Summary
Analyse af Tick hemolymph repræsenterer en vigtig kilde til information om, hvordan nogle patogener forårsage sygdom og hvordan flåter immunologisk reagere på denne infektion. Nærværende undersøgelse viser, hvordan man inokulere svampe spredningslegemer og indsamle hæmolymph fra rhipicephalus microplus engorged kvinder.
Abstract
Flåter er forpligte hæmatophagøse ektoparasitter og rhipicephalus microplus har stor betydning i veterinærmedicin, fordi det forårsager anæmi, vægttab, afskrivning af dyrenes læder og også kan fungere som en vektor af flere patogener. På grund af de enorme omkostninger til at kontrollere disse parasitter, skader på miljøet forårsaget af uhensigtsmæssig brug af kemiske acaricider, og den øgede resistens over for traditionelle parasiticider, alternativ kontrol af flåter, ved hjælp af entomopatogene svampe, for eksempel, er blevet betragtet som en interessant tilgang. Ikke desto mindre har kun få undersøgelser vist, hvordan Tick immunsystem virker til at bekæmpe disse entomopathogens. Derfor, denne protokol viser to metoder, der anvendes til entomopatiogen inokulering i engorged kvinder og to teknikker, der anvendes til hæmolymph indsamling og hemocytes høst. Inokulation af patogener på benet indsættelse i kryds hundens krop tillader evaluering af hunner biologiske parametre i modsætning til inokulation mellem scutum og kapitulum, som ofte skader Genés orgel. Dorsal hæmolymph samling gav en højere volumen opsving end indsamling gennem benene. Nogle begrænsninger af flåt hæmolymph indsamling og behandling omfatter i) høje rater af hemocytes ' afbrydelse, II) hæmolymph forurening med forstyrret midgut, og III) lav hæmolymph volumen opsving. Når hæmolymph er indsamlet gennem benet skæring, hæmolymph tager tid at akkumulere på benet åbning, favoriserer koagulations processen. Desuden opnås færre hemocytter i samlingen gennem benet i forhold til rygsamlingen, selvom den første metode anses for lettere at blive udført. Forståelse af immunrespons i flåter medieret af entomopathogenic agenter hjælper med at afsløre deres patogenese og udvikle nye mål for flåt kontrol. De her beskrevne inokulations processer kræver meget lave teknologiske ressourcer og kan ikke kun anvendes til at afsløre flåter til patogene mikroorganismer. Tilsvarende, indsamlingen af flåt hæmolymph kan repræsentere det første skridt for mange fysiologiske undersøgelser.
Introduction
Kvæg flåt, Rhipicephalus microplus, er en hæmatophagus Ectoparasite med en enorm negativ indvirkning på husdyr i tropiske områder. Dette kryds er vektor af patogene agenser såsom babesia bovis, babesia bigemina, og anaplasma marginale , at kombineret med den direkte hemofeeding skader, kan reducere mælk og kødproduktion, forårsage anæmi og i sidste ende døden. Tab forårsaget af denne Ectoparasite blev anslået i 3.240.000.000 dollars om året i Brasilien1. Bæredygtige metoder er påkrævet, og brugen af entomopathogenic agenter betragtes som et lovende alternativ til at reducere brugen af kemiske acaricider2,3,4.
Entomopatogene svampe, såsom Metarhizium spp., er naturlige fjender af leddyr, herunder flåter, og nogle isolater kan bruges som biocontrollere. Disse patogener inficere aktivt værten gennem neglebånd og kolonisere deres krop2,5,6. Som infektionen udvikler, cellulære og humorale reaktioner medieres af flåt immunsystemet. Analyse af kryds hemolymph er rapporteret som et nyttigt redskab til at vurdere immunrespons efter den udfordrende med patogener7,8.
