Summary
Her præsenterer vi protokoller for dyrkning af humane Periodontal ligament (PDL) celle sfæroider af chitosan film. Kulturen i tredimensionale (3D) cellulære sfæroider giver et alternativ til konventionel vævskultur polystyren (TCPS) kultur system.
Abstract
Periodontal ligament (PDL) celler holder stort løfte for Periodontal vævsregenerering. Konventionelt, PDL celler er kultiveret på to-dimensionelle (2D) substrater som vævskultur polystyren (TCPS). Der er imidlertid observeret karakteristiske ændringer af PDL-celler under in vitro-kulturen. Dette fænomen er sandsynligvis fordi 2D TCPS adskiller sig fra in vivo tredimensionale (3D) mikromiljø. Sammenlignet med celler, der er dyrket på 2D-substrater, udviser celler, der dyrkes i et 3D-mikromiljø, flere ligheder med in vivo-celler. Derfor, 3D cellekultur modeller giver et lovende alternativ til konventionelle 2D enkeltlags cellekultur. For at forbedre konventionelle PDL cellekultur modeller, har vi for nylig udviklet en 3D cellekultur metode, som er baseret på sfæroide dannelse af PDL celler på chitosan film. Her præsenterer vi detaljerede celle sfæide kultur protokoller baseret på chitosan film. 3D kultur system af PDL cellulære sfæroider overvinde nogle af begrænsningerne i forbindelse med konventionelle 2D enkeltlags cellekultur, og dermed kan være egnet til at producere PDL celler med en forbedret terapeutisk effekt for fremtidige Periodontal vævsregeneration.
Introduction
Periodontitis, initialiseret primært af dental plaque1, er karakteriseret ved skaden af Periodontal væv, herunder Periodontal ligament (PDL), alveolær knogle, og cementum. Nuværende behandlinger for parodontitis er normalt vellykket i at forhindre udviklingen af den aktive sygdom, men regenerering af tabte Periodontal væv er fortsat en klinisk udfordring. For nylig er der gjort vigtige fremskridt i cellebaserede tilgange til Periodontal vævsregenerering for at overvinde ulemperne ved nuværende behandlinger2,3,4.
Vores tidligere systematiske gennemgang afslørede, at PDL celler viste stort potentiale for Periodontal regenerering5. Konventionelt, PDL celler er kultiveret på to-dimensionelle (2D) substrater som vævskultur polystyren (TCPS). Der er imidlertid observeret karakteristiske ændringer af PDL-celler under in vitro-kultur6. Dette fænomen er sandsynligvis fordi 2D TCPS adskiller sig fra in vivo tredimensionale (3D) mikromiljø7. Sammenlignet med celler, der er dyrket på 2D-substrater, udviser celler, der dyrkes i et 3D-mikromiljø, flere ligheder med in vivo-cellerne8. Derfor, 3D cellekultur modeller giver et lovende alternativ til konventionelle 2D enkeltlags cellekultur.
Konventionel 3D-kultur metode er indkapstende celler i 3D biomaterialer. Sammenlignet med celler indkapslet i 3D-biomaterialer, efterligner cellulære sfæroider in vivo-situationen nøjere, fordi sfæroider er aggregater af celler, der vokser fri for fremmede materialer9,10,11, 12. det rapporteres, at cellulære sfæroider PROMOVEREDE MSC-bioaktiviteter via bevaring af komponenter af ekstracellulær matrix (ECM), herunder fibronectin og Laminin13. For at forbedre konventionelle PDL cellekultur modeller, har vi for nylig udviklet en 3D PDL cellekultur metode, som er baseret på sfæroide dannelse af PDL celler på chitosan film14. Spheroid-dannelsen øgede den selvfornyende og osteogene differentierings kapacitet for PDL-celler14. Her præsenterer vi detaljerede PDL celle sfæide kultur protokoller baseret på chitosan film. 3D kultur system af PDL cellulære sfæroider overvinde nogle af de mangler i forbindelse med konventionelle TCPS cellekultur, og dermed kan være egnet til at producere PDL celler med en forbedret terapeutisk effekt for fremtidige Periodontal vævsregeneration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Forsøgsprotokollen blev godkendt af den etiske komité for skole og Hospital for Stomatology, Tongji University. Alle patienter gav skriftlig informeret samtykke.
