Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

الكشف عن الانصهار الجيني الأنسيوجيني باستخدام تفاعل سلسلة بوليميراز متعددة المضاعفات متبوعاً بتسلسل الجيل التالي

Published: July 5, 2019 doi: 10.3791/59895
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Pathology, University of Colorado - Anschutz Medical Campus

Summary

تفاصيل هذه المقالة استخدام مجموعة إعداد المكتبة متعددة التفاعلات المتعددة المثبتة على سلسلة من ردود الفعل تليها تسلسل الجيل التالي لتقييم انصهار الجينات الأنكجينية في عينات الورم الصلب السريرية. ويرد وصف لكل من خطوات المقاعد الرطبة وتحليل البيانات.

Abstract

غالباً ما تساهم الانصهارات الجينية في النمط الظاهري الأنسيوجيني للعديد من أنواع السرطان المختلفة. بالإضافة إلى ذلك، فإن وجود بعض الانصهارات في عينات من مرضى السرطان غالبا ما يؤثر بشكل مباشر على التشخيص، والتشخيص، و / أو اختيار العلاج. ونتيجة لذلك، أصبح الكشف الدقيق عن الانصهارات الجينية عنصرا حاسما في الإدارة السريرية للعديد من أنواع الأمراض. وحتى وقت قريب، كان الكشف عن الانصهار الجيني السريري يتم في الغالب من خلال استخدام الاختبارات أحادية الجينات. ومع ذلك، فإن قائمة من الانصهارات الجينية المتنامية مع الأهمية السريرية خلقت الحاجة إلى تقييم حالة الانصهار من الجينات متعددة في وقت واحد. وقد حقق الجيل التالي من الاختبارات المستندة إلى التسلسل (NGS) هذا الطلب من خلال القدرة على تسلسل الحمض النووي بطريقة موازية على نطاق واسع. وهناك نُهُج متعددة قائمة على المنظمات غير الحكومية تستخدم استراتيجيات مختلفة لإثراء الأهداف الجينية متاحة الآن للاستخدام في التشخيص الجزيئي السريري، ولكل منها نقاط القوة والضعف الخاصة بها. توضح هذه المقالة استخدام الترسب المتعدد المترسخ (AMP) القائم على إثراء الهدف وإعداد المكتبة متبوعاً بـ NGS لتقييم انصهار الجينات في عينات الورم الصلب السريرية. AMP هي فريدة من نوعها بين نهج التخصيب القائم على amplicon من حيث أنه يحدد الانصهارات الجينية بغض النظر عن هوية شريك الانصهار. وفيما يلي تفاصيل هذه الخطوات على حد سواء الرطب مقاعد البدلاء وتحليل البيانات التي تضمن الكشف الدقيق عن الانصهار الجينات من العينات السريرية.

Introduction

يمكن أن يحدث دمج اثنين أو أكثر من الجينات في كيان نسخي واحد نتيجة للاختلافات الكروموسومية على نطاق واسع بما في ذلك الحذف، والازدواجية، وعمليات الإدراج، والانحرافات، والتحويل. من خلال التحكم النسخي المتغير و / أو تغيير الخصائص الوظيفية للمنتج الجيني أعرب، يمكن أن تمنح هذه الجينات الانصهار خصائص أوجينيك للخلايا السرطانية1. في كثير من الحالات، ومن المعروف أن الجينات الانصهار بمثابة المحركات الأولية oncogenic عن طريق تفعيل مباشرة الانتشار الخلوي ومسارات البقاء على قيد الحياة.

أصبحت الأهمية السريرية للانصهار الجيني لمرضى السرطان واضحة لأول مرة مع اكتشاف كروموسوم فيلادلفيا وجين الانصهار BCR-ABL1 المقابل في ابيضاض الدم النقوي المزمن (CML)2. تم تطوير مثبطات الجزيء الصغير إيماتينيب ميسيلات لاستهداف هذا الجين الانصهار على وجه التحديد وأظهرت فعالية ملحوظة في BCR-ABL1إيجابية مرضى CML3. كما نجح الاستهداف العلاجي لاندماجات الجينات الأنكجينية في الأورام الصلبة، مع تثبيط الجينات الانصهارية ALK وROS1 في سرطان الرئة غير الصغير الخلايا التي تعمل كأمثلة أولية4،5. في الآونة الأخيرة، تم اعتماد مثبطات NTRK larotrectinib إدارة الأغذية والعقاقير لNTRK1/2/3 الأورام الصلبة الإيجابية الانصهار، بغض النظر عن موقع المرض6. وإلى جانب اختيار العلاج، فإن الكشف عن الانصهار الجيني له أيضاً أدوار في تشخيص الأمراض والتكهن بها. وينتشر هذا بشكل خاص في مختلف أنواع الساركوما والأورام الخبيثة الدموية التي يتم تعريفها تشخيصيا من خلال وجود انصهات محددة و / أو التي وجود الانصهار يعلم مباشرة التكهن7،8 , 9 , 10 سنوات , 11.هذه ليست سوى عدد قليل من الأمثلة على التطبيق السريري للكشف عن الانصهار الجينات لمرضى السرطان.

نظرا للدور الحاسم في صنع القرار السريري، الكشف الدقيق عن الانصهار الجيني من العينات السريرية هو ذو أهمية حيوية. وقد تم تطبيق العديد من التقنيات في المختبرات السريرية للانصهار أو تحليل إعادة ترتيب الكروموسومات بما في ذلك: تقنيات الخلايا الوراثية، والنسخ العكسي تفاعل البوليميراز سلسلة (RT-PCR)، الفلورة في الموقع التهجين (FISH)، الكيمياء المناعية (IHC)، و 5'/3' تحليل عدم التوازن التعبير (من بين أمور أخرى)12،13،14،15. وفي الوقت الحاضر، أدت القائمة الآخذة في الاتساع السريع للانصهار الجيني القابل للتنفيذ في السرطان إلى الحاجة إلى تقييم حالة انصهار جينات متعددة في وقت واحد. وبالتالي، فإن بعض التقنيات التقليدية التي لا يمكن هادىء أو عدد قليل من الجينات في وقت واحد أصبحت نُهجاً غير فعالة، خاصة عندما ننظر إلى أن عينات الورم السريري غالباً ما تكون محدودة جداً وغير قابلة للتقسيم بين عدة تجارب. ومع ذلك، فإن الجيل التالي من التسلسل (NGS) هو منصة تحليل مناسبة تمامًا لاختبار الجينات المتعددة، وقد أصبحت الاختبارات المستندة إلى NGS شائعة في مختبرات التشخيص الجزيئي السريري.

