Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att exakt bilda hemogent endotel från humana pluripotenta stamceller i ett Matnings-och xenofritt tillstånd. Denna metod kommer att ha breda tillämpningar inom sjukdoms modellering och screening för terapeutiska föreningar.
Abstract
Att härleda funktionell hematopoetisk stam och stamceller (HSPCs) från humana pluripotenta stamceller (PSC) har varit ett svårfångade mål för autologa transplantationer för att behandla hematologiska och maligna sjukdomar. Hemogent endotel (HE) är en mottagbar plattform för att producera funktionella HSPCs genom transkriptionsfaktorer eller för att inducera lymfocyter på ett robust sätt. Men nuvarande metoder för att härleda han är antingen kostsamma eller varierande i avkastning. I detta protokoll har vi fastställt en kostnads effektiv och exakt metod för att härleda HE inom 4 dagar i en feeder-och Xeno-fri definierade villkor. Den resulterande han genomgick en endotelial-till-hematopoetisk över gång och producerade CD34+CD45+ klonogena hematopoetiska progenitorer. Den potentiella kapaciteten hos vår plattform för att generera funktionella HSPCs kommer att ha breda tillämpningar inom sjukdoms modellering och screening för terapeutiska föreningar.
Introduction
Utvecklingen av nya terapier för hematologiska och immunologiska sjukdomar har hämmats av avsaknaden av robusta plattformar för sjukdoms modellering och hög genom strömning drog screening med autologa hematopoetiska stamceller (HSCs) som härrör från patientens de pluripotenta stamcellerna (PSC). Genombrottet av inducerad (i) PSC-teknik håller löftet att modellera sjukdomar från patienternas celler, men inrättandet av funktionella HSCs från patientens iPSCs har varit svårfångade. För att härleda hscs från mänskliga PSCs, är korrekt induktion av embryonala mönster och transkriptionella program nyckel1,2,3,4,5,6, 7,8. De senaste framstegen i hematopoetisk utveckling har visat rollen av hemogent endotel (HE) i HSC utveckling9. Han kan induceras från PSCs och är mottaglig för nedströms intervention såsom gen överföring10,11,12,13. Med hjälp av he som plattform, kombinationen av 5 transkriptionsfaktorer (ERG, HOXA5, HOXA9, lcor, RUNX1) framgångs rikt inducerade funktionella hscs som implantera långsiktiga och differentiera till flera linjer14. Men, varierande och ineffektiv generering av HE från PSC har hindrat systematisk manipulation och analys av celler tillsammans med off-the-shelf produktion och storskalig induktion av hematopoetiska celler för klinisk användning.
Här beskriver vi en kostnads effektiv och exakt metod för att härleda HE i 4 dagar med ett Matnings-och xenofritt definierat tillstånd. I denna metod, sfäroiden bildning och spontan åter tillplattning på iMarix-511 säkerställer en konsekvent densitet av PSC-kolonier, vilket är avgörande för en effektiv induktion av HE-celler.
Protocol
1. reagenser
- Cellinjer (Human PSCs): skaffa antingen embryonala stamceller (ESCs) eller iPSC Lines 409B2 och 201B7 (317-9)) och CBA11.
-
Beredning av reagens
- PSC bordläggningen medium: blanda PSC underhålls medium med 10 μM Y-27632 och lagra vid 4 ° c.
- PSC spheroid plattsättning medium: mix PSC underhålls medium med 625 – 1250 ng/mL humant rekombinant laminin-511 E8 fragment (LM511-E8) (beroende på cellinjen) strax före användning.
Anmärkning: LM511-E8 kan blandas i media15. Annan matris såsom ful längds laminin-511 måste vara pre-Coated, och även gjorde det, de inte upprätthålla mesodermala organoider följs under differentierings processen. - Dag 0 differentiering medium: blanda Mesodermal basal medium med 2 μM CHIR99021, 80 ng/mL benmorfogenetiska protein 4 (BMP4) och 80 ng/ml vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF).
