Summary
Здесь мы представляем протоколы культивирования человеческих пародонтальных связок (PDL) клеточных сфероипов по пленкам хитозана. Культура трехмерных (3D) клеточных сфероидов является альтернативой обычной системе культуры тканей (TCPS).
Abstract
Клетки пародонтальной связки (PDL) имеют большие перспективы для регенерации тканей пародонта. Условно, клетки PDL культивируются на двухмерных (2D) субстратах, таких как полистирол культуры тканей (TCPS). Тем не менее, характерные изменения клеток PDL наблюдались во время культуры in vitro. Это явление, вероятно, потому, что 2D TCPS отличается от in vivo трехмерной (3D) микросреды. По сравнению с клетками, культивируемыми на 2D субстратах, клетки, выращенные в 3D микроокружении, обладают большим сходством с клетками in vivo. Таким образом, модели культуры 3D-клеток являются перспективной альтернативой традиционной 2D монослойной клеточной культуре. Для улучшения традиционных моделей культуры клеток PDL мы недавно разработали метод 3D-культуры клеток, который основан на сфероидном образовании клеток PDL на пленках хитозана. Здесь мы представляем подробные протоколы клеточной сфероидной культуры, основанные на фильмах хитозана. 3D-система культуры PDL клеточных сфероидов преодолеть некоторые ограничения, связанные с обычной 2D монослойной клеточной культуры, и, таким образом, может быть пригодным для производства PDL клеток с повышенной терапевтической эффективностью для будущего регенерации ткани пародонта.
Introduction
Пародонтит, инициализированный главным образом зубной налет1, характеризуется повреждением пародонтальных тканей, включая пародонтальные связки (PDL), альвеолярной кости и цемента. Текущие методы лечения пародонтита, как правило, успешно предотвращают прогресс активного заболевания, но регенерация потерянных тканей пародонта остается клинической проблемой. В последнее время был достигнут значительный прогресс в клеточных подходах к регенерациитканей пародонта, чтобы преодолеть недостатки текущих методов лечения 2,3,4.
Наш предыдущий систематический обзор показал, что PDL клетки показали большой потенциал для регенерации пародонта5. Условно, клетки PDL культивируются на двухмерных (2D) субстратах, таких как полистирол культуры тканей (TCPS). Однако характерные изменения клеток PDL наблюдались во время культуры in vitro6. Это явление, вероятно, потому, что 2D TCPS отличается от in vivo трехмерной (3D) микросреды7. По сравнению с клетками, культивируемыми на 2D субстратах, клетки, выращенные в 3D микроокружении, обладают большим сходством с клетками in vivo8. Таким образом, модели культуры 3D-клеток являются перспективной альтернативой традиционной 2D монослойной клеточной культуре.
Обычный метод 3D-культуры инкапсулирует клетки в 3D биоматериалах. По сравнению с клетками, инкапсулированными в 3D биоматериалах, клеточные сфероиды более тесно имитируют ситуацию in vivo, потому что сфероиды являются агрегатами клеток, растущих свободными от посторонних материалов9,10,11, 12. Сообщается, что клеточные сфероиды способствовали биоактивности MSC путем сохранения внеклеточных матричных (ECM) компонентов, включая фибронектин и ламинин13. Для улучшения обычных моделей культуры клеток PDL, мы недавно разработали метод культуры 3D PDL, который основан на сфероидном образовании клеток PDL на пленках хитозана14. Сфероидное образование увеличило способность самообновления и остеогенной дифференциации клеток PDL14. Здесь мы представляем подробные протоколы pdL клеточной сфероидной культуры, основанные на фильмах хитозана. 3D-система культуры PDL клеточных сфероидов преодолеть некоторые недостатки, связанные с обычной культурой клеток TCPS, и, таким образом, может быть пригодным для производства клеток PDL с повышенной терапевтической эффективностью для будущего регенерации тканей пародонта.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол исследования был одобрен Комитетом по этике школы и больницы стоматологии Университета Тонджи. Все пациенты предоставили письменное информированное согласие.
1. Изоляция клеток PDL
- Сделайте средство распространения для культуры клеток PDL: среда q-MEM дополнена 10% FCS и 100 U/mL пером/strep.
- Подготовьте контейнер со льдом для передачи изолированных третьих моляров.
- Стерилизовать хирургические инструменты с помощью автоклава.
