעותית למטופלים הסובלים מסוכרת ולקשישים, ויש צורך בטיפול אפקטיבי. מתאים מחוץ לגוף ובגישות vivo חיוניים לזיהוי מולקולות היעד החדש לטיפול תרופתי כדי לשפר את תהליך הריפוי של הפצע בעור. זיהינו את β3 יחידת של ערוצי סידן מגודרת מתח (Cavβ3) כמולקולה היעד הפוטנציאלי להשפיע על ריפוי הפצע בשני assays עצמאית, כלומר, בשנת הגירה הפריה חוץ גופית ואת המודל הקאמרית vivo העור מתקפל. העכבר העיקרי פיברותקיעות (MEFs) מבודדים בחריפות מן פראי סוג (WT) ו קוβ3-עכברים לקוי (קוβ3 KO) או פיברותקיעות בודד בבידוד מן העכברים WT שטופלו עם sirna למטה-לווסת את הביטוי של הגן Cacnb3 , קידוד קוβ3, שימשו. שריטה הוחלה על מונאולייר תא שוטף וסגירת הפער החלה בעקבות התמונות המיקרוסקופית בנקודות הזמן המוגדרות עד להשלמת האוכלוסיה המלאה של הפער על ידי התאים הנודדים. תמונות אלה נותחו, ושיעור העברת התא נקבע עבור כל תנאי. In in בvivo, השתלנו חדר מתקפל העור על WT ו Cavβ3 KO, להחיל פצע עגול מוגדר של קוטר 2 מ"מ, כיסו את הפצע עם שמיכות זכוכית כדי להגן עליו מפני זיהומים והתייבשות, ופיקוח על סגירת הפצע מאקרוסקופי עם הזמן סגירת הפצע הייתה מהירה באופן משמעותי בעכברים Cacnb3-gene. מכיוון שהתוצאות של הvivo ומחוץ למבחנה מספר מתאם היטב, הטיפול במבחנה עשוי להיות שימושי עבור הקרנת תפוקה גבוהה לפני אימות הפגיעות מחוץ גופית על ידי במודל ריפוי vivo פצע. מה שאנחנו הראו כאן לסוג פראי ו-קוβ3-לקוי עכברים או תאים עשוי להיות גם ישים עבור מולקולות ספציפיות מלבד Cavβ3.
Introduction
ריפוי בעור הפצע מתחיל מיד לאחר פגיעת העור כדי לשחזר את שלמות העור כדי להגן על האורגניזם מפני זיהומים. תהליך הריפוי בפצע עובר ארבעה שלבים חופפים; קרישה, דלקת, מבנה רקמות חדש ושיפוץ רקמות1. העברת תאים היא קריטית במהלך שלבים אלה. תאים דלקתיים, תאים חיסוניים, keratinocytes, תאים אנדותל, ופיברופיצוצים מופעלים בנקודות זמן שונות לפלוש לאזור הפצע2. שיטות לחקור ריפוי הפצע בתוך מבחנה ובvivo הם עניין גדול לא רק להבין את המנגנונים הבסיסיים אלא גם כדי לבדוק תרופות חדשות לפתח אסטרטגיות חדשות במטרה שפר ולהאיץ ריפוי פצע העור.
כדי לנטר ולנתח העברת תאים, ניתן להשתמש ביכולות העברת הטיוטה. הוא מכונה לעתים קרובות שיטת הריפוי של הפצע מתורבת. שיטה זו מחייבת מתקן תרבית תאים3. זהו הליך פשוט, אין צורך של ציוד high-end ואת הטיפול ניתן לבצע ברוב מעבדות ביולוגיה התא. בצורה זו, שטח נטול תאים נוצר על-ידי הפרעה מכנית של מונאולייר תא מאגד, רצוי לתאים אפיתל או לתאי האנדותל. תאים בשולי השריטה יועברו כדי לאכלס מחדש את הפער שנוצר. הקוונפיקציה של האזור היורד ללא תא לאורך זמן דומה לקצב ההעברה ומציין את הזמן, אשר התאים צריכים לסגור את הפער. למטרה זו, החוקרים יכולים להשתמש בתאים מבודדים בחריפות מעכברים WT או עכברים חסר גן של ריבית4, או תאים מונצח זמין ממאגרי תאים אמינים. שיטת הגירוד מאפשרת ללמוד את ההשפעה של תרכובות פעילות פרמקולוגית או השפעה של cDNAs או siRNAs בהעברת תאים.
ב vivo, ריפוי הפצע הוא תהליך פיזיולוגי מורכב, המחייב סוגי תאים שונים כולל keratinocytes, תאים דלקתיים, פיברותקיעות, תאים חיסוניים ותאי האנדותל כדי לשחזר את היושרה הפיזית של העור מהר ככל האפשר1 . שיטות שונות ללמוד בריפוי vivo פצעים פותחו ובשימוש בעבר5,6,7,8. תא העור המתקפל שמתואר במאמר זה שימש בעבר לריפוי הפצע בחני9. הוא משמש כהכנה לחדר השינה שהשתנה לעכברים. המודל הקאמרי המתוקן של העור יש מספר יתרונות. 1) זה ממזער את התכווצות העור, אשר מונע התבוננות בתהליך הריפוי הפצע עלול להשפיע על תיקון הפצע בעכברים. 2) החדר הזה עושה שימוש בכיסוי הפצע בעזרת שמיכות זכוכית, הפחתת דלקות רקמות והתייבשות, דבר שעלול לעכב את תהליך ההחלמה. 3) זרימת הדם והvascularization יכולים להיות מנוטרים ישירות. 4) זה מאפשר יישום מקומי חוזרות של תרכובות פעילים פרמקוולוגית וריאגנטים כדי לטפל בפצע ולהאיץ את הריפוי9,10.