1. isolation af PDL-celler
- Gør proliferation medium for kultur af PDL celler: α-MEM medium suppleret med 10% FCS og 100 U/mL pen/STREP.
- Forbered en container med is til at overføre isolerede tredje molarer.
- Steriliser kirurgiske instrumenter ved hjælp af autoklaven.
- Uddrag normale menneskelige påvirkede tredje molarer fra voksne (18-28 år) på Dental Clinic of School og Hospital for Stomatology, Tongji University.
- Anbring tredje molarer i sprednings mediet, og overfør dem til laboratoriet ved 4 °C.
- Anbring den ekstraherede tand i en steril 100 mm Petri skål, der arbejder inden for en Biohazard laminar flow hætte.
- Tilsæt 10 mL PBS til at vaske den ekstraherede tand. Gentag vaske trinnet to gange.
- Ved at bruge en steril skalpel skal du forsigtigt adskille PDL fra roden.
Bemærk: PDL skal skrabes fra den midterste tredje del af roden for at undgå kontaminering fra gingival eller apikale væv. - Mince PDL i 1-2-mm fragmenter ved hjælp af en steriliseret skalpel klinge.
- PDL-fragmenter anbringes i en T-25-dyrknings kolbe fyldt med 3-4 mL sprednings medium.
- Prøverne udtages i en inkubator ved 37 °C i 5% CO2 med luftfugtighed.
- Ændring af dyrkningsmediet efter udvækst af PDL-celler blev observeret. Det tager normalt 1-2 uger for den udvækst af PDL celler. Observere udvækst af PDL celler via en omvendt fasekontrast mikroskop.
- Skift kulturmediet to gange om ugen derefter.
- Når PDL celler har nået sammenløbet, sub-kultur celler i forholdet 1:4 (passage 1).
- Observere cellevækst dagligt og ændre dyrkningsmediet to gange om ugen.
- Udfør hver efterfølgende passage ved forholdet 1:4 efter cellerne opnår 80% sammenløbet. Brug tredje til femte generation af PDL-celler til celle såning.
2. fremstilling af chitosan-film
- Til fremstilling af en 1% (v/v) eddikesyre tilsættes 5 mL eddikesyre til 495 mL dobbeltdestilleret vand i et rent glasbæger.
- Til fremstilling af 1% w/v chitosan-opløsning afvejes 5 g chitosan-pulver (gennemsnitlig molekylvægt 400 kDa, 85% acetylsalicylsyre) og tilsættes 495 mL 1% (v/v) eddikesyreopløsning.
- Den tilberedte opløsning omrøres i 24 timer med rørog magnetisk omrørings plade ved 60 °C.
- Autoclave den tilberedte opløsning for at sikre fuldstændig opløsning af chitosan.
Bemærk: eksperimentet kan sættes på pause på dette stadie. - At danne chitosan film, tilsæt 1% w/v chitosan opløsning i vævskultur polystyren (TCPS) retter på 0,25 mL/cm2. For eksempel, tilføje 0,5 mL af 1% w/v chitosan opløsning til en brønd af 24-brønd plade.
- Tør TCPS retter i en ovn ved 60 °C i 24 timer til at danne chitosan film.
- Forbered 0,5 N natriumhydroxid (NaOH). Rør 10 g NaOH, lidt ad gangen, ind i en stor mængde dobbeltdestilleret vand ved hjælp af den magnetiske røre stang, og derefter fortynde opløsningen til at gøre 0,5 L.
Bemærk: Tilsæt NaOH til vand--tilsæt ikke vand til fast NaOH. Rør ikke NaOH! Det kan forårsage kemiske forbrændinger. - Neutraliser chitosan film med 0,5 N NaOH. Tilsæt 0,5 mL 0,5 N NaOH opløsning til en brønd af 24-brønd pladen i 2 timer.
- Vask chitosan-filmene tre gange med dobbeltdestilleret vand.
Bemærk: eksperimentet kan sættes på pause på dette stadie. - Før celle såning, Steriliser de chitosan-belagte 24-brønd plader i 70% alkohol natten over ved stuetemperatur.
