Summary
この記事では、アンカーされた多重ポリメラーゼ連鎖反応ベースのライブラリー調製キットの使用について詳しく述べたり、臨床固形腫瘍サンプルにおける発生遺伝子融合を評価するための次世代シーケンシングが続きます。ウェットベンチとデータ分析の両方の手順について説明します。
Abstract
遺伝子融合は、多くの異なるタイプの癌の発癌表現型にしばしば寄与する。さらに、癌患者からのサンプル中の特定の融合の存在は、多くの場合、診断、予後、および/または治療の選択に直接影響を与えます。その結果、遺伝子融合の正確な検出は、多くの疾患タイプの臨床管理の重要な構成要素となっています。最近まで、臨床遺伝子融合検出は、主に単一遺伝子アッセイの使用によって達成されました。しかし、臨床的意義を持つ遺伝子融合のリストが増え続けているために、複数の遺伝子の融合状態を同時に評価する必要性が生まれています。次世代シーケンシング(NGS)ベースのテストは、核酸を非常に平行な方法で配列する能力を通じて、この要求を満たしています。遺伝子標的濃縮に異なる戦略を採用した複数のNGSベースのアプローチが、それぞれ独自の長所と短所を持つ臨床分子診断で使用できるようになりました。本稿では、臨床固形腫瘍標本における遺伝子融合を評価するためにNGSに続くアンカー多重PCR(AMP)ベースの標的濃縮およびライブラリー調製の使用について説明する。AMPは、アンプリコンベースの濃縮アプローチの中でも、融合パートナーのアイデンティティにかかわらず遺伝子融合を識別するというユニークなアプローチです。ここでは、臨床サンプルからの正確な遺伝子融合検出を保証するウェットベンチとデータ解析の両方の手順を詳しく説明します。
Introduction
2つ以上の遺伝子を単一の転写実体に融合させるのは、欠損、複製、挿入、反転、転座を含む大規模な染色体変動の結果として起こり得る。これらの融合遺伝子は、発現した遺伝子産物の転写制御および/または改変された機能特性を通じて、癌細胞1に発癌特性を付与することができる。多くの場合、融合遺伝子は、細胞増殖および生存経路を直接活性化することによって、主要な発癌因子として作用することが知られている。
がん患者に対する遺伝子融合の臨床的関連性は、フィラデルフィア染色体およびそれに対応するBCR-ABL1融合遺伝子の慢性骨髄性白血病(CML)2の発見によって最初に明らかになった。この融合遺伝子を特異的に標的とする低分子阻害剤イマチニブメシレートを開発し、BCR-ABL1-陽性CML患者3において顕著な有効性を実証した。 腫瘍遺伝子融合の治療的ターゲティングは固形腫瘍においても成功しており、非小細胞肺癌におけるALKおよびROS1融合遺伝子の阻害が主な例として役立つ4、5。最近、NTRK阻害剤ラロトレクチニブは、疾患部位6にかかわらず、NTRK1/2/3融合陽性固形腫瘍に対してFDA承認された。 治療の選択を超えて、遺伝子融合検出は疾患診断および予後にも役割を持つ。これは、特定の融合の存在によって診断的に定義される様々な肉腫および血液悪性腫瘍のサブタイプおよび/または融合の存在が予後を直接知らせる7,8で特に一般的である。,9,10歳,11.これらは、がん患者に対する遺伝子融合検出の臨床応用例のほんの一部にすぎない。
臨床意思決定において重要な役割を果たしているため、臨床サンプルからの正確な遺伝子融合検出は極めて重要です。細胞遺伝学的手法、逆転写性ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)、現場ハイブリダイゼーションにおける蛍光(FISH)を含む融合または染色体再配置分析のための臨床検査室で多数の技術が適用されている。免疫組織化学(IHC)、および5'/3'発現不均衡分析(とりわけ)12、13、14、15。現在、がんにおけるアクション可能な遺伝子融合のリストが急速に拡大している結果、複数の遺伝子の融合状態を同時に評価する必要が出てきました。その結果、一度に1つまたは少数の遺伝子しか照会できない伝統的な技術の中には、特に臨床腫瘍サンプルが非常に有限であり、複数のアッセイに分けられることが多いと考えると、非効率的なアプローチになりつつあります。しかし、次世代シーケンシング(NGS)は、多遺伝子検査に適した解析プラットフォームであり、NGSベースのアッセイは臨床分子診断ラボで一般的になっています。
現在使用されている核融合/再配置検出に使用されるNGSアッセイは、使用される入力材料、ライブラリー調製および標的濃縮に使用される化学物質、およびアッセイ内で照会された遺伝子の数に関して異なります。NGSアッセイは、試料から抽出されたRNAまたはDNA(またはその両方)に基づいていることができる。RNAベースの分析は、高度に分解されたRNAを含む臨床サンプルの傾向によって妨げられますが、DNAベースの融合試験の標的であるが、NGSでは困難であることが証明されている大規模で頻繁に反復的なイントロンを配列する必要性を回避します。データ分析16.RNAベースのNGSアッセイの標的濃縮戦略は、主にハイブリッド捕捉またはアンプリコン媒介アプローチに分けられます。両方の戦略は融合検出にうまく利用されていますが、それぞれが他の17、18に対する利点を含んでいます。ハイブリッドキャプチャアッセイは、一般的に、より複雑なライブラリと減少したアリルドロップアウトをもたらすのに対し、アンプリコンベースのアッセイは一般的に低い入力を必要とし、オフターゲットシーケンシング19の結果が少ない。しかし、おそらく、従来のアンプリコンベースの濃縮の主な制限は、すべての既知の融合パートナーへのプライマーの必要性です。多くの臨床的に重要な遺伝子が数十の異なるパートナーと融合することが知られており、たとえプリマー設計がすべての既知のパートナーの検出を可能にしたとしても、新しい融合事象は検出されないままであるので、これは問題となる。アンカー多重 PCR (または短い場合は AMP) と呼ばれる最近説明された手法は、この制限20に対処します。AMP では、入力 RNA から派生した cDNA フラグメントに「半機能」NGS アダプターがリゲーションされます。標的濃縮は、遺伝子特異的プライマーとアダプターへのプライマーとの間の増幅によって達成される。その結果、目的の遺伝子に対するすべての融合は、たとえ新しい融合パートナーが関与していても、検出されるべきである(図1参照)。この記事では、固形腫瘍サンプルにおける発因性遺伝子融合の検出にAMPを採用したNGSベースのアッセイであるArcherDx FusionPlex固形腫瘍キットの使用について説明します(補足表1参照)完全な遺伝子リスト)。ウェットベンチプロトコルとデータ分析手順は、臨床検査改善修正(CLIA)認定ラボで厳密に検証されています。