זיהינו את β3 יחידת של ערוצי סידן מגודרת מתח גבוה (Cavβ3) כמולקולה היעד הפוטנציאלי כדי להשפיע על ריפוי הפצע בעור באמצעות שני פרוטוקולים עצמאיים, כלומר, הגירה בלתי מתורבת ההגירה והוא במודל הקאמרית הvivo. עבור שיטת מחוץ גופית, השתמשנו בגידולים הראשוניים, תאים אלה מבטאים את Cacnb3 Gene קידוד Cavβ3 חלבון אבל חסר depolarization המושרה ca2 + זרם או תלוי מתח ca2 + זרמים. תיארנו פונקציה הרומן של Cavβ3 בפיברופיצוצים אלה: Cavβ3 נקשר ל-אינוזיטול 1, 4, 5-trisp, שנאת קולטן (IP3R) ואילוצים שחרור סידן מתוך רשתית רשתית פלזמית. מחיקת הגן Cacnb3 בעכברים מוביל רגישות מוגברת של IP3R עבור IP3, הגירה תא משופר ומוגברת תיקון פצע העור4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההליכים הניסיוניים אושרו והוצעו בהתאם לתקנות האתיקה ולוועדות הרווחה של בעלי החיים באוניברסיטת זארלנד.
1 תרבות התא הראשי ומעבר הסינא
הערה: בשיטה המתוארת, נעשה שימוש בפיברותקיעות ראשיים. תאים אלה לשחק תפקיד מכריע בריפוי פצע ושיפוץ רקמות11. בניסוי זה, Cacnb3 gene, קידוד Cavβ3 יחידת משנה של ערוצי סידן מגודרת מתח12 היה למטה מוסדר, ובכך מראה את תפקידה הגירה התא ב מבחנה ותיקון פצע העור ב vivo4.
- הכנת siRNA: לפני מחדש את Sirna, בקצרה צנטריפוגה את צינורות כדי להבטיח כי התוכן הוא בתחתית. מהווים מחדש את siRNAs ב 100 μL RNase-מאגר חינם (100 מילימטר אצטט אשלגן, 30 מ"מ HEPES, pH 7.5) שסופקו על ידי היצרן בריכוז של 20 μM. זהו פתרון מניות של siRNAs.
- לאחר פתרון מניות זה ב 10 μL לצינור (20 הריכוז μM) ולאחסן ב-20 ° צ' עד השימוש.
- באמצעות סמן קבוע ultrafine, לסמן צלחת 6-באר עם קו אופקי בתחתית של כל באר כדי להיות מסוגל תמיד לזהות את אותו אזור שריטה של עניין לעקוב אחר הסגר שלה.
הערה: 6-לוחיות התרבות שימשו בשיטה זו משום שהם גדולים מספיק, כדי לספק מספיק מקום וגמישות כדי להחיל שריטה עקבית, מחדש ואנכי באמצעות טיפ 200 μL מעבר לרוחב התא מונאולייר. אם מספר מוגבל של תאים זמינים, חלופה וכנראה שהדרך החסכונית ביותר תהיה להשתמש בלוחות התרבות 12 או 24. - הצלחת פיברופיצוצים ראשוניים, מבודדים מן פראי סוג ו-β3 לקויה עכברים4, בצלחת 6-באר בצפיפות של 5 x 105 תאים/גם בנוכחות של 2 mL בינונית של הנשר שונה של מדיום (dmem) שיושלם עם 10% סרום שור עוברי (fcs).
הערה: 5 x 105 תאים לכל טוב כבר הוקמה עבור 6-היטב לוחית התרבות ועל פיברוהפיצוצים העיקריים של העכבר. ייתכן שיהיה צורך בבדיקות אם נעשה שימוש בלוחות של 12 או 24 היטב של תרבות תא או סוגי תאים אחרים, שעשויים להיות שונים בגודלם. יש לטפל בתאים בסביבה סטרילית, כגון ארונות בטיחות ביולוגיים מחלקה II. - התווית את הצלחת 6-הטוב עם סוג התא, גנוטיפ, ואת התאריך.
- להעביר את הצלחת 6-היטב לתוך החממה תרבות התא ולשמור על תאים ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 24 h.
- למחרת, לקחת את הצלחת מתוך החממה, להשליך את המדיום התרבות התא מתוך הבאר, למחוק אותו ולהחליף אותו עם 2.25 mL מדיום התרבות טרי על ידי הוספת אותו בזהירות על הקיר של הבאר.
- על מנת להפעיל את הפיברונס עם siRNAs, השתמש בזיהום מבוסס השומנים המבוסס על מגיב כמומלץ על ידי היצרן.
- , עבור כל העברה. תייג שתי צינוריות מיקרוצנטריפוגה באחד הראשון, להוסיף 9 μL של הזיהום מגיב ולדלל אותו עם 150 μL סרום מופחת בינוני. בצינור השני, להוסיף 1.5 μL siRNA (Cacnb3 sirna-1, Cacnb3 sirna-2 או sirna מעורבל כפקד שלילי) ולדלל אותו עם 150 μl מופחת סרום בינוני.
- הוסף את siRNA מדולל לתוך הצינור המכיל מדולל הזיהום החוצה ומערבולת עבור 2 s. מודלת את התערובת עבור 5 דקות ב -21 ° c.
- תווית בארות עם או Cacnb3 sirna-1, Cacnb3 sirna-2 או sirna מעורבל. הוסף 250 μL של התערובת הכימית של siRNA-transfection לתאים.
- מניחים את הצלחת 6-היטב התרבות חזרה לתוך החממה ולשמור על התאים ב 37 ° צ' ו 5% CO2 עבור 72 h.
- כדי לבדוק את היעילות של Cacnb3 gene השתקה, לאסוף תאים מזוהמים ולבצע ניתוח כתמי חיסוני כמתואר בעבר4.
2. בתוך שיטת הריפוי של הפצע מחוץ למבחנה (הגירה שריטה)
- קח את צלחת תרבות התא מתוך החממה ובדוק את התאים מתחת למיקרוסקופ באמצעות המטרה 10x. התחל בסדר השריטה רק כאשר הם הגיעו ל100% שליטה.
