Detección de fusión genética oncogénica mediante reacción en cadena de polimerasa múltiplex anclada seguida de secuenciación de próxima generación

Resumen

Este artículo detalla el uso de un kit de preparación de biblioteca sin reacción en cadena de múltiples polimerasas anclada seguido de secuenciación de próxima generación para evaluar las fusiones de genes oncogénicos en muestras de tumores sólidos clínicos clínicos. Se describen los pasos de análisis de datos y de banco húmedo.

Resumen

Las fusiones genéticas con frecuencia contribuyen al fenotipo oncogénico de muchos tipos diferentes de cáncer. Además, la presencia de ciertas fusiones en muestras de pacientes con cáncer a menudo influye directamente en el diagnóstico, pronóstico y/o selección de terapia. Como resultado, la detección precisa de fusiones genéticas se ha convertido en un componente crítico del manejo clínico para muchos tipos de enfermedades. Hasta hace poco, la detección de la fusión génica clínica se realizaba predominantemente mediante el uso de ensayos de un solo gen. Sin embargo, la lista cada vez mayor de fusiones genéticas con importancia clínica ha creado la necesidad de evaluar el estado de fusión de múltiples genes simultáneamente. Las pruebas basadas en secuenciación de próxima generación (NGS) han satisfecho esta demanda a través de la capacidad de secuenciar ácido nucleico de manera masivamente paralela. Múltiples enfoques basados en NGS que emplean diferentes estrategias para el enriquecimiento de objetivos genéticos ahora están disponibles para su uso en diagnóstico molecular clínico, cada uno con sus propias fortalezas y debilidades. Este artículo describe el uso de el enriquecimiento objetivo basado en PCR múltiple (AMP) anclado y la preparación de bibliotecas seguida de NGS para evaluar las fusiones genéticas en muestras de tumores sólidos clínicos. AMP es único entre los enfoques de enriquecimiento basados en amplificación, ya que identifica fusiones genéticas independientemente de la identidad del socio de fusión. Aquí se detallan los pasos de análisis de datos y de banco húmedo que garantizan una detección precisa de la fusión genética a partir de muestras clínicas.

Introducción

La fusión de dos o más genes en una sola entidad transcripcional puede ocurrir como resultado de variaciones cromosómicas a gran escala, incluyendo eliminaciones, duplicaciones, inserciones, inversiones y translocaciones. A través del control transcripcional alterado y/o las propiedades funcionales alteradas del producto genético expresado, estos genes de fusión pueden conferir propiedades oncogénicas a las células cancerosas¹. En muchos casos, los genes de fusión son conocidos por actuar como principales motores oncogénicos mediante la activación directa de la proliferación celular y las vías de supervivencia.

La re....

Protocolo

1. Preparación y secuenciación de la biblioteca

1. Consideraciones generales sobre el ensayo y las medidas previas a la prueba
   1. Las ejecuciones de ensayos suelen consistir en siete muestras clínicas y un control positivo (aunque el número de muestras por ejecución de preparación de la biblioteca se puede ajustar según sea necesario). Utilice un control positivo que contenga al menos varias fusiones genéticas (que los objetivos del ensayo) que hayan sido confirmadas por un fabricante y/o hayan sido confirmadas por una metodología ortogonal. Un control no-plantilla (NTC) debe incluirse como una muestra adicional en cada ejecución de ensa....

Resultados

Se muestran en la Figura 3, la Figura 4 y la Figura 5 son capturas de pantalla de la interfaz de usuario de análisis que demuestran los resultados de una muestra de adenocarcinoma pulmonar. En la Figura 3, se muestra el resumen de ejemplo (arriba) que enumera las fusiones de evidencia fuertes llamadas, así como el estado de control de calidad (en círculo en rojo). La fusión ADCK4-NUMBL (de las .......