- Skyl de chitosan-belagte plader tre gange med PBS ved stuetemperatur.
- Steriliser chitosan-belagte plader ved behandling under ultraviolet lys natten over ved stuetemperatur.
3. celle såning
- Præ-varm sprednings medium PBS-opløsning og trypsin/EDTA-opløsning til 37 °C.
- Supernatanten kasseres fra T-75-celle dyrknings kolben.
- Vask konflydende PDL-celler med 10 mL PBS-opløsning.
- Kassér PBS-opløsningen.
- Der tilsættes 1 mL trypsin/EDTA-opløsning til T-75-celle dyrknings kolbe.
- Cellerne inkurueres med trypsin/EDTA-opløsning i 3 min ved 37 °C.
- Nedbrydningsprocessen af trypsin afbrydes ved tilsætning af 3 mL sprednings medium til T-75-celle dyrknings kolbe.
- Den forberedte cellesuspension overføres til et 15 mL konisk centrifugeglas.
- Der centrifugeres suspensionen i 5 min ved 300 x g og stuetemperatur.
- Supernatanten kasseres fra det 15 mL koniske centrifugeglas, og celle pillen gensuspenderes i 500 μL sprednings medium.
- Tæl PDL-celler med et hemocytometer.
- Frøpdl celler ved tætheder på 0,5 x 104, 1 x 104, 3 x 104og 6 x 104 celler/cm2.
- Culture PDL-celler på chitosan-film i en inkubator ved 37 °C i 5% CO2 med furet luft.
- Skift kulturmediet to gange om ugen derefter.
- På dag 1, 2, 3, 4 og 5, observere cellens morfologi dagligt via en omvendt fasekontrast mikroskop.
4. cellernes overlevelse
- Efter 1, 3, og 6 dages kultur, bestemme overlevelsen af celler ved hjælp af en kommerciel levedygtighed/cytotoksicitet kit.
- I et 15 mL rør forberedes 2 mL af en frisk opløsning på 2 mM calcein-AM og 4 mM ethidium homodimer i PBS ved vortexning i 5 s.
Bemærk: hold processen i mørke. - Fjern dyrkningsmediet og vask sfæroider i PBS.
- Sfæroider i PBS, der indeholder 2 mM calcein-AM og 4 mM ethidium homodimer i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke.
- Skyl sfæroider to gange i PBS. For sfæroider fra et brønd af 24-brønd plade, brug 2 mL PBS for hver gang.
- Overhold prøverne ved hjælp af et fluorescens mikroskop med 10 x eller 20x forstørrelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af denne protokol blev levedygtige PDL celle sfæroider med succes dannet. Figur 1 viste, at suspenderede celler eller sfæroider i stedet for tilknyttede celler hovedsagelig blev observeret på chitosan-film. For såning tæthed af 0,5 x 104 celler/cm2, blev vedhæftet PDL celler lejlighedsvis fundet på dag 1 og 3, og PDL celle sfæroider blev sjældent observeret. Derimod blev der siden dag 1 fundet forskellige størrelser PDL-cellesfæroider for såning af 3 x 104 og 6 x 104 celler/cm2. PDL-cellens sfæoide dannelse blev observeret fra alle såning tætheder efter 3 dage. Som vist i figur 1, 3 x 104 celler/cm2 var den optimale PDL celle såning tæthed, fordi størrelsen af PDL celle sfæroider var homogen ved denne celle såning tæthed. Efter 5 dages kultur blev der dannet større sfæroider for alle celle såning tætheder. Suspenderede PDL-celler blev sjældent fundet på dag 5.
Levedygtigheden af PDL-celler i sfæroider blev vurderet efter 1, 3 og 6 dage. Som vist i figur 2var størstedelen af cellerne i sfæroider levende celler på dag 1, 3 og 6. På dag 6 blev antallet af døde celler forøget i den centrale del.
Figur 1. Den morfologi af PDL cellulære sfæroider.