הערה: לצורך הדיוק וההסבה, 100% מהווה גורם הכרחי להפעלת שיטת העברת הטיוטה. לכן, חשוב לזרוע את אותו מספר תאים לבארות התרבות, לבחון כל היטב את השטף ולהחיל את השריטה באותה נקודת זמן (יום 0 שליטה). מחכה זמן רב יותר לאחר התאים להגיע 100% השטף יכול לעורר תגובות שונות. - לאחר שהתא מגיע 100% השטף, לחלק את המדיום התרבותי מתוך הבאר ולהשליך אותו.
- השתמש בעצת פיפטה (200 μL) כדי ליצור באופן ידני שריטה אנכית לקו האופקי המסומן בתחתית הבאר, על-פני המונאולייר של התא החרוט באמצע הבאר.
- לשטוף כל טוב פעמיים עם 2 מ ל פוספט באגירה מלוחים (PBS) (137 מ"מ הנאל, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4, 8.1 mm Na2hpo4, pH 7.4) כדי להסיר את הגורמים שפורסמו מתאים פגומים, תאים רופפים, ופסולת מהאזור שרוט. הוסיפו 2 מ ל PBS בזהירות מול הקיר של הבאר כדי למנוע ניתוק תאים מהתרבות התאים היטב.
- הוסף 2 מ ל של תרבות התא בינונית המכילה 10% סרום או 1% סרום בזהירות על כל באר.
הערה: מומלץ לבצע את שיטת הגירוד מתחת ל-10% סרום ומתחת ל-1% סרום כדי לוודא שהאפקט הנצפה נגרם על-ידי הפצת התאים והגירה או על-ידי העברת תאים בלבד. - להעביר את הצלחת לשלב המיקרוסקופ וללכוד תמונות שדה בהיר של אזור ללא תא (שני אזורים לכל טוב) מיד לאחר גירוד (t = 0h) בהגדלה 10x באמצעות מיקרוסקופ אור. כדי לצלם תמיד את אותו אזור של השריטה, השתמש בקו האופקי, שהוכן בשלב (1.3), וצלם תמונה אחת מעל הקו הזה ותמונה אחת מתחת לקו זה. שמירת תמונות כ-TIFF או JPEG.
- מכיוון ששלב המיקרוסקופ אינו מתחזק את מצב צמיחת התאים, הזז את הצלחת בחזרה לחממה של תרבות התא ושמור את התאים ב-37 ° c ו-5% CO2.
- לאחר 6, 10 ו 30 h, להעביר את הצלחת לשלב המיקרוסקופ שוב ללכוד את התמונות באותו אופן כפי שמתואר בשלב 2.6.
הערה: נקודות הזמן הללו הוקמו עבור ההליך המתואר ועבור הפיברופיצוצים העיקריים. במהלך ניסוי הפיילוט הראשון, בחנו יותר נקודות זמן כדי לראות כיצד הפיברותקיעות מהירה מאכלס את הפער. למרות ש-0, 6, 10 ו-30 h הם נקודות התחלה סבירות, החוקרים צריכים למטב ולבסס את נקודות הזמן המתאימות עבור כל יישום ועבור כל סוג תא. החלופה המדויקת יותר, אם היא זמינה, תהיה שימוש במיקרוסקופיה בזמן הקפיצה. - שימוש ב-ImageJ13, מכמת את האזור ההתחלתי ללא תא (100%) והשטח הנותר לאחר 6, 10 ו -30 שעות (איור 1). האחוז של אזור הטיוטה שאוכלס מחדש על-ידי תאים מנודדים מחושב ביחס לאזור הטיוטה ההתחלתי.
3. ניתוח אזור השריטה
- פתח את תוכנת ImageJ13.
- העלה את התמונה הראשונה כ-JPEG (לדוגמה, תמונות RGB של 24 סיביות 1360x1024) על-ידי שחרור התמונה לתוך שורת התפריטים ImageJ.
- בחירת לחצן בחירות ביד חופשית וסימון האזור ללא תא
- לחץ על לנתח ובחר מדידה. חלון עם התוצאות יופיע ויכיל את ערך האזור.
- העבר ערך זה לגיליון אלקטרוני של ניתוח.
- חזור על שלבים 3.2-3.5 עבור כל תמונה מנקודת זמן 0 h ולאחר מכן התחל שוב עבור נקודות הזמן הבאות 6, 10 ו-30 h.
- חשב את אחוז האזור הזמני שאוכלס מחדש על-ידי העברת תאים לאחר 6, 10 ו-30 שעות עבור כל שריטה באמצעות המשוואה הבאה:
a = אזור פנוי תא של הטיוטה הראשונית, b = שטח פנוי תא לאחר 6 שעות - חשב את הממוצע ואת השגיאה הסטנדרטית של הממוצע (S.E.M.) עבור אחוז השטח הזמני שאוכלס מחדש על-ידי העברת תאים לאחר 6 שעות. הצג נתונים כתרשים עמודות או כהתוויה של פיזור.
4. בטיפול בפצע הvivo בעור
הערה: C57BL/6 גברים פראי סוג (8-12 שבועות בן עם 22-26 g משקל הגוף) ו-Cavβ3 לקויה עכברים כפקד משמשים למחקר זה.
- יום אחד לפני תחילת הניסוי, להפעיל את כל המכשירים כירורגי, ברגים, אגוזים ומסגרות טיטניום לשמש הכנה קאמרית העור.
הערה: מסגרת הטיטניום מורכבת משני חצאים משלימים סימטריים ויש לה חלון תצפית מעגלי שבו הפצע יוחל ואחריו מיקרוסקופ (ראה איור 2א). - להפחית מסוג פראי או β3 לקוי של העכבר (22-26 גרם משקל הגוף) על ידי הזרקת הצפק (כיתה) של 0.1 mL מלוחים/10 גרם משקל הגוף המכיל תערובת של קטמין (75 מ"ג/ק"ג משקל הגוף) ו xylazine (25 מ"ג/ק"ג משקל הגוף). בדוק את עומק ההרדמה על ידי חוסר תגובה לצביטה בבוהן.