وتختلف الاختبارات المستخدمة حالياً في مجال خدمات الإزالة الوطنية للكشف عن الانصهار/إعادة الترتيب فيما يتعلق بمواد المدخلات المستخدمة، والكيمياء المستخدمة في إعداد المكتبة والإثراء المستهدف، وعدد الجينات التي يتم الاستفسار عنها في إطار الاختبار. يمكن أن تستند اختبارات NGS إلى الحمض النووي الريبي (أو الحمض النووي (أو كليهما) المستخرجة من العينة. على الرغم من أن التحليل القائم على الحمض النووي الريبي يعوقه ميل العينات السريرية إلى احتواء الحمض النووي الريبي المتدهور للغاية، فإنه يتحايل على الحاجة إلى تسلسل الإينترونات الكبيرة والمتكررة في كثير من الأحيان التي هي أهداف لاختبار الانصهار القائم على الحمض النووي ولكن ثبت أن من الصعب على NGS تحليل البيانات16. ويمكن تقسيم استراتيجيات التخصيب المستهدفة لتجارب الـ NGS القائمة على الحمض النووي الريبي إلى حد كبير إلى نهج هجينة للالتقاط أو بوساطة أمبليسون. في حين تم استخدام كلتا الاستراتيجيتين بنجاح للكشف عن الانصهار، كل يحتوي على مزايا أكثر منغيرها 17،18. وعادة ما تؤدي الاختبارات الهجينة للالتقاط إلى مكتبات أكثر تعقيداً وتقلل من التسرب من الأليليك، في حين أن الاختبارات المستندة إلى amplicon تتطلب عموماً مدخلات أقل وتؤدي إلى تسلسل أقل خارج الهدف19. ومع ذلك، ربما يكون الحد الرئيسي من التخصيب التقليدي القائم على amplicon هو الحاجة إلى التمهيديات لجميع شركاء الانصهار المعروفة. وهذا أمر مثير للمشاكل لأن العديد من الجينات الهامة سريرياً معروفة بالصمامات مع عشرات الشركاء المختلفين، وحتى لو سمح التصميم التمهيدي بالكشف عن جميع الشركاء المعروفين، فإن أحداث الانصهار الجديدة ستظل غير مكتشفة. تقنية وصفت مؤخرا تسمى متعددة المضاعفات PCR (أو AMP لفترة قصيرة) يعالج هذا القيد20. في AMP، يتم ربط محول NGS 'نصف وظيفية' إلى أجزاء cDNA المشتقة من RNA الإدخال. يتم تحقيق الإثراء المستهدف عن طريق التضخيم بين التمهيديات الخاصة بالجين والتمهيدي إلى المحول. ونتيجة لذلك، ينبغي الكشف عن جميع عمليات الاندماج في الجينات ذات الأهمية، حتى لو كان هناك شريك جديد للانصهار (انظر الشكل1). توضح هذه المقالة استخدام مجموعة الأورام الصلبة ArcherDx FusionPlex، وهو اختبار يستند إلى NGS يستخدم AMP لإثراء الهدف وإعداد المكتبة، للكشف عن انصهار الجينات الأورام في عينات الورم الصلب (انظر الجدول التكميلي 1 للحصول على قائمة الجينات كاملة). وقد تم التحقق بدقة من بروتوكول مقاعد البدلاء الرطب ة وخطوات تحليل البيانات في مختبر معتمد من قبل تعديلات تحسين المختبرات السريرية (CLIA).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1 - إعداد المكتبة وتسلسلها