- Dag 2 differentierings medium: blanda Hemogent basal medium med 1 μM SB431542, 80 ng/mL VEGF och 100 ng/mL stamcells faktor (SCF).
- Förbered fosfatbuffertsaltlösning (PBS) utan kalcium eller magnesium (se material tabell).
- 1 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA) buffert: tillsätt 1 mL 0,5 M EDTA till 500 mL PBS.
- EHT medium: blanda hematopoetiskt basal medium med 50 ng/mL SCF, 20 ng/mL trombopoietin (TPO), 50 ng/mL FMS-relaterad tyrosinkinas 3 ligand (flt-3L), 20 ng/mL interleukin-6/interleukin-6 receptor alfa (IL-6/IL-6Rα), insulin-transferrin-selen-etanolamin, L-glutamin och penicillin/streptomycin/amfotericin B.
- FACS buffert: blanda PBS med 2% Foster kalv serum och 1 mM EDTA.
- Förbered magnetisk separeringbuffert (se material tabell).
- Förbered metylcellulosabaserade medier (se material tabell).
2. PSC-Kolonibildning
- Växa hPSCs till 70 – 80% sammanlänkning på en 0,5 μg cm-2 LM511-E8-belagd 6-well plattan i mTeSR1 i en 37 ° c inkubator med 5% co2.
-
PSC-dissociation (dag-4)
- Aspirera mediet och tvätta cellerna med PBS två gånger. Skölj cellerna med dissociationslösning. Inkubera vid 37 ° c i 15 minuter (cellerna kommer inte att torkas ut i denna tid).
- Suspendera cellerna i PSC-underhållsmediet, överför SUS pensionen till ett lämpligt stort rör och centrifugera cellerna vid 200 x g i 3 min. aspirera supernatanten och suspendera CELLERNA i PSC-pläteringsmediet.
- Platta KUSP SUS pensionen med en densitet av 48 000 – 70 000 celler cm-2 (beroende på cellinjen) på ett Micro-fabricerade plast kärl och inkubera över natten i den 37 ° c inkubator med 5% co2.
Anmärkning: Vi rekommenderar 100 μL brunn-1 cell SUS pension i ett 96-väl Micro-fabricerade plast fartyg. Du kommer vanligt vis utsäde 20 000 celler well-1 i en 96-well plattan för att ge cirka 100 sfäroider. -
Tiling PSC sfäroider på LM511-E8 (Dag-3)
- Samla PSC-sfäroiderna i ett 15 mL koniskt rör genom att försiktigt Pipettera med P1000 micropipetter och låt sfäroiderna stå i rums temperatur i 2 minuter för att fällas ut genom gravitation. Aspirera supernatanten.
- Suspendera i sfäroiden plätering medium, Dispensera SUS pensionen i en icke-belagd 6-well kultur plattan med en densitet av 4-sfäroider cm-2 och kultur i 37 ° c inkubator med 5% co2 för tre dagar.
3. hemogen induktion (dag 0)
- Aspirera mediet, tillsätt Day0 differentiering medium och kultur i 37 ° c inkubator med 5% O2 och 5% co2 (hypoxic inkubator).
- Efter två dagars kultur i Day0 differentiering medium, aspirera mediet, tillsätt sedan dag2 differentiering medium och kultur i hypoxisk inkubator.
4. isolering av Hemogent Endotelium (dag 4)
- Två dagar senare, aspirera mediet och tvätta cellerna med PBS två gånger. Skölj cellerna med dissociationslösning. Inkubera i 37 ° c med 5% CO2 under 30 min.
- Suspendera försiktigt cellerna i 1 mM EDTA för att separera till encellig nivå, överför SUS pensionen till ett 50 mL koniskt rör och centrifugera cellerna vid 200 x g i 3 min. aspirera supernatanten och suspendera cellpelleten med 300 μl magnetisk separation Buffert.