הערה: הזרקה זו מעניקה סביב 30 דקות הרדמה כירורגית ועומק ההרדמה חייב להיות נשלט באמצעות הליך כירורגי, על ידי בדיקת הרפלקסים של העכבר. - כדי למנוע יובש או נזק של העיניים, להחיל משחה אופטלמולוגית על שתי העיניים ולחזור על היישום במידת הצורך.
- בזהירות לגלח את העכבר dorsum, באמצעות מכונת גילוח חשמלי ואחריו יישום של קרם להסרת שיער לאזור מגולח כדי להסיר את השיער הנותרים. לדאוג לא לפגוע בעור העכבר. השאירו את הקרם להסרת שיער בסביבות 10 דקות כדי להסיר לחלוטין את כל השיער.
- הכן את תא טיטניום על ידי לקיחת חלק אחד של מסגרת תא טיטניום סימטרי לתקן את הברגים חיבור עם אגוזים בצד אחד. אגוזים אלה ישמש מרווח כדי לשמור על 400-500 יקרומטר בין שני חלקים סימטריים של החדר כדי למנוע דחיסה של כלי הדם בעור.
- להסיר את הקרם מאחורי העכבר ולנקות את האזור נטול שיער עם חם (35-37 ° c) ברז מים.
- ודא כי המקום לבצע ניתוח הוא נקי, חם (37 ° c) ומחולל לחות.
- לחטא את אזור נטול שיער של העכבר עם מחטא העור. לקחת קיפול של העור האחורי של העכבר מול מקור אור ולמקם את הקו האמצעי של השכבה הכפולה של העור שבו תא טיטניום יהיה מושתל. לאחר מכן, לתקן את העור המעטפת עם הגולגולת תפר פוליפרופילן ולהחדיר ולהדק את הצד השני של תפר על מתלה מתכת כדי להרים את העור מקופל העכבר. כוונן את גובה ארון התקשורת כדי לאפשר לעכבר לשבת בנוחות.
- שתל תא טיטניום לתוך קיפול של העור האחורי של העכבר בדרך כריך את שכבת העור המקופל מקופל בין שני החצאים סימטרי של מסגרת טיטניום. הצמד את המחצית הראשונה של מסגרת טיטניום על ידי תפרים פוליפרופילן על הקצה העליון שלה לחלק האחורי של קיפול העור גב.
הערה: על מסגרת טיטניום, יש 8 חורים על הקצה העליון (איור 2א) ואת העור המקופל צריך להיות קבוע היטב על ידי התפרים פוליפרופילן על כל אחד משמונת החורים. - לפני שעוברים לשלב הבא, לבדוק את הרפלקסים של העכבר כדי לוודא את עומק ההרדמה נשמרת.
- בבסיס העור, העבירו את שני הברגים המחוברים, מחוברים למחצית הראשונה של תא הטיטניום, כדי לחדור את העור מאחור אל הצד הקדמי. הפוך חתכים קטנים על העור (באמצעות מספריים עדינים) כדי לסייע לחדירה חלקה של הברגים המחוברים.
- לנתק את העכבר מארון התקשורת ולמקם אותו על מיקום לרוחב. שים את החצי המשלים השני של תא טיטניום על גבי 3 ברגים חיבור (ראה איור 2א) ולהחיל לחץ קל עם האצבעות כדי לעבור ברגים אלה דרך המחצית השנייה של מסגרת טיטניום. אז, לתקן את שני החלקים סימטרי עם אגוזים נירוסטה.
- שים לב לאטימות הברגים בשלב זה, כיוון שהוא עלול להתנתק, אם הוא רופף מדי. לעומת זאת, אם זה הדוק מדי, זה יהיה לסחוט את העור, להפחית את זרימת הדם והוא יכול להוביל ליקוי ונמק ברקמות.
הערה: אגוזים שהוכנו בשלב 4.5 לשמש מרווח כדי לשמור על מרחק של 400-500 יקרומטר בין שני החצאים סימטרי של תא טיטניום. יש לחזק את האגוזים עד להרגשת התנגדות קלה. - חותכים את החלק הנותר של הברגים באמצעות צבת.
הערה: יש צורך בשלב זה כדי להשתמש במשקפיים בטיחות המעבדה להגנה על העין במקרה שהבורג מגיע לכיוון הלא נכון. - מארק את אזור הפצע על ידי אגרוף ביופסיה סטנדרטית (2 מ"מ בקוטר), במרכז העור בתוך חלון התצפית (ראה איור 2א) של תא המעטפת, כדי להבטיח את גודל הפצע לאחר הפציעה.
- באמצעות מלקחיים ומספריים עדינים, ליצור פצע עגול בתוך האזור המסומן על ידי הסרת העור המלא עם האפידרמיס ו dermis. אזור הפצע הסופי יהיה סביב 3.5-4.5 מ"מ2, ראה איור 2ב. לנקות את הפצע עם 0.5 mL מלוחים סטרילי (0.9% הנאגל, 37 ° c).
- לכסות את הפצע עם שמיכות זכוכית ולתקן את זה שמיכות זכוכית עם טבעת הצמד באמצעות הצמד הטבעת בחדר טיטניום.
- מיד לאחר סיום ההליך כירורגי, למקם את העכבר על שלב הדמיה של stereomicroscope מצויד במצלמה ולקחת תמונות (יום 0) תחת תאורה. השתמש בהגדלה של 40X ושמור את התמונות לניתוח לא מקוון עתידי.
הערה: על החוקר לבחון את התמונות מיד לאחר הלכידה כדי להבטיח שהאיכות מספיקה לניתוחים מחוץ לתחום העתיד. הכנת החדר והביצועים של פצע העור לוקח בערך 30 דקות. - לשמור על העכבר במקום חם במהלך ההתאוששות מהרדמה לפחות 2 h. לאחר מכן, העבר עכברים בכלובים בודדים חזרה למתקן החי (12 h מחזור אור/כהה) וודא כי עכברים יש גישה למזון ולמים.