Arthropods ' immunrespons er opdelt i humorale og cellulære reaktioner. Den humorale respons involverer hæmagglutination processer og produktion af antimikrobielle proteiner/peptider, mens den cellulære immunrespons udføres gennem hemocytes. Disse celler er til stede i hæmolymph fra alle leddyr og er rapporteret til at udvikle en udtryksfulde rolle i undersøgelser, der involverer medfødt immunrespons9, da det er direkte relateret til fagocytose og indkapsling processer. Derfor undersøgelser om hemocytes kan bidrage til at undersøge død pathway og forstå processer såsom autophagy, apoptose, og nekrose. I nogle invertebrater som biventiler, den hemocytes ' samling ansigter begrænsninger som celleforstyrrelse, lav hæmolymph volumen opnået, og lav koncentration af gendannede celler10. Meget hyppigt, afhængigt af den anvendte metode, er reduceret koncentration af celler opnået, påvirker direkte på celler kvantificering og analyse.
Antallet af hemocytter cirkulerer i hæmolymph er variabel blandt forskellige leddyr og det kan ændre sig i de samme arter på grund af forskellige fysiologiske stadier såsom køn, alder, og leddyr er udviklingsmæssige fase11. Hemocytter kan også findes overholdt nogle organer og blive frigivet i omløb lige efter infektionen proces11. Ikke desto mindre, de fleste undersøgelser rapporterede bruge insekter, mens flåter forbliver mindre udforsket med hensyn til deres fysiologi og patologi. Trods patogen inokulation og hæmolymph indsamling i flåter er mindre anvendte teknikker, etablering af standardmetoder hjælper udviklingen af mere præcise undersøgelser.
Formålet med denne undersøgelse var at sammenligne de mest anvendte metoder til hæmolymph indsamling og inokulering af patogener i R. microplus flåter, evaluere effekten i hæmolymph erhvervelse og hemocytes koncentration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Flåter, der anvendes i denne undersøgelse, er fremstillet af en kunstig koloni, der er blevet anvendt ved Federal Rural University of Rio de Janeiro, og som er blevet godkendt af Udvalget for etik vedrørende brug af hvirveldyr (CEUA-IV/UFRRJ #037/2014).
1. Afkryds de engorged hunner
- Efter flåt indsamling, vask engorged hunner ved hjælp af vand fra hanen og fordybe dem i 0,5% (v/v) natriumhypochlorit opløsning i 3 min i en 500 mL bægerglas recipient, for neglebånd hygiejne (figur 1), derefter tørre alle kvinder ved hjælp af sterile papirservietter (figur 2).
- Dividerer hunnerne i homogene vægtede grupper (med 20 hunner hver): en gruppe uden behandling, en kontrolgruppe inokuleret med 5 μL 0,1% polyoxyethylensorbitanmonooleat vandig opløsning (v/v) og en inficeret-gruppe inokuleret med 5 μL ved 1,0 x 10 7 blastosporer ml-1.
Bemærk: kun ubehandlet flåter blev brugt til volumen og hemocyte koncentration. Tre replikater af hver gruppe blev udført.
2. patogener inokulering mellem scutum og kapitulum
Bemærk: i nærværende undersøgelse blev entomopatogene svampe suspensioner anvendt som et eksempel.
- Svampe blastosporer suspenderes i 1 mL 0,1% polyoxyethylensorbitanmonooleat vandig opløsning (v/v) og justeres til en slutkoncentration på 1,0 x 107 blastosporer ml-1. Der tilsættes en alikvot på 5 μL Metarhizium blastosporer (figur 3) til overfladen af en plastik paraffin film.
Bemærk: Metarhizium blastosporer suspension blev justeret ved hjælp af en Neubauer ́s kammer. For at fremskynde inokulations processen kan der tilsættes flere bobler til plast paraffin filmens overflade, hver boble svarende til 5 μL. - Brug en 1 mL ultra-fin insulin sprøjte og en 0,3 mm nål til at trække suspensionen og inokulere den i kryds. Husk at tage al luften ud af sprøjten, før du bruger den.
- Der inokuleres 5 μL svampe suspension i kryds kvinden mellem scutum og kapitulum. Inokulere hunnerne fra kontrolgruppen med 5 μL 0,1% polyoxyethylensorbitanmonooleat vandig opløsning (v/v) uden svamp.
Bemærk: en lille mængde hæmolymph kan være til stede på foramen efter nålen indsættelse. Vær omhyggelig med ikke at inokulere luft.
