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Developmental Biology

एक फीडर में मानव Pluripotent स्टेम सेल से हेमोजेनिक एंडोथेलियम भेदभाव- और Xeno मुक्त परिभाषित हालत

Published: June 16, 2019 doi: 10.3791/59823
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Center for iPS cell research and application (CiRA)
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ, हम एक फीडर में मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं से ठीक hemogenic endothelium फार्म के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत- और विदेशी मुक्त हालत. इस विधि रोग मॉडलिंग और चिकित्सीय यौगिकों के लिए स्क्रीनिंग में व्यापक अनुप्रयोगों होगा.

Abstract

मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं (PSCs) से कार्यात्मक hematopoietic स्टेम और जनक कोशिकाओं (HSPCs) को प्राप्त करने के लिए hematological और घातक विकारों के इलाज के लिए autologous प्रत्यारोपण के लिए एक मायावी लक्ष्य किया गया है. हेमोजेनिक एंडोथेलियम (एचई) ट्रांसक्रिप्शन कारकों द्वारा कार्यात्मक एचएसपीसी का उत्पादन करने के लिए या एक मजबूत तरीके से लिम्फोसाइटों को प्रेरित करने के लिए एक अनुकूल मंच है। हालांकि, एचई प्राप्त करने के लिए वर्तमान तरीके या तो महंगा है या उपज में चर रहे हैं। इस प्रोटोकॉल में, हमने फीडर और विदेशी-मुक्त परिभाषित स्थिति में 4 दिनों के भीतर महामहिम को प्राप्त करने के लिए एक लागत प्रभावी और सटीक विधि स्थापित की। परिणामी हे एक एन्डोथेलियल-टू-हेमेटोपोइटिक संक्रमण करते थे और सीडी 34+सीडी 45+ क्लोनोजेनिक हेमेटोपोएटिक जनक उत्पन्न हुए। कार्यात्मक HSPCs पैदा करने के लिए हमारे मंच की क्षमता क्षमता रोग मॉडलिंग और चिकित्सीय यौगिकों के लिए स्क्रीनिंग में व्यापक अनुप्रयोगों होगा.

Introduction

हेमेटोलॉजिकल और इम्यूनोलॉजिकल विकारों के लिए नई चिकित्सकीय के विकास रोग मॉडलिंग के लिए मजबूत प्लेटफार्मों की कमी से बाधित किया गया है और autologous hematopoietic स्टेम सेल (HSCs) रोगी से व्युत्पन्न के साथ उच्च थ्रूपुट दवा स्क्रीनिंग pluripotent स्टेम सेल (PSCs). प्रेरित (i) पीएससी प्रौद्योगिकी की सफलता रोगियों की कोशिकाओं से मॉडल रोगों के लिए वादा रखती है, लेकिन रोगी iPSCs से कार्यात्मक एचएससी की स्थापना मायावी है. मानव पीएससी से एचएससी प्राप्त करने के लिए भ्रूणीय पैटर्न और ट्रांसक्रिप्शनल कार्यक्रमों को उचित रूप से शामिल किया जाता है , यह कुंजी1,2,3,4,5,6, 7,8. हेमेटोपोइटिक विकास में हाल ही में हुई प्रगति ने एचएससी विकास9में हेमोजेनिक एंडोथेलियम (एचई) की भूमिका का प्रदर्शन किया है। महामहिम को पीएससी से प्रेरित किया जा सकता है और यह डाउनस्ट्रीम हस्तक्षेप के लिए अनुकूल है जैसे जीन अंतरण10,11,12,13. एक मंच के रूप में महामहिम का उपयोग करना, 5 प्रतिलेखन कारकों का संयोजन(ERG, HOXA5, HOXA9, LCOR, RUNX1) सफलतापूर्वक कार्यात्मक HSS प्रेरित है कि लंबी अवधि engraft और कई वंशों में अंतर14. तथापि, पीएससी से एचई की चर और अक्षम पीढ़ी ने नैदानिक उपयोग के लिए ऑफ-द-शेल्फ उत्पादन और हेमेटोपोएटिक कोशिकाओं के बड़े पैमाने पर प्रेरण के साथ-साथ कोशिकाओं के व्यवस्थित हेरफेर और विश्लेषण को बाधित किया है।