- שלושה ימים לאחר פציעתו מקום העכבר בתוך הרסן העכבר ולתקן את הרסן על גבי שלב הדמיה.
- מניחים את הבמה תחת מstereomicroscope מצויד במצלמה. לצלם תמונות תחת תאורה עם הגדלה 40x, להקליט את כל התמונות ולשמור אותם לניתוח בעתיד מחוץ לתחום
- חזור על שלבים 4.20 ו 4.21 שוב ביום 6, 10 ו יום 14 לאחר פציעתו.
- השתמש בתמונות הפצע, לניתוח לא מקוון ב-ImageJ13. אזור הפציעה ביום 0 נחשב 100% וסגירת הפצע לאורך זמן מותווה יחסית לאזור הפצע הראשוני. תוצאות הנציג מוצגות באיור 2ג, ד.
- חישוב האחוז (%) של אזור הפציעה בכל פעם באמצעות המשוואה הבאה:
x: נקודת זמן (יום 0, 3, 10 או 14),: אזור הפצעביום 0, b: אזור הפצע בנקודת זמן x
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שיטת השריטה בוצעה על מונאולייר של תאים מסוג פראי ובעלי מβ3 לקוי (איור 1ג). לאחר ביצוע "שריטה" באמצעות טיפ 200 μL הצינורות, תאים משני הגנוטיפים להגר לאזור הטיוטה ולסגור את הפער. תמונות צולמו לאחר 6, 10 ו 30 h (איור 1א). העברת תאים כמותית כאחוז (%) של אזור שריטה מאוכלס מחדש על-ידי העברת תאים 6 שעות לאחר ביצוע השריטה. העברת MEFs Cavβ3-לקוי סגרה את אזור האחסון משמעותית מוקדם יותר מאשר MEFs מעכברים מסוג פראי (איור 1א, ב). כדי שלא לכלול השפעה של תפוצת תאים, הערך של העברת הטיוטה בוצע בנוכחות של 10% או 1% FCS. ב-10% FCS קיימים שני התהליכים, הפצת התאים והגירה, ואילו בשנת 1% הפצת תא FCS ממוזערת. פיברופיצוצים ב 10% (איור 1b, שמאל) או 1% fcs (איור 1b, ימין) הראה דפוס דומה הגירה, לפסול את האפשרות של תרומת תאים התפשטות Cavβ3 שנצפו פנוטיפים. Cavβ3-MEFs לקוי סגר את הפער באופן משמעותי מוקדם יותר MEFs סוג פראי תחת שני התנאים. כדי לאשר את ההשפעה התלוית Cavβ3 נצפתה בפיברומוטים β3-, העור הפראי היה מנוכר עם siRNA למטה-לווסת את החלבון Cavβ3 (איור 1e). כפקד על התקנה למטה, החיסונית בוצעו כדי לאשר את היעילות של הטיפול siRNA. בשימוש בשני סינאס Cacnb3 ספציפיים (siRNA1 ו-siRNA2), ו sirnas מעורבל (כפקד) שימשו. פיברובטים שטופלו באמצעות siRNAs Cacnb3מתנהגים כאילו β3-מחסור בפיברוטים (איור 1d), כלומר, הגירה גדלה בהיעדר חלבון Cavβ3 (איור 1e).
בשנת vivo, החדר המתקפל האחורי היה מושתל (איור 2א, ב) ופצע עגול מוגדר של קוטר 2 מ"מ נוצר על החזרה מגולח (איור 2ב) של העכברים סוג פראי ולקוי Cavβ3 (8 בעלי חיים לכל גנוטיפ, 8-12 שבועות בן 22-26 גרם משקל). הפצע בוצע על ידי הסרת העור המלא עם האפידרמיס והדראמיס. כדי להשוות את הריפוי בפצע העור בין הגנוטיפים, אזור הפציעה בחדר קיפול העור צולם ישירות לאחר פציעתו (יום 0) ולאחר מכן התמונות נלקחו 3, 6, 10, ו 14 ימים לאחר פציעות (איור 2ג). גודל הפצעים נמדדו בתמונות דיגיטליות אלה ואזור הפציעה ביום נתון התבטא כאחוז (%) של אזור הפצע הראשוני (איור 2ד). סגירת הפצע הוגדלה בעכברים β3 לעומת שולטת סוג פראי. בניגוד לסוג פראי, הפצע בעכברים β3-לקויה היה סגור כמעט לחלוטין כבר לאחר 10 ימים. ביום 14 לאחר פציעתו, הפצעים נסגרו לחלוטין בשני הגנוטיפים (איור 2ג, ד).