  1. اعتبارات التبّعات العامة وخطوات ما قبل التبّل
    1. عادة ما يتكون الفحص من سبع عينات سريرية وتحكم إيجابي واحد (على الرغم من أن عدد العينات لكل تشغيل إعداد المكتبة يمكن تعديله حسب الضرورة). استخدام عنصر تحكم إيجابي يحتوي على ما لا يقل عن العديد من الانصهارات الجينية (أن أهداف اختبار) التي تم تأكيدها من قبل الشركة المصنعة و / أو تم تأكيدها من قبل منهجية متعامدة. يجب إدراج عنصر تحكم غير قالب (NTC) كعينة إضافية في كل اختبار تشغيل، ولكن يتم فقط من خلال توليف cDNA حبلا الثاني ومراقبة الجودة قبل التسلسل (قبل Seq QC؛ لضمان عدم وجود توليف cDNA). استخدام عينة مخفف (10 mM تريس حمض الهيدروكلوريك الحموضة 8.0) لNTC.
    2. إجراء استخراج الأحماض النووية الكلي (TNA) من الأنسجة البارافين المضمنة (FFPE) الثابتة من رسميين.
    3. قياس مكون الحمض النووي الريبي من TNA باستخدام اختبار الفلورومتري.
      ملاحظة: منع تدهور الحمض النووي الريبي في العينات عن طريق الحد من دورات تجميد ذوبان، والحفاظ على حمض نووي المذاب في درجة حرارة منخفضة (كتلة المبردة، والجليد، أو بديل)، ومنع التلوث RNase (ارتداء القفازات، وذلك باستخدام رذاذ تطهير RNase).
  2. فتيلة عشوائية
    ملاحظة: المدخلات المطلوبة للفحص هو 200 نانوغرام RNA (استناداً إلى الكم الفلورومتري من TNA). ويمكن استخدام المدخلات المنخفضة إذا تعذر تحقيق 200 نانوغرام. إذا فشل النموذج بعد التسلسل مراقبة الجودة، تكرار مع مدخلات أعلى قد يؤدي إلى مقاييس مراقبة الجودة مقبولة.
    1. تمييع TNA في 10 mM تريس حمض الهيدروكلوريك الحموضة 8.0 لتحقيق تركيز الحمض النووي الريبي المطلوب. لكل عينة، نقل 20 ميكرولتر من التخفيف إلى أنابيب الشريط الكاشف ة عشوائية (وضعت في كتلة الألومنيوم المبردة مسبقا) ومزيج عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 6−8 مرات. تدور لفترة وجيزة إلى أسفل ونقل حجم كامل إلى لوحة PCR 96 جيدا وختم مع فيلم RT.
    2. إدراج لوحة في كتلة thermocycler، وتغطية مع لوحة ضغط، وغطاء وثيق. الحضانة في 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق (غطاء ساخن).
    3. إزالة لوحة من دراجة حرارية ووضعها على الجليد لمدة 2 دقيقة.
  3. أول توليف cDNA حبلا
    1. نقل حجم كامل من المنتج فتيلة عشوائية في أول أنابيب قطاع الكاشف حبلا (وضعت في كتلة الألومنيوم المبردة مسبقا). امزجه عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 6-8 مرات. تدور لفترة وجيزة إلى أسفل، ونقل حجم كامل إلى لوحة PCR 96 جيدا وختم مع فيلم RT.
    2. إدراج لوحة في كتلة thermocycler، وتغطية مع لوحة ضغط، وغطاء وثيق. تشغيل برنامج thermocycler: 25 درجة مئوية 10 دقيقة، 42 درجة مئوية 30 دقيقة، 80 درجة مئوية 20 دقيقة، 4 درجة مئوية عقد (غطاء ساخن).
  4. الثاني حبلا cDNA التوليف
    1. في مجموعة جديدة من أنابيب قطاع PCR، إنشاء تخفيف 1:10 من المنتج حبلا الأول عن طريق إضافة 1 ميكرولتر من المنتج حبلا الأولى إلى 9 ميكرولتر nuclease المياه الحرة. وضع التخفيف جانبا لاستخدامها في ما قبل Seq مراقبة الجودة.
    2. أضف 21 ميكرو لتر من المياه الخالية من النوكلإلى إلى منتج حبلاً الأول المتبقي. نقل 40 درجة مئوية من المنتج حبلا الأولى والمياه الخالية nuclease إلى أنبوب قطاع الكاشف حبلا الثاني (وضعت في كتلة الألومنيوم المبردة مسبقا). امزجه عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 6-8 مرات. تدور أسفل، ونقل حجم كامل إلى لوحة PCR 96 جيدا وختم مع فيلم RT.
    3. إدراج لوحة في كتلة thermocycler، وتغطية مع لوحة ضغط، وغطاء وثيق. تشغيل برنامج thermocycler: 16 درجة مئوية 60 دقيقة، 75 درجة مئوية 20 دقيقة، 4 درجة مئوية عقد (غطاء ساخنة).
      ملاحظة: هذه نقطة توقف مقبولة. ويمكن تخزين لوحة في -20 درجة مئوية.
  5. قبل Seq QC
    ملاحظة: يُستخدم هذا التصاق مراقبة الجودة في المقام الأول للتحقق من عدم وجود توليف للحمض النووي الريبي من المجلس الوطني الانتقالي. ومع ذلك، قد تكون البيانات أيضاً مفيدة في استكشاف أخطاء الاختبار وإصلاحها. على سبيل المثال، إذا كانت العينة ذات قيمة جيدة لـ مراقبة الجودة قبل Seq ولكن مقاييس اختبار رديئة (انظر أدناه) فقد يكون ذلك مؤشراً على وجود مشكلة في تشغيل الاختبار، مما يستلزم تكرار.
    1. تشغيل كل عينة وNTC في مكررة. وتشمل أيضا في مراقبة الجودة قبل Seq تشغيل رد فعل NTC، وهو nuclease المياه الحرة (أيضا تشغيل في مكررة). إلى كل بئر قابل للتطبيق من لوحة بصرية 96 جيدا إضافة 5 ميكرولتر من المزيج الرئيسي الفحص، 1 μL من 10X VCP التمهيدي، و 4 ميكرولتر من تخفيف 1:10 من المنتج حبلا الأول الذي تم إنشاؤه في الخطوة 1.4.1.
    2. ختم لوحة مع فيلم RT، تدور إلى أسفل، وتحميل في PCR الكمية (qPCR) الصك. تشغيل البرنامج: ما قبل أمبير: 1 دورة 95 درجة مئوية 20 ق، أمبير: 35 دورات 95 درجة مئوية 3 s (4.4 درجة مئوية / ق معدل المنحدر) - 60 درجة مئوية 30 ق (2.2 درجة مئوية / ق معدل المنحدر).
    3. تأكد من عدم وجود قيمة عتبة دورة (Ct) لكل من المجلس الوطني الانتقالي للتحديد ورد الفعل NTC.
      ملاحظة: إذا لم يكن هناك Ct لوحظ في NTC إجراء التسى لن يتم ترحيلها إلى الأمام في التسى. مراقبة قيمة Ct في رد فعل NTC يتطلب تكرار تقييم مراقبة الجودة قبل Seq. تشير مراقبة Ct في فحص NTC إلى تلوث العينة في مرحلة ما قبل إجراء الفحص، مما يتطلب البدء في فحص كامل (جميع العينات). يجب أن تكون قيمة Ct قبل Seq QC لعينة جودة كافية أقل من 30 (انخفاض قيم Ct ترتبط مع المزيد من المنتجات وبالتالي أعلى جودة RNA). القيم فوق 30 ليست مؤشرات مطلقة للفشل وينبغي أن تستمر هذه العينة في النموذج. ومع ذلك، ينبغي استعراض جميع البيانات المستمدة من هذه العينات بعناية، ولا سيما في الحالات التي لا يسمى الانصهار.
  6. نهاية إصلاح وتنقية حبة
    1. نقل 40 درجة مئوية من المنتج حبلا الثاني في نهاية إصلاح أنبوب قطاع الكاشف (وضعت في كتلة الألومنيوم المبردة مسبقا). امزجه بواسطة الأنابيب صعوداً وهبوطاً 6-8 مرات، والدوران لأسفل وإلى كتلة الدراجات الحرارية (إبقاء الغطاء الساخن مفتوحاً) وتشغيل برنامج الدراجات الحرارية: 25 درجة مئوية 30 دقيقة، 4 درجة مئوية.