यहाँ, हम एक फीडर और विदेशी मुक्त परिभाषित शर्त के साथ 4 दिनों में महामहिम प्राप्त करने के लिए एक लागत प्रभावी और सटीक विधि का वर्णन. इस विधि में, इमेरिक्स-511 पर गोलभड गठन और सहज पुन: सपाट पीएससी कालोनियों का एक सुसंगत घनत्व सुनिश्चित करता है, जो एचई कोशिकाओं के कुशल प्रेरण के लिए महत्वपूर्ण है।

Protocol

1. अभिकर्मकों

  1. सेल लाइनों (मानव PSCs): या तो भ्रूण स्टेम सेल (ESCs) या iPSC लाइनों 409B2 और 201B7(317-9) और CBA11 प्राप्त.
  2. अभिकर्मक तैयारी
    1. पीएससी चढ़ाना माध्यम: 10 डिग्री सेल्सियस वाई-27632 के साथ पीएससी रखरखाव माध्यम को मिलाएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. पीएससी स्फरॉइड टाइलिंग मीडियम: पीएससी रखरखाव माध्यम को 625-1,250 एनजी/एमएल मानव रिकॉमबिनेंट लैमिन-511 ई8 खंड (एलएम 511-ई8) (सेल लाइन पर निर्भर करता है) के साथ मिश्रण बस उपयोग करने से पहले।
      नोट: LM511-E8 मीडिया15में मिलाया जा सकता है . इस तरह के पूर्ण लंबाई laminin-511 के रूप में अन्य मैट्रिक्स पूर्व लेपित होने की जरूरत है, और यहां तक कि ऐसा किया, वे mesodermal organoids भेदभाव की प्रक्रिया के दौरान पालन बनाए रखने नहीं है.
    3. दिन 0 भेदभाव माध्यम: मिश्रण Mesodermal बेसल मध्यम के साथ 2 $M CHIR99021, 80 ng/mL अस्थि morphogenetic प्रोटीन 4 (BMP4) और 80 ng/mL संवहनी endothelial विकास कारक (VEGF).
    4. दिन 2 भेदभाव मध्यम: मिश्रण हेममोजेनिक बेसल मध्यम के साथ 1 $M SB431542, 80 ng/mL VEGF और 100 ng/mL स्टेम सेल कारक (SCF).
    5. कैल्शियम या मैग्नीशियम के बिना फॉस्फेट बफर लवण (पीबीएस) तैयार करें (सामग्री की तालिकादेखें) ।
    6. 1 m ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) बफर: पीबीएस के 500 एमएल करने के लिए 0.5 M EDTA के 1 एमएल जोड़ें।
    7. EHT माध्यम: मिश्रण Hematopoietic बेसल मध्यम के साथ 50 ng/mL SCF, 20 ng/mL थ्रोम्बोपोइटिन (TPO), 50 ng/mL Fms से संबंधित टायरोसिन kinase 3 ligand (Flt-3L), 20 ng/mL Interleukin-6/ इंसुलिन-ट्रांसफररिन-सेलेनियम-एथेलेनियम, एल-ग्लूटामाइन और पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन/एम्फोटेरिकिन बी।
    8. FACS बफर: 2% भ्रूण बछड़ा सीरम और 1 एमएम EDTA के साथ पीबीएस मिश्रण.
    9. चुंबकीय पृथक्करण बफर तैयार कीजिए (सामग्री की सारणीदेखिए )
    10. मेथिलसेल्यूलोस-आधारित मीडिया तैयार करें (सामग्री तालिकादेखें)।