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Protocol
1. 図書館の準備と順序付け
- 一般的なアッセイに関する考慮事項と事前アッセイ手順
- アッセイランは、通常、7つの臨床サンプルと1つの陽性対照で構成されています(ただし、ライブラリ調製実行あたりのサンプル数は必要に応じて調整できます)。製造業者によって確認された、または直交的方法論によって確認された少なくともいくつかの遺伝子融合(アッセイターゲット)を含む陽性対照を使用する。非テンプレート制御(NTC)は、すべてのアッセイ実行に追加サンプルとして含める必要がありますが、第2鎖cDNA合成および事前シーケンシング品質管理(Pre-Seq QC;cDNA合成を確実に行う)を介してのみ実施されます。NTCにはサンプル希釈剤(10 mMトリスHCl pH 8.0)を使用してください。
- ホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)組織の全核酸(TNA)抽出を行う。
- フッ素測定アッセイを用いてTNAのRNA成分を定量する。
注:凍結解凍サイクルを制限し、解凍された核酸を低温(チルドブロック、氷、代替)に保ち、RNase汚染(手袋を着用し、RNase除染スプレーを使用)を防ぐことで、サンプル中のRNA劣化を防ぎます。
- ランダムプライミング
注:アッセイの所望の入力は200 ng RNAです(TNAの蛍束量量に基づく)。200 ng を達成できない場合は、低い入力を使用できます。サンプルがシーケンシング後QCに失敗した場合、より高い入力で繰り返しすると、許容可能なQCメトリックが得られます。- 所望のRNA濃度を達成するために10 mMトリスHCl pH 8.0でTNAを希釈する。各サンプルについて、希釈の20 μLをランダムプライミング試薬ストリップチューブ(予冷アルミニウムブロックに配置)に移し、上下6-8回ピペッティングして混合します。簡単にスピンダウンし、96ウェルPCRプレートに全体のボリュームを転送し、RTフィルムでシールします。
- サーモサイクラーブロックにプレートを挿入し、圧縮パッドでカバーし、蓋を閉じます。65°Cで5分間インキュベート(蓋を加熱)します。
- サーモサイクラーからプレートを取り出し、氷の上に2分間置きます。
- 最初の鎖cDNA合成
- ランダムプライミング製品の全容積を、最初のストランド試薬ストリップチューブ(あらかじめ冷蔵されたアルミニウムブロックに入れた)に移します。上下6-8回ピペッティングしてミックスします。簡単にスピンダウンし、全容積を96ウェルPCRプレートに移し、RTフィルムでシールします。
- サーモサイクラーブロックにプレートを挿入し、圧縮パッドでカバーし、蓋を閉じます。サーモサイクラープログラムを実行する:25 °C 10分、42 °C 30分、80 °C 20分、4 °C ホールド(加熱された蓋)。
- 第2鎖cDNA合成
- PCRストリップチューブの新しいセットでは、9 μLヌクレスフリー水に最初のストランド生成物の1 μLを追加することにより、最初のストランド生成物の1:10希釈を作成します。希釈をプレSeq QCアッセイで使用するように脇に設定します。
- 残りの最初のストランド製品に21 μLのヌクレアーゼフリー水を加えます。第1鎖産物の40μLを第2の鎖試薬ストリップチューブ(予め冷やされたアルミニウムブロックに置く)に自由な水を移す。上下6-8回ピペッティングしてミックスします。スピンダウンし、全容積を96ウェルPCRプレートに移し、RTフィルムでシールします。
- サーモサイクラーブロックにプレートを挿入し、圧縮パッドでカバーし、蓋を閉じます。サーモサイクラープログラムを実行する:16 °C 60分、75 °C 20分、4 °Cホールド(加熱された蓋)。
注: これは許容できる停止ポイントです。プレートは-20°Cで保存することができます。
- プレセック QC
注:この品質管理(QC)アッセイは、主にNTCからのcDNA合成がない検証に使用されます。ただし、データはアッセイのトラブルシューティングでも有益な場合があります。たとえば、サンプルに Pre-Seq QC 値が良好で、アッセイメトリックが不十分な場合(下記参照)、アッセイ実行における問題を示す可能性があり、繰り返しを必要とする場合があります。- 各サンプルと NTC を重複して実行します。また、プレSeq QCに含める反応NTC、これはヌクレアーゼフリー水である(また、重複して実行される)。光学96ウェルプレートの各該当ウェルにアッセイマスターミックスの5μL、10x VCPプライマーの1μL、およびステップ1.4.1で作成された最初のストランド産物の1:10希釈の4μLを加えます。
- RTフィルムでプレートを密封し、スピンダウンし、定量PCR(qPCR)器具にロードします。プログラムを実行する:プリアンプ:1サイクル95 °C 20秒、アンプ:35サイクル95 °C 3秒(4.4 °C/sランプレート)- 60 °C 30 s (2.2 °C/sランプレート)
- アッセイNTCと反応NTCの両方のサイクルしきい値(Ct)値の欠如を確認します。