    2. إزالة حبات تنقية من 4 درجة مئوية والسماح لequilibrate إلى درجة حرارة الغرفة. تشكل ما يكفي من الإيثانول 70٪ لتستمر طوال إعداد المكتبة بأكملها. دوامة الخرز جيدا قبل الاستخدام وpipet 100 € L في العدد المناسب من الآبار من لوحة U-أسفل.
      ملاحظة: لكل 8 عينات التي يتم تشغيلها، سوف تكون هناك حاجة إلى 20 مل من الإيثانول 70٪.
    3. إضافة حجم كامل من المنتج إصلاح نهاية إلى الخرز. يُنقل إلى أعلى وأسفل 6-8 مرات للخلط والحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق، يليه حضانة لمدة 5 دقائق على المغناطيس.
    4. إزالة وتجاهل supernatant وأداء اثنين 200 € L 70٪ يثانول الشهي مع 30 ق الحضانة. بعد الغسل النهائي إزالة جميع الإيثانول 70٪ والسماح للهواء الجاف لمدة 5 دقائق.
    5. إزالة من المغناطيس وإعادة تعليق الخرز في 22 درجة مئوية من 10 mM تريس حمض الهيدروكلوريك 8.0. احتضان قبالة المغناطيس لمدة 3 دقائق تليها حضانة 2 دقيقة على المغناطيس. انتقل على الفور إلى الخطوة 1 الربط.
  7. خطوة الربط 1 وتنقية حبة
    1. نقل 20 درجة مئوية من نهاية إصلاح حبة تنقية لوحة (مع الحرص على عدم إزعاج حبة بيليه) في خطوة ربط 1 أنابيب قطاع (وضعت في كتلة الألومنيوم المبردة مسبقا). امزجه من خلال الأنابيب صعوداً وهبوطاً 6-8 مرات، والدوران لأسفل ونقل وحدة التخزين بأكملها إلى لوحة PCR 96 بئر.
    2. إدراج لوحة في كتلة thermocycler، وتغطي مع لوحة ضغط وغطاء وثيق. تشغيل برنامج thermocycler: 37 درجة مئوية 15 دقيقة، 4 درجة مئوية عقد (غطاء ساخن).
    3. إزالة حبات تنقية من 4 درجة مئوية والسماح لequilibrate إلى درجة حرارة الغرفة. دوامة الخرز جيدا قبل الاستخدام وpipet 50 € L في العدد المناسب من الآبار من لوحة U-أسفل.
    4. إضافة حجم كامل من ربط الخطوة 1 المنتج إلى الخرز. يُنقل إلى أعلى وأسفل 6-8 مرات للخلط والحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق، يليه حضانة لمدة 5 دقائق على المغناطيس.
    5. إزالة وتجاهل supernatant وأداء اثنين 200 € L 70٪ يثانول الشهي مع 30 ق الحضانة. بعد الغسل النهائي إزالة جميع الإيثانول 70٪ والسماح للهواء الجاف لمدة 5 دقائق.
    6. إزالة من المغناطيس وإعادة تعليق الخرز في 42 درجة مئوية من 10 mM تريس حمض الهيدروكلوريك 8.0. احتضان قبالة المغناطيس لمدة 3 دقائق تليها حضانة 2 دقيقة على المغناطيس. انتقل على الفور إلى الخطوة 2 الربط.
  8. خطوة الربط 2 وتنقية حبة
    1. إزالة الباركود الجزيئي (MBC) محول قطاع أنبوب الكواشف من 4 درجة مئوية التخزين. الترقيم الصحيح من قطاع محول MBC مهم للغاية كما يتم إضافة فهارس خاصة بالعين في هذه المرحلة. وضع الأنابيب أفقيا مع المفصلات إلى الخلف واستخدام علامة دائمة لتسمية الأنابيب 1، 2، 3 ... من اليسار إلى اليمين. من الضروري أيضاً تسجيل الفهارس الخاصة بالعينلأغراض التسلسل (يجب إدخالها في ورقة عمل التسلسل).
    2. نقل 40 درجة مئوية من خطوة الربط 1 حبة تنقية لوحة (مع الحرص على عدم إزعاج حبة بيليه) إلى أنابيب قطاع محول MBC (وضعت في كتلة الألومنيوم المبردة مسبقا). امزجه عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 6-8 مرات.
    3. تدور أسفل ونقل حجم كامل إلى ربط الخطوة 2 أنابيب قطاع الكاشف (وضعت أيضا في كتلة الألومنيوم المبردة مسبقا). امزجه من خلال الأنابيب صعودا وهبوطا 6-8 مرات، وتدور إلى أسفل ووضعها في كتلة دراجة حرارية. مع غطاء ساخنة قبالة تشغيل برنامج thermocycler: 22 درجة مئوية 5 دقيقة، 4 درجة مئوية عقد.
      ملاحظة: هذه نقطة توقف آمنة ويمكن تخزين العينات في -20 درجة مئوية.
    4. قم بإزالة حبات تنظيف الربط من سعة تخزين 4 درجات مئوية والسماح بالتحكم في درجة حرارة الغرفة. إعداد 1 مل من هيدروكسيد الصوديوم الطازجة 5 M.
    5. دوامة الخرز تنظيف الربط وإضافة 50 درجة مئوية إلى مجموعة جديدة من أنابيب قطاع PCR. حضانة على المغناطيس لمدة 1 دقيقة. بعد 1 دقيقة الحضانة إزالة وتجاهل supernatant. قم بإزالة أنابيب الشريط من المغناطيس وإعادة تعليق هافي 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتنظيف الربط عن طريق الأنابيب صعوداً وهبوطاً 6-8 مرات.
    6. نقل حجم كامل من المنتج خطوة الربط 2 في أنابيب شريط حبة تنظيف الربط. خلط العينات عن طريق الدوامة والحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. مرة أخرى، مزيج عينات عن طريق الدوامة والحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق أخرى. بعد الحضانة الثانية لمدة 5 دقائق، مزيج العينات عن طريق الدوامة، تدور لفترة وجيزة وحضانة على المغناطيس لمدة 1 دقيقة.
    7. إزالة وتجاهل supernatant. إضافة 200 μL من المخزن المؤقت تنظيف الربط ودوامة لإعادة تعليق. قم بإجراء دورة سريعة ومكان على المغناطيس لمدة دقيقة واحدة.
    8. بعد غسل اثنين مع العازلة تنظيف الربط إجراء غسل متطابقة باستخدام المياه فائقة النقية. بعد غسل المياه فائقة النقاء إعادة تعليق الخرز في 20 درجة مئوية من هيدروكسيد الصوديوم 5 MM ونقل إلى 96 لوحة PCR جيدا. ضع اللوحة في كتلة دراجة حرارية مع وسادة ضغط وتشغيل برنامج الدراجات الحرارية: 75 درجة مئوية 10 دقيقة، 4 درجة مئوية عقد (غطاء ساخن).
    9. تدور أسفل لوحة PCR مرة واحدة قد تبريد العينات إلى 4 درجة مئوية. وضع لوحة على المغناطيس لمدة 3 دقائق على الأقل والمضي قدما على الفور إلى PCR الأولى.
  9. أول PCR وحبة تنقية
    1. قم بإزالة أول أنابيب شريط الكاشف PCR من 4 درجة مئوية التخزين ووضعها في كتلة الألومنيوم المبردة مسبقا. أيضا، إزالة التمهيديات GSP1 من -20 درجة مئوية والسماح لequilibrate إلى درجة حرارة الغرفة.
    2. إضافة 2 μL من التمهيديات GSP1 إلى كل بئر من أنابيب قطاع الكاشف PCR الأولى. نقل 18 ميكرولتر من منتج تنظيف الربط 2 إلى أول أنابيب شريط الكاشف PCR ومزجها عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 6-8 مرات.
    3. تدور إلى أسفل ونقل إلى لوحة PCR 96 جيدا. ضع اللوحة في كتلة دراجة حرارية مع وسادة ضغط وتشغيل برنامج الدراجات الحرارية: 95 درجة مئوية 3 دقيقة، 15 دورات 95 درجة مئوية 30 s - 65 درجة مئوية 5 دقيقة (100٪ معدل المنحدر)، 72 درجة مئوية 3 دقيقة، 4 درجة مئوية عقد (غطاء ساخن).