3. inokulation af entomopatogene svampe mellem benet lår og flåt hundens krop
- Inokulere hunnerne med svampe suspension (5 μL ved 1,0 x 107 blastosporer ml-1) mellem benet og kvindens krop ved hjælp af en 1 ml ultra-fin insulin sprøjte koblet til en 0,3 mm nål. Inokulere hunnerne fra kontrolgruppen med 5 μL 0,1% polyoxyethylensorbitanmonooleat vandig opløsning (v/v).
Bemærk: når Metarhizium blastosporer inokulering udføres mellem benet og den kvindelige flåt, kan en lille mængde hæmolymph være til stede på Tigh efter nålen indsættelse. Vær omhyggelig med ikke at inokulere luft.
4. dorsale hæmolymph samling
- Brug gummidelen af en bevinget infusionssæt, en 0,3 mm kapillar tube, og en filtreret spids til at udføre hæmolymph samling.
- Forstyrre den kvindelige dorsale cutikel ved hjælp af en 0,3 mm nål.
- Efter afbrydelse skal der anvendes et forsigtigt Tryk på den forreste del af kryds legemet. Overhold en næsten transparent væske, der trækker ud af forstyrrelsen. Saml Hæmolysen ved at sutte væsken gennem filter spidsen koblet til gummidelen af et bevinget infusionssæt og et 0,3 mm kapillar rør.
Bemærk: Tryk ikke på flådens krop næppe under sin immobilisering, fordi dette kan forstyrre midgut) og forurere hæmolymph. Vent, indtil det blide tryk kan udvise væsken uden kontaminering.
5. hemolymph samling fra flåt benet
- Immobilier kryds, skær et stykke af en forreste ben med et par saks.
Bemærk: en eller flere ben kan skæres, samt det samme ben kan skæres mere end én gang. - Påfør forsigtigt trykket på flådens bageste kropsdel. Overhold en transparent væske boble, der dukker op på det afskårne sted og Saml den med Kapillarrøret, som beskrevet i trin 4,3.
Bemærk: Tryk ikke på flådens krop næppe under sin immobilisering, fordi dette kan forstyrre midgut) og forurere hæmolymph. Vent, indtil det blide tryk kan udvise væsken uden kontaminering.
6. hæmolymph behandling
- Efter hæmolymph-opsamling skal den deponeres i 1,5 mL-mikrorør, der tidligere er fyldt med 30 μL proteasecocktail og 82 μL saltvands buffer. Hold mikrorørene på is i hele hæmolymph samling.
- Centrifuge prøverne (500 x g i 3 min ved 4 °c). En blød pille af hemocytes vil blive dannet efter hæmolymph centrifugering.
Bemærk: for hæmolymph kvantificering, kvantificere hæmolymph volumen opnået ved at tælle den samlede mængde inde i mikrorøret og diskontering mængden af proteasecocktail og saltvands buffer. - Fjern forsigtigt supernatanten (celle-fri hæmolymph). Resuspender forsigtigt cellerne i, for eksempel, Leibovitz ' L-15-kultur justeret til pH 7.0-7.2. Kvantificere hemocytes ved at placere 10 μL resuspenderede hæmoocytter i et Neubauer kammer.
7. hemocyte prøvetagning slide forberedelse
- Skær flådens forreste ben med et par saks.
- Påfør forsigtigt trykket på flådens bageste kropsdel. Overhold en transparent væske boble, der dukker op på det afskårne sted.
- Påfør hæmolymph dråber direkte på rene mikroskop slides, efter at bruge tilegnede metoder til at plette cellerne.