For såning tæthed af 0,5 x 104 celler/cm2, PDL Cell sfæroider blev sjældent observeret på dag 1 og 3. For såning densiteterne af 3 x 104 og 6 x 104 celler/cm2, forskellige størrelser af PDL Cell sfæroider blev fundet siden dag 1. PDL-cellens sfæoide dannelse blev observeret fra alle såning tætheder efter 3 dage. Efter 5 dages kultur blev der dannet større sfæroider for alle celle såning tætheder. Suspenderede PDL-celler blev sjældent fundet på dag 5. Skala stang: 200 μm. Dette tal er blevet ændret fra Yan et al.14. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Levedygtigheden af PDL cellulære sfæroider på chitosan film.
Levedygtigheden af PDL-celler i sfæroider blev vurderet efter 1, 3 og 6 dage. Som vist her var størstedelen af cellerne i sfæroider levende celler på dag 1, 3 og 6. På dag 6 blev antallet af døde celler forøget i den centrale del. Skala stænger: 200 μm. Dette tal er blevet ændret fra Yan et al.14. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nærværende undersøgelse indførte en 3D cellekultursystem til at overvinde nogle begrænsninger i forbindelse med konventionelle 2D enkeltlags cellekultur. Ifølge protokollen blev PDL cellulære sfæroider med succes dannet ved dyrkning af celler på chitosan film. Vores tidligere undersøgelse rapporterede, at sfæoide dannelsen øgede selv fornyelsen og osteogen differentiering kapaciteter af PDL celler14. I stedet for at bruge et enzym til at høste celler fra TCPS, kunne PDL celle sfæroider høstes fra chitosan film ved blot at pipette mediet et par gange14. Således kan ECM og intercellulære vejkryds være godt bevaret.
De kritiske trin i denne protokol omfatter: (1) at sikre, at de kirurgiske instrumenter og chitosan film er steriliseret til cellekultur; (2) skraber PDL fra den midterste tredjedel af roden for at undgå kontaminering fra gingival eller apikale væv; og (3) kræver højere celle såning tætheder (≥ 3 x 104 celler/cm2) for den vellykkede sfæroide dannelse af PDL celler.
Men, en begrænsning for denne metode er, at nedsat proliferation af PDL celler blev observeret efter sfæroide formation14, hvilket svarer til nogle tidligere undersøgelser, der udføres på fedtvæv stromale celler10 og hepatocellulær karcinom cellelinje15. Dette er sandsynligvis forårsaget af forskellen i reguleringen af cyclin-afhængige kinasehæmmere mellem sfæroide og enkeltlags celler16. For at gavne den kliniske anvendelse er der behov for yderligere undersøgelser for at fremme udbredelsen af cellesfæroider.
En anden ulempe ved det cellulære sfæroide er den utilstrækkelige diffusion i kernen. Selv om PDL-cellerne hovedsageligt var i live i sfæroide-kulturen, blev antallet af døde celler forøget i den centrale del af sfæroider på dag 6. Dette fænomen var sandsynligvis fordi spredningen af ilt og næringsstoffer er kompromitteret i sfæroide kerne som PDL Cell sfæroider bliver større17,18.
Andre metoder, der rapporteres at inducere cellulære sfæroider omfatter en ikke-vedhængende overflade19, mikrobrønde20, spinner kolber21, mikromønstrede flader22,23, hængende dråber24, og en teknik til tvungen aggregering25. Sammenlignet med førnævnte metoder er chitosan-filmene relativt omkostningseffektive og nemme at reproducere. En anden fordel ved denne metode er de antimikrobielle egenskaber af chitosan26, som er betydeligt gavnlig for in vitro cellekultur.
Sammenfattende, her præsenterer vi detaljerede 3D celle sfæide kultur protokoller baseret på chitosan film. Kulturen i PDL cellulære sfæroider overvinde nogle af begrænsningerne relateret til konventionelle 2D TCPS cellekultur, og dermed kan være egnet til fremstilling af PDL celler med en forbedret terapeutisk effekt for fremtidig Periodontal vævsregeneration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev sponsoreret af National Natural Science Foundation i Kina (NSFC 81700978), grundlæggende forskningsfonde for de centrale universiteter (1504219050), Natural Science Foundation of Shanghai (17ZR1432800), og Shanghai Medical Exploration Project ( 17411972600).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| α-MEM | Gibco | 11900-073 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 64197 | |
| Cell culture flask 25 cm2 | Corning | 430639 | |
| Cell culture flask 75 cm2 | Corning | 430641 | |
| Chitosan | Heppe Medical Chitosan GmbH | / | molecular weight 500 kDa, degree of deacetylation 85% |
| FCS | Gibco | 26140-079 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Molecular Probes | L3224 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 1310732 | |
| PBS | KeyGen Biotech | KGB5001 | |
| pen/strep | Gibco | 15140-122 | |
| Trypsin/EDTA | KeyGen Biotech | KGM25200 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 430790 | |
| 24-well plate | Corning | 3524 |
References
- Albandar, J. M. Epidemiology and risk factors of periodontal diseases. Dental Clinics of North America. 49 (3), 517-532 (2005).