注:アッセイNTCにCtが観察されない場合、アッセイでは繰り越されなくなります。NTCの反応におけるCt値の観察は、プレセックQCアッセイの繰り返しを必要とする。アッセイNTCにおけるCtの観察は、アッセイの前のある時点でサンプル汚染を示唆し、したがって、アッセイ全体(すべてのサンプル)をやり直す必要がある。適切な品質サンプルのプレSeq QC Ct値は30未満でなければなりません(低いCt値はより多くの製品と相関し、したがってより高品質のRNA)。30を超える値は、故障の絶対的な指標ではなく、これらのサンプルはアッセイで継続する必要があります。ただし、このようなサンプルから派生したすべてのデータは、特に融合が呼び出されない場合には慎重に確認する必要があります。
- 修理とビーズの精製を終了
- 第2のストランド製品の40 μLをエンドリペア試薬ストリップチューブに移します(あらかじめ冷やされたアルミニウムブロックに入れます)。上下6-8回ピペッティングしてミックスし、スピンダウンしてサーモサイクラーブロック(加熱された蓋を開いたままにする)に入れ、サーモサイクラープログラムを実行します:25 °C 30分、4°Cホールド。
- 4°Cから精製ビーズを取り出し、室温まで平衡化します。図書館全体の準備を通して持続するのに十分な70%のエタノールを作ります。使用前に渦ビーズを使用し、Uボトムプレートの適切な数のウェルに100 μLをピペットします。
注:実行される8つのサンプルごとに、70%のエタノールの20 mLが必要になります。 - 最終修理製品の全容積をビーズに追加します。ピペットを上下6-8回混合し、室温で5分間インキュベートし、続いて磁石に5分間インキュベーションを行います。
- 上清を取り出して廃棄し、200 μL 70%のエタノール洗いを2回行い、30回のインキュベーションを行います。最後の洗浄後、すべての70%エタノールを除去し、5分間空気を乾燥させます。
- 磁石から取り出し、10 mMトリスHCl pH 8.0の22 μLでビーズを再サスペンドします。磁石を3分間インキュベートし、その後、磁石に2分のインキュベーションを行います。直ちにライゲーションステップ1に進みます。
- ライゲーション工程1とビーズ精製
- エンドリペアビーズ精製プレートから20μLをライゲーションステップ1ストリップチューブ(予冷アルミニウムブロックに入れる)に移します。上下6~8回ピペッティングしてミックスし、スピンダウンし、ボリューム全体を96ウェルPCRプレートに移します。
- サーモサイクラーブロックにプレートを挿入し、圧縮パッドでカバーし、蓋を閉じます。サーモサイクラープログラムを実行する:37 °C 15分、4 °Cホールド(加熱された蓋)。
- 4°Cから精製ビーズを取り出し、室温まで平衡化します。使用前に渦ビーズを使用し、Uボトムプレートの適切な数のウェルに50 μLをピペットします。
- ライゲーションステップ1製品の全量をビーズに追加します。ピペットを上下6-8回混合し、室温で5分間インキュベートし、続いて磁石に5分間インキュベーションを行います。
- 上清を取り出して廃棄し、200 μL 70%のエタノール洗いを2回行い、30回のインキュベーションを行います。最後の洗浄後、すべての70%エタノールを除去し、5分間空気を乾燥させます。
- 磁石から取り出し、10 mMトリスHCl pH 8.0の42 μLでビーズを再サスペンドします。磁石を3分間インキュベートし、その後、磁石に2分のインキュベーションを行います。直ちにライゲーションステップ2に進みます。
- ライゲーション工程2とビーズ精製
- 4 °Cの貯蔵から分子バーコード(MBC)アダプタストリップチューブ試薬を取り外します。この時点でサンプル固有の索引が追加されるので、MBC アダプター・ストリップの適切な番号付けは非常に重要です。チューブをヒンジを背面に水平に配置し、パーマネントマーカーを使用してチューブ1、2、3にラベルを付けます。左から右へ。シーケンスの目的でサンプル固有のインデックスを記録することも重要です (シーケンサー ワークシートに入力する必要があります)。
- ライゲーションステップ1ビーズ精製プレートから40μLをMBCアダプタストリップチューブ(予冷アルミニウムブロックに入れる)に移します。上下6-8回ピペッティングしてミックスします。
- スピンダウンし、ライゲーションステップ2試薬ストリップチューブ(また、事前に冷却されたアルミニウムブロックに配置)に全体のボリュームを転送します。上下6~8回ピペッティングしてミックスし、スピンダウンしてサーモサイクラーブロックに入ります。加熱された蓋をオフにしてサーモサイクラープログラムを実行します:22 °C 5分、4 °Cホールド。
注:これは安全な停止ポイントであり、サンプルは-20 °Cで貯えることができる。 - 4°Cの貯蔵からライゲーションクリーンアップビーズを取り除き、室温まで平衡化します。新鮮な5 mM NaOHの1 mLを準備します。
- ライゲーションクリーンアップビーズを渦にし、PCRストリップチューブの新しいセットに50 μLを追加します。磁石に1分間インキュベートします。1分インキュベーション後に上清を除去し、廃棄する。磁石からストリップチューブを取り外し、6~8回ピペッティングしてライゲーションクリーンアップバッファを50μLで再中断します。
- ライゲーションステップ2製品の全容積をライゲーションクリーンアップビーズストリップチューブに移します。ボルテックスでサンプルを混合し、室温で5分間インキュベートします。繰り返しになりますが、ボルテックスによってサンプルを混合し、室温でさらに5分間インキュベートします。2回目の5分間のインキュベーションの後、ボルテックスによってサンプルを混合し、短時間スピンダウンし、磁石上で1分間インキュベートします。
- 上清を取り除いて廃棄します。200 μL のライゲーションクリーンアップ バッファーと渦を追加して再中断します。クイックスピンを行い、磁石の上に1分間置き、ライゲーションクリーンアップバッファを使用して2回目の洗浄を行います。