      ملاحظة: هذه نقطة توقف آمنة ويمكن تخزين العينات في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها أو في -20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
    4. إزالة حبات تنقية من 4 درجة مئوية والسماح لequilibrate إلى درجة حرارة الغرفة. دوامة الخرز جيدا قبل الاستخدام وpipet 24 € L في العدد المناسب من الآبار من لوحة U-أسفل.
    5. نقل 20 درجة مئوية من أول منتج PCR إلى 24 ميكرولتر من الخرز. قم بخلط وحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق، متبوعاً بحضانة لمدة دقيقتين على المغناطيس.
    6. إزالة وتجاهل supernatant وأداء اثنين 200 € L 70٪ يثانول الشهي مع 30 ق الحضانة. بعد الغسل النهائي إزالة جميع الإيثانول 70٪ والسماح للهواء الجاف لمدة 2 دقيقة.
    7. إزالة من المغناطيس وإعادة تعليق الخرز في 24 درجة مئوية من 10 mM تريس حمض الهيدروكلوريك 8.0. احتضان قبالة المغناطيس لمدة 3 دقائق تليها حضانة 2 دقيقة على المغناطيس. انتقل على الفور إلى PCR الثاني.
  10. الثانية PCR وحبة تنقية
    1. قم بإزالة أنابيب شريط الكاشف PCR الثاني من 4 درجة مئوية ووضعها في كتلة الألومنيوم المبردة مسبقا. والترقيم الصحيح لأنابيب شريط PCR الثاني أمر بالغ الأهمية عند إضافة فهارس خاصة بالعينة عند هذه النقطة. وضع الأنابيب أفقيا مع المفصلات إلى الخلف واستخدام علامة دائمة لتسمية الأنابيب 1، 2، 3 ... من اليسار إلى اليمين. أيضا، إزالة التمهيديات GSP2 من -20 درجة مئوية والسماح لequilibrate إلى درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: من الضروري أيضاً تسجيل الفهارس الخاصة بالعينة لأغراض التسلسل (يجب إدخالها في ورقة عمل التسلسل).
    2. إضافة 2 μL من التمهيديات GSP2 إلى كل بئر من أنابيب قطاع الكاشف PCR الثاني. نقل 18 ميكرولتر من أول منتج تنظيف PCR إلى أنابيب شريط الكاشف PCR الثاني ومزجها عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا 6-8 مرات.
    3. تدور إلى أسفل ونقل إلى لوحة PCR 96 جيدا. ضع لوحة في كتلة thermocycler مع لوحة ضغط وتشغيل برنامج thermocycler: 95 درجة مئوية 3 دقيقة، 18 دورات 95 درجة مئوية 30 ق - 65 درجة مئوية 5 دقيقة (100٪ معدل المنحدر)، 72 درجة مئوية 3 دقيقة، 4 درجة مئوية عقد (غطاء ساخن).
      ملاحظة: هذه نقطة توقف آمنة ويمكن تخزين العينات في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها أو في -20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
    4. إزالة حبات تنقية من 4 درجة مئوية والسماح لequilibrate إلى درجة حرارة الغرفة. دوامة الخرز جيدا قبل الاستخدام وpipet 24 € L في العدد المناسب من الآبار من لوحة U-أسفل.
    5. نقل 20 درجة مئوية من المنتج PCR الثاني إلى الخرز. قم بخلط وحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق، متبوعاً بحضانة لمدة دقيقتين على المغناطيس.
    6. إزالة وتجاهل supernatant وأداء اثنين 200 € L 70٪ يثانول الشهي مع 30 ق الحضانة. بعد الغسل النهائي إزالة جميع الإيثانول 70٪ والسماح للهواء الجاف لمدة 2 دقيقة.
    7. إزالة من المغناطيس وإعادة تعليق الخرز في 24 درجة مئوية من 10 mM تريس حمض الهيدروكلوريك 8.0. احتضان قبالة المغناطيس لمدة 3 دقائق تليها حضانة 2 دقيقة على المغناطيس. نقل 20 درجة مئوية من المنتج تنظيف PCR الثاني إلى لوحة PCR 96 جيدا جديدة.
      ملاحظة: هذه نقطة توقف آمنة ويمكن تخزين المكتبات عند -20 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل أو المتابعة فوراً إلى القياس الكمي للمكتبة.
  11. مكتبة الكم
    1. قم بإزالة المزيج الرئيسي للكم في المكتبة والمعايير من -20 درجة مئوية والسماح بالتوازن إلى درجة حرارة الغرفة.
    2. تنفيذ 1:5 تخفيف جميع المكتبات (المنتج PCR الثاني) باستخدام 10 مللي متر تريس حمض الهيدروكلوريك الرقم الهيدروجيني 8.0 تليها تخفيف تسلسلي من 1:199، 1:199، و 20:80 باستخدام 10 مللي متر تريس حمض الهيدروكلوريك الرقم الهيدروجيني 8.0 0.05٪ بوليسوربات. وسيتم تشغيل التميّز النهائيين من 1:200,000 و 1:1,000,000 على التوالي في ثلاثة أضعاف.
    3. إضافة 6 ميكرولتر من المزيج الرئيسي إلى كل بئر من لوحة الآبار البصرية 96 تليها 4 ميكرولتر من التخفيف المناسب أو القياسية. تدور أسفل لوحة وتحميلها على أداة qPCR. استخدام ظروف ركوب الدراجات التالية: 1 دورة 95 درجة مئوية 5 دقيقة، 35 دورات 95 درجة مئوية 30 ق (4.4 درجة مئوية / ث معدل المنحدر) - 60 درجة مئوية 45 ق (2.2 درجة مئوية / ق معدل المنحدر).
    4. بعد اكتمال القياس الكمي للمكتبة وتحديد تركيزات المكتبة (من خلال متوسط كل من التخفيفات المختبرة)، تطبيع جميع المكتبات إلى 2 nM باستخدام 10 mM Tris HCl الحموضة 8.0. جعل تجمع المكتبة عن طريق الجمع بين 10 درجة مئوية من كل مكتبة تطبيع في أنبوب واحد 1.5 مل الطرد المركزي الصغير.
  12. تسلسل المكتبات
    1. قم بإزالة خرطوشة الكاشف المتسلسل من -20 درجة مئوية للتخزين ووضعها في ماء منزوع الأيونات (DI) حتى خط التعبئة لمدة ساعة واحدة على الأقل. أيضا، إزالة مجموعة الكاشف المنظم من 4 درجة مئوية والسماح لequilibrate إلى درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة على الأقل. الحد الأقصى لعدد المكتبات التي يمكن تسلسلها على هذا النظام الأساسي للتسلسل هو 8 (يجب أن يكون أحدها عنصر التحكم الإيجابي).
    2. جعل مكتبة amplicon مشوه (DAL) بركة من خلال الجمع بين 10 درجة مئوية من بركة المكتبة مع 10 ميكرولتر من 0.2 N هيدروكسيد الصوديوم وحضانة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة 5 دقائق إضافة 10 درجة مئوية من 200 mM تريس حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.0، تليها 970 درجة مئوية من HT1 الهجين العازلة.
    3. جعل أنبوب الحمل النهائي عن طريق الجمع بين 300 درجة مئوية من HT1، 25 درجة مئوية من 20 PM PhiX و 675 درجة مئوية من تجمع DAL. دوامة وتدور أسفل أنبوب الحمل. إضافة حجم كامل من أنبوب التحميل إلى عينة جيدا من خرطوشة الكاشف المنظم وخرطوشة تحميل في جهاز التسلسل تشغيل 2 × 151 bp يقرأ مع 2 × 8 يقرأ الفهرس.