Discusión

El enriquecimiento objetivo y la preparación de bibliotecas basados en PCR múltiples anclados seguidos de secuenciación de próxima generación son adecuados para la evaluación de la fusión genética multiplexada en muestras de tumores clínicos. Al centrarse en la entrada de ARN en lugar del ADN genómico, se evita la necesidad de secuenciar intrones grandes y repetitivos. Además, dado que este enfoque amplifica las fusiones genéticas independientemente de la identidad del socio de fusión, se detectan nuevas fusiones. Esta e.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
10 mM Tris HCl pH 8.0	IDT	11-05-01-13	Utilizado para la dilución de TNA
1M Tris pH 7.0	Thermo Fisher	AM9850G	Utilizado en la agrupación de bibliotecas
25 mL Depósito de reactivos con divisor	USA Scientific	9173-2000	Para uso con pipetas multicanal y grandes volúmenes de reactivos
TemPlate Semifaldón de 96 pocillos 0,1 ml Placa de PCR natural	USA Scientific	1402-9700	Placa utilizada para los pasos del termociclador
Agencourt AMPure XP Beads	Beckman Coulter	A63881	Utilizado en la purificación después de varios pasos de ensayo
Agencourt Formapure Kit	Beckman Coulter	A33343	Utilizado en la extracción de TNA
Archer FusionPlex Kit de tumores sólidos	ArcherDX	AB0005	Este kit contiene la mayoría de los reactivos necesarios para realizar la preparación de bibliotecas para la secuenciación de Illumina (también hay disponibles kits para la secuenciación de Ion Torrent)
Bloque frío, 96 pocillos	Light Labs	A7079	Se utiliza para mantener las muestras refrigeradas en varios pasos
Ethanol	Decon Labs	DSP-MD.43	Se utiliza para lavados de perlas
Cuantificación de bibliotecas para el estándar de control interno de Illumina	Kapa Biosystems	KK4906	Se utiliza para la cuantificación de bibliotecas
Cartones de cuantificación de bibliotecas y mezcla ROX Low qPCR	Kapa Biosystems	KK4973	Utilizado para la cuantificación de bibliotecas
Estándares de cuantificación de bibliotecas	Kapa Biosystems	KK4903	Utilizado para la cuantificación de bibliotecas
Placa magnética, 96 pocillos (grado N38)	Alpaqua	A32782	Utilizado en los pasos de purificación de perlas
Juego de adaptadores MBC	ArcherDX	AK0016-48	Adaptadores que contienen índices específicos de la muestra para permitir la secuenciación multiplexada
Micro Centrifuge	USA Scientific	2641-0016	Se utiliza para girar tubos de PCR
MicroAmp EnduraPlate Placa óptica de 96 pocillos	Thermo-Fisher	4483485	utilizado para la cuantificación de QClibrary Pre-Seq
Almohadilla de compresión de película óptica Microamp	Biosystems aplicada	4312639	utilizado para la cuantificación de bibliotecas
Mini Spinner de placas	Labnet	MPS-1000	Se utiliza para recoger líquido en el fondo de los pocillos de placas
MiSeq Recomponent Kit v3 (600 ciclos)	Illumina	MS-102-3003	Contiene los componentes necesarios para una ejecución de secuenciación MiSeq
Sistema MiSeqDx	Illumina		NGS Instrumento de secuenciación
Modelo 9700 Termociclador	Biosistemas		Se utiliza para varios pasos durante Ensayo
Agua libre de nucleasa	Ambion	9938	Se utiliza como diluyente general
ABI óptico Cubiertas de placas de PCR de 96 pocillos	Thermo-Fisher	4311971	utilizado para la cuantificación previa de QClibrary
Estación de trabajo de PCR Modelo 600	Sistemas de limpieza de aire	BZ10119636	Pasos de ensayo de banco húmedo realizados en esta 'caja de aire muerto'Proteinasa
K	Qiagen	1019499	Utilizado en la extracción de TNA
QuantStudio 5	Applied Biosystems	LSA28139	instrumento de qPCR utilizado para la cuantificación de PreSeq y bibliotecas
Qubit RNA HS Assay Kit	Technologies	Q32855	Uso para determinar la concentración de ARN en muestras
TNA RNasa Away Fisher		12-402-178	Se utiliza para la descontaminación general de RNasa de áreas de trabajo
Seraseq FFPE Material de referencia de ARN de fusión tumoral Seraseq FFPE v2	SeraCare	0710-0129	Se utiliza como control positivo
de ensayo Hidróxido de sodio	Fisher	BP359-212	Se utiliza en los pasos de limpieza y para la configuración de la secuenciación
SYBR Green Supermix	Bio Rad	172-5120	Componente del ensayo PreSeq QC
TempAssure PCR Tiras de 8 tubos	USA Scientific	1402-2700	Se utiliza para la mezcla de reactivos y muestras, etc.
Plantilla RT Película PCR EE	. UU. Scientific	2921-7800	Se utiliza para cubrir placas de 96 pocillos
Fondo en U Microplaca de 96 pocillos	LSP	MP8117-R	Se utiliza durante la purificación de perlas

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