- ライゲーションクリーンアップバッファで2回洗浄した後、超純水を用いて同一の洗浄を行います。超純水洗浄に続いて、ビーズを5mM NaOHの20 μLで再中断し、96ウェルPCRプレートに移します。圧縮パッドでサーモサイクラーブロックにプレートを配置し、サーモサイクラープログラムを実行します:75 °C 10分、4 °Cホールド(加熱された蓋)。
- サンプルが4°Cに冷却されたら、PCRプレートをスピンダウンします。プレートを磁石の上に少なくとも3分間置き、すぐに最初のPCRに進みます。
- 最初のPCRとビーズ精製
- 最初のPCR試薬ストリップチューブを4°Cの貯蔵から取り外し、あらかじめ冷やされたアルミニウムブロックに入れます。また、GSP1プライマーを-20°Cから取り外し、室温まで平衡化します。
- 最初のPCR試薬ストリップチューブの各ウェルにGSP1プライマーの2 μLを追加します。ライゲーション2クリーンアップ製品の18 μLを最初のPCR試薬ストリップチューブに移し、6~8回ピペッティングして混合します。
- スピンダウンし、96ウェルPCRプレートに転送します。圧縮パッドでプレートをサーモサイクラーブロックに入れ、サーモサイクラープログラムを実行します:95 °C 3分、15サイクル95 °C 30 s - 65 °C 5分(100%ランプレート)、72 °C 3分、4°Cホールド(加熱された蓋)。
注:これは安全な停止点であり、サンプルは一晩4 °Cまたは長期貯蔵のための-20 °Cで貯えることができる。 - 4°Cから精製ビーズを取り出し、室温まで平衡化します。使用前に渦ビーズを使用し、ピペ24 μLをUボトムプレートの適切な数のウェルに入れます。
- 最初のPCR製品の20 μLをビーズの24 μLに移します。ピペットを上下6-8回混合し、室温で5分間インキュベートし、続いて磁石に2分間インキュベーションを行います。
- 上清を取り出して廃棄し、200 μL 70%のエタノール洗いを2回行い、30回のインキュベーションを行います。最後の洗浄後、すべての70%エタノールを除去し、2分間空気を乾燥させます。
- 磁石から取り出し、10 mMトリスHCl pH 8.0の24 μLでビーズを再中断します。磁石を3分間インキュベートし、その後、磁石に2分のインキュベーションを行います。直ちに 2 番目の PCR に進みます。
- 第2PCRおよびビーズ精製
- 第2のPCR試薬ストリップチューブを4°Cから取り外し、あらかじめ冷やしたアルミニウムブロックに入れます。この時点でサンプル特異的な索引が追加されるにつれて、2番目のPCRストリップチューブの適切な番号付けは非常に重要です。チューブをヒンジを背面に水平に配置し、パーマネントマーカーを使用してチューブ1、2、3にラベルを付けます。左から右へ。また、GSP2プライマーを-20°Cから取り外し、室温まで平衡化します。
注: シーケンスの目的でサンプル固有のインデックスを記録することも重要です (シーケンサー ワークシートに入力する必要があります)。 - 2番目のPCR試薬ストリップチューブの各ウェルにGSP2プライマーの2 μLを追加します。最初のPCRクリーンアップ製品の18 μLを2番目のPCR試薬ストリップチューブに転送し、6~8回ピペッティングして混合します。
- スピンダウンし、96ウェルPCRプレートに転送します。圧縮パッドでサーモサイクラーブロックにプレートを配置し、サーモサイクラープログラムを実行します:95 °C 3分、18サイクル95 °C 30 s - 65 °C 5分(100%ランプレート)、72 °C 3分、4°Cホールド(加熱された蓋)。
注:これは安全な停止点であり、サンプルは一晩4 °Cまたは長期貯蔵のための-20 °Cで貯えることができる。 - 4°Cから精製ビーズを取り出し、室温まで平衡化します。使用前に渦ビーズを使用し、ピペ24 μLをUボトムプレートの適切な数のウェルに入れます。
- 2番目のPCR製品の20 μLをビーズに移します。ピペットを上下6-8回混合し、室温で5分間インキュベートし、続いて磁石に2分間インキュベーションを行います。
- 上清を取り出して廃棄し、200 μL 70%のエタノール洗いを2回行い、30回のインキュベーションを行います。最後の洗浄後、すべての70%エタノールを除去し、2分間空気を乾燥させます。
- 磁石から取り出し、10 mMトリスHCl pH 8.0の24 μLでビーズを再中断します。磁石を3分間インキュベートし、その後、磁石に2分のインキュベーションを行います。2番目のPCRクリーンアップ製品の20 μLを新しい96ウェルPCRプレートに移します。
注:これは安全な停止点であり、ライブラリは-20 °Cで長期保存したり、ライブラリの定量化に直ちに進むことができます。
- 第2のPCR試薬ストリップチューブを4°Cから取り外し、あらかじめ冷やしたアルミニウムブロックに入れます。この時点でサンプル特異的な索引が追加されるにつれて、2番目のPCRストリップチューブの適切な番号付けは非常に重要です。チューブをヒンジを背面に水平に配置し、パーマネントマーカーを使用してチューブ1、2、3にラベルを付けます。左から右へ。また、GSP2プライマーを-20°Cから取り外し、室温まで平衡化します。
- ライブラリ定量
- -20 °Cの貯蔵からライブラリ定量マスターミックスと規格を取り外し、室温まで平衡化します。
- 10 mM Tris HCl pH 8.0 を使用してすべてのライブラリ(2 番目の PCR プロダクト)を 1:5 希釈し、続いて 10 mM トリス HCl pH 8.0 0.05% ポリソルベートを使用してシリアル希釈を実行します。1:200,000 と 1:1,000,000 の最後の 2 つの希釈は、それぞれ三循環で実行されます。