2 - تحليل البيانات

  1. تسلسل معالجة البيانات وتحليلها
    1. تحميل مقاييس التسلسل من أداة NGS.
    2. تأكد من أن بيانات التسلسل تقع في النطاقات أدناه (خاصة بالمجموعة المستخدمة في هذا المثال). الكثافة العنقودية (الكثافة[K/mm 2]): 945-1600 K؛ النسبة المئوية لـ "عامل تصفية تمرير القراءات" (كتل PF [%]): >90%; درجات الجودة (٪ ≥ Q30): > 85٪؛ محاذاة PhiX (محاذاة٪): 1.5−6.0%; معدل خطأ PhiX (معدل الخطأ [%]): <1.0%; يقرأ عامل تصفية تمرير (يقرأ PF [M]): >22 مليون.
      ملاحظة: تشغيل التسلسل لا تفي بهذه المقاييس عرضة للتكرار.
    3. مراجعة النسبة المئوية للقراءات المنسوبة إلى كل عينة (أي كل فهرس خاص بالعينة). لتشغيل نموذجي الذي كان ارتفاع في في حوالي 5٪ و 8 عينات تم تسلسلها، يجب أن تمثل كل عينة بشكل مثالي ما يقرب من 11.9٪ من القراءات. النطاق المقبول لكل عينة هو 5-25%. إذا كانت أية عينات لا تناسب ضمن هذا النطاق، كرر كمية المكتبة والتسلسل.
  2. تقديم بيانات التسلسل الخام إلى خوارزمية التحليل
    ملاحظة: يتم وصف الإصدار 4.1.1.7 من تحليل ArcherDx هنا. في هذا المثال، يتم نشر برنامج التحليل كـ "جهاز ظاهري" يعمل على ملقم داخلي. وحدة معالجة مركزية واحدة (CPU) و 12 غيغابايت من ذاكرة الوصول العشوائي (RAM) مطلوبة لكل عينة لتحليلها في وقت واحد (عادة ً ما تتم معالجة 8 عينات في نفس الوقت تتطلب 8 وحدة المعالجة المركزية و 96 غيغابايت من ذاكرة الوصول العشوائي). تستغرق المعالجة عادةً 3-8 ساعة.
    1. استخدم إعدادات التحليل الافتراضية داخل نظام التحليل، باستثناء MIN_AVERAGE_UNIQUE_RNA_START_SITES_PER_GSP2_CONTROLS (يتم تغيير هذا من 10 إلى 20) و READ_DEPTH_NORMALIZATION (يتم تعيين هذا إلى 0 لمنع أخذ العينات لأسفل).
    2. لبدء مهمة تحليل، انقر فوق إجراء تحليل في واجهة المستخدم، ثم قم بإرسال اسم للمهمة، ثم حدد ملفات FASTQ الضرورية (التأكد من تحديد كل من القراءة [R1 و R2] لكل عينة).
    3. حدد RNA Fusion لأنواع تحليل RNA، وIllumina (المقترنة) للمنصة، وFusionPlex لوحة الأورام الصلبة للمنطقة المستهدفة. ثم انقر على إرسال التحليل.
  3. تفسير بيانات التبّل
    1. افتح واجهة المستخدم لنظام التحليل وحدد الوظيفة المطلوبة. حدد نموذج عنصر التحكم الموجب. تأكد من أن جميع عمليات الدمج المتوقعة والأشكال الأيزوفورمية الأنجينية قد تم الكشف عنها ويتم سردها في علامة التبويب أدلة قوية.
      ملاحظة: إذا لم يتم الكشف عن أي من انصهار تعقب في عنصر التحكم الإيجابي لتشغيل معين من اختبار قد يكون مؤشراً على وجود مشكلة في هذا التشغيل الذي يتطلب تكرار (من بداية اختبار).
    2. فحص إحصائيات القراءة لكل عينة سريرية في التشغيل بالنقر فوق علامة التبويب إحصائيات القراءة. وينبغي أن تكون كل عينة ممثلة بما لا يقل عن مليون قطعة من الشظايا الإجمالية. إذا كان أقل من مليون، إعادة تسلسل المكتبة مع اعتبارات لإعادة الكم لضمان الكم الأولي لم يكن مرتفعا بشكل شاذ.
      ملاحظة: سيتم عرض عينات ذات نوعية جيدة بشكل عام على الهدف ٪ > 85٪، وينبغي أن تكون صناديق الجزيئية RNA > 20،000 وتضم > 30٪ من القراءات. ومع ذلك، عدم استيفاء هذه المقاييس لا يؤدي تلقائياً فشل العينة.
    3. فحص متوسط مواقع البدء الفريدة لكل قيمة التحكم GSP2.
      ملاحظة: هذه القيمة هي مقياس لتعقيد التسلسل من التمهيديات إلى أربعة جينات التدبير المنزلي. هذا المقياس هو محدد حاسم لنوعية الحمض النووي الريبي في العينة (إذا كان تسلسل الجينات المتوقع التعبير عنها في العينة ضعيفاً، فإن الثقة في القدرة على الكشف عن اندماج الجينات المعبر عنها منخفضة). قطع لهذا المقياس هو 20. إذا كان أي نموذج يعرض قيمة أقل من 20، ثم يجب الإبلاغ عن نتائج العينة غير مفيدة إذا تم العثور على أي اندماج ثقة عالية. يمكن أيضًا تحديد حالة هذا المقياس في الصفحة الموجزة للتشغيل (سيتم سرد الحالة كـ FUSION QC: Pass أو Fusion QC: عدد مواقع بدء التحكم في نظام الـ RNA GSP2 الفريدة وفقًا للقيمة التي تقل عن 20). لا يزال يمكن الإبلاغ عن اندماج ثقة عالية في عينة لم تمر بمقياس مراقبة الجودة هذا إذا تقرر أنها حقيقية (انظر أدناه). بشكل عام، ترتبط درجات مراقبة الجودة الأعلى باستخدام هذا المقياسبدرجات Ct PreSeq أقل، كما هو متوقع (الشكل 2).
  4. الانصهار تفسير الدعوة
    1. التدقيق بعناية كل ما يسمى الانصهار تحت علامة التبويب أدلة قوية (غالبية الانصهارات أدلة قوية دعا إليها النظام هي artifactual). أيضا مسح سلة الانصهار الأدلة الضعيفة، على الرغم من أن وجود الانصهار غير الأثرية في هذا بن هو حدث نادر للغاية. لتقييم صحة الانصهار، لاحظ أولاً مقاييس القراءة (#/%)
      ملاحظة: بشكل عام، تزيد الثقة في الانصهار يسمى أعلى هذه المقاييس. الانصهارات التي تدعمها أقل من 5 مواقع البداية وأقل من 10٪ من يقرأ من التمهيدي دعم ينبغي أن تعتبر مشبوهة للغاية كما يجري artifactual.
    2. دوّن الرموز المعروضة في العمود عوامل التصفية.
      ملاحظة: العديد من هذه الرموز تنبيه المستخدم مصدر محتمل لمكالمة artifactual. ومن بين هذه الحالات المتكررة (والتي توجد في المقام الأول في سلة الأدلة الضعيفة التي تسمى الانصهارات) الحالات التي يُعرف فيها الشركاء بالمظلات أو يظهرون تشابهاً مع بعضهم البعض في التسلسل (مما يشير إلى احتمال سوء فتيلة أو محاذاة خاطئة). يحدث مصدر شائع آخر لدعوات الانصهار الالأثري عندما تحتوي القراءات التي تدعم الانصهار على معدل خطأ مرتفع يشير إلى ضعف رسم الخرائط إلى الجينوم المرجعي، ويرتبط هذا برمز مميز. يتم تعريف أحداث القراءة النسخي عبر رمز آخر. هذه شائعة ويتم تجاهلها بشكل عام. يتم استخدام العديد من الرموز الأخرى أيضاً في واجهة المستخدم ولكن وصف كامل لكافة خارج نطاق هذه المقالة. وتشمل القطع الأثرية الشائعة التي يمكن تجاهلها عموما دون مزيد من التحقيق: ADCK4-NUMBL، SYN2-PPARG, DGKG-ETV5, ETV6-AXL, ETV1-ERG, ETV4-ETV1, FGFR3-PDGFRB, EGFR-NTRK1, RAF1-RET, ALK-TFEB, NOTCH1-RET, RELA-RET, NTRK3-ALK, BRAF-ADAMTS8, وFCGR2C-MAST.
    3. تصور القراءات الداعمة لكل اندماج محتمل عن طريق النقر على الرابط تصور في واجهة المستخدم، والذي يأخذ المستخدم إلى عرض JBrowse المستندة إلى شبكة الإنترنت من أكوام من قراءات دعم الانصهار الفردية. تأكد من أن القراءات عادة خالية من عدم التطابق (على الرغم من أن بعض الضوضاء من المتوقع)، أن نسبة كبيرة (من الناحية المثالية >30 قواعد) من القراءات محاذاة إلى شريك الانصهار، وأن تسلسل المتاخمة مباشرة إلى نقطة التوقف بين الجينات ومواقع الربط التمهيدي خالية من الإدراج أو الحذف. تأكد من أن تسلسل محاذاة يتضمن جزء 3 'من تسلسل الربط التمهيدي للالتمهيديات التي تدعم يقرأ الانصهار (إذا لم يتم تضمين أجزاء 3 '، يمكن أن يكون مؤشرا على سوء فتيلة).
    4. إذا كانت تسلسلات الترميز لكلا الجينات تشارك في الانصهار، تأكد من أن شريك 3 'لا يزال في الإطار. انقر على رابط الترجمة في الواجهة (والتي سوف تعطي حالة True أو False لكل تركيبة تسلسل مرجعي) وأيضا يدويا تأكيد أن الانصهار هو في الإطار من خلال التفتيش من نقاط التوقف دعا في متصفح الجينوم. يمكن تحديد نقاط التوقف المسماة عن طريق تمرير الماوس فوق النقاط الحمراء في مخطط الانصهار.
      ملاحظة: بما أن معظم (ولكن ليس كل) نقاط التوقف الجينية للانصهات المشروعة تحدث في المناطق الإنتروترولية وتؤدي إلى الربط معا من الطاردات الكاملة، يتم النظر إلى الانصهارات التي تشكل حدود exon نقاط التوقف لكلا الشريكين عموما مع درجة أعلى من الثقة. ومع ذلك، نظراً لأن هناك العديد من الأمثلة المنشورة من نقاط التوقف في منتصف exonic في الانصهارات، وهذا لا ينبغي أن تستخدم كمعايير مطلقة في تفسير الانصهار.
    5. لكل انصهار، يدوياً تأكد من أن التسلسلات المجاورة لنقطة التوقف ليست متجانسة إلى القواعد المتجاورة المتوقعة التالية لكل شريك. فحص جميع الطاردات القريبة المحتملة في متصفح الجينوم.
      ملاحظة: مصدر شائع للانصهار الأثري هو عدم المحاذاة أو سوء فتيلة بسبب homology بين اثنين من شركاء الجينات، وهذا لا يسمى دائما من قبل النظام عبر الرموز الموضحة أعلاه.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يظهر في الشكل 3والشكل 4 والشكل 5 لقطات من واجهة مستخدم التحليل التي تبين النتائج من عينة سرطان الغدة الرئوية. في الشكل 3، يتم عرض ملخص العينة (أعلى) الذي يسرد ما يسمى الانصهارات الأدلة القوية، فضلا عن حالة مراقبة الجودة (دائرة باللون الأحمر). يتم تجاهل الانصهار ADCK4-NUMBL (التي يتم سرد 3 isoforms) على الفور لأنه حدث القراءة النسخي المستمر (لاحظ من قبل رموز الدائرة المكسورة بجانب القوائم). الجزء السفلي من الشكل 3 هو لقطة شاشة من صفحة إحصاءات القراءة. يتم تدوير المقاييس الإعلامية بشكل خاص باللون الأخضر. يتم تمييز مقياس مراقبة الجودة الحرج الذي يحدد طبيعة تمرير/فشل العينة باللون الأحمر (هذا هو المقياس الذي يملي حالة المرور/الفشل في الملخص أعلاه). إذا كانت هذه القيمة أقل من 20، تعتبر نتيجة الانصهار السلبية 'غير مفيدة'. الشكل 4 والشكل 5 هي لقطات من مخططات الانصهار (أعلى) وJBrowse وجهات النظر من الانصهار دعم يقرأ (أسفل) للانصهار اثنين التي تبرر المزيد من التحقيق. وKIF5B-RET الانصهار (الشكل 4) يوضح عددا كبيرا من القراءات الداعمة، ونسبة عالية من القراءة من التمهيدي دعم الانصهار، وعدد كبير من مواقع البداية. بالإضافة إلى ذلك، يتم تضمين العديد من الطاردات المتجاورة من شريك الانصهار(KIF5B)في المحاذاة، وتم التحقق من الانصهار ليكون في الإطار، ويقرأ دعم الانصهار عموما خالية من عدم التطابق. ولهذه الأسباب، يعتبر الانصهار حقيقيا ً ويمكن الإبلاغ عنه. يوضح الانصهار LOC101927681-PDGFRB (الشكل5) مقاييس الدعم المنخفضة. وعلاوة على ذلك، فإن الجزء من تعيين القراءة إلى الشريك قصيرة نسبيا وتحتوي على معدل خطأ عالية، مما يشير بقوة إلى عدم التوافق ودعوة الانصهار الأثرية. وأخيرا، يتم تضمين تسلسل intronic من PDGFRB، مما يشير كذلك قطعة أثرية (معظم، ولكن ليس كل، وتتألف الانصهارات المشروعة فقط من التسلسل الذي خرائط لترميز المناطق من كلا الجينات). لهذه الأسباب، يعتبر هذا الانصهار قطعة أثرية وغير قابلة للإبلاغ.