- Bartold, P. M., McCulloch, C. A., Narayanan, A. S., Pitaru, S. Tissue engineering: a new paradigm for periodontal regeneration based on molecular and cell biology. Periodontology 2000. 24, 253-269 (2000).
- Chen, F. M., Jin, Y. Periodontal tissue engineering and regeneration: current approaches and expanding opportunities. Tissue Engineering Part B Review. 16 (2), 219-255 (2010).
- Yu, N., et al. Enhanced periodontal tissue regeneration by periodontal cell implantation. Journal of Clinical Periodontology. 40 (7), 698-706 (2013).
- Yan, X. Z., Yang, F., Jansen, J. A., de Vries, R. B., van den Beucken, J. J. Cell-Based Approaches in Periodontal Regeneration: A Systematic Review and Meta-Analysis of Periodontal Defect Models in Animal Experimental Work. Tissue Engineering Part B Review. 21 (5), 411-426 (2015).
- Itaya, T., et al. Characteristic changes of periodontal ligament-derived cells during passage. Journal of Periodontal Research. 44 (4), 425-433 (2009).
- Zhang, J., Li, B., Wang, J. H. The role of engineered tendon matrix in the stemness of tendon stem cells in vitro and the promotion of tendon-like tissue formation in vivo. Biomaterials. 32 (29), 6972-6981 (2011).
- Elliott, N. T., Yuan, F. A review of three-dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (1), 59-74 (2011).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
- Yeh, Y. C., et al. Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model. Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).
- Kabiri, M., et al. 3D mesenchymal stem/stromal cell osteogenesis and autocrine signalling. Biochemical and Biophysical Research Communications. 419 (2), 142-147 (2012).
- Lee, J. H., Han, Y. S., Lee, S. H. Long-Duration Three-Dimensional Spheroid Culture Promotes Angiogenic. Activities of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules & therapeutics. 24 (3), 260-267 (2016).
- Yan, X. Z., van den Beucken, J., Yuan, C., Jansen, J. A., Yang, F. Spheroid formation and stemness preservation of human periodontal ligament cells on chitosan films. Oral Diseases. 24 (6), 1083-1092 (2018).
- Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. Influence of a three-dimensional, microarray environment on human Cell culture in drug screening systems. Biomaterials. , (2012).
- LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors. Cancer Research. 64 (5), 1621-1631 (2004).
- Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate. Tissue Engineering Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).
- Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 9176357 (2016).
- Tong, J. Z., Sarrazin, S., Cassio, D., Gauthier, F., Alvarez, F. Application of spheroid culture to human hepatocytes and maintenance of their differentiation. Biology of the Cell. 81 (1), 77-81 (1994).
- Lee, W. Y., et al. The use of injectable spherically symmetric cell aggregates self-assembled in a thermo-responsive hydrogel for enhanced cell transplantation. Biomaterials. 30 (29), 5505-5513 (2009).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Engineering Part C Methods. 16 (4), 735-749 (2010).
- Wang, W., et al. 3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).
- Miyagawa, Y., et al. A microfabricated scaffold induces the spheroid formation of human bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells and promotes efficient adipogenic differentiation. Tissue Engineering Part A. 17 (3-4), 513-521 (2011).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. Scaffold-free culture of mesenchymal stem cell spheroids in suspension preserves multilineage potential. Cell and Tissue Research. 347 (3), 701-711 (2012).
- Rabea, E. I., Badawy, M. E., Stevens, C. V., Smagghe, G., Steurbaut, W. Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action. Biomacromolecules. 4 (6), 1457-1465 (2003).