- Tillsätt 100 μl CD34+ mikrokorn och försiktigt pipet. Inkubera i 30 minuter i rums temperatur. Upp till 20 000 000 celler per 100 μL CD34+ pärlor kan användas.
- Filtrera SUS pensionen genom en 40 μm cell sil.
- Separera CD34+ -cellerna med hjälp av en magnetisk separator.
5. induktion av Endotelial till hematopoetisk över gång (EHT)
-
Fibronectin-beläggning
- Bered den erforderliga volymen av 5 μg/ml Fibronektin-beläggnings lösning genom spädning av 1 mg/ml Fibronektin i PBS.
- Fördela 0,5 mL av beläggnings lösningen i varje brunn i en 24-vältodlings platta. Inkubera plattan i rums temperatur i 30 min.
- Centrifugera de sorterade CD34+ -cellerna vid 200 x g i 3 min. resuspendera cellen pellet i 1 ml EHT-medium.
- Bestäm den livskraftiga cell tätheten med cell räknaren. Justera cell tätheten till 200 000 celler mL-1 genom att lägga till EHT-medium.
- Aspirera och kassera beläggnings lösningen från fibronectin-belagda brunnen. Fördela 0,5 mL CD34+ cell SUS pension i varje fibronectin-belagd brunn.
- Inkubera i hypoxisk inkubator under en vecka.
6. Flow Cytometri analys av hematopoetiska celler
- Flytande cell samling: Överför odlings mediet till ett 15 mL koniskt rör. Centrifugera mediet vid 200 x g i 3 min. aspirera supernatanten.
-
Adherent cell insamling
- Tvätta cellerna med 0,5 mL PBS två gånger.
- Skölj cellerna med dissocierande lösning och aspirera överskotts vätskan.
- Inkubera plattan i 37 ° c för 5 min.
- Omsuspendera cellerna i 1 mL FACS-buffert.
- Blanda flytande celler och anhängare celler.
- Centrifugera cellerna vid 200 x g i 3 min. aspirera supernatanten. Omsuspendera i 50 μL FACS-buffert. Inkubera cellerna med anti-CD34 och anti-CD45 anti kroppar för 1 h vid rums temperatur i mörker.
- Tvätta cellerna med PBS två gånger och centrifugera vid 200 x g i 3 min. aspirera supernatanten och resuspendera i 0,5 ml FACS buffert med 0,5 μg/ml 4 ', 6-diamidino-2-fenylindole.
- Mät CD34 och CD45 uttryck genom flödescytometer.
7. kolonibildande enhet (CFU) halt av hematopoetiska celler
- Hematopoetisk cell insamling: Överför mediet från kulturen till ett 15 mL koniskt rör. Skölj försiktigt brunnen två gånger med PBS.
- Centrifugera cellerna vid 200 x g i 3 min. aspirera supernatanten. Omsuspendera i 1 mL EHT-medium. Bestäm cell nummer med cell räknaren.
- Tillsätt en SUS pension volym motsvarande 10 000 celler till 3 mL metylcellulosa-baserade medier kompletteras med antibiotika och blanda väl 5 gånger med en 16 G eller 18 G spruta.
- Dispensera hela metylcellulosa-baserade Media SUS pensionen i varje brunn av en 6-well tallrik.
- Inkubera i 37 ° c med 5% CO2 i två veckor samtidigt som den håller sig fuktig. Stör inte skålen. Kolonier är rörelse känsliga.
- Efter två veckor, räkna kolonierna under ett Mikroskop.