2. पीएससी कॉलोनी गठन

  1. 70 - 80% संगम पर एक 0.5 डिग्री सेमी-2 LM511-E8-कोट 6-वेल प्लेट में mTeSR1 में एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर के साथ 5% सीओ2के साथ 80% संगम हो जाना ।
  2. पीएससी वियोजन (दिन -4)
    1. मध्यम aspirate और दो बार पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें. वियोजन समाधान के साथ कोशिकाओं कुल्ला. 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट (कोशिकाएं इस समय में desiccate नहीं होगा)।
    2. पीएससी रखरखाव माध्यम में कोशिकाओं को निलंबित करें, निलंबन को उचित आकार की ट्यूब पर स्थानांतरित करें और 3 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें और सुपरनेंट को एस्पेरेट करें और पीएससी चढ़ाना माध्यम में कोशिकाओं को निलंबित करें।
  3. 48,000 - 70,000 कोशिकाओं सेमी-2 (सेल लाइन पर निर्भर करता है) के घनत्व पर पीएससी निलंबन प्लेट एक सूक्ष्म-निर्मित प्लास्टिक पोत पर और 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रात भर इनक्यूबेट ।
    नोट: हम एक 96 अच्छी तरह से सूक्ष्म निर्मित प्लास्टिक पोत में सेल निलंबन के 100 $L अच्छी तरह से-1 की सलाह देते हैं. आप आम तौर पर एक 96 अच्छी तरह से थाली में 20,000 कोशिकाओं को अच्छी तरह सेबीज होगा लगभग 100 गोलभों उपज.
  4. टाइलिंग पीएससी स्फरॉइड्स पर LM511-E8 (दिन -3)
    1. पीएससी गोलोइड को 15 एमएल शंकु नली में पी 1000 माइक्रोपाइपेटर का उपयोग करके धीरे-धीरे पाइपिंग करके पीएससी का भिक्षाभ लीजिए और गोलियों को गुरुत्वाकर्षण से कम करने के लिए 2 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर खड़े होने के लिए छोड़ दें। अधिनान्त को प्रेरित करें।
    2. स्फीरोइड चढ़ाना मध्यम में निलंबित, एक गैर लेपित 6 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट में 4-स्फीरॉइड सेमी-2 और 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में संस्कृति के घनत्व पर निलंबन को वितरित करें जिसमें 5% सीओ2 तीन दिनों के लिए है।

3. हेमोजेनिक प्रेरण (दिन 0)

  1. माध्यम को प्रेरित करें, 5% ओ2 और 5% सीओ2 (हाइपोक्सिक इनक्यूबेटर) के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में डे0 भेदभाव मध्यम और संस्कृति जोड़ें।
  2. Day0 भेदभाव माध्यम में संस्कृति के दो दिनों के बाद, माध्यम aspirate, तो hypoxic इनक्यूबेटर में Day2 भेदभाव मध्यम और संस्कृति जोड़ें.

4. हेमोजेनिक एंडोथेलियम का अलगाव (दिन 4)

  1. दो दिन बाद, मध्यम aspirate और दो बार पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें. वियोजन समाधान के साथ कोशिकाओं कुल्ला. 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 5% सीओ2 के साथ 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
  2. एकल-सेल स्तर से अलग करने के लिए 1 एमएम EDTA में कोशिकाओं को निलंबित करें, निलंबन को 50 एमएल शंकु ट्यूब में स्थानांतरित करें और कोशिकाओं को 3 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर अपकेंद्रण करें। सुपरनॉटेंट को प्रेरित करें और सेल गोली को 300 डिग्री सेल्सियस चुंबकीय पृथक्करण के साथ निलंबित करें। बफ़र.
  3. CD34+ microbeads और धीरे पाइप के 100 $L जोड़ें. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट। अप करने के लिए 20 लाख कोशिकाओं प्रति 100 $L CD34+ मोती इस्तेमाल किया जा सकता है.
  4. एक 40 डिग्री सेल छलनी के माध्यम से निलंबन फ़िल्टर.
  5. किसी चुंबकीय विभाजक का उपयोग करके CD34+ कक्षों को अलग करें.

5. एंडोथेलियल-टू-हेमेटोपोइटिक संक्रमण (ईएचटी) का प्रेरण

  1. फाइब्रोनेक्टिन लेपन
    1. पीबीएस में 1 मिलीग्राम/एमएल फाइब्रोनेक्टिन को कम करके 5 ग्राम/एमएल फाइब्रोनेक्टिन-कोटिंग समाधान की आवश्यक मात्रा तैयार की जा रही है।
    2. एक 24 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से में कोटिंग समाधान के 0.5 एमएल वितरित. 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर थाली इनक्यूबेट करें।
  2. 3 मिनट के लिए 200 x g पर सॉर्ट की गई CD34+ कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। EHT माध्यम के 1 एमएल में सेल पेलेट को पुन: निलंबित करें।
  3. सेल काउंटर के साथ व्यवहार्य सेल घनत्व निर्धारित करें। EHT माध्यम जोड़कर 200,000 कोशिकाओं एमएल-1 के लिए सेल घनत्व समायोजित करें.
  4. एस्पायर और फाइब्रोनेक्टिन लेपित अच्छी तरह से कोटिंग समाधान को त्याग दें। प्रत्येक फाइब्रोनेक्टिन-कोटेड वेल में सीडी34+ सेल सस्पेंशन का 0.5 एमएल वितरित करें।
  5. एक सप्ताह के लिए hypoxic इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट।