- Извлекайте нормальные людские повлиянные на третьи molars от взрослых (18-28 лет) на зубоврачебной клинике школы и стационара Stomatology, Университет Tongji.
- Поместите третьи моляры в среду распространения и перенесите в лабораторию при 4 градусах Цельсия.
- Поместите извлеченный зуб в стерильное 100 мм чашку Петри, работая в биоопасный ламинарный капот потока.
- Добавьте 10 мл PBS для мытья извлеченного зуба. Повторите шаг стирки дважды.
- С помощью стерильного скальпеля аккуратно отделите PDL от корня.
ПРИМЕЧАНИЕ: PDL следует выцарапать из средней третьей части корня, чтобы избежать загрязнения от деснных или акических тканей. - Фарш PDL на 1-2-мм фрагменты с помощью стерилизованного лезвия скальпеля.
- Поместите фрагменты PDL в культурную колбу Т-25, наполненную 3-4 мл среды распространения.
- Культура образцов в инкубаторе при 37 градусах Цельсия в 5% CO2 с увлажненным воздухом.
- Изменение среды культуры после нарастания PDL клеток наблюдается. Это обычно занимает 1-2 недели для роста PDL клеток. Наблюдайте за ростом клеток PDL с помощью обратного фазового контрастного микроскопа.
- Изменяйте среду культуры два раза в неделю после этого.
- Когда клетки PDL достигли слияния, субкультурные клетки в соотношении 1:4 (проход 1).
- Наблюдайте рост клеток ежедневно и меняйте среду культуры два раза в неделю.
- Выполните каждый последующий проход в соотношении 1:4 после достижения клеток 80% слияния. Используйте клетки PDL от третьего до пятого поколения для посева клеток.
2. Подготовка хитозанов
- Для приготовления раствора уксусной кислоты 1% (v/v) добавьте 5 мл уксусной кислоты до 495 мл двойной дистиллированной воды в чистый стеклянный стакан.
- Для приготовления раствора 1% w/v хитозана, взвесьте 5 г порошка хитозана (средний молекулярный вес 400 кДа, 85% степени ацетилирования) и добавьте к 495 мл 1% (v/v) раствор уксусной кислоты.
- Перемешать готовый раствор в течение 24 часов с перемешиванием бар и магнитной помешивая пластины при 60 градусах Цельсия.
- Автоклав подготовленное решение для обеспечения полного растворения хитозана.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент может быть приостановлен на этом этапе. - Для формирования хитозановых пленок добавьте 1% раствор хитозана в полистирол культуры тканей(TCPS) на 0,25 мл/см 2. Например, добавьте 0,5 мл 1% w/v хитозана раствор атакжем 24-ну.
- Сухие tCPS блюда в духовке при температуре 60 градусов по Цельсию в течение 24 часов, чтобы сформировать пленки хитозана.
- Подготовка 0,5 N гидроксида натрия (NaOH). Перемешать 10 г NaOH, немного за один раз, в большой объем двойной дистиллированной воды с помощью магнитного перемешать бар, а затем разбавить раствор, чтобы сделать 0,5 л.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавить NaOH к воде - не добавляйте воду в твердых NaOH. Не трогайте NaOH! Это может вызвать химические ожоги. - Нейтрализовать пленки хитозана с 0,5 N NaOH. Добавьте 0,5 мл 0,5 N NaOH раствор атакжем 24-хорошо пластины в течение 2 часов.
- Вымойте хитозан пленки три раза с двойной дистиллированной воды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент может быть приостановлен на этом этапе. - Перед посевом клеток, стерилизовать хитозан покрытием 24-колодцы пластины в 70% алкоголя на ночь при комнатной температуре.
- Промыть хитозан покрытием пластин ы три раза с PBS при комнатной температуре.
- Стерилизовать плиты с покрытием хитозана путем обработки под ультрафиолетовым светом на ночь при комнатной температуре.
3. Посев ячейки
- Предварительно теплое средство распространения среднего решения PBS и трипсин /EDTA решение до 37 градусов по Цельсию.
- Откажитесь от супернатанта из колбы т-75.
- Вымойте сопливые PDL-клетки раствором PBS.
- Откажитесь от решения PBS.
- Добавьте 1 мл раствора трипсина/ЭДТА в колбу т-75.