Figure 1
الشكل 1: التمثيل التخطيطي لنهج AMP. إن النُهُج التقليدية التي يتم التبشّر بها من أجل الإثراء المستهدف محدودة بسبب الحاجة إلى مواد أولية لجميع شركاء الانصهار. وبالتالي، لن يتم الكشف عن شركاء الانصهار رواية. في AMP، التمهيدي المتعارضة محددة للمحول، وبالتالي يتم الكشف عن شركاء الرواية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: الارتباط بين درجة مراقبة الجودة PreSeq ومراقبة الجودة بعد التسلسل. وقد تم ربط Ct PreSeq ومتوسط مواقع البدء الفريدة لكل قيم التحكم في نظام الأفضليات المعمم 2 بسلسلة من 100 عينة. عموما، كما هو متوقع، ودرجات PreSeq منخفضة ترتبط مع ارتفاع قيم SS/GSP2 (كلاهما مؤشرات على نوعية جيدة RNA). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: مثال نموذج ملخص وقراءة طرق العرض الإحصائية. أعلى: عرض ملخص عينة في واجهة المستخدم مع الانصهار أدلة قوية المدرجة. أسفل: عرض صفحة إحصائيات القراءة في واجهة المستخدم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: مثال على دعوة الانصهار المشروعة. أعلى: عرض تخطيطي الانصهار في واجهة المستخدم. أسفل: JBrowse عرض يقرأ الفردية دعم الانصهار. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: مثال على دعوة الانصهار الأثرية. أعلى: عرض تخطيطي الانصهار في واجهة المستخدم. أسفل: JBrowse عرض يقرأ الفردية دعم الانصهار. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

AKT3 فى الفترة من 1الى 2005 من الدرجة الأولى PRKCA
ALK FGFR1 من الدرجة الثانية PRKCB
في هذا الـ26 FGFR2 NRG1 RAF1
اكسل FGFR3 NTRK1 RELA
BRAF FGR NTRK2 Ret
BRD3 INSR NTRK3 ROS1
BRD4 محمد الدوسري NUMBL RSPO2
فى الفرنسيّة MAST1 NUTM1 RSPO3
ERG فى 20 PDGFRA TERT
ESR1 اجتمع PDGFRB TFE3
ETV1 MSMB PIK3CA TFEB
ETV4 المسك PKN1 تهادا
ETV5 Myb PPARG TMPRSS2
ETV6
ويشمل هذا القول التمهيديات الخاصة بالجينات لمختلف الطاردات (وبعض الإنترونات) في الجينات الـ 53 المذكورة أعلاه.

الجدول التكميلي 1: قائمة بالجينات التي تُدرج لها مواد أولية خاصة بالجينات في التبيّس (لمختلف الطاردات والإنترونات).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

إن الإثراء المستهدف القائم على الـ PCR وتحضير المكتبة متبوعاً بالجيل التالي من التسلسل مناسبين لتقييم دمج الجينات المتعددة في عينات الأورام السريرية. من خلال التركيز على مدخلات الحمض النووي الريبي بدلا من الحمض النووي الجينومي، يتم تجنب الحاجة إلى تسلسل الإينترونات الكبيرة والمتكررة. بالإضافة إلى ذلك، منذ هذا النهج تضخيم الانصهارات الجينية بغض النظر عن هوية شريك الانصهار، يتم الكشف عن الانصهارات الرواية. هذا هو ميزة حاسمة في المجال السريري، وكانت هناك العديد من الأمثلة على الانصهارات الجينات الجديدة قابلة للتنفيذ التي تم تحديدها من خلال AMP ذكرت في الأدب21،22،23،24، 25.

وبما أن الفحص يستند إلى الحمض النووي الريبي، فمن الأهمية بمكان الحفاظ على جودة الحمض النووي الريبي في العينات أثناء المعالجة. ومن المهم أيضا تحديد العينات التي أنتجت تسلسل الحمض النووي الريبي الذي هو ضعيف جدا للثقة نتائج الانصهار السلبية. ويتحقق ذلك من خلال تقييم بيانات التسلسل من المواد التمهيدية إلى أربعة جينات التدبير المنزلي. إذا كان تسلسل هذه الجينات ضعيفًا، فإن نتائج الانصهار السلبية تعتبر غير مفيدة. وبالإضافة إلى ذلك، ونظرا لتعقيد والعديد من الخطوات الرطب مقاعد البدلاء في اختبار، من المهم أن تشمل السيطرة الإيجابية الانصهار في كل تشغيل اختبار. من خلال القيام بذلك، يتم إجراء إجراء فرز للخطر يصبح واضحاً من خلال تحليل أحداث الانصهار المتوقعة في عنصر التحكم.

كما هو الحال مع جميع النهج القائمة على amplicon، AMP تعتمد إلى حد كبير على الأداء التمهيدي الفردية. عند تقييم الطاردات المتعددة للجينات المتعددة، لا مفر من أن بعض المواد التمهيدية لن تؤدي وكذلك غيرها. ولذلك، فمن الأهمية بمكان للمستخدمين أن يعرفوا أين يكون أداء التدقيق أقل بسبب عدم كفاءة التمهيدي. وبالإضافة إلى ذلك، تتطلب الاختبارات القائمة على خدمات الحماية الوطنية تحليلامعقدا لبيانات المعلوماتية الأحيائية. إذا لم يتم تصميم الخوارزميات المستخدمة بعناية، فمن المحتمل أن تكون النتائج السلبية الكاذبة والإيجابية الكاذبة. من المهم جدا أن يتم فحص جميع الانصهارات الجينية التي تسمى بواسطة خوارزميات التحليل يدويا من قبل المستخدم.

مع قائمة متزايدة من الانصهارات الجينية القابلة للتنفيذ التي ينبغي تقييمها في عينات الورم السريرية، فإن استخدام الاختبارات متعددة المضاعفات مثل AMP سيستمر في الزيادة في المختبرات السريرية. ومن المرجح أن تركز التطبيقات المستقبلية لهذه التقنية على الجمع بين الانصهار وتقييم الطفرة ضمن اختبار واحد. وبغض النظر عن نهج التحليل الجزيئي، يجب على المستخدمين أن يكونوا دائماً على علم بقيود الفحص، وينبغي أن يضعوا دائماً مقاييس لمراقبة الجودة لتوجيه تفسير البيانات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