6. हेमाटोपोइटिक कोशिकाओं का प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण

  1. फ्लोटिंग सेल संग्रह: संस्कृति माध्यम को 15 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें। 3 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर मध्यम केंद्र का उपयोग करें।
  2. अनुलग्न कक्ष संग्रह
    1. पीबीएस के 0.5 एमएल से कोशिकाओं को दो बार धो लें।
    2. कोशिकाओं को अलग करने वाले घोल से कुल्ला करें और अधिशेष तरल को प्रेरित करें।
    3. 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में प्लेट को इनक्यूबेट करें।
    4. एफएसीएस बफर के 1 एमएल में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।
  3. अस्थायी कोशिकाओं और अनुलग्न कोशिकाओं को मिलाएं।
  4. 3 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। एफएसीएस बफर के 50 डिग्री एल में पुन: निलंबित करें। अंधेरे में कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए एंटी-सीडी34 और एंटी-सीडी45 एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  5. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धोएं और 3 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें। सुपरनेंट को एस्पायर करें और 0.5 एमएल एफएसीएस बफर में 0.5 ग्राम/एमएल 4',6-डायमिडिनो-2-फेनिलिनोल के साथ पुन: स्फूंश करें।
  6. प्रवाह cytometer द्वारा CD34 और CD45 अभिव्यक्ति को मापने.

7. हेमाटोपोइटिक सेल की कालोनी बनाने की इकाई (सीएफयू) परख

  1. हेमाटोपोइटिक सेल संग्रह: एक 15 एमएल शंकु ट्यूब के लिए संस्कृति से माध्यम स्थानांतरण. धीरे पीबीएस के साथ अच्छी तरह से दो बार कुल्ला.
  2. 3 मिनट के लिए 200 x ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें। EHT माध्यम के 1 एमएल में पुन: निलंबित. कक्ष काउंटर के साथ कक्ष संख्या निर्धारित करें.
  3. मिथाइलसेलुलोस-आधारित मीडिया के 3 एमएल में 10,000 कोशिकाओं के बराबर निलंबन मात्रा जोड़ें एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक और 16 जी या 18 जी सिरिंज के साथ अच्छी तरह से 5 बार मिश्रण करें।
  4. एक 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से में पूरे मिथाइलसेलुलोस आधारित मीडिया निलंबन वितरित.
  5. नम रखते हुए दो सप्ताह के लिए 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में इनक्यूबेट। पकवान परेशान मत करो. कालोनियों गति के प्रति संवेदनशील हैं.
  6. दो सप्ताह के बाद, एक माइक्रोस्कोप के तहत कालोनियों गिनती.

Representative Results

पीएससी कालोनियों के गठन की एक रूपरेखा चित्र 1कमें दर्शाया गया है . पीएससी स्रूपभॉइड एक दिन के लिए एक सूक्ष्म निर्मित प्लास्टिक के बर्तन पर बनते हैं। एक प्रतिनिधि परिणाम के रूप में, 20,000 409B2 कोशिकाओं सूक्ष्म निर्मित प्लास्टिक पोत के 96-वेल प्रति नियंत्रित किया जा सकता है, हालांकि अन्य सेल लाइनों एक उच्च घनत्व की आवश्यकता हो सकती है (30,000-40,000 कोशिकाओं प्रति 96-अच्छी सूक्ष्म निर्मित प्लास्टिक पोत की). उन क्षेत्रों को स्वतः एक लगभग दो आयामी संस्कृति को चपटा कर रहे हैं जब LM511-E8 की उपस्थिति में एक संस्कृति पकवान पर चढ़ाया.