- 光学96ウェルプレートの各ウェルに6 μLのマスターミックスを加え、その後に4μLの適切な希釈または標準を加えます。プレートをスピンダウンし、qPCR機器にロードします。次のサイクリング条件を使用してください: 1 サイクル 95 °C 5 分, 35 サイクル 95 °C 30 秒 (4.4 °C/s ランプ レート) - 60 °C 45 s (2.2 °C/s ランプレート)
- ライブラリー定量が完了し、ライブラリー濃度が決定された後(両方の試験された希釈を平均化して)、10 mM Tris HCl pH 8.0を使用してすべてのライブラリーを2 nMに正規化します。各正規化されたライブラリの 10 μL を 1 つの 1.5 mL マイクロ遠心分離管に組み合わせてライブラリ プールを作成します。
- ライブラリのシーケンス
- シーケンサー試薬カートリッジを-20°Cの貯蔵から取り出し、少なくとも1時間は塗りつぶしラインまで脱イオン化(DI)水に入れます。また、シーケンサー試薬キットを4°Cから取り出し、室温まで少なくとも1時間平衡化します。このシーケンス・プラットフォームでシーケンスできるライブラリーの最大数は 8 です (そのうちの 1 つは正のコントロールである必要があります)。
- ライブラリプールの10 μLと0.2 N NaOHの10 μLを組み合わせ、室温で5分間インキュベートして変性アンプリコンライブラリ(DAL)プールを作ります。5分インキュベーション後、200mMのトリスHCl pH 7.0の10 μLを追加し、続いてHT1ハイブリダイゼーションバッファーの970 μLを追加します。
- HT1の300 μL、20 pM PhiXの25 μL、DALプールの675 μLを組み合わせて最終的な負荷管を作ります。渦とロードチューブをスピンダウン。シーケンサー試薬カートリッジとロードカートリッジのサンプルウェルにロードチューブの全ボリュームを2 x 8のインデックス読み取りで2 x 151 bp読み取りを実行しているシーケンサーに追加します。
2. データ分析
- データの処理と分析の順序付け
- NGS計測器からシーケンスメトリックをダウンロードします。
- シーケンス データが次の範囲に収まれないことを確認します (この例で使用するキットに固有)。クラスター密度 (密度 [K/mm2]): 945 -1600 K;読み渡しフィルタの % (クラスター PF [%]): >90%;品質スコア (% ≥Q30): >85%;PhiX の位置合わせ (整列%): 1.5−6.0%;PhiX エラー率 (エラー率 [%]): <1.0%;読み取りフィルタ (PF [M]を読み取る): >2,200 万。
注: これらのメトリックを満たさないシーケンス実行は、繰り返し行う必要があります。 - 各サンプルに起因する読み取りの%(各サンプル固有のインデックス)を確認します。PhiX スパイクインが ~5% で、8 個のサンプルが配列された一般的な実行では、各サンプルが理想的には読み取りの約 11.9% を占める必要があります。各サンプルの許容範囲は5−25%です。サンプルがこの範囲内に収まらない場合は、ライブラリの定量とシーケンスを繰り返します。
- 分析アルゴリズムへの生シーケンスデータの送信
注: ArcherDx 解析のバージョン 4.1.1.7 について説明します。この例では、分析ソフトウェアは、内部サーバー上で実行される 「仮想マシン」としてデプロイされます。各サンプルを同時に分析するには、1 つの中央処理装置 (CPU) と 12 GB のランダム アクセス メモリ (RAM) が必要です (通常、8 つのサンプルが 8 CPU と 96 GB の RAM を必要とする同時処理されます)。処理には通常 3~8 時間かかります。- MIN_AVERAGE_UNIQUE_RNA_START_PER_GSP2_CONTROLS (これは 10 から 20 に変更されます)と READ_DEPTH_NORMALIZATION (ダウンサンプリングを防ぐために 0 に設定されています) を除き、解析システム内で既定の解析設定を使用します。
- 分析ジョブを開始するには、[ユーザー インターフェイスで分析の実行] をクリックし、ジョブの名前を送信し、必要な FASTQ ファイルを選択します (各サンプルに対して [R1 と R2] の両方の読み取りが選択されていることを確認します)。
- RNA解析タイプにはRNA融合、プラットフォームにはイルミナ(ペアリング)、ターゲット領域にはFusionPlex固形腫瘍パネルを選択します。次に、[分析の送信] をクリックします。
- アッセイデータ解釈
- 分析システムのユーザー インターフェイスを開き、目的のジョブを選択します。正のコントロール サンプルを選択します。すべての予想される融合および発生アイソフォームが検出され、[強い証拠]タブにリストされていることを確認します。
注:正のコントロール内の追跡された融合のいずれかがアッセイの所定の実行に対して検出されない場合、それは(アッセイの最初から)繰り返しを必要とするその実行における問題を示している可能性があります。 - [統計情報の読み取り] タブをクリックして、実行中の各臨床サンプルの読み取り統計を調べます。各サンプルは、少なくとも 100 万個の総フラグメントで表す必要があります。100 万未満の場合は、再定量を考慮してライブラリを再シーケンスし、最初の定量が異常に高くないことを確認します。
注:良質のサンプルは一般的に目標%>85%に表示され、RNA分子ビンは>20,000で、読み取りの>30%を含む必要があります。ただし、これらのメトリックを満たさない場合、サンプル障害は自動的に発生しません。 - GSP2 制御値ごとの平均一意の開始サイトを検査します。