Representative Results
En Schematisk bild av PSC-kolonier avbildas i figur 1a. PSC sfäroider bildas på ett Micro-fabricerade plast-fartyg för en dag. Som ett representativt resultat, 20 000 409B2 celler kan hanteras per 96-brunn av mikro-fabricerade plast fartyg, även om andra cellinjer kan kräva en högre densitet (30000-40000 celler per 96-brunn av mikro-fabricerade plast fartyg). Dessa sfärer är spontant tillplattade till en nästan tvådimensionell kultur när den är klädd på en kultur rätt i närvaro av LM511-E8.
En schematisk av hemogen induktion illustreras i figur 1b. När PSC-kolonier växer till en diameter av 750 μm, ändras mediet sekventiellt för att inducera mesodermala organoider. PSC-kolonierna kommer gradvis att bli en solig sida upp struktur under differentiering till mesodermala organoider genom sekventiell medel förändring till dag 4. På dag 4, hemogena endotelia anges från mesodermala organoider genom magnetisk sortering och därefter pläterade på Fibronektin i EHT medium. 5-10 miljoner CD34+CD45- celler förväntas från sfäroider som innehåller 1 000 000 PSCs (figur 1c).
Det observeras att cellerna morfologiskt förändras från endotelceller till hematopoetiska celler (kompletterande video 1). En representativ fas kontrast bild av hematopoetiska stamceller vid stimulering med hematopoetisk cocktail dag 7 visas i figur 2A. Hematopoetiska cellkolonier uppstod i kulturen.
En representativ flödescytometri diagram visas i figur 2b. Hela kulturen stimuleras med hematopoetisk cocktail och på dag 7 analyseras för uttrycket av CD34 och CD45 av flödescytometri. Hematopoetiska progenitorceller uttrycker CD34 och CD45.
En CFU-analys visade generering av granulocyter/makrofagkolonier från CD34+ CD45+ hematopoetiska stamceller (figur 2C). Det uppskattade antalet kolonier är 38 CFU-G/M per 10 000 celler (figur 2D)
Figur 1: Schematisk uppdelning av PSC-kolonier och efterföljande hematopoetiska differentiering via hemogen endotelia. ASchematisk process för bildandet av PSC-kolonier. De gemensamma kontakt punkterna upprätthålls på en LM511-E8-belagd 6-well-platta i PSC-underhållsmediet. På dag-4, celler lossas och separeras till encellig nivå med separera lösning, därefter pläterad på mikro-fabricerade plast fartyg i PSC underhålls medium med Y-27632 och odlade över natten för att bilda sfäroider. På dag-3, är sfäroider pläterade i PSC underhålls medium med LM511-E8 och odlade i tre dagar. Vid dag 0, sfäroider är spontant tillplattad till en nästan tvådimensionell kultur. Skal streck = 200 μm. (B) på dag 0 ersätts mediet med Day0 differentierings medium och odlas i hypoxisk inkubator. På dag 2 av differentieringen, mediet ersätts med dag2 differentiering medium. På dag 4 av hemogena endotelium berikning, CD34+ celler magnetiskt sorteras och odlas på en fibronectin-belagd 12-well plattan i EHT medium för 6 dagar. C representativ flowcytometri-Plot av CD45 och CD34 uttryck för dag 4-celler sorterade efter CD34. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: analys av hematopoetisk egendom. (A) representativ fas kontrast bild av hematopoetiska progenitorceller efter stimulering med hematopoetisk cocktail dag 7. Skalbar = 200 μm. (B) representativ flödescytometri tomt på CD45 och CD34 uttryck för hela kulturen vid stimulering med hematopoetiska cocktail på dag 7. (C) representativ fas kontrast bild av en granulocyt/makrofagkoloni som genereras från dag 11 hematopoetiska stamceller. Skalbar = 500 μm. (D) antal cfus per 10 000 celler. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande video 1: EHT-video. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Discussion
Vår matar-och xenofria definierade induktions metod erbjuder en exakt och kostnads effektiv plattform för att inducera HE-celler på ett skalbart sätt. Den trogna bildandet av hemogena endotelet i konventionella protokoll10,11,12,13,14 har hämmats av brist på exakt kontroll av PSC kolonidensitet och storlek, som påverkar effektiviteten hos morfogen/cytokin-baserad riktad differentiering. Vi hade upplevt inkonsekvens av hemogena endotelium induktion i varje oberoende parti från konventionella protokoll. Det nya protokollet möjliggör en stram reglering av PSC kolonidensitet och storlek, därmed övervinner inkonsekvensen av hemogena endotelium induktion.