איור 1 : בשנת הגירה מחוץ למבחנה. (א) דמויות מייצגות של תרבויות מסוג פראי (WT, שמאל) ו Cavβ3 KO (β3 ko, ימין) העכבר הראשי מעובריים מתחלקים (mefs) מיד, 6, 10 ו 30 h לאחר ביצוע שריטה. התמונות הומרו לקנה מידה אפור של 8 סיביות, והניגודיות, כמו גם בהירות, הותאמו להמחיש באופן מקסימאלי את שטח התא הפנוי. ניתוח השטח הפנוי של התא (% מאזור שריטה שאוכלס מחדש על-ידי תאים נודדים) בוצע בתמונות RGB המקוריות של 24 סיביות. (ב) תרשימי עמודות המציגות אחוזים (%) של אזור שריטה מאוכלס מחדש על ידי העברת תאים לאחר 6 שעות או בנוכחות של גבוה (10%, שמאל) או נמוך (1%, ימין) סרום העוברי (FCS) בטבע פראי (שחור) ו Cavβ3 KO (אדום) ניסויים (c) חיסוני (ג) המוח מסוג פראי (50 μg לנתיב) ופיברותקיעות (MEFs, 100 μg לנתיב) באמצעות נוגדן מסוים Cavβ3. חלבון β3 (55 kDa) נמצא במוח מסוג פראי (משמש כפקד), ופיברותקיעות, אבל הוא נעדר תמציות חלבונים של Cavβ3-לקוי המוח והפיברוטים המוכנים מעכברים לקוי Cavβ3. (ד) סיכום אחוז השטח הזמני שאוכלס מחדש על-ידי העברת תאים לאחר 6 שעות בתאי סוג פראי שטופלו ב-sirna מעורבל (בקרה, שחור) או שני Cacnb3 סינאס עצמאיים (siRNA1 ו-siRNA2, בארים פתוחים אדומים). (ה) החיסוני המתאים מתוך הניסוי ב (ד). נתונים מוצגים כממוצע ± SEM, ערכי p חושבו באמצעות מבחן t של סטודנט דו-זנבי שאינו משויך. פאנלים a ו- b השתנו מ [בלקצ'מי ואח ', 2018]4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : בvivo הפצע בעור הריפוי בעכברים. (א) טיטניום מסגרת הפנים מבט מראה חצי אחד של תא טיטניום השקפה החזית מראה את תא טיטניום התאספו עם שני חצאים סימטריים מחוברת עם ברגים ואגוזים. (ב) עכבר לאחר גילוח העור החוזר והרכבה הקאמרית מקפלים את החדר מורכב משתי מסגרות טיטניום סימטרי (המשקל של מסגרת טיטניום הוא סביב 2 גרם) והחלת פצע מעגלי (2 מ"מ קוטר). (ג) תמונות של הפצע מיד לאחר פציעתו (יום 0) ו-3, 6, 10 ו -14 ימים לאחר פציעתו. התהליך המתמשך של סגירת הפצע, עם האפיתל מלאה, מוצג לאורך 14 ימים פראי-סוג (WT, למעלה) ו Cavβ3 KO (β3 KO, למטה) עכברים. (ד) בנקודות הזמן המצוין, אזור הפצע נקבע באמצעות תוכנית ניתוח תמונה בסיוע מחשב מותווים כאחוז של אזור הפצע מיד לאחר הפציעה ביום 0 (ממוצע ± SEM של n = 8, β3 KO עכברים ואת סוג פראי המתאים עכברים שליטה). ערכי P חושבו באמצעות מבחן מרובה של ANOVA ו-Bonferroni השוואות מרובות. פאנלים c ו -d שונו מ [בלקצ'מי ואח ', 2018]4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בכתב יד זה, אנו מתארים בתוך מבחנה ובvivo הריפוי הפצע ולתאם את התוצאות שהתקבלו. עבור שיטת מחוץ גופית, השתמשנו בעכבר הראשי פיברופיצוצים4,14,15 אשר לשחק תפקיד חשוב בריפוי פצע ושיפוץ רקמה11. סוגים אחרים של תאים החסיד גדל כמו monolayers (למשל, תאים אפיתל, תאים אנדותל, keratinocytes) ניתן להשתמש גם. ציפוי באותו מספר של תאים קיימא ובריא להחיל את השריטה באותה מידה של השטף הוא בעל חשיבות עליונה על מנת להשיג תוצאות מדויקות ומיושמעות. מומלץ מאוד לבצע משכפל ביולוגי וטכני. בשיטה הנוכחית, השתמשו בלוחות בנות 6-ובכן, אך ניתן גם להשתמש בלוחות של 12 או 24 צלחות במיוחד כאשר התאים זמינים רק במספרים מוגבלים. במקרה של טיפול siRNA, ניתוח כתמי חיסוני לאחר כל קבוצה של ניסויים הוא הכרחי כדי לוודא כי חלבון היעד הוא ביעילות למטה מוסדר. יש לבדוק ולבחור את חלון הזמן הניתן לזיהוי העברה ולבחירה עבור כל סוג תא לפני התחלת הבדיקה בשיטת ההעברה. במקרה של פיברומותקיעות ואת הגן Cacnb3 , זה לקח 3 כדי 4 ימים כדי להגיע לרמה הרצויה של תקנה למטה. לעומת זאת, שיטת ההעברה של הטיוטה זקוקה לשעות קצרות יותר (6 עד 24 שעות). כדי להימנע משינויים גבוהים בגודל הטיוטה, חובה על אותו חוקר ליישם את השריטה עבור כל ערכה של ניסויים, שלחץ שווה מנוהל על-ידי קצה הפיפטה וכדי לשמור על הפצע ככל שניתן אנכית לקו המסומן ב תחתית הצלחת. על פני מונאולייר התא היישום של שריטה מכנית על פני מונאולייר התא מוביל לשחרור של גורמים סלולריים שונים (למשל, ATP) מתאים פגומים לחלל מתוך החילוץ. גורמים אלה יגרמו לאיתות הפררין כולל Ca2 +-איתות בתאים הסמוכים, אשר בתורו ישפיע על תגובות הסלולר16. כדי למנוע אפקטים אלה, מוסיף התרבות יכול לשמש עבור תאים ציפוי ולאחר ההסרה של אלה מוסיף מרווח תא ללא נזק נוצר מבלי לפגוע בתאים השכנים17. עבור הקרנת תפוקה גבוהה, החוקרים עשויים לשקול שימוש במכשירים הזמינים בשוק כדי ליצור שריטות שניתן לראות ועקביות ב-96 לוחיות הרישוי. כדי לעקוב אחר קינטיקה של העברת תאים ברציפות לאורך זמן, משתמשים יכולים גם לשקול שימוש במערכות מסחריות high-end עבור לכידת תמונה אוטומטית. עם זאת, מערכות אוטומטיות ליישום טיוטה ולכידת תמונה אינן זמינות תמיד עקב עלויות גבוהות. פתרון נגיש יותר וחסכוני להדמיה בזמן הדמיה יהיה למשל באמצעות המערכת (ATLIS: הדמיה זמן במחיר סביר מערכת דגירה) תיאר על ידי הרננדז ורה ועמיתים18.