चित्र 1खमें हेमोजेनिक प्रेरण की एक रूपरेखा को स्पष्ट किया गया है। जब पीएससी कालोनियों 750 डिग्री के व्यास के लिए विकसित, मध्यम क्रमिक organoids प्रेरित करने के लिए क्रमिक रूप से बदल दिया है. पीएससी कालोनियों धीरे-धीरे 4 दिन तक अनुक्रमिक मध्यम परिवर्तन द्वारा mesodermal organoids के लिए भेदभाव के दौरान एक धूप पक्ष संरचना बन जाएगा। 4 दिन, हेमोजेनिक एंडोथेलिया चुंबकीय छँटाई द्वारा mesodermal organoids से निर्दिष्ट कर रहे हैं और बाद में EHT माध्यम में fibronectin पर चढ़ाया. 5-10 लाख CD34+CD45- कोशिकाओं 1 लाख PSCs युक्त गोलभों से की उम्मीद कर रहे हैं (चित्र 1C) .

यह देखा गया है कि कोशिकाएं अंत:संवलेसे हेमेटोपोएटिक कोशिकाओं (अनुपूरक वीडियो 1) में परिवर्तित हो जाती हैं। 7 दिन पर हेमेटोपोएटिक कॉकटेल के साथ उत्तेजना पर हेमेटोपोएटिक जनक कोशिकाओं की एक प्रतिनिधि चरण-कंट्रास्ट छवि चित्र 2Aमें दिखाया गया है। हेमाटोपोइटिक सेल कालोनियों संस्कृति में उभरा.

एक प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री आलेख चित्र 2खमें दिखाया गया है। पूरी संस्कृति hematopoietic कॉकटेल के साथ प्रेरित है और 7 दिन पर प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा CD34 और CD45 की अभिव्यक्ति के लिए विश्लेषण किया है. Hematopoietic जनक कोशिकाओं CD34 और CD45 व्यक्त करते हैं.

एक CFU परख CD34+ CD45+ hematopoietic जनक कोशिकाओं से दानेदार/मैक्रोफेज कालोनियों की पीढ़ी से पता चला (चित्र 2C) . अनुमानित कॉलोनी संख्या 38 CFU-G/M प्रति 10,000 कोशिकाओं है (चित्र 2 डी)

Figure 1
चित्र 1: पीएससी कालोनियों और बाद में हेमेटोपोएटिक भेदभाव हेमोजेनिक एंडोथेलिया के माध्यम से टाइलिंग की योजना। (क) पीएससी कालोनियों के गठन की योजना प्रक्रिया। पीएससी रखरखाव माध्यम में एलएम 511-ई8-कोट्ड 6-वेल प्लेट पर पीएससी का रखरखाव किया जाता है। -4 दिन, कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं और अलग समाधान का उपयोग कर एकल सेल स्तर से अलग, बाद में वाई-27632 के साथ पीएससी रखरखाव माध्यम में सूक्ष्म निर्मित प्लास्टिक पोत पर चढ़ाया और spheroids फार्म के लिए रात भर सुसंस्कृत. -3 दिन, गोलभड़ों को पीएससी रखरखाव माध्यम में LM511-E8 के साथ चढ़ाया जाता है और तीन दिनों के लिए सुसंस्कृत किया जाता है। 0 दिन तक, गोलभों को लगभग दो आयामी संस्कृति के लिए सहज रूप से चपटा कर दिया जाता है। स्केल बार्स ] 200 डिग्री मी. (बी) दिन 0 पर, माध्यम को डे0 विभेदन माध्यम से बदल दिया जाता है और hypoxic इनक्यूबेटर में सुसंस्कृत किया जाता है। भेदभाव के दूसरे दिन, माध्यम Day2 भेदभाव माध्यम के साथ बदल दिया है. हेमजेनिक एंडोथेलियम संवर्धन के 4 दिन, CD34+ कोशिकाओं चुंबकीय रूप से हल कर रहे हैं और 6 दिनों के लिए EHT माध्यम में एक fibronectin लेपित 12 अच्छी तरह से प्लेट पर सुसंस्कृत. (सी) CD45 के प्रतिनिधि flowcytotry साजिश और दिन 4 कोशिकाओं की CD34 अभिव्यक्ति CD34 द्वारा क्रमबद्ध. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: हेमेटोपोएटिक संपत्ति का विश्लेषण। (क) दिन 7 पर हेमेटोपोएटिक कॉकटेल के साथ उत्तेजना के बाद हेमेटोपोएटिक जनक कोशिकाओं के प्रतिनिधि चरण-कंट्रास्ट छवि। स्केल बार ] 200 $m. (बी) प्रतिनिधि प्रवाह cytometry साजिश CD45 और सीडी34 पूरी संस्कृति की अभिव्यक्ति के दिन हेमेटोपोएटिक कॉकटेल के साथ उत्तेजना पर 7. (ग) दिन 11 हेमेटोपोएटिक जनक कोशिकाओं से उत्पन्न एक दानेदार/मैक्रोफेज कॉलोनी के प्रतिनिधि चरण-कंट्रास्ट छवि। स्केल बार - 500 डिग्री मी. (डी) प्रति 10,000 कोशिकाओं पर CFUs की संख्या। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Video
अनुपूरक वीडियो 1: EHT वीडियो. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