- Инкубировать клетки с раствором трипсина/ЭДТА в течение 3 мин при 37 градусах Цельсия.
- Прекратите процесс пищеварения трипсина, добавив 3 мл пролиферации среднего к Т-75 клеточной культуры колбы.
- Перенесите подготовленную подвеску ячейки в коническую центрифугу мощностью 15 мл.
- Centrifuge подвески в течение 5 мин при 300 х г и комнатной температуры.
- Откажитесь от супернатанта из конической центрифуги 15 мл и повторно приостановите действие клеточной гранулы в 500 л среды распространения.
- Подсчитайте клетки PDL гемоситометром.
- Клетки семян PDL при плотности 0,5х 10 4, 1 х 104,3 x 104и 6 x 104 клетки/см2.
- Культура PDL клеток на пленках хитозана в инкубаторе при 37 градусах По Цельсию в 5% CO2 с увлажненным воздухом.
- Изменяйте среду культуры два раза в неделю после этого.
- В дни 1, 2, 3, 4 и 5, наблюдать морфологию клеток ежедневно через обратный контрастный микроскоп фазы.
4. Выживание клеток
- После 1, 3 и 6 дней культуры, определить выживание клеток с помощью коммерческой жизнеспособности / цитотоксичности комплект.
- В трубке 15 мл приготовьте 2 мл свежего раствора 2 мМ кальцийн-АМ и 4 мМ имхидийного омодимера в PBS путем вихря на 5 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Держите процесс в темноте. - Удалите среду культуры и мыть сфероиды в PBS.
- Инкубировать сфероиды в PBS, содержащий 2 мМ кальцийн-АМ и 4 мМ эфидий гомогимер в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте.
- Промыть сфероиды дважды в PBS. Для сфероидов из одной скважины из 24-колодца, используйте 2 мл PBS для каждого времени.
- Наблюдайте за образцами с помощью флуоресцентного микроскопа с помощью 10x или 20x увеличения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
С помощью настоящего протокола успешно сформировались жизнеспособные сфероиды PDL-клеток. Рисунок 1 показал, что подвесные клетки или сфероиды вместо прикрепленных клеток в основном наблюдались на пленках хитозана. Для плотности посева 0,5 х 104 клетки / см2, прилагается PDL клетки иногда встречаются на день 1 и 3, и PDL клеточных сфероиредко редко наблюдались. Напротив, для плотности посева 3 х 104 и 6 х 104 клетки/см2, различные размеры PDL клеточных сфероидов были найдены с первого дня. Образование сфероидов клеток PDL наблюдалось из всех плотностей посева через 3 дня. Как показано на рисунке 1, 3 х 104 клетки / см2 была оптимальной плотностью PDL клеток посева, потому что размер PDL клеток сферои были однородными в этой плотности посева клеток. После 5 дней культуры, большие сфероиды были сформированы для всех плотностей посева клеток. Подвесные клетки PDL редко обнаруживались на 5-й день.
Жизнеспособность клеток PDL в сфероидах оценивалась через 1, 3 и 6 дней. Как показано на рисунке 2, большинство клеток в сфероидах были живыми клетками на 1, 3 и 6 день. В то время как на 6-й день, количество мертвых клеток было увеличено в центральной части.
Рисунок 1. Морфология PDL клеточных сфероидов.
Для плотности посева 0,5 х 104 клетки/см2, PDL клеточные сфероиды редко наблюдались в день 1 и 3. Для посева плотности 3 х 104 и 6 х 104 клетки/см2, различные размеры PDL клеточных сфероидов были найдены с первого дня. Образование сфероидов клеток PDL наблюдалось из всех плотностей посева через 3 дня. После 5 дней культуры, большие сфероиды были сформированы для всех плотностей посева клеток. Подвесные клетки PDL редко обнаруживались на 5-й день. Шкала бар: 200 мкм. Эта цифра была изменена с Yan et al.14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2. Жизнеспособность PDL клеточных сфероидов на хитозан пленки.
Жизнеспособность клеток PDL в сфероидах оценивалась через 1, 3 и 6 дней. Как показано здесь, большинство клеток в сфероидах были живыми клетками на 1, 3 и 6 день. В то время как на 6-й день, количество мертвых клеток было увеличено в центральной части. Шкала баров: 200 мкм. Эта цифра была изменена с Yan et al.14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Настоящее исследование ввело систему 3D-культуры клеток для преодоления некоторых ограничений, связанных с обычной 2D монослойной клеточной культурой. Согласно протоколу, клеточные сфероиды PDL успешно формировались культивированием клеток на хитозановых пленках. Наше предыдущее исследование сообщило, что образование сфероидов увеличило способность самообновления и остеогенной дифференциации клеток PDL14. Вместо того, чтобы использовать фермент для сбора клеток из TCPS, PDL клеток сфероимогут быть собраны из хитозана пленки просто pipetting среды несколько раз14. Таким образом, ECM и межклеточные соединения могут хорошо сохранились.
Критические шаги этого протокола включают: (1) обеспечение стерилизации хирургических инструментов и хитозанов для клеточной культуры; (2) выскабливание PDL из средней третьей части корня, чтобы избежать загрязнения от деснных или акических тканей; и (3) требует более высокой плотности посева клеток (3 х 104 клетки/см2)для успешного образования сфероидов клеток PDL.
Однако, одним из ограничений для этого метода является то, что снижение пролиферации клеток PDL наблюдалось после образования сфероидов14, который похож на некоторые предыдущие исследования, которые проводились на жировой стромальных клеток10 и гепатоцеллюлярной карциномы клеточной линии15. Это, вероятно, вызвано разницей в регуляции циклин-зависимых ингибиторов киназы между сфероидными и монослойными клетками16. Для получения пользы от клинического применения необходимы дальнейшие исследования для содействия пролиферации клеточных сфероидов.
Еще одним недостатком клеточного сфероида является неадекватная диффузия в ядре. Хотя клетки PDL были в основном живы в сфероидной культуре, количество мертвых клеток было увеличено в центральной части сфероидов на 6-й день. Это явление было, вероятно, потому, что диффузия кислорода и питательных веществ скомпрометирована в сфероидное ядро, как PDL клеток сфероидов становятся больше17,18.
Другие методы, которые сообщили, чтобы вызвать клеточные сфероиды включают неприсоединения поверхности19, microwells20, спиннер колбы21, микропаттернированные поверхности22,23, висячие капли24, и техника принудительной агрегации25. По сравнению с вышеупомянутыми методами, пленки хитозана являются относительно экономично эффективными и легко размножаются. Еще одним преимуществом этого метода являются противомикробные свойства хитозана26,что значительно полезно для культуры клеток in vitro.
Таким образом, здесь мы представляем подробные 3D-клеточные сфероидные протоколы культуры на основе фильмов хитозана. Культура PDL клеточных сфероидов преодолеть некоторые ограничения, связанные с обычной 2D TCPS клеточной культуры, и, таким образом, может быть пригодным для производства PDL клеток с повышенной терапевтической эффективностью для будущего регенерации ткани пародонта.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было организовано Национальным фондом естественных наук Китая (NSFC 81700978), Фундаментальными исследовательскими фондами для центральных университетов (1504219050), Фондом естественных наук Шанхая (17'14432800) и Шанхайским проектом медицинских исследований ( 17411972600).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| α-MEM | Gibco | 11900-073 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 64197 | |
| Cell culture flask 25 cm2 | Corning | 430639 | |
| Cell culture flask 75 cm2 | Corning | 430641 | |
| Chitosan | Heppe Medical Chitosan GmbH | / | molecular weight 500 kDa, degree of deacetylation 85% |
| FCS | Gibco | 26140-079 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Molecular Probes | L3224 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 1310732 | |
| PBS | KeyGen Biotech | KGB5001 | |
| pen/strep | Gibco | 15140-122 | |
| Trypsin/EDTA | KeyGen Biotech | KGM25200 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 430790 | |
| 24-well plate | Corning | 3524 |
References
- Albandar, J. M. Epidemiology and risk factors of periodontal diseases. Dental Clinics of North America. 49 (3), 517-532 (2005).
- Bartold, P. M., McCulloch, C. A., Narayanan, A. S., Pitaru, S. Tissue engineering: a new paradigm for periodontal regeneration based on molecular and cell biology. Periodontology 2000. 24, 253-269 (2000).
- Chen, F. M., Jin, Y. Periodontal tissue engineering and regeneration: current approaches and expanding opportunities. Tissue Engineering Part B Review. 16 (2), 219-255 (2010).
- Yu, N., et al. Enhanced periodontal tissue regeneration by periodontal cell implantation. Journal of Clinical Periodontology. 40 (7), 698-706 (2013).
- Yan, X. Z., Yang, F., Jansen, J. A., de Vries, R. B., van den Beucken, J. J. Cell-Based Approaches in Periodontal Regeneration: A Systematic Review and Meta-Analysis of Periodontal Defect Models in Animal Experimental Work. Tissue Engineering Part B Review. 21 (5), 411-426 (2015).
- Itaya, T., et al. Characteristic changes of periodontal ligament-derived cells during passage. Journal of Periodontal Research. 44 (4), 425-433 (2009).
- Zhang, J., Li, B., Wang, J. H. The role of engineered tendon matrix in the stemness of tendon stem cells in vitro and the promotion of tendon-like tissue formation in vivo. Biomaterials. 32 (29), 6972-6981 (2011).
- Elliott, N. T., Yuan, F. A review of three-dimensional in vitro tissue models for drug discovery and transport studies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (1), 59-74 (2011).
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
- Yeh, Y. C., et al. Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model. Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).
- Kabiri, M., et al. 3D mesenchymal stem/stromal cell osteogenesis and autocrine signalling. Biochemical and Biophysical Research Communications. 419 (2), 142-147 (2012).
- Lee, J. H., Han, Y. S., Lee, S. H. Long-Duration Three-Dimensional Spheroid Culture Promotes Angiogenic. Activities of Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells. Biomolecules & therapeutics. 24 (3), 260-267 (2016).
- Yan, X. Z., van den Beucken, J., Yuan, C., Jansen, J. A., Yang, F. Spheroid formation and stemness preservation of human periodontal ligament cells on chitosan films. Oral Diseases. 24 (6), 1083-1092 (2018).
- Meli, L., Jordan, E. T., Clark, D. S., Linhardt, R. J., Dordick, J. S. Influence of a three-dimensional, microarray environment on human Cell culture in drug screening systems. Biomaterials. , (2012).
- LaRue, K. E., Khalil, M., Freyer, J. P. Microenvironmental regulation of proliferation in multicellular spheroids is mediated through differential expression of cyclin-dependent kinase inhibitors. Cancer Research. 64 (5), 1621-1631 (2004).
- Tsai, A. C., Liu, Y., Yuan, X., Ma, T. Compaction, fusion, and functional activation of three-dimensional human mesenchymal stem cell aggregate. Tissue Engineering Part A. 21 (9-10), 1705-1719 (2015).
- Cesarz, Z., Tamama, K. Spheroid Culture of Mesenchymal Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 9176357 (2016).
- Tong, J. Z., Sarrazin, S., Cassio, D., Gauthier, F., Alvarez, F. Application of spheroid culture to human hepatocytes and maintenance of their differentiation. Biology of the Cell. 81 (1), 77-81 (1994).
- Lee, W. Y., et al. The use of injectable spherically symmetric cell aggregates self-assembled in a thermo-responsive hydrogel for enhanced cell transplantation. Biomaterials. 30 (29), 5505-5513 (2009).
- Frith, J. E., Thomson, B., Genever, P. G. Dynamic three-dimensional culture methods enhance mesenchymal stem cell properties and increase therapeutic potential. Tissue Engineering Part C Methods. 16 (4), 735-749 (2010).
- Wang, W., et al. 3D spheroid culture system on micropatterned substrates for improved differentiation efficiency of multipotent mesenchymal stem cells. Biomaterials. 30 (14), 2705-2715 (2009).
- Miyagawa, Y., et al. A microfabricated scaffold induces the spheroid formation of human bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells and promotes efficient adipogenic differentiation. Tissue Engineering Part A. 17 (3-4), 513-521 (2011).
- Bartosh, T. J., et al. Aggregation of human mesenchymal stromal cells (MSCs) into 3D spheroids enhances their antiinflammatory properties. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (31), 13724-13729 (2010).
- Baraniak, P. R., McDevitt, T. C. Scaffold-free culture of mesenchymal stem cell spheroids in suspension preserves multilineage potential. Cell and Tissue Research. 347 (3), 701-711 (2012).
- Rabea, E. I., Badawy, M. E., Stevens, C. V., Smagghe, G., Steurbaut, W. Chitosan as antimicrobial agent: applications and mode of action. Biomacromolecules. 4 (6), 1457-1465 (2003).