Vi utnyttjade den uniformerade bildandet av sfäroider och därefter förmedlas en feeder-och Xeno-fri definierade villkor för att bilda HE i totalt 4 dagar. Vi bekräftade med hjälp av tre oberoende cellinjer att sfäroiden bildandet försäkrar konsekvent bildandet av HE celler. Som ett representativt resultat gav 409B2 cellinjerna 12,7%-23,6% CD34+ cell effektivitet baserat på tre oberoende experiment. Den kritiska faktorn för att kakel PSC sfäroider är LM511-E8. Vi rekommenderar inte att ersätta detta med andra matriser, såsom Matrigel eller ful längds laminin produkter i våra erfarenheter. Vi upplevde att mesodermala organoider var lätt lossnat från Matrigel och förlorade under differentierings processen. Och varken Matrigel eller ful längds laminin inte ankare celler utan pre-beläggning.
Den potentiella begränsningen av detta protokoll är att vi är beroende av PSC-underhållsmediet för att upprätthålla gemensamma kontakt punkter. Vi har testat andra medier som StemFit, men vi har kompromissat med hemogen induktion. Förmodligen celler var resistenta mot utträde ur pluripotenta tillstånd i vår korta tid (4 dagar) induktions protokoll. Om man upprätthåller gemensamma kontakt punkter i andra medier, rekommenderar vi att anpassa cellerna i PSC underhålls medium och genomföra ett par passager före differentiering. Denna plattform kommer att möjliggöra systematisk manipulation och analys av celler, och off-the-shelf produktion och storskalig induktion av hematopoetiska celler för potentiell klinisk användning. Ett långsiktigt mål för detta system är att modellera immun brist sjukdomar i humaniserad mus modeller för att undersöka de ansvariga cellulära och molekyl ära mekanismer och genomföra drog visningar.
Disclosures
Författarna deklarerar inga intresse konflikter.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för Alina Li och Seiko Benno för deras tekniska assistans. Vi vill också tacka MS Harumi Watanabe för att ge administrativt stöd och Dr Peter Karagiannis för att redigera papperet. Detta arbete stöddes av Core Center för iPS cell Research av Research Center nätverk för förverkligande av regenerativ medicin från Japan Agency för medicinsk forskning och utveckling (AMED) [M.K.S.], programmet för Svårsmittat sjukdomar forskning Använda. Sjukdomsspecifika iPS-celler från AMED (17935423) [M.K.S.] och Center for innovation-programmet för Japans vetenskaps-och teknik byrå (JST) [R.O. och M.K.S.].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575 | 0.5 M EDTA |
| 40 μm cell strainer | Corning | 352340 | 40μM cell strainer |
| 6 well plate | Corning | 353046 | 6 well plate |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240-112 | Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B |
| anti-CD34 antibody | Beckman Coulter | A07776 | anti-CD34 antibody |
| anti-CD45 antibody | Biolegend | 304012 | anti-CD45 antibody |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP-010 | BMP4 |
| CD34 microbeads | Miltenyi | 130-046-703 | CD34 microbeads |
| CHIR99021 | Wako | 038-23101 | CHIR99021 |
| Essential 6 | Thermo Fisher Scientific | A15165-01 | Hemogenic basal medium |
| Essential 8 | Thermo Fisher Scientific | A15169-01 | Mesodermal basal medium |
| Ezsphere SP Microplate 96well | AGC | 4860-900SP | micro-fabricated plastic vessel |
| FCS | Biosera | FB-1365/500 | FCS |