注: この値は、プライマーから 4 つのハウスキーピング 遺伝子へのシーケンシングの複雑さの尺度です。このメトリックは、サンプル中のRNA品質の重要な決定要因です(サンプル中で発現すると予想される遺伝子のシーケンシングが不十分な場合、発現した遺伝子融合を検出する能力に対する信頼度は低くなります)。このメトリックのカットオフは 20 です。いずれかのサンプルに 20 未満の値が表示される場合、高信頼度の融合が見つからない場合、サンプルの結果は非有益であると報告する必要があります。このメトリックのステータスは、実行のサマリー ページで決定することもできます (ステータスは Fusion QC: パスまたはフュージョン QC: 値が 20 未満であるか否かによって、一意の RNA GSP2 コントロール開始サイトの数が低くなります)。このQCメトリックを通過しなかったサンプルの高信頼融合は、それが本物であると判断された場合でも報告することができます(下記参照)。一般に、このメトリックを使用する QC スコアが高いほど、予想どおりに PreSeq Ct スコアが低い (図2)。
- 分析システムのユーザー インターフェイスを開き、目的のジョブを選択します。正のコントロール サンプルを選択します。すべての予想される融合および発生アイソフォームが検出され、[強い証拠]タブにリストされていることを確認します。
- 融合呼び出し解釈
- 強力な証拠タブの下で融合と呼ばれるすべての融合を注意深く精査します(システムによって呼び出される強力な証拠融合の大部分はアーティフィコです)。また、このビン内の非人工核融合の存在は非常にまれな事象であるが、弱い証拠融合ビンをスキャンする。フュージョンの妥当性を評価するには、まず読み取り (#/%)と[サイトの開始] メトリックを確認します。
注: 一般に、融合と呼ばれる融合に対する信頼度は、これらのメトリックが高いほど増加します。5 基未満の開始サイトでサポートされ、サポートプライマーからの読み取りの 10% 未満でサポートされている融合は、アーティフィカルサイトと見なされる必要があります。 - [フィルター] 列に表示されるアイコンをメモします。
注: これらのアイコンのいくつかは、アーティフィカルコールの潜在的なソースをユーザーに警告します。これらの中で頻繁に(そして主に融合と呼ばれる弱い証拠ビンで見られる)は、パートナーが既知のパラログであるか、順番に互いに類似性を示す例です(誤ったプライミングまたは誤ったアライメントを示します)。融合を支持する読み取りが、参照ゲノムへのマッピングが不十分であることを示す高い誤差率が含まれており、これが明確なアイコンに関連付けられている場合に、アーティフィックな融合呼び出しのもう一つの一般的なソースが発生します。転写読み取りイベントは、別のアイコンによって識別されます。これらは一般的であり、一般的には無視されます。他のいくつかのアイコンもユーザー インターフェイスで使用されますが、すべての完全な説明はこの記事の範囲を超えています。一般的に、さらなる調査なしに無視できる一般的なアーティファクトは、次のとおりです。 SYN2-PPARG, DGKG-ETV5, ETV6-AXL, ETV1-ERG, ETV4-ETV1, FGFR3-PDGFRB, EGFR-NTRK1, RAF1-RET, ALK-TFEB, ノッチ1-RET, RELA-RET, NTRK3-ALK, BRAF-ADAMTS8,とFCGR2Cマスト。 - ユーザー インターフェイスのVisualizeリンクをクリックして、個々の融合をサポートする読み取りの積み重ねの Web ベースの JBrowse ビューにユーザーを連れて行くことで、潜在的な融合ごとにサポートする読み取りを視覚化します。読み取りが一般的に不一致(一部のノイズが予想される)がないことを確認し、読み取りの有意な割合(理想的には>30塩基)が融合パートナーに整列し、その配列が遺伝子間のブレークポイントに直結していることを確認します。プライマー バインディング サイトには挿入または削除がありません。整列シーケンスに、融合読み取りをサポートするプライマーのプライマー結合シーケンスの 3' 部分が含まれていることを確認します (3' 部分が含まれていない場合は、ミス プライミングの兆候である可能性があります)。
- 両方の遺伝子のコード配列が融合に関与している場合は、3'パートナーがフレーム内に残っていることを確認してください。インターフェイスの翻訳リンクをクリックし(各参照シーケンスの組み合わせに対してTrueまたはFalseステータスを与えます)、また、呼び出されたブレークポイントの検査を通じて融合がフレーム内にあることを手動で確認します。ゲノムブラウザ。呼び出されたブレークポイントは、融合回路図の赤い点の上にマウスを置くことによって決定できます。
注:正当な融合のためのゲノムブレークポイントのほとんどがイントロニック領域で発生し、エキソン全体のスプライシングをもたらすため、エキソン境界が両方のパートナーのブレークポイントを構成する融合は、一般的に高いレベルで見られます。自信の。しかし、融合には中間エキソニックブレークポイントの例が多く含まれるため、融合の解釈において絶対基準として使用すべきではありません。 - 各融合について、ブレークポイントに隣接するシーケンスが、各パートナーに対して次に予想される連続したベースと同種でないことを手動で確認します。ゲノムブラウザで可能なすべての連続したエキソンを検査します。
注:アーティフィファクト融合の一般的な源は、2つの遺伝子パートナー間の相同性による不整列またはミスプライミングであり、これは常に上記のアイコンを介してシステムによって呼び出されるわけではありません。
- 強力な証拠タブの下で融合と呼ばれるすべての融合を注意深く精査します(システムによって呼び出される強力な証拠融合の大部分はアーティフィコです)。また、このビン内の非人工核融合の存在は非常にまれな事象であるが、弱い証拠融合ビンをスキャンする。フュージョンの妥当性を評価するには、まず読み取り (#/%)と[サイトの開始] メトリックを確認します。
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Representative Results