- For at plette hemocytter ved hjælp af Giemsa, luft-tør hæmolymph på sliden i 30 min, ordne det ved stuetemperatur med methanol i 3 min, og plet i Giemsa løsning (1:9 ratio af Sørensens bufferopløsning, pH 7,2) i 30 min ved stuetemperatur. Vask slidene med rindende vand for at fjerne det overskydende farvestof, luft-tør sliden og Evaluer cellerne ved 400x i et optisk mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne artikel nærmer inokulering og hæmolymph indsamlingsmetoder anvendes til flåter. Efter inokulationen mellem benet lår og kryds hundens krop, nogle væske (hæmolymph) kan udskilles under processen; Det er dog vigtigt at bemærke, at når inokulationen er færdig, var der ingen væske eller væv i nålens spids eller på inokulationsstedet, hvilket sikrede, at svampe suspensionen blev fuldstændig inokuleret. Når inokulations processen blev udført korrekt, var nåle indsættelsen ikke årsag til flåt hundens død. På den anden side, flåter døde ca 48 h efter inokulation af entomopathogenic svamp. Inokulation mellem benet lår og Tick hundens krop kan beskadige flåt interne organer såsom midgut) og Malpighian tubuerne, mens skader på gens orgel kan forekomme under inokulation mellem scutum og kapitulum.
Når flåt midgut) forstyrres af nålen under rygnings hemolymph samling, den opnåede væske er rød, ikke farveløs. Dette indikerer en forkert hæmolymph samling. I disse tilfælde skal hæmolymph kasseres, da det er forurenet med tarmindhold.
Den korrekte hæmolymph samling er afgørende for korrekt gennemføre eksperimenter og opnå pålidelige resultater. Når hæmolymph blev indsamlet fra cut flåtben (n = 20 flåter homogen vejet), den opnåede mængde var lavere end den samlede hæmolymph opnået fra rygsamlingen (n = 20 flåter homogent vejet) (figur 4). Det foreslås, at på grund af den lave volumen af hver dråbe, der trækker ud af snittet ben, hæmolymph Koagulering kan være ofte til stede under denne proces af hæmolymph samling. Dette kan påvirke indkøbet og klassificeringen af hemocytterne negativt (figur 5 og figur 6). Trods den højere volumen opnåelse af hæmolymph, den rygsamling anses for vanskeligere at blive udført.
Figur 1 : Flåter ' kutikula hygiejne. Rhipicephalus microplus fuldt engorged hunner blev vasket ved hjælp af ledningsvand og nedsænket i 0,5% natriumhypochlorit opløsning (v/v) i 3 min i en 500 ml bægerglas modtager. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Flåter ' tørring af neglebånd. Rhipicephalus microplus fuldt engorged hunner blev tørret ved hjælp af sterile papirhåndklæder. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Metarhizium blastosporer. Svampe propaluges, der anvendes i flåt inokulering. Skaleringsbar = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Repræsentativ graf demonstrerer hæmolymph volumen opnået med hver kollekton metode. Rhipicephalus microplus hæmolymph volumen opnået efter dorsale eller ben samling. Der blev anvendt en pulje på 20 homogene vejede flåter til hver metode. Disse flåter blev ikke tidligere inokuleret. Middelværdier ± standardafvigelsen efterfulgt for samme bogstav afviger ikke statistisk efter analyse af varians (ANOVA) (P ≥ 0,05). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Hemocytes koncentration opnået med hver hæmolymph indsamlingsmetode. Rhipicephalus microplus hemocytes koncentration opnået efter opblanding i Leibovitz ' L-15 kulturmedium efter rygnings-eller benkollektion. De gennemsnitlige værdier ± standardafvigelsen, der er fulgt for samme bogstav, afviger ikke statistisk efter Kruskal-Wallis-testen (P ≥ 0,05). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Hemocytter fundet i Rhipicephalus microplus hæmolymph smøre. R. microplus hemocytes blev plettet af Giemsa. Sorte pile angiver de forskellige celler i kryds hemolymph. Skaleringsbar = 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inokulation af patogener er nyttigt, når undersøgelsen har til formål at undersøge in vivo-virkningen af mikroorganismer i eksperimentelle leddyr modeller, fordi det forsikrer, at patogenet er inde i værten. Teknikken kan også anvendes til inokulate molekyler såsom RNA interferens (RNAi). Inokulation mellem scutum og kapitulum anses for lettere at udføre, men ofte skader genés orgel, hvilket forringer æggenes levedygtighed12,13. Genés orgel er anatomisk placeret tæt på den forreste del af capitum, og det er et vigtigt organ for flåt æglægnings14. Derfor er inokulation mellem benet og kvindens krop mere passende, hvis undersøgelsen kræver observation af hundens biologiske parametre, da Genés orgel ikke vil blive skadet. På trods af inokulations metoden mellem benet lår og flådens krop anses for vanskeligere og let beskadige eller eksponere Tick indre organer, såsom midgut) og Malpighian tubules, når det er godt udført, vil det ikke forstyrre disse organer.
Hæmolymph analyse er afgørende for at forstå leddyr immunsystemet samt at forstå patogenese15,16. Derfor kryds hæmolymph kan bruges til at afsløre kryds fysiologi, forsikre flåt smitteevne, forstå flåt-patogen interaktioner, og den cellulære og humorale immunrespons9,17,18.
Tick hemolymph indsamling gennem benet skæring er rapporteret i flere undersøgelser19,20,21. På trods af denne metode er enkel med ingen eller meget lav hæmolymph forurening, det betragtes som kontraproduktiv for undersøgelser, der kræver høje koncentrationer af hemocytes eller store mængder af hæmolymph. På den anden side, den korrekte udførelse af hæmolymph samling gennem rygfinne regionen af engorged hunner er ikke let at opnå, da tarmen indtager næsten hele flåt krop og brud det med nålen forårsager hæmolymph forurening. Kontaminering på grund af tarmforstyrrelser kan også observeres, når kryds er naturligt inficeret med høje belastninger af hemoparasites (dvs., Babesia spp.), eller i de sidste trin af døds processen forårsaget af entomopathogens8. I disse tilfælde skal hæmolymph kasseres, da hemocytter og plasma analyser kan blive påvirket.
Centrifugeringshastigheden af hæmolymph prøver for hemocytes høst er også vigtigt og direkte indflydelse på hemocytes koncentration, da høj relative centrifugal felt (RCF) hastigheder bidrager til: i) celle pellet vanskeligt at resuspendere, II) celler forstyrrelser, og III) hemocytter degranulering. Den ideelle celle pellet er en blød pellet let at resuspendere. Derfor blev centrifugeringen ved 500 x g i tre minutter ved 4 °c8 anvendt. I denne undersøgelse blev hemocytter resuspenderet i et dyrkningsmedium og ikke i fosfat-Buffered saltvand (PBS), fordi kulturmediet understøtter bedre cellers levedygtighed.
De metoder, der præsenteres her kan stå over for begrænsninger, når de anvendes til immatures stadier (larve og nymfe) af flåter eller ufodret voksne. Den inokulations metode, for eksempel, anvendes kun for voksne engorged kvinder, fordi nålen størrelse vil skade umodne stadier og muligvis ufodret voksne flåter. For at inokulere disse stadier skal der anvendes en mikroinjektor. Tilsvarende, hæmolymph samling gennem rygfinne regionen er mere effektiv, når den anvendes til engorged flåter, mens hæmolymph indsamling ved at skære benene kan anvendes i undersøgelser med ufodret voksne flåter eller umodne stadier. På trods af dette, vores mål her var at vise metoder, der kræver meget lave teknologiske ressourcer. Desuden skal Centrifugerings teknikken udføres ved lav Centrifugerings kraft, fordi høj kraft eller forlænget spin tid kan beskadige cellerne.
De metoder, der oplyses her kan bruges som retningslinjer for undersøgelser, der involverer inokulering af entomopathogens i flåter og hæmolymph/hemocytes høst. De teknikker, der præsenteres her kræver meget lave teknologiske ressourcer og er klassiske trin for undersøgelser om kryds fysiologi, patologi, og flåt immunrespons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev delvis finansieret af Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) fra Brasilien, Finance Code 001. CAPES leverede Ph.D. stipendium til A.F. Marciano. Vi takker det nationale råd for videnskabelig og teknologisk udvikling (CNPq) i Brasilien for at levere Ph.D. stipendium til J. Fiorotti. Denne forskning blev også støttet af tilskud fra Carlos Chagas Filho Foundation for Research i staten Rio de Janeiro (FAPERJ) og CNPq. V.R.E.P. Bittencourt er en CNPq forsker.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alkaline Hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | A1727 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| EDTA | Synth | 2706 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000036 | |
| Flexible rubber | BD | ||
| Giemsa stain | Sigma-Aldrich | 48900-500ML-F | |
| Glass capillary | CTechGlass | CT95-02 | |
| Insulin syringe (needle) | BD | SKU: 324910 | |
| KH2PO4 | Vetec | 60REAVET014512 | |
| Leibovitz's L-15 culture medium | Gibco | 11415-064 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| Microscope slides | Kasvi | K5-7105 | |
| Microtubes | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Na2HPO4 | Vetec | 60REAVET014593 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Neubauer chamber | Kasvi | K5-0111 | |
| Penicillin | Gibco | 15140163 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 |
References
- Grisi, L., et al. Reassessment of the potencial economic impact of cattle parasites in Brazil. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 23 (2), 150-156 (2014).
- Schrank, A., Vainstein, M. H. Metarhizium anisopliae enzymes and toxins. Toxicon. 56 (7), 1267-1274 (2010).
- Camargo, M. G., et al. Metarhizium anisopliae for controlling Rhipicephalus microplus ticks under field conditions. Veterinary Parasitology. 223, 38-42 (2016).
- Perinotto, W. M. S., et al. In vitro pathogenicity of different Metarhizium anisopliae s.l. isolates in oil formulations against Rhipicephalus microplus. Biocontrol Science and Technology. 27 (3), 338-347 (2017).
- Pedrini, N., Crespo, R., Juarez, M. P. Biochemistry of insect epicuticle degradation by entomopathogenic fungi. Comparative Biochemistry and Physiology. Part C: Toxicology and Pharmacolpgy. 146 (1-2), 124-137 (2007).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Action on the surface: Entomopathogenic fungi versus the insect cuticle. Insects. 4 (3), 357-374 (2013).
- Angelo, I. C., et al. Detection of serpins involved in cellular immune response of Rhipicephalus microplus challenged with fungi. Biocontrol Science and Technology. 24 (3), 351-360 (2014).
- De Paulo, J. F., et al. Rhipicephalus microplus infected by Metarhizium: unveiling hemocyte quantification, GFP-fungi virulence, and ovary infection. Parasitology Research. 117, 1847-1856 (2018).
- Marmaras, V. J., Lampropoulou, M. Regulators and signalling in insect haemocyte immunity. Cell Signal. 21, 186-195 (2009).
- Hinzmann, M. F., Lopes-Lima, M., Gonçalves, J., Machado, J. Antiaggregant and toxic properties of different solutions on hemocytes of three freshwater bivalves. Toxicological & Environmental Chemistry. 95, 790-805 (2013).
- Nation, J. L. Insect Physiology and Biochemistry. , University of Florida. Gainesville, FL. (2016).
- Gene, J. Mémoires de l'Académie royale des sciences. Torino. 9, 751 (1848).
- Lees, A. D., Beament, J. W. L.
- Sonenshine, D. E., Roe, R. M. Biology of ticks. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2014).
- Tan, J., et al. Characterization of hemocytes proliferation in larval silkworm Bombyx mori. Journal of Insect Physiology. 59 (6), 595-603 (2013).
- Bowden, T. J. The humoral immune systems of the American lobster (Homarus americanus) and the European lobster (Homarus gammarus). Fish Research. 186, 367-371 (2017).
- Sonenshine, D. E., Hynes, W. L. Molecular characterization and related aspects of the innate immune response in ticks. Frontiers in Bioscience. 13, 7046-7063 (2008).
- Tsakas, S., Marmaras, V. Insect immunity and its signaling: an overview. Invertebrate Survival Journal. 7, 228-238 (2010).
- Burgdorfer, W. Hemolymph Test. A technique for detection of Rickettsiae in ticks. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 19, 1010-1014 (1970).
- Dunham-Ems, S. M., et al. Live imaging reveals a biphasic mode of dissemination of Borrelia burgdorferi within ticks. Journal of Clinical Investigation. 119, 3652-3665 (2009).
- Patton, T. G., et al. Saliva, salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks. Journal of Visualized Experiments. 60, e3894 (2012).