בהעדר מעכבי הפצת תאים, האוכלוסיה החוזרת של הפער בתוך שיטת העברת הטיוטה היא שילוב של העברת תאים והפצת תאים. כדי לנטר העברת תאים בלבד, ניתן לדכא את תפוצת התאים לדוגמה על-ידי הטיפול ב-אקטינומיצין C19 אומיטומיצין C. ריכוזים נאותים של תרכובות אלה חייב להיות נחוש ונבדק בקפידה כדי למנוע את ההשפעות הרעילות של תרכובות אלה, אשר עשוי להשפיע על הכדאיות של התאים ויכולתם להגר. כפי שמתואר במאמר הנוכחי, הרעב סרום או הפחתת ריכוז הנסיוב במדיום התרבות היא דרך נוספת להפחית את ההשפעות של התפשטות התא. הרעבה בסרום משמשת מספר מבוסס תאים אחרים. היא יכולה לגרום למספר גבוה של תגובות סלולריות, שעלולות להפריע לתוצאות ולפרשנויות המתקבלות21. הרעב בסרום חייב להיות מיושם בקפידה והשפעתו על הכדאיות של התא יש להעריך לפני תחילת הניסוי. במאמר הנוכחי, הגירה של שריראות ראשוניים בנוכחות של 10% או 1% סרום מוצג (ראה איור 1ב). קצב ההעברה, כצפוי, איטי יותר בריכוזים נמוכים של סרום. עם זאת, β3-לקוי העברת התאים מהר יותר מאשר בתאי סוג פראי בשני התנאים; ריכוז בסרום נמוך וגבוה.
הפצע הריפוי בעור בעזרת החדר הוא הליך פשוט יחסית לחקור את הסגר פצע העור לאורך זמן בvivo. ההשתלה של תא טיטניום העור מתקפל תוארה בפעם הראשונה בחולדות22. Sorg ואח ' השתמשו בטכניקה זו ב SKH1-hr עכברים שיער לעקוב אחר ריפוי הפצע היווצרות של כלי דם חדשים9. המודל הקאמרי בעור העור המתואר במאמר זה יש יתרונות רבים על הריפוי הקלאסי הפצע שבוצעה על הסקין הגבי, על האוזן23 או הגפיים האחוריות7 של עכברים. כיסוי באזור הפצע עם שמיכות זכוכית מונע זיהומים וטראומה ומגביל התייבשות של הפצע. חדר התצפית מכוסה עם שמיכות זכוכית ניתן לפתוח בכל עת במהלך תהליך הריפוי, המאפשר יישום אקטואלי של תרכובות פעילות פרמקוולוגית שונים (g., siRNA עבור Cavβ3 כמו פתרונות או משחות) ואת החדר יכול להיות סגורים שוב העור מורנה פצעים תהליך הריפוי מורכב הן התכווצות האפיתל24. באמצעות תא העור מתקפל למטה בעכברים ממזער את ההתכווצות ונותן את ההזדמנות ללמוד בעיקר את תהליך האפיתל. הוא מספק גם חלון ברור כדי להתבונן ולנטר את תהליך סגירת הפצע. אחד חיסרון של תא טיטניום הוא כי העכבר צריך לשאת את התא טיטניום, אשר יש משקל סביב 2 גרם (7.7% של המשקל של העכבר 26 g), עבור 14 ימים. זה עלול לגרום קצת אי נוחות עבור העכבר, למרות שנראה כי עכברים לסבול היטב זה חדר והם נוחים והוא יכול בקלות להגיע למזון ולמים. הפצע העור מודל ריפוי הציג במאמר זה יכול ללמוד רק פצע אחד לכל עכבר. שיטות אחרות שפורסמו25, 26 מציע החלת שני פצעים לכל עכבר אשר תפחית את מספר בעלי החיים הדרושים למחקר. זה חשוב מאוד ליצור פצע מעגלי בגודל דומה עבור כל העכברים כדי לקבל מידע אובייקטיבי, כמו גם תוצאות אמינות ולאחר הנתונים. כדי לקחת תמונות של הפצעים לאורך זמן, העכברים תוקנו על הרסן של העכבר, הניח על הבמה, וחדר העור הכפולפי ממוקם תחת stereomicroscope. השימוש הרסן מסייע בהימנעות מהרדמה ומזעור הלחץ עבור העכברים. עכברים יכולים להיות הוקרב ורקמות מהאזור הפצוע יכול להיות הצביע ונאסף בשלבים שונים של תהליך הריפוי (או לאחר ריפוי מלא או בנקודות זמן מוקדם יותר) עבור ניתוח היסטולוגית, האוסף RNA או חלבון ביוכימיה.
לסיכום, הצגנו שתי טכניקות, a בתוך שריטה שריטות מבחנה באמצעות הפיברוכדורים העיקריים ובתוך vivo העור הפצע הריפוי הטיפול בעכברים. בשני הצדדים, ריפוי הפצע/הפער הסגר גדל בהעדר Cavβ3 יחידת של ערוצי סידן מגודרת מתח. כמו עם פראי ועכברים Cavβ3 לקויה או תאים, שניהם בחני עשוי להתאים בהעדר או נוכחות של מולקולות ספציפיות אחרות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
אנו מודים לד ר פטרה וייסגרבר ויחידת הטרנסגנים של מתקן בעל חיים SPF (פרויקט P2 של SFB 894) של הפקולטה לרפואה ומתקן בעלי חיים במכון לכירורגיה קלינית וניסויית בפקולטה לרפואה של אוניברסיטת זארלנד, באד ומבורג. אנחנו מודים לד ר אנדראס בק. על קריאה קריטית בכתב היד מחקר זה מומן על ידי הגרמני הפורשיגומיייסמייססביםבבריזאג (DFG) Sonderforschsברםץ (SFB) 894, פרויקט A3 כדי א יהושע ו V.F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9 % NaCl | |||
| 1 ml syringes | BD Plastipak | 303172 | |
| 6 well plate | Corning | 3516 | |
| Biopsy punch | Kai Industries | 48201 | 2 mm |
| Cacnb3 Mouse siRNA Oligo Duplex (Locus ID 12297) | Origene | SR415626 | |
| Depilation cream | any depilation cream | ||
| Dexpanthenol 5% (BEPANTHEN) | Bayer | 3400935940179.00 | (BEPANTHEN) |
| Dihydroxylidinothiazine hydrochloride (Xylazine) | Bayer Health Care | Rompun 2% | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco by life technologies | 41966-029 | |
| Fetal bovine serum | Gibco by life technologies | 10270-106 | |
| Hexagon full nut | |||
| Ketamine hydrochloride | Zoetis | KETASET | |
| Light microscope | Keyence, Osaka, Japan | BZ-8000 | Similar microscopes might be used |
| Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 13778075 | |
| Micro-forceps | |||
| Micro-Scissors | |||
| Mouse restrainer | Home-made | ||
| Normal scissors | |||
| Objective | Nikon | plan apo 10x/0.45 | |
| Opti-MEM | Gibco by life technologies | 51985-026 | |
| Polypropylene sutures | |||
| Screwdriver | |||
| Skin disinfectant (octeniderm) | Schülke & Mayr GmbH | 118212 | |
| Slotted cheese head screw | |||
| Snap ring | |||
| Snap ring plier | |||
| Surgical microscope with camera | Leica | Leica M651 | |
| Titanium frames for the skinfold chamber | IROLA | 160001 | Halteblech M |
| Wire piler |
References
- Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T.
- Martin, P. Wound healing--aiming for perfect skin regeneration. Science. 276, 75-81 (1997).
- Gabbiani, G., Gabbiani, F., Heimark, R. L., Schwartz, S. M. Organization of actin cytoskeleton during early endothelial regeneration in vitro. Journal of Cell Science. 66, 39-50 (1984).
- Belkacemi, A., et al. IP3 Receptor-Dependent Cytoplasmic Ca(2+) Signals Are Tightly Controlled by Cavbeta3. Cell Reports. 22, 1339-1349 (2018).
- Breuing, K., Eriksson, E., Liu, P., Miller, D. R. Healing of partial thickness porcine skin wounds in a liquid environment. Journal of Surgical Research. 52, 50-58 (1992).
- Colwell, A. S., Krummel, T. M., Kong, W., Longaker, M. T., Lorenz, H. P. Skin wounds in the MRL/MPJ mouse heal with scar. Wound Repair and Regeneration. 14, 81-90 (2006).
- Vagesjo, E., et al. Accelerated wound healing in mice by on-site production and delivery of CXCL12 by transformed lactic acid bacteria. Proceedings National Academy of Science. 115, 1895-1900 (2018).
- Eming, S. A., et al. Accelerated wound closure in mice deficient for interleukin-10. American Journal of Pathology. 170, 188-202 (2007).
- Sorg, H., Krueger, C., Vollmar, B. Intravital insights in skin wound healing using the mouse dorsal skin fold chamber. Journal of Anatomy. 211, 810-818 (2007).
- Laschke, M. W., Vollmar, B., Menger, M. D. The dorsal skinfold chamber: window into the dynamic interaction of biomaterials with their surrounding host tissue. European Cell and Materials. 22, 147-164 (2011).
- Trepat, X., Chen, Z., Jacobson, K.
- Hofmann, F., Belkacemi, A., Flockerzi, V. Emerging Alternative Functions for the Auxiliary Subunits of the Voltage-Gated Calcium Channels. Current Molecular Pharmacology. 8, 162-168 (2015).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
- Chen, L., et al. Protein 4.1G Regulates Cell Adhesion, Spreading, and Migration of Mouse Embryonic Fibroblasts through the beta1 Integrin Pathway. Journal of Biological Chemistry. 291, 2170-2180 (2016).
- Dewor, M., et al. Macrophage migration inhibitory factor (MIF) promotes fibroblast migration in scratch-wounded monolayers in vitro. FEBS Letters. 581, 4734-4742 (2007).
- Handly, L. N., Wollman, R. Wound-induced Ca(2+) wave propagates through a simple release and diffusion mechanism. Molecular Biology of the Cell. 28, 1457-1466 (2017).
- Cappiello, F., Casciaro, B., Mangoni, M. L. A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration. Journal of Visualized Experiments. (133), 56825 (2018).
- Hernandez Vera, R., Schwan, E., Fatsis-Kavalopoulos, N., Kreuger, J. A Modular and Affordable Time-Lapse Imaging and Incubation System Based on 3D-Printed Parts, a Smartphone, and Off-The-Shelf Electronics. PLoS One. 11, 0167583 (2016).
- Reinhart-King, C. A. Endothelial cell adhesion and migration. Methods in Enzymology. 443, 45-64 (2008).
- Treloar, K. K., Simpson, M. J. Sensitivity of edge detection methods for quantifying cell migration assays. PLoS One. 8, 67389 (2013).
- Pirkmajer, S., Chibalin, A. V.
- Papenfuss, H. D., Gross, J. F., Intaglietta, M., Treese, F. A. A transparent access chamber for the rat dorsal skin fold. Microvascular Research. 18, 311-318 (1979).
- Deoliveira, D., et al. An ear punch model for studying the effect of radiation on wound healing. International Journal of Radiation Biology. 87, 869-877 (2011).
- Chen, L., Mirza, R., Kwon, Y., DiPietro, L. A., Koh, T. J. The murine excisional wound model: Contraction revisited. Wound Repair and Regeneration. 23, 874-877 (2015).
- Dunn, L., et al.
- Wahedi, H. M., Park, Y. U., Moon, E. Y., Kim, S. Y. Juglone ameliorates skin wound healing by promoting skin cell migration through Rac1/Cdc42/PAK pathway. Wound Repair and Regeneration. 24, 786-794 (2016).