図3、図4および図5に示すのは、肺腺癌サンプルからの結果を示す分析ユーザーインターフェースからのスクリーンショットである。図 3では、サンプルサマリーが示され(上)、いわゆる強い証拠融合と QC ステータス (赤で囲まれた) が表示されます。ADCK4-NUMBL融合(そのうち3つのアイソフォームがリストされている)は、永続的な転写読み取りイベント(リストの横にある壊れた円のアイコンによって示される)であるため、直ちに無視されます。図 3の下部は、[統計情報の読み取り] ページのスクリーンショットです。特に有益なメトリックは緑色で囲みます。サンプルの合格/不合格の性質を決定する重要な QC メトリックは赤で強調表示されます (これは、上記の要約で合格/不合格の状態を決定するメトリックです)。この値が 20 未満の場合、負の融合結果は「非有益」と見なされます。図 4と図 5は、融合回路図 (上) と JBrowse の融合支持の図のスクリーンショットです (下) さらに調査を行う必要がある 2 つの融合の読み取り (下) です。KIF5B-RET融合 (図4) は、支持読み取りの数が多く、融合をサポートするプライマーからの読み取り率が高く、開始部位の数が多いことがわかります。さらに、融合パートナー(KIF5B)のいくつかの連続したエキソンがアライメントに含まれ、融合がフレーム内にあることを検証され、融合を支持する読み取りは一般的に不一致を持ちません。これらの理由から、融合は現実的で報告可能とみなされます。LOC101927681-PDGFRB融合(図5)は、より低い支持メトリックを示しています。さらに、パートナーへのマッピングの部分は比較的短く、誤差率が高く、不整列と実際の融合呼び出しを強く示唆しています。最後に、PDGFRBのイントロニック配列が含まれており、さらにアーティファクトを示唆しています(ほとんどの正当な融合は、両方の遺伝子のコード領域にマップする配列のみで構成されています)。これらの理由から、この融合はアーティファクトとみなされ、報告できません。
図1:AMP アプローチの概略表現。ターゲットエンリッチメントのための従来のアンプリコン媒介アプローチは、すべての融合パートナーにプライマーが必要であるという事実によって制限されます。したがって、新しい融合パートナーは検出されません。AMP では、対向するプライマーはアダプターに固有であるため、新しいパートナーが検出されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 2: PreSeq QC スコアと後シーケンシング QC の相関関係。PreSeq Ct および GSP2 コントロール値あたりの平均一意の開始サイトは、一連の 100 サンプルに対して相関していました。一般に、予想どおり、PreSeq スコアが低いほど、SS/GSP2 値が高くなります (どちらも良質 RNA の指標です)。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 3: サンプルサマリーと読み取り統計ビューの例。上: 強力な証拠融合がリストされているユーザー インターフェイスのサンプルサマリーのビュー。下: ユーザー インターフェイスの読み取り統計ページのビュー。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図 4: 正当な融合呼び出しの例。上: ユーザー インターフェイスの融合回路図のビュー。下: 融合をサポートする個々の読み取りの JBrowse ビュー。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:アーティフィカルな融合呼び出しの例。上: ユーザー インターフェイスの融合回路図のビュー。下: 融合をサポートする個々の読み取りの JBrowse ビュー。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
| AKT3 | EWSR1 | ノッチ1 | プルッカ |
| Alk | FGFR1 | ノッチ2 | PRKCB |
| ARHGAP26 | FGFR2 | NRG1 | ラフ1 |
| Axl | FGFR3 | NTRK1 | レラ |
| Braf | FGR | NTRK2 | Ret |
| BRD3 | インス | NTRK3 | ロス1 |
| BRD4 | マムル2 | ヌンベル | RSPO2 |
| Egfr | マスト1 | ナットム1 | RSPO3 |
| Erg | マスト2 | PDGFRA | テルト |
| エスル1 | 会った | PDGFRB | TFE3 |
| ETV1 | MSMB | PIK3CA | TFEB |
| ETV4 | ムスク | PKN1 | タダ |
| ETV5 | マイブ | PPARG | TMPRSS2 |
| ETV6 | |||
| アッセイは、上記53遺伝子中の様々なエキソン(および一部のイントロン)に対する遺伝子特異的プライマーを含む。 | |||
補足表1:遺伝子特異的プライマーがアッセイに含まれる遺伝子のリスト(様々なエキソンおよびイントロンに)。
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Discussion
アンカー多重PCRベースの標的濃縮およびライブラリー調製に続いて次世代シーケンシングは、臨床腫瘍サンプルにおける多重遺伝子融合評価に適しています。ゲノムDNAではなくRNA入力に焦点を当てることで、大きく反復的なイントロンを配列する必要性が回避されます。さらに、このアプローチは、融合パートナーの同一性にかかわらず遺伝子融合を増幅するため、新規の融合が検出される。これは臨床領域における重要な利点であり、AMPを通じて同定された実用可能な新規遺伝子融合の多くの例が文献21、22、23、24、および、 25.