Discussion

हमारे फीडर- और विदेशी मुक्त परिभाषित प्रेरण विधि एक स्केलेबल तरीके से एचई कोशिकाओं को प्रेरित करने के लिए एक सटीक और लागत प्रभावी मंच प्रदान करता है। पारंपरिक प्रोटोकॉल10,11, 12,13,14 में हेमोजेनिक एंडोथेलियम के वफादार गठन पीएससी कॉलोनी घनत्व और आकार के सटीक नियंत्रण की कमी के कारण बाधित किया गया है , जो मॉर्फोजेन/साइटोकीन आधारित निर्देशित विभेदन की दक्षता को प्रभावित करता है। हम पारंपरिक प्रोटोकॉल से प्रत्येक स्वतंत्र बैच में हेमोजेनिक endothelium प्रेरण की असंगति का अनुभव किया था. नए प्रोटोकॉल पीएससी कॉलोनी घनत्व और आकार के तंग विनियमन सक्षम बनाता है, इस प्रकार हेमोजेनिक एंडोथेलियम प्रेरण की असंगति पर काबू पा लिया।

हमने स्फीरोइड के वर्दीधारी गठन का उपयोग किया और बाद में कुल 4 दिनों में एचई बनाने के लिए एक फीडर- और विदेशी मुक्त परिभाषित स्थिति से अवगत कराया। हम तीन स्वतंत्र सेल लाइनों का उपयोग कर की पुष्टि की है कि गोलभय गठन एचई कोशिकाओं के लगातार गठन का आश्वासन दिया. एक प्रतिनिधि परिणाम के रूप में, 409B2 सेल लाइनों तीन स्वतंत्र प्रयोगों के आधार पर 12.7%-23.6% CD34+ सेल दक्षता मिले. पीएससी स्फीरोइड को टाइल करने के लिए महत्वपूर्ण कारक LM511-E8 है। हम इस अन्य मैट्रिक्स के साथ प्रतिस्थापन की सिफारिश नहीं है, ऐसे Matrigel या हमारे अनुभवों में पूर्ण लंबाई laminin उत्पादों के रूप में. हमने अनुभव किया कि मध्यप्रर्मल organoids आसानी से Matrigel से अलग कर रहे थे और भेदभाव की प्रक्रिया के दौरान खो दिया है. और न ही Matrigel या पूर्ण लंबाई laminin पूर्व कोटिंग के बिना कोशिकाओं लंगर नहीं है.

इस प्रोटोकॉल की संभावित सीमा यह है कि हम पीएससी रखरखाव के माध्यम पर निर्भर करते हैं ताकि पीएससी बनाए रखी जा सके। हम ऐसे StemFit के रूप में अन्य मीडिया का परीक्षण किया है, लेकिन हम hemogenic प्रेरण समझौता किया. शायद कोशिकाओं को हमारे कम समय (4 दिन) प्रेरण प्रोटोकॉल में pluripotent राज्य से बाहर निकलने के लिए प्रतिरोधी थे. यदि कोई अन्य मीडिया में पीएससी रखता है, तो हम पीएससी रखरखाव माध्यम में कोशिकाओं को अनुकूलित करने की सलाह देते हैं और भेदभाव से पहले कुछ मार्ग संचालित करते हैं। यह मंच कोशिकाओं के व्यवस्थित हेरफेर और विश्लेषण की अनुमति देगा, और संभावित नैदानिक उपयोग के लिए ऑफ-द-शेल्फ उत्पादन और बड़े पैमाने पर हेमेटोपोएटिक कोशिकाओं को शामिल किया जाएगा। इस प्रणाली का एक दीर्घकालिक लक्ष्य जिम्मेदार सेलुलर और आणविक तंत्र की जांच और दवा स्क्रीनिंग का संचालन करने के लिए मानवीय माउस मॉडल में इम्यूनोडेफिशियेंसी रोगों का मॉडल है।

Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

हम उनकी तकनीकी सहायता के लिए Alina ली और Seiko Benno के आभारी हैं. हम कागज के संपादन के लिए प्रशासनिक सहायता और डा पीटर कारागियान्स को प्रदान करने के लिए सुश्री हारुमी वाटानाबे को भी धन्यवाद देना चाहेंगे। यह काम चिकित्सा अनुसंधान और विकास के लिए जापान एजेंसी से अपक्षयी चिकित्सा के एहसास के लिए अनुसंधान केंद्र नेटवर्क के आई पी एस सेल अनुसंधान के लिए कोर सेंटर द्वारा समर्थित किया गया था (AMED) [M.K.S.], Intractable रोग अनुसंधान के लिए कार्यक्रम उपयोग. AMED के रोग-विशिष्ट आई पी एस कोशिकाओं (17935423) [M.K.S.] और जापान विज्ञान और प्रौद्योगिकी एजेंसी (JST) के नवाचार कार्यक्रम के लिए केंद्र [आर.ओ. और एम.के.एस.].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA Thermo Fisher Scientific 15575 0.5 M EDTA
40 μm cell strainer Corning 352340 40μM cell strainer
6 well plate Corning 353046 6 well plate
Antibiotic-antimycotic Thermo Fisher Scientific 15240-112 Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B
anti-CD34 antibody Beckman Coulter A07776 anti-CD34 antibody
anti-CD45 antibody Biolegend 304012 anti-CD45 antibody
BMP4 R&D Systems 314-BP-010 BMP4
CD34 microbeads Miltenyi 130-046-703 CD34 microbeads
CHIR99021 Wako 038-23101 CHIR99021
Essential 6 Thermo Fisher Scientific A15165-01 Hemogenic basal medium
Essential 8 Thermo Fisher Scientific A15169-01 Mesodermal basal medium
Ezsphere SP Microplate 96well AGC 4860-900SP micro-fabricated plastic vessel 
FCS Biosera FB-1365/500 FCS
Fibronectin Millipore FC010-100MG Fibronectin
Flt-3L R&D Systems 308-FK-005 Flt-3L
Glutamax Thermo Fisher Scientific 35050-061 L-Glutamine
IL-6/IL-6Rα R&D Systems 8954-SR IL-6/IL-6Rα
iMatrix-511 Matrixome 892 001 LM511-E8
ITS-X Thermo Fisher Scientific 51500-056 Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine
MACS buffer Miltenyi 130-091-221 magnetic separation buffer
Methocult 4435MethoCult™ H4435 Enriched STEMCELL TECHNOLOGIES 04435 Methylcellulose-based media
mTeSR1 STEMCELL TECHNOLOGIES 85850 PSC maintenance medium
PBS nacalai tesque 14249-24 PBS
SB431542 Wako 031-24291 SB431542
SCF R&D Systems 255-SC-010 SCF
Stemline II Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium Sigma Aldrich S0192-500ML Hematopoietic basal medium
TPO R&D Systems 288-TPN TPO
TrypLE Express Thermo Fisher Scientific 12604-021 dissociation solution
VEGF R&D Systems 293-VE-010 VEGF
Y-27632 Wako 253-00513 Y-27632

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक 148 हेमजेनिक एंडोथेलियम हेमेटोपोइसिस मानव pluripotent स्टेम सेल पीएससी spheroids mesoderm organoids निर्देशित भेदभाव विदेशी मुक्त फीडर मुक्त
एक फीडर में मानव Pluripotent स्टेम सेल से हेमोजेनिक एंडोथेलियम भेदभाव- और Xeno मुक्त परिभाषित हालत
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Ohta, R., Sugimura, R., Niwa, A., Saito, M. K. Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition. J. Vis. Exp. (148), e59823, doi:10.3791/59823 (2019).

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