| Fibronectin | Millipore | FC010-100MG | Fibronectin |
| Flt-3L | R&D Systems | 308-FK-005 | Flt-3L |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | L-Glutamine |
| IL-6/IL-6Rα | R&D Systems | 8954-SR | IL-6/IL-6Rα |
| iMatrix-511 | Matrixome | 892 001 | LM511-E8 |
| ITS-X | Thermo Fisher Scientific | 51500-056 | Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine |
| MACS buffer | Miltenyi | 130-091-221 | magnetic separation buffer |
| Methocult 4435MethoCult™ H4435 Enriched | STEMCELL TECHNOLOGIES | 04435 | Methylcellulose-based media |
| mTeSR1 | STEMCELL TECHNOLOGIES | 85850 | PSC maintenance medium |
| PBS | nacalai tesque | 14249-24 | PBS |
| SB431542 | Wako | 031-24291 | SB431542 |
| SCF | R&D Systems | 255-SC-010 | SCF |
| Stemline II Hematopoietic Stem Cell Expansion Medium | Sigma Aldrich | S0192-500ML | Hematopoietic basal medium |
| TPO | R&D Systems | 288-TPN | TPO |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12604-021 | dissociation solution |
| VEGF | R&D Systems | 293-VE-010 | VEGF |
| Y-27632 | Wako | 253-00513 | Y-27632 |
References
- Pereira, C. F., et al. Induction of a hemogenic program in mouse fibroblasts. Cell Stem Cell. 13, 205-218 (2013).
- Lancrin, C., et al. The haemangioblast generates haematopoietic cells through a haemogenic endothelium stage. Nature. 457, 892-895 (2009).
- Loh, K. M., et al. Mapping the Pairwise Choices Leading from Pluripotency to Human Bone, Heart, and Other Mesoderm Cell Types. Cell. , 451-467 (2016).
- Ng, E. S., et al. Differentiation of human embryonic stem cells to HOXA+ hemogenic vasculature that resembles the aorta-gonad-mesonephros. Nature Biotechnology. 34, 1168-1179 (2016).
- Batta, K., et al. Direct reprogramming of murine fibroblasts to hematopoietic progenitor cells. Cell Reports. 9, 1871-1884 (2014).
- Sturgeon, C. M., et al. Defining the path to hematopoietic stem cells. Nature Biotechnology. 31, 416-418 (2013).
- Ivanovs, A., et al. Human haematopoietic stem cell development: from the embryo to the dish. Development. 144, 2323-2337 (2017).
- Blaser, B. W., Zon, L. I. Making HSCs in vitro: don't forget the hemogenic endothelium. Blood. , (2018).
- Speck, N., Dzierzak, E. Of lineage and legacy: the development of mammalian hematopoietic stem cells. Nature imunology. , (2008).
- Niwa, A., et al. A novel serum-free monolayer culture for orderly hematopoietic differentiation of human pluripotent cells via mesodermal progenitors. PLoS One. 6, e22261 (2011).
- Sturgeon, C. M., et al. Wnt signaling controls the specification of definitive and primitive hematopoiesis from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32, 554-561 (2014).
- Ditadi, A., et al. Human definitive haemogenic endothelium and arterial vascular endothelium represent distinct lineages. Nature Cell Biology. 17, 580-591 (2015).
- Kennedy, M., et al. T lymphocyte potential marks the emergence of definitive hematopoietic progenitors in human pluripotent stem cell differentiation cultures. Cell Reports. 2, 1722-1735 (2012).
- Sugimura, R., et al. Haematopoietic stem and progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature. 545, 432-438 (2017).
- Miyazaki, T., et al. Efficient Adhesion Culture of Human Pluripotent Stem Cells Using Laminin Fragments in an Uncoated Manner. Scientific Reports. 7, 41165 (2017).