アッセイはRNAベースであるため、処理中にサンプル中のRNA品質を保持することが重要です。また、どのサンプルがRNAシーケンシングを生成したかを判断することも重要です。これは、プライマーから4つのハウスキーピング遺伝子へのシーケンシングデータの評価によって達成されます。これらの遺伝子の配列が悪い場合、負の融合結果は有益でないとみなされます。さらに、アッセイ内のウェットベンチステップの複雑さと多数を考えると、すべてのアッセイ実行に融合陽性制御を含める必要があります。これにより、コントロール内で予想される核融合イベントの解析を通じて、侵害されたアッセイランが明らかになります。
すべてのアンプリコンベースのアプローチと同様に、AMPは個々のプライマー性能に大きく依存しています。複数の遺伝子の複数のエキソンを評価する場合、一部のプライマーが他の遺伝子と同様に実行しないことは避けられません。したがって、プライマーの非効率性により、アッセイのパフォーマンスが低下する場所をユーザーが知ることは重要です。さらに、NGSベースのアッセイには、複雑なバイオインフォマティクスデータ分析が必要です。採用されたアルゴリズムが思慮深く設計されていない場合は、偽陰性および偽陽性の結果が生じる可能性が高い。解析アルゴリズムによって呼び出されるすべての遺伝子融合は、ユーザーが手動で検査することが非常に重要です。
臨床腫瘍標本で評価されるべき実行可能な遺伝子融合のリストが増え続ける中、AMPのような多重化アッセイの使用は臨床検査室で増加し続けるでしょう。この技術の将来の応用は、単一のアッセイ内での融合と突然変異評価の組み合わせに焦点を当てる可能性が高い。分子アッセイアプローチにかかわらず、ユーザーは常にアッセイの限界を認識し、データ解釈を導く品質管理メトリックを常に確立する必要があります。
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Disclosures
D.L.A.はバイエル腫瘍学、ジェネンテック、AbbVie、ブリストルマイヤーズスクイブからコンサルティング料を受け取っています。K.D.D.はアーチャーDxからスポンサー旅行を受け取りました。
Acknowledgments
この研究は、コロラド大学の分子病理学共有リソース(国立がん研究所がんセンター支援助成金第1号)によって支援されました。P30-CA046934)とコロラド州パーソナライズド医療センターによって。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10 mM Tris HCl pH 8.0 | IDT | 11-05-01-13 | Used for TNA dilution |
| 1M Tris pH 7.0 | Thermo Fisher | AM9850G | Used in library pooling |
| 25 mL Reagent Reservoir with divider | USA Scientific | 9173-2000 | For use with multi-channel pipetters and large reagent volumes |
| 96-well TemPlate Semi-Skirt 0.1mL PCR plate-natural | USA Scientific | 1402-9700 | Plate used for thermocycler steps |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | Used in purification after several assay steps |
| Agencourt Formapure Kit | Beckman Coulter | A33343 | Used in TNA extraction |
| Archer FusionPlex Solid Tumor kit | ArcherDX | AB0005 | This kit contains most of the reagents necessary to perform library preperation for Illumina sequencing (kits for Ion Torrent sequencing are also available) |
| Cold block, 96-well | Light Labs | A7079 | Used for keeping samples chilled at various steps |
| Ethanol | Decon Labs | DSP-MD.43 | Used for bead washes |
| Library Quantification for Illumina Internal Control Standard | Kapa Biosystems | KK4906 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Primers and ROX Low qPCR mix | Kapa Biosystems | KK4973 | Used for library quantitation |
| Library Quantification Standards | Kapa Biosystems | KK4903 | Used for library quantitation |
| Magnet Plate, 96-well (N38 grade) | Alpaqua | A32782 | Used in bead purificiation steps |
| MBC Adapters Set B | ArcherDX | AK0016-48 | Adapters that contain sample-specific indexes to enable multiplex sequencing |
| Micro Centrifuge | USA Scientific | 2641-0016 | Used for spinning down PCR tubes |
| MicroAmp EnduraPlate Optical 96 well Plate | Thermo-Fisher | 4483485 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| Microamp Optical Film Compression Pad | Applied Biosystems | 4312639 | Used for library quantitation |
| Mini Plate Spinner | Labnet | MPS-1000 | Used for collecing liquid at bottom of plate wells |
| MiSeq Reagent Kit v3 (600 cycle) | Illumina | MS-102-3003 | Contains components necessary for a MiSeq sequencing run |
| MiSeqDx System | Illumina | NGS Sequencing Instrument | |
| Model 9700 Thermocycler | Applied Biosystems | Used for several steps during assay | |
| nuclease free water | Ambion | 9938 | Used as general diluent |
| Optical ABI 96-well PCR plate covers | Thermo-Fisher | 4311971 | Used for Pre-Seq QClibrary quantitation |
| PCR Workstation Model 600 | Air Clean Systems | BZ10119636 | Wet-bench assay steps performed in this 'dead air box' |
| Proteinase K | Qiagen | 1019499 | Used in TNA extraction |
| QuantStudio 5 | Applied Biosystems | LSA28139 | qPCR instrument used for PreSeq and library quantitation |
| Qubit RNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32855 | Use for determing RNA concentration in TNA samples |
| RNase Away | Fisher | 12-402-178 | Used for general RNase decontamination of work areas |
| Seraseq FFPE Tumor Fusion RNA Reference Material v2 | SeraCare | 0710-0129 | Used as the assay positive control |
| Sodium Hydroxide | Fisher | BP359-212 | Used in clean-up steps and for sequencing setup |
| SYBR Green Supermix | Bio Rad | 172-5120 | Component of PreSeq QC Assay |
| TempAssure PCR 8-tube Strips | USA Scientific | 1402-2700 | Used for reagent and sample mixing etc. |
| Template RT PCR film | USA Scientific | 2921-7800 | Used for covering 96-well plates |
| U-Bottom 96-well Microplate | LSP | MP8117-R | Used during bead purification |
References
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