تلقت D.L.A. رسوم الاستشارات من باير الأورام، Genentech، AbbVie، وبريستول مايرز Squibb. وقد تلقت K.D.D السفر برعاية من ArcherDx.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا العمل من قبل الموارد المشتركة لعلم الأمراض الجزيئية من جامعة كولورادو (المعهد الوطني للسرطان مركز دعم مركز المنحة رقم. P30-CA046934) ومن قبل مركز كولورادو للطب الشخصي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10 mM Tris HCl pH 8.0 IDT 11-05-01-13 Used for TNA dilution
1M Tris pH 7.0 Thermo Fisher AM9850G Used in library pooling
25 mL Reagent Reservoir with divider USA Scientific 9173-2000 For use with multi-channel pipetters and large reagent volumes
96-well TemPlate Semi-Skirt 0.1mL PCR plate-natural USA Scientific 1402-9700 Plate used for thermocycler steps
Agencourt AMPure XP Beads Beckman Coulter A63881 Used in purification after several assay steps
Agencourt Formapure Kit Beckman Coulter A33343 Used in TNA extraction
Archer FusionPlex Solid Tumor kit ArcherDX AB0005 This kit contains most of the reagents necessary to perform library preperation for Illumina sequencing (kits for Ion Torrent sequencing are also available)
Cold block, 96-well Light Labs A7079 Used for keeping samples chilled at various steps
Ethanol Decon Labs DSP-MD.43 Used for bead washes
Library Quantification for Illumina Internal Control Standard Kapa Biosystems KK4906 Used for library quantitation
Library Quantification Primers and ROX Low qPCR mix Kapa Biosystems KK4973 Used for library quantitation
Library Quantification Standards Kapa Biosystems KK4903 Used for library quantitation
Magnet Plate, 96-well (N38 grade) Alpaqua A32782 Used in bead purificiation steps
MBC Adapters Set B ArcherDX AK0016-48 Adapters that contain sample-specific indexes to enable multiplex sequencing
Micro Centrifuge USA Scientific 2641-0016 Used for spinning down PCR tubes
MicroAmp EnduraPlate Optical 96 well Plate Thermo-Fisher 4483485 Used for Pre-Seq QClibrary quantitation
Microamp Optical Film Compression Pad Applied Biosystems 4312639 Used for library quantitation
Mini Plate Spinner Labnet MPS-1000 Used for collecing liquid at bottom of plate wells
MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycle) Illumina MS-102-3003 Contains components necessary for a MiSeq sequencing run
MiSeqDx System Illumina NGS Sequencing Instrument
Model 9700 Thermocycler Applied Biosystems Used for several steps during assay
nuclease free water Ambion 9938 Used as general diluent
Optical ABI 96-well PCR plate covers Thermo-Fisher 4311971 Used for Pre-Seq QClibrary quantitation
PCR Workstation Model 600 Air Clean Systems BZ10119636 Wet-bench assay steps performed in this 'dead air box'
Proteinase K Qiagen 1019499 Used in TNA extraction
QuantStudio 5 Applied Biosystems LSA28139 qPCR instrument used for PreSeq and library quantitation
Qubit RNA HS Assay Kit Life Technologies Q32855 Use for determing RNA concentration in TNA samples
RNase Away Fisher 12-402-178 Used for general RNase decontamination of work areas
Seraseq FFPE Tumor Fusion RNA Reference Material v2 SeraCare 0710-0129 Used as the assay positive control
Sodium Hydroxide Fisher BP359-212 Used in clean-up steps and for sequencing setup
SYBR Green Supermix Bio Rad 172-5120 Component of PreSeq QC Assay
TempAssure PCR 8-tube Strips USA Scientific 1402-2700 Used for reagent and sample mixing etc.
Template RT PCR film USA Scientific 2921-7800 Used for covering 96-well plates
U-Bottom 96-well Microplate LSP MP8117-R Used during bead purification

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mitelman, F., Johansson, B., Mertens, F. The impact of translocations and gene fusions on cancer causation. Nature Reviews Cancer. 7 (4), 233-245 (2007).
  2. Daley, G. Q., Van Etten, R. A., Baltimore, D. Induction of chronic myelogenous leukemia in mice by the P210bcr/abl gene of the Philadelphia chromosome. Science. 247 (4944), 824-830 (1990).
  3. Druker, B. J., et al. Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome. New England Journal of Medicine. 344 (14), 1038-1042 (2001).
  4. Solomon, B. J., et al. First-line crizotinib versus chemotherapy in ALK-positive lung cancer. New England Journal of Medicine. 371 (23), 2167-2177 (2014).
  5. Shaw, A. T., et al. Crizotinib in ROS1-rearranged non-small-cell lung cancer. New England Journal of Medicine. 371 (21), 1963-1971 (2014).
  6. Drilon, A., et al. Efficacy of Larotrectinib in TRK Fusion-Positive Cancers in Adults and Children. New England Journal of Medicine. 378 (8), 731-739 (2018).
  7. Kawai, A., et al. SYT-SSX gene fusion as a determinant of morphology and prognosis in synovial sarcoma. New England Journal of Medicine. 338 (3), 153-160 (1998).
  8. de Alava, E., et al. EWS-FLI1 fusion transcript structure is an independent determinant of prognosis in Ewing's sarcoma. Journal of Clinical Oncology. 16 (4), 1248-1255 (1998).
  9. Pierron, G., et al. A new subtype of bone sarcoma defined by BCOR-CCNB3 gene fusion. Nature Genetics. 44 (4), 461-466 (2012).
  10. Papaemmanuil, E., et al. Genomic Classification and Prognosis in Acute Myeloid Leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
  11. Arber, D. A., et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute. Blood. 127 (20), 2391-2405 (2016).
  12. Sanders, H. R., et al. Exon scanning by reverse transcriptase-polymerase chain reaction for detection of known and novel EML4-ALK fusion variants in non-small cell lung cancer. Cancer Genetics. 204 (1), 45-52 (2011).
  13. Camidge, D. R., et al. Optimizing the Detection of Lung Cancer Patients Harboring Anaplastic Lymphoma Kinase (ALK) Gene Rearrangements Potentially Suitable for ALK Inhibitor Treatment. Clinical Cancer Research. 16 (22), 5581-5590 (2010).
  14. Mino-Kenudson, M., et al. A novel, highly sensitive antibody allows for the routine detection of ALK-rearranged lung adenocarcinomas by standard immunohistochemistry. Clinical Cancer Research. 16 (5), 1561-1571 (2010).
  15. Suehara, Y., et al. Identification of KIF5B-RET and GOPC-ROS1 fusions in lung adenocarcinomas through a comprehensive mRNA-based screen for tyrosine kinase fusions. Clinical Cancer Research. 18 (24), 6599-6608 (2012).
  16. Davies, K. D., et al. Comparison of Molecular Testing Modalities for Detection of ROS1 Rearrangements in a Cohort of Positive Patient Samples. Journal of Thoracic Oncology. 13 (10), 1474-1482 (2018).
  17. Reeser, J. W., et al. Validation of a Targeted RNA Sequencing Assay for Kinase Fusion Detection in Solid Tumors. Journal of Molecular Diagnostics. 19 (5), 682-696 (2017).
  18. Beadling, C., et al. A Multiplexed Amplicon Approach for Detecting Gene Fusions by Next-Generation Sequencing. Journal of Molecular Diagnostics. 18 (2), 165-175 (2016).
  19. Mamanova, L., et al. Target-enrichment strategies for next-generation sequencing. Nature Methods. 7 (2), 111-118 (2010).
  20. Zheng, Z., et al. Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing. Nature Medicine. 20 (12), 1479-1484 (2014).
  21. Davies, K. D., et al. Dramatic Response to Crizotinib in a Patient with Lung Cancer Positive for an HLA-DRB1-MET Gene Fusion. JCO Precision Oncology. 2017 (1), (2017).
  22. Vendrell, J. A., et al. Detection of known and novel ALK fusion transcripts in lung cancer patients using next-generation sequencing approaches. Scientific Reports. 7 (1), 12510 (2017).
  23. Agaram, N. P., Zhang, L., Cotzia, P., Antonescu, C. R. Expanding the Spectrum of Genetic Alterations in Pseudomyogenic Hemangioendothelioma With Recurrent Novel ACTB-FOSB Gene Fusions. American Journal of Surgical Pathology. 42 (12), 1653-1661 (2018).
  24. Skalova, A., et al. Molecular Profiling of Mammary Analog Secretory Carcinoma Revealed a Subset of Tumors Harboring a Novel ETV6-RET Translocation: Report of 10 Cases. American Journal of Surgical Pathology. 42 (2), 234-246 (2018).
  25. Guseva, N. V., et al. Anchored multiplex PCR for targeted next-generation sequencing reveals recurrent and novel USP6 fusions and upregulation of USP6 expression in aneurysmal bone cyst. Genes Chromosomes and Cancer. 56 (4), 266-277 (2017).

Tags

أبحاث السرطان، العدد 149، دمج الجينات، الطب الدقيق، التشخيص الجزيئي، تسلسل الجيل التالي، PCR متعددة الإرساء، المعلوماتية الحيوية
الكشف عن الانصهار الجيني الأنسيوجيني باستخدام تفاعل سلسلة بوليميراز متعددة المضاعفات متبوعاً بتسلسل الجيل التالي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Seager, M., Aisner, D. L., Davies,… More

Seager, M., Aisner, D. L., Davies, K. D. Oncogenic Gene Fusion Detection Using Anchored Multiplex Polymerase Chain Reaction Followed by Next Generation Sequencing. J. Vis. Exp. (149), e59895, doi:10.3791/59895 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter