Summary
Analyse av tick hemolymph representerer en viktig kilde til informasjon om hvordan noen patogener forårsake sykdom og hvordan flått immunologisk svare på denne infeksjonen. Den nåværende studien viser hvordan du vaksinere fungal propagules og samle hemolymph fra Rhipicephalus MicroPlus engorged kvinner.
Abstract
Flått er forplikte hematophagous ektoparasitter og Rhipicephalus MicroPlus har stor betydning i veterinærmedisin fordi det forårsaker anemi, vekttap, avskrivninger av dyrene ' lær og kan også fungere som en vektor av flere patogener. På grunn av den ublu kostnadene for å kontrollere disse parasitter, skade på miljøet forårsaket av upassende bruk av kjemiske acaricides, og den økte motstanden mot tradisjonelle parasiticides, alternativ kontroll av flått, ved bruk av Entomopathogenic sopp, for eksempel, har vært betraktet som en interessant tilnærming. Likevel har noen studier vist hvordan tick immunsystem fungerer for å bekjempe disse entomopathogens. Derfor demonstrerer denne protokollen to metoder som brukes for entomopathogen inoculation i engorged hunner og to teknikker som brukes for hemolymph innsamling og hemocytes høsting. Inoculation av patogener ved beinet innsetting i tick kvinnens kropp tillater evaluering av kvinner biologiske parametre i motsetning til inoculation mellom scutum og capitulum, som ofte skader Gené's organ. Rygg hemolymph samling ga en høyere volum utvinning enn samlingen gjennom bena. Noen begrensninger av tick hemolymph samling og prosessering inkluderer i) høy forekomst av hemocytes ' avbrudd, II) hemolymph forurensning med forstyrret midttarm, og III) lav hemolymph volum utvinning. Når hemolymph er samlet gjennom beinet skjæring, hemolymph tar tid å akkumulere på beinet åpningen, favoriserer blodpropp prosessen. I tillegg oppnås det færre hemocytes i samlingen gjennom benet i forhold til rygg samlingen, selv om den første metoden anses som lettere å utføre. Forstå immunresponsen i flått formidlet av Entomopathogenic agenter bidrar til å avsløre sine patogenesen og utvikle nye mål for tick kontroll. De inoculation prosessene som beskrives her krever svært lave teknologiske ressurser og kan brukes ikke bare til å utsette flått for patogene mikroorganismer. Tilsvarende kan samlingen av tick hemolymph representerer det første skrittet for mange fysiologiske studier.
Introduction
Storfe Tick, Rhipicephalus MicroPlus, er en hematophagus ektoparasitt med en enorm negativ innvirkning på husdyr i tropiske områder. Dette tick er vektoren for patogene midler som Babesia bovis, Babesia Bigemina, og Anaplasma marginale som, kombinert med direkte hemofeeding skade, kan redusere melk og kjøttproduksjon, forårsake anemi og til slutt død. Tap forårsaket av denne ektoparasitt ble anslått i 3 240 000 000 dollar årlig i Brasil1. Bærekraftige metoder er etterspurt og bruk av Entomopathogenic midler er ansett som et lovende alternativ for å redusere bruken av kjemiske acaricides2,3,4.
Entomopathogenic sopp, som Metarhizium spp., er naturlige fiender av leddyr inkludert flått, og noen isolerer kan brukes som biocontrollers. Disse patogener aktivt infisere verten gjennom cuticle og kolonisere kroppen2,5,6. Som infeksjonen utvikler, Cellular og humoral svar er formidlet av tick immunsystem. Analyse av tick hemolymph er rapportert som et nyttig verktøy for å evaluere immunresponsen etter utfordrende med patogener7,8.
Leddyr ' immunrespons er delt inn i humoral og cellulære responser. Humoral respons innebærer hemagglutination prosesser og produksjon av antimikrobielle proteiner/peptider, mens den cellulære immunresponsen utføres gjennom hemocytes. Disse cellene er til stede i hemolymph fra alle leddyr og rapporteres å utvikle en uttrykksfull rolle i studier som involverer medfødt immunrespons9, som det er direkte relatert til fagocytose og innkapsling prosesser. Følgelig kan studier om hemocytes bidra til å undersøke døds forløp og forstå prosesser som autofagi, apoptose og nekrose. I noen virvelløse dyr som muslinger, hemocytes ' samlingen ansikter begrensninger som celleforstyrrelser, lavt hemolymph volum oppnådd, og lav konsentrasjon av gjenopprettede celler10. Svært ofte, avhengig av metodikk anvendt, redusert konsentrasjon av celler er oppnådd, påvirker direkte på celler kvantifisering og analyse.
Antallet hemocytes som sirkulerer i hemolymph er variabel blant ulike leddyr og det kan endre seg i samme art på grunn av ulike fysiologiske stadier som kjønn, alder, og arthropod er utviklingstrinn11. Hemocytes kan også bli funnet overholdt noen organer og bli sluppet inn i omløp like etter smitte prosessen11. Likevel rapporterte de fleste studier bruke insekter, mens flått fortsatt mindre utforsket om deres fysiologi og patologi. Til tross for patogen inoculation og hemolymph samling i flått er mindre brukte teknikker, etablere standard metoder bidrar til utvikling av mer nøyaktige studier.
Målet med denne studien var å sammenligne de mest brukte metodene for hemolymph innsamling og inoculation av patogener i R. MicroPlus flått, evaluere effekten i hemolymph oppkjøpet og hemocytes konsentrasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Flått brukt i denne studien ble innhentet fra en kunstig koloni, mantained ved Federal Rural University of Rio de Janeiro, hvilke metoder har blitt godkjent av komiteen for etikk for bruk av virveldyr dyr (CEUA-IV/UFRRJ #037/2014).
1. tick engorged kvinner
- Etter tick samling, vaske engorged hunner bruker vann fra springen og dyppe dem i 0,5% (v/v) natrium natriumhypokloritt løsning for 3 min i en 500 mL glass beger mottaker, for cuticle hygiene (figur 1), deretter tørke alle kvinner med sterile papirhåndklær (figur 2).
- Del opp hunner i homogene grupper (med 20 hunner hver): én gruppe uten behandling, én kontrollgruppe inokulert med 5 μL 0,1% polyoksyetylensorbitanmonooleat sorbitan polyoksyetylensorbitanmonooleat vandig oppløsning (v/v) og en infisert gruppe inokulert med 5 μL ved 1,0 x 10 7 blastospores ml-1.
Merk: bare ubehandlede flått ble brukt for volum og hemocyte konsentrasjon. Tre replikerer av hver gruppe ble utført.
2. patogener inoculation mellom scutum og capitulum
Merk: i denne studien, Entomopathogenic fungal suspensjoner ble brukt som et eksempel.
- Suspendere sopp blastospores i 1 mL 0,1% polyoksyetylensorbitanmonooleat sorbitan polyoksyetylensorbitanmonooleat vandig oppløsning (v/v) og justere til en endelig konsentrasjon av 1,0 x 107 blastospores ml-1. Tilsett en alikvot på 5 μL Metarhizium Blastospores (Figur 3) suspensjon på overflaten av en plast para fin film.
Merk: Metarhizium blastospores-oppheng ble justert ved hjelp av et Neubauer-kammer. For å fremskynde inoculation prosessen, kan flere bobler legges til plast parafin film overflaten, hver boble tilsvarende 5 μL. - Bruk en 1 mL ultra-fin insulinsprøyte og en 0,3 mm nål til å trekke suspensjonen og vaksinere den i haken. Husk å ta all luften ut av sprøyten før du bruker den.
- Vaksinere 5 μL av sopp suspensjon i haken kvinnelige mellom scutum og capitulum. Vaksinere kvinner fra kontrollgruppen med 5 μL av 0,1% polyoksyetylensorbitanmonooleat sorbitan polyoksyetylensorbitanmonooleat vandig oppløsning (v/v) uten sopp.
Merk: et lite volum av hemolymph kan være til stede på foramen etter nålen innsetting. Vær forsiktig så du ikke vaksinere luft.
3. inoculation av Entomopathogenic sopp mellom beinet lår og tick kvinnens kropp
- Vaksinere kvinner med sopp oppheng (5 μL ved 1,0 x 107 blastospores ml-1) mellom Ben tigh og kvinnens kropp, ved hjelp av en 1 ml ultra-fin insulinsprøyte koblet til en 0,3 mm nål. Vaksinere kvinner fra kontrollgruppen med 5 μL 0,1% polyoksyetylensorbitanmonooleat sorbitan polyoksyetylensorbitanmonooleat vandig oppløsning (v/v).
Merk: Når Metarhizium blastospores inoculation utføres mellom beinet tigh og haken kvinnens kropp, et lite volum av hemolymph kan være til stede på tigh etter nålen innsetting. Vær forsiktig så du ikke vaksinere luft.
4. rygg hemolymph kolleksjon
- Bruk gummidelen av et infusjonssett med vinger, et 0,3 mm kapillærrør og et filtrert tips for å utføre hemolymph-kolleksjonen.
- Forstyrre den kvinnelige rygg cuticle ved hjelp av en 0,3 mm nål.
- Etter avbrudd, Påfør lett trykk på den fremre delen av haken kroppen. Observer en nesten gjennomsiktig væske trekke ut av avbrudd området. Samle hemolymph ved å suge væsken gjennom filter spissen koblet til gummidelen av et infusjonssett med vinger, og et 0,3 mm kapillærrør.
Merk: ikke trykk på haken kroppen neppe under sin immobilisering fordi dette kan forstyrre midttarm og forurense hemolymph. Vent til forsiktig trykk kan utvise væsken uten forurensning.
5. Hemolymph samling fra haken beinet
- Nakkens haken, skjær et stykke av en front etappe med en saks.
Merk: en eller flere ben kan kuttes, så vel som, kan det samme benet kuttes mer enn én gang. - Påfør lett press på haken bakre kroppsdel. Observer en gjennomsiktig flytende boble som dukker opp på kutt stedet og samle den med kapillærrøret, som beskrevet i trinn 4,3.
Merk: ikke trykk på haken kroppen neppe under sin immobilisering fordi dette kan forstyrre midttarm og forurense hemolymph. Vent til forsiktig trykk kan utvise væsken uten forurensning.
6. Hemolymph behandling
- Etter hemolymph samling, sett den inn i 1,5 mL mikrorør tidligere fylt med 30 μL protease cocktail og 82 μL saltvann buffer. Hold mikrorør på is i hele hemolymph-kolleksjonen.
- Sentrifuge prøver (500 x g i 3 min. ved 4 ° c). En myk pellet av hemocytes vil bli dannet etter hemolymph sentrifugering.
Merk: for hemolymph kvantifisering, tallfeste hemolymph volum oppnås ved å telle det totale volumet inne i microtube og rabatt på volumet av protease cocktail og saltvann buffer. - Fjern forsiktig supernatanten (celle frie hemolymph). Forsiktig resuspend cellene i, for eksempel, Leibovitz ' s L-15 kultur justert til pH 7.0-7.2. Kvantifisere hemocytes ved å plassere 10 μL av resuspendert hemocytes i et Neubauer kammer.
7. Hemocyte prøvetaking Slide forberedelse
- Skjær haken foran benet med et par saks.
- Påfør lett press på haken bakre kroppsdel. Observer en gjennomsiktig flytende boble som dukker opp på kuttet området.
- Påfør hemolymph dråper direkte på rene mikroskop lysbilder, etter det, bruke bevilget metoder for å flekken cellene.
- Å flekk hemocytes benytter Giemsa, luften-tørr det hemolymph på skyve for 30 min, fastsette den for romtemperatur med metanol for 3 min, og flekk inne Giemsa løsning (1:9 forhold av Sorensen ' buffer løsning, pH 7,2) for 30 min for romtemperatur. Vask lysbildene med rennende vann for å fjerne overflødig fargestoff, luft-tørk lysbildet og evaluere cellene på 400x i et optisk mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne artikkelen nærmer seg inoculation og hemolymph innsamlings metoder som brukes på flått. Etter inoculation mellom beinet lår og tick kvinnens kropp, noen væske (hemolymph) kan skilles ut i løpet av prosessen; Det er imidlertid viktig å merke seg at når inoculation er ferdig, ingen væske eller vev var til stede i nålen spissen eller på inoculation stedet, slik at fungal suspensjonen var helt inokulert. Når inoculation prosessen ble riktig utført, gjorde nålen innsetting ikke føre tick kvinner ' død. På den annen side, flått døde ca 48 h etter inoculation av Entomopathogenic sopp. Inoculation mellom beinet lår og tick kvinnens kropp kan skade tick intern organer som midttarm og Malpighian tubuli, mens skade på Gene ' s organ kan forekomme under inoculation mellom scutum og capitulum.
Når haken midttarm avbrytes av nålen under rygg hemolymph samlingen, væsken innhentet er rød, ikke fargeløs. Dette indikerer en feil hemolymph samling. I disse tilfellene, hemolymph skal kastes siden det er forurenset med intestinal innhold.
Den korrekte hemolymph-kolleksjonen er avgjørende for å kunne utføre eksperimentene og oppnå pålitelige resultater. Når hemolymph ble samlet fra cut tick ben (n = 20 flått homogenously veid), volumet innhentet var lavere enn den totale hemolymph innhentet fra rygg samlingen (n = 20 flått homogenously veid) (Figur 4). Det er antydet at på grunn av det lave volumet av hver dråpe som trekker ut av kuttet beinet, hemolymph blodpropp kan ofte til stede under denne prosessen av hemolymph samling. Dette kan ha negativ innvirkning på hemocytes anskaffelse og klassifisering (figur 5 og figur 6). Til tross for høyere volum oppnåelse av hemolymph, er rygg samlingen betraktet som vanskeligere å bli utført.
Figur 1 : Merker ' cuticle hygienization. Rhipicephalus MicroPlus fullt engorged hunner ble vasket med vann fra springen og nedsenket i 0,5% natrium natriumhypokloritt løsning (v/v) for 3 min i en 500 ml glass beger mottaker. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Flått ' cuticle tørking. Rhipicephalus MicroPlus fullt engorged hunner ble tørket ved hjelp av sterile papirhåndklær. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Metarhizium blastospores. Fungal propaluges brukes i tick inoculation. Scale bar = 50 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Representative grafen demonstrerer hemolymph volum oppnådd med hver collecton metode. Rhipicephalus MicroPlus hemolymph volum oppnådd etter rygg eller Ben samling. En pool av 20 homogenously veide flått ble brukt for hver metode. Disse flått var ikke tidligere inokulert. Median verdier ± standardavvik etterfulgt av samme bokstav er ikke forskjellig statistisk etter analyse av varians (ANOVA) test (P ≥ 0,05). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Hemocytes konsentrasjon oppnådd med hver hemolymph innsamlingsmetode. Rhipicephalus MicroPlus hemocytes konsentrasjon oppnådd etter blanding i Leibovitz ' s L-15 kultur medium etter rygg eller Ben samling. Median verdier ± standardavvik etterfulgt av samme bokstav skiller seg ikke statistisk etter Kruskal-Wallis-test (P ≥ 0,05). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Hemocytes funnet i Rhipicephalus MicroPlus hemolymph smøre. R. MicroPlus hemocytes ble farget av Giemsa. Svarte piler angir de forskjellige cellene i hake hemolymph. Scale bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inoculation av patogener er nyttig når studien tar sikte på å undersøke in vivo handling av mikroorganismer i eksperimentelle arthropod modeller fordi det sikrer at organismen er inne i verten. Teknikken kan også anvendes på vaksinere molekyler som RNA interferens (RNAi). Inoculation mellom scutum og capitulum anses lettere å utføre, men ofte skader Gené's organ, svekke eggene levedyktighet12,13. Gené's orgel er anatomisk plassert nær den fremre delen av capitum, og det er et viktig organ for tick oviposition14. Følgelig inoculation mellom beinet tigh og kvinnens kropp er mer hensiktsmessig hvis studien krever observasjon av kvinners biologiske parametre siden Gené's organ vil ikke bli skadet. Til tross for inoculation metoden mellom beinet lår og tick kropp anses vanskeligere og lett skade eller utsette tick indre organer, slik som midttarm og Malpighian tubuli, når det er godt utført, vil det ikke forstyrre disse organene.
Hemolymph analyse er viktig å forstå arthropod immunsystem samt å forstå patogenesen15,16. Følgelig tick hemolymph kan brukes til å avsløre tick fysiologi, forsikrer tick infectivity, forstå tick-patogen interaksjoner, og mobilnettet og humoral immunresponser9,17,18.
Tick hemolymph samling gjennom beinet skjæring er rapportert i flere studier19,20,21. Til tross for denne metoden er enkel med ingen eller svært lav hemolymph forurensning, det anses mot produktiv for studier som krever høye konsentrasjoner av hemocytes eller store volumer av hemolymph. På den annen side, er riktig utførelse av hemolymph samlingen gjennom rygg regionen engorged kvinner ikke lett å oppnå siden tarmen opptar nesten hele tick kroppen og rupturing det med nålen forårsaker hemolymph forurensning. Forurensning på grunn av gut avbrudd kan også observeres når tick er naturlig smittet med høye belastninger av hemoparasites (viz., Babesia spp.), eller i de siste trinnene i døds prosessen forårsaket av entomopathogens8. I disse tilfellene, hemolymph skal kastes siden hemocytes og plasma analyser kan bli påvirket.
Den sentrifugering hastighet av hemolymph prøver for hemocytes høsting er også viktig og direkte påvirke hemocytes konsentrasjon, siden høy relativ sentrifugal feltet (RCF) hastigheter bidra til: i) celle pellet vanskelig å resuspend, II) celler forstyrrelser, og III) hemocytes degranulering. Den ideelle celle pellet er en myk pellet som er lett å resuspend. Av denne grunn ble sentrifugering ved 500 x g i tre minutter ved 4 ° c8 brukt. I denne studien ble hemocytes resuspendert i et kultur medium og ikke i fosfat-bufret saltvann (PBS) fordi kultur mediet støtter bedre celle levedyktighet.
Metodene som presenteres her kan stå overfor begrensninger når de brukes på immatures stadier (Larven og nymfe) av flått eller unfed voksne. Det inoculation metoden, for eksempel, er bare anvendt for voksen engorged kvinner fordi nålen størrelse ville skade umodne scener og muligens unfed voksen flått. For å vaksinere disse stadiene skal det brukes en microinjector. På samme måte er hemolymph samling gjennom rygg området mer effektiv når den brukes på engorged flått, mens hemolymph samling ved å kutte bena kan brukes i studier med unfed voksen flått eller umodne stadier. Til tross for dette, var vårt mål her å vise metoder som krever svært lave teknologiske ressurser. I tillegg har sentrifugering teknikk som skal utføres ved lav sentrifugering kraft fordi høy kraft eller forlenget spin tid kan skade celler.
Metodene avslørt her kan brukes som retningslinjer for studier som involverer inoculation av entomopathogens i flått og hemolymph/hemocytes høsting. Teknikkene som presenteres her krever svært lave teknologiske ressurser og er klassiske trinn for studier om tick fysiologi, patologi, og tick ' s immunrespons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble delvis finansiert av Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (KAPPER) fra Brasil, finans kode 001. KAPPER gitt Ph.D. stipend for A.F. Marciano. Vi takker Nasjonalt råd for vitenskapelig og teknologisk utvikling (CNPq) i Brasil for å gi Ph.D. stipend for J. Fiorotti. Denne forskningen ble også støttet av tilskudd av Carlos Chagas Filho Foundation for Research i staten Rio de Janeiro (FAPERJ) og CNPq. V.R.E.P. Bittencourt er en CNPq forsker.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alkaline Hypochlorite solution | Sigma-Aldrich | A1727 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-1KG | |
| EDTA | Synth | 2706 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000036 | |
| Flexible rubber | BD | ||
| Giemsa stain | Sigma-Aldrich | 48900-500ML-F | |
| Glass capillary | CTechGlass | CT95-02 | |
| Insulin syringe (needle) | BD | SKU: 324910 | |
| KH2PO4 | Vetec | 60REAVET014512 | |
| Leibovitz's L-15 culture medium | Gibco | 11415-064 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-1L-R | |
| Microscope slides | Kasvi | K5-7105 | |
| Microtubes | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Na2HPO4 | Vetec | 60REAVET014593 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653-1KG | |
| Neubauer chamber | Kasvi | K5-0111 | |
| Penicillin | Gibco | 15140163 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P2714 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 |
References
- Grisi, L., et al. Reassessment of the potencial economic impact of cattle parasites in Brazil. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 23 (2), 150-156 (2014).
- Schrank, A., Vainstein, M. H. Metarhizium anisopliae enzymes and toxins. Toxicon. 56 (7), 1267-1274 (2010).
- Camargo, M. G., et al. Metarhizium anisopliae for controlling Rhipicephalus microplus ticks under field conditions. Veterinary Parasitology. 223, 38-42 (2016).
- Perinotto, W. M. S., et al. In vitro pathogenicity of different Metarhizium anisopliae s.l. isolates in oil formulations against Rhipicephalus microplus. Biocontrol Science and Technology. 27 (3), 338-347 (2017).
- Pedrini, N., Crespo, R., Juarez, M. P. Biochemistry of insect epicuticle degradation by entomopathogenic fungi. Comparative Biochemistry and Physiology. Part C: Toxicology and Pharmacolpgy. 146 (1-2), 124-137 (2007).
- Ortiz-Urquiza, A., Keyhani, N. O. Action on the surface: Entomopathogenic fungi versus the insect cuticle. Insects. 4 (3), 357-374 (2013).
- Angelo, I. C., et al. Detection of serpins involved in cellular immune response of Rhipicephalus microplus challenged with fungi. Biocontrol Science and Technology. 24 (3), 351-360 (2014).
- De Paulo, J. F., et al. Rhipicephalus microplus infected by Metarhizium: unveiling hemocyte quantification, GFP-fungi virulence, and ovary infection. Parasitology Research. 117, 1847-1856 (2018).
- Marmaras, V. J., Lampropoulou, M. Regulators and signalling in insect haemocyte immunity. Cell Signal. 21, 186-195 (2009).
- Hinzmann, M. F., Lopes-Lima, M., Gonçalves, J., Machado, J. Antiaggregant and toxic properties of different solutions on hemocytes of three freshwater bivalves. Toxicological & Environmental Chemistry. 95, 790-805 (2013).
- Nation, J. L. Insect Physiology and Biochemistry. , University of Florida. Gainesville, FL. (2016).
- Gene, J. Mémoires de l'Académie royale des sciences. Torino. 9, 751 (1848).
- Lees, A. D., Beament, J. W. L.
- Sonenshine, D. E., Roe, R. M. Biology of ticks. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2014).
- Tan, J., et al. Characterization of hemocytes proliferation in larval silkworm Bombyx mori. Journal of Insect Physiology. 59 (6), 595-603 (2013).
- Bowden, T. J. The humoral immune systems of the American lobster (Homarus americanus) and the European lobster (Homarus gammarus). Fish Research. 186, 367-371 (2017).
- Sonenshine, D. E., Hynes, W. L. Molecular characterization and related aspects of the innate immune response in ticks. Frontiers in Bioscience. 13, 7046-7063 (2008).
- Tsakas, S., Marmaras, V. