Summary
Aquí, presentamos protocolos de cultivo de esferoides celulares del ligamento periodontal humano (PDL) por películas de quitosano. El cultivo de esferoides celulares tridimensionales (3D) proporciona una alternativa al sistema de cultivo de poliestireno (TCPS) de cultivo tisular convencional.
Abstract
Las células del ligamento periodontal (PDL) son muy prometedoras para la regeneración del tejido periodontal. Convencionalmente, las células PDL se cultivan en sustratos bidimensionales (2D), como el poliestireno de cultivo tisular (TCPS). Sin embargo, se han observado cambios característicos de las células PDL durante el cultivo in vitro. Este fenómeno se debe probablemente a que el TCPS 2D difiere del microambiente tridimensional in vivo (3D). En comparación con las células cultivadas en sustratos 2D, las células cultivadas en un microambiente 3D presentan más similitudes con las células in vivo. Por lo tanto, los modelos de cultivo de celdas 3D proporcionan una alternativa prometedora para el cultivo de células monocapa 2D convencional. Para mejorar los modelos convencionales de cultivo celular PDL, recientemente hemos desarrollado un método de cultivo celular 3D, que se basa en la formación de esferoides de células PDL en películas de quitosana. Aquí, presentamos protocolos detallados de cultivo de esferoides celulares basados en películas de quitosano. El sistema de cultivo 3D de esferoides celulares PDL supera algunas de las limitaciones relacionadas con el cultivo celular monocapa 2D convencional, y por lo tanto puede ser adecuado para la producción de células PDL con una eficacia terapéutica mejorada para la regeneración futura del tejido periodontal.
Introduction
La periodontitis, inicializada principalmente por placa dental1, se caracteriza por el daño de los tejidos periodontales incluyendo el ligamento periodontal (PDL), hueso alveolar, y cemento. Los tratamientos actuales para la periodontitis suelen tener éxito en la prevención del progreso de la enfermedad activa, pero la regeneración de los tejidos periodontales perdidos sigue siendo un desafío clínico. Recientemente, se han realizado importantes progresos en los enfoques basados en células para la regeneración del tejido periodontal para superar los inconvenientes de los tratamientos actuales2,3,4.
Nuestra revisión sistemática anterior reveló que las células PDL mostraron un gran potencial para la regeneración periodontal5. Convencionalmente, las células PDL se cultivan en sustratos bidimensionales (2D), como el poliestireno de cultivo tisular (TCPS). Sin embargo, se han observado cambios característicos de las células PDL durante el cultivo in vitro6. Este fenómeno se debe probablemente a que el TCPS 2D difiere del microambiente tridimensional in vivo (3D)7. En comparación con las células cultivadas en sustratos 2D, las células cultivadas en un microambiente 3D presentan más similitudes con las células in vivo8. Por lo tanto, los modelos de cultivo de celdas 3D proporcionan una alternativa prometedora para el cultivo de células monocapa 2D convencional.
El método de cultivo 3D convencional es encapsular células en biomateriales 3D. En comparación con las células encapsuladas en biomateriales 3D, los esferoides celulares imitan más de cerca la situación in vivo porque los esferoides son agregados de células que crecen libres de materiales extraños9,10,11, 12. Se informa que los esferoides celulares promovieron las bioactividades de MSC a través de la preservación de componentes de matriz extracelular (ECM), incluyendo fibronectina y laminina13. Para mejorar los modelos convencionales de cultivo celular PDL, recientemente hemos desarrollado un método de cultivo celular PDL 3D, que se basa en la formación de esferoides de células PDL en películas de quitosana14. La formación de esferoides aumentó la auto-renovación y las capacidades de diferenciación osteogénica de las células PDL14. Aquí, presentamos protocolos detallados de cultivo de esferoides de células PDL basados en películas de quitosano. El sistema de cultivo 3D de esferoides celulares PDL supera algunas de las deficiencias relacionadas con el cultivo celular TCPS convencional, y por lo tanto puede ser adecuado para la producción de células PDL con una eficacia terapéutica mejorada para la regeneración futura del tejido periodontal.
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Protocol
El protocolo de estudio fue aprobado por el Comité de ética de la escuela y el hospital de estomatología, Universidad Tongji. Todos los pacientes proporcionaron consentimiento informado por escrito.
1. Aislamiento de células PDL
- Haga medio de proliferación para el cultivo de células PDL: medio MEM complementado con 10% FCS y 100 U/ml pluma/estreptococo.
- Preparar un recipiente con hielo para transferir terceros molares aislados.
- Esterilice los instrumentos quirúrgicos utilizando un autoclave.
- Extraer terceros molares normales afectados por el ser humano de adultos (18-28 años de edad) en la Clínica Dental de La Escuela y Hospital de Estomatología, Universidad de Tongji.
- Colocar los terceros molares en el medio de proliferación y pasar al laboratorio a 4oC.
- Coloque el diente extraído en una placa estéril de 100 mm Petri, trabajando dentro de una campana de flujo laminar de riesgo biológico.
- Agregue 10 ml de PBS para lavar el diente extraído. Repita el paso de lavado dos veces.
- Mediante el uso de un bisturí estéril, separe suavemente la PDL de la raíz.
NOTA: La PDL se debe raspar de la tercera parte media de la raíz para evitar la contaminación de los tejidos gingivales o apicales. - Mince PDL en fragmentos de 1-2 mm con la ayuda de una cuchilla de bisturí esterilizado.
- Colocar fragmentos de PDL en un matraz de cultivo T-25, lleno de 3-4 ml de medio de proliferación.
- Cultivar las muestras en una incubadora a 37oC en 5%CO2 con aire humidificado.
- Cambiar el medio de cultivo después de que se observó el crecimiento de las células PDL. Por lo general, toma 1-2 semanas para el crecimiento de las células PDL. Observe el crecimiento de las células PDL a través de un microscopio de contraste de fase inversa.
- Cambiar el medio de cultivo dos veces por semana a partir de entonces.
- Cuando las células PDL han alcanzado la confluencia, las células de subcultivo en una proporción de 1:4 (pasaje 1).
- Observe el crecimiento celular diariamente y cambie el medio de cultivo dos veces por semana.
- Realice cada pasaje posterior con una relación de 1:4 después de que las células alcancen un 80% de confluencia. Utilice células PDL de tercera a quinta generación para la sembración celular.
2. Preparación de películas de quitosano
- Para la preparación de una solución de ácido acético al 1% (v/v), añadir 5 ml de ácido acético a 495 ml de agua de doble destilación en un vaso de precipitados de vidrio limpio.
- Para la preparación de 1% p/v solución de quitosan, pesar 5 g de polvo de quitosano (peso molecular medio 400 kDa, 85% grado de acetilación) y añadir a 495 ml de 1% (v/v) solución de ácido acético.
- Revuelva la solución preparada durante 24 horas con la barra de agitación y la placa de agitación magnética a 60 oC.
- Autoclave la solución preparada para asegurar la disolución completa del quitosano.
NOTA: El experimento se puede pausar en esta etapa. - Para formar películas de quitosano, añada un 1% de solución cincasía con v en los platos de poliestireno (TCPS) de cultivo tisular a 0,25 ml/cm2. Por ejemplo, agregue 0,5 ml de solución de quitosan a un pozo de 24 –bien.
- Platos TCPS secos en un horno a 60oC durante 24 horas para formar películas de quitosano.
- Preparar hidróxido de sodio de 0,5 N (NaOH). Revuelva 10 g de NaOH, poco a poco, en un gran volumen de agua destilada dos veces utilizando la barra de agitación magnética, y luego diluya la solución para hacer 0.5 L.
NOTA: Agregue NaOH al agua--no agregue agua al NaOH sólido. ¡No toqueN a NaOH! Podría causar quemaduras químicas. - Neutraliza las películas de quitosan con 0.5 NaOH. Añadir 0,5 ml de solución NaOH de 0,5 N a un pozo de placa de 24 pocillos durante 2 horas.
- Lave las películas de quitosano tres veces con agua destilada doble.
NOTA: El experimento se puede pausar en esta etapa. - Antes de la sembración celular, esterilizar las placas de 24 pocillos recubiertas de quitosano en 70% de alcohol durante la noche a temperatura ambiente.
- Enjuague las placas recubiertas de quitosano tres veces con PBS a temperatura ambiente.
- Esterilice las placas recubiertas de quitosano mediante el tratamiento bajo luz ultravioleta durante la noche a temperatura ambiente.
3. Sembrado celular
- Pre-caliente proliferación medio de solución PBS y solución trypsin/EDTA a 37 oC.
- Deseche el sobrenadante del matraz de cultivo celular T-75.
- Lave las células PDL confluentes con 10 ml de solución de PBS.
- Deseche la solución PBS.
- Añadir 1 ml de solución de trippsina/EDTA al matraz de cultivo celular T-75.
- Incubar células con solución de tripsina/EDTA durante 3 min a 37 oC.
- Terminar el proceso de digestión de la tripsina añadiendo 3 ml de medio de proliferación al matraz de cultivo celular T-75.
- Transfiera la suspensión de celda preparada a un tubo centrífugo cónico de 15 ml.
- Centrifugar la suspensión durante 5 min a 300 x g y a temperatura ambiente.
- Deseche el sobrenadante del tubo centrífugo cónico de 15 ml y vuelva a suspender el pellet celular en 500 ml de medio de proliferación.
- Cuente las células PDL con un hemocaquímetro.
- Células PDL semillas a las densidades de 0,5 x 104, 1 x 104, 3 x 104y 6 x 104 celdas/cm2.
- Cultivo de células PDL en películas de quitosan en una incubadora a 37oC en 5% CO2 con aire humidificado.
- Cambiar el medio de cultivo dos veces por semana a partir de entonces.
- En los días 1, 2, 3, 4 y 5, observe la morfología celular diariamente a través de un microscopio de contraste de fase inversa.
4. Supervivencia celular
- Después de 1, 3 y 6 días de cultivo, determinar la supervivencia de las células utilizando un kit de viabilidad comercial/citotoxicidad.
- En un tubo de 15 ml, preparar 2 ml de una solución fresca de 2 mM de calceína-AM y 4 mM de homodimer de etidio en PBS por vórtice durante 5 s.
NOTA: Mantenga el proceso en la oscuridad. - Retire el medio de cultivo y lave los esferoides en PBS.
- Incubar esferoides en PBS que contienen 2 mM de calceína-AM y 4 mM de etidio homodímero durante 30 min a temperatura ambiente en la oscuridad.
- Enjuague los esferoides dos veces en PBS. Para esferoides de un pozo de placa de 24 pocillos, utilice 2 ml de PBS para cada vez.
- Observe las muestras utilizando un microscopio de fluorescencia utilizando un aumento de 10x o 20x.
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Representative Results
Usando el protocolo actual, se formaron con éxito esferoides de células PDL viables. La Figura 1 mostró que las células suspendidas o esferoides en lugar de las células adheridas se observaron principalmente en películas de quitosano. Para la densidad de sembrado de 0,5 x 104 células/cm2,las células PDL conectadas se encontraron ocasionalmente en los días 1 y 3, y rara vez se observaron esferoides de células PDL. Por el contrario, para las densidades de sembrado de 3 x 104 y 6 x 104 células/cm2,se encontraron varios tamaños de esferoides de células PDL desde el día 1. Se observó la formación de esferoides de células PDL a partir de todas las densidades de sembración después de 3 días. Como se muestra en la Figura1, 3 x 104 células/cm2 fue la densidad óptima de sembración de células PDL porque el tamaño de los esferoides de células PDL era homogéneo en esta densidad de sembración celular. Después de 5 días de cultivo, se formaron esferoides más grandes para todas las densidades de semilla celular. Las células PDL suspendidas rara vez se encontraron en el día 5.
La viabilidad de las células PDL en esferoides se evaluó después de 1, 3 y 6 días. Como se muestra en la Figura 2, la mayoría de las células de los esferoides eran células vivas en los días 1, 3 y 6. Mientras que en el día 6, el número de células muertas se incrementó en la parte central.
Figura 1. La morfología de los esferoides celulares PDL.
Para la densidad de sembración de 0,5 x 104 células/cm2,rara vez se observaron esferoides de células PDL en los días 1 y 3. Para las densidades de sembrado de 3 x 104 y 6 x 104 células/cm2,se encontraron varios tamaños de esferoides de células PDL desde el día 1. Se observó la formación de esferoides de células PDL a partir de todas las densidades de sembración después de 3 días. Después de 5 días de cultivo, se formaron esferoides más grandes para todas las densidades de semilla celular. Las células PDL suspendidas rara vez se encontraron en el día 5. Barra de escala: 200 m. Esta cifra ha sido modificada de Yan et al.14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. La viabilidad de los esferoides celulares PDL en películas de quitosano.
La viabilidad de las células PDL en esferoides se evaluó después de 1, 3 y 6 días. Como se muestra aquí, la mayoría de las células de los esferoides eran células vivas en los días 1, 3 y 6. Mientras que en el día 6, el número de células muertas se incrementó en la parte central. Barras de escala: 200 m. Esta cifra ha sido modificada de Yan et al.14. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El presente estudio introdujo un sistema de cultivo celular 3D para superar algunas limitaciones relacionadas con el cultivo celular monocapa 2D convencional. Según el protocolo, los esferoides celulares PDL se formaron con éxito mediante el cultivo de células en películas de quitosana. Nuestro estudio anterior informó que la formación de esferoides aumentó las capacidades de auto-renovación y diferenciación osteogénica de las células PDL14. En lugar de utilizar una enzima para cosechar células de TCPS, los esferoides de células PDL podrían ser cosechados de películas de quitosano simplemente pipeteando el medio unas cuantas veces14. Por lo tanto, eCM y uniones intercelulares pueden ser bien conservados.
Los pasos críticos de este protocolo incluyen: (1) asegurarse de que los instrumentos quirúrgicos y las películas de quitosan están esterilizados para el cultivo celular; 2) raspar la PDL de la tercera parte media de la raíz para evitar contaminaciones de tejidos gingivales o apicales; y (3) que requieren densidades de sembración celular más altas (3 x 104 células/cm2)para la formación exitosa de esferoides de células PDL.
Sin embargo, una limitación para este método es que se observó una disminución de la proliferación de células PDL después de la formación de esferoides14, que es similar a algunos estudios previos que se realizaron en células estromales adiposas10 y carcinoma hepatocelular línea celular15. Esto es probablemente causado por la diferencia en la regulación de los inhibidores de la quinasa dependientes de la ciclina entre las células esferoide y monocapa16. Para beneficiar la aplicación clínica, se requieren más estudios para promover la proliferación de esferoides celulares.
Otro inconveniente del esferoide celular es la difusión inadecuada en el núcleo. Aunque las células PDL estaban principalmente vivas en el cultivo de esferoides, el número de células muertas se incrementó en la parte central de los esferoides el día 6. Este fenómeno fue probablemente porque la difusión de oxígeno y nutrientes se ve comprometida en el núcleo esferoide a medida que las esferoides de células PDL se hacen más grandes17,18.
Otros métodos que reportaron inducir esferoides celulares incluyen una superficie no adherente19, micropozos20, frascos spinner21, superficies micropatrónizadas22,23, gotas colgantes24,y un técnica de agregación forzada25. En comparación con los métodos antes mencionados, las películas de quitosano son relativamente rentables y fáciles de reproducir. Otra ventaja de este método es las propiedades antimicrobianas del quitosano26,que es significativamente beneficioso para el cultivo celular in vitro.
En resumen, aquí presentamos protocolos detallados de cultivo de esferoides de células 3D basados en películas de quitosano. El cultivo de esferoides celulares PDL supera algunas de las limitaciones relacionadas con el cultivo celular TCPS 2D convencional, y por lo tanto puede ser adecuado para la producción de células PDL con una eficacia terapéutica mejorada para la regeneración futura del tejido periodontal.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este estudio fue patrocinado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (NSFC 81700978), los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales (1504219050), la Fundación de Ciencias Naturales de Shanghái (17ZR1432800), y el Proyecto de Exploración Médica de Shanghái ( 17411972600).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| α-MEM | Gibco | 11900-073 | |
| acetic acid | Sigma-Aldrich | 64197 | |
| Cell culture flask 25 cm2 | Corning | 430639 | |
| Cell culture flask 75 cm2 | Corning | 430641 | |
| Chitosan | Heppe Medical Chitosan GmbH | / | molecular weight 500 kDa, degree of deacetylation 85% |
| FCS | Gibco | 26140-079 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Molecular Probes | L3224 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 1310732 | |
| PBS | KeyGen Biotech | KGB5001 | |
| pen/strep | Gibco | 15140-122 | |
| Trypsin/EDTA | KeyGen Biotech | KGM25200 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Corning | 430790 | |
| 24-well plate | Corning | 3524 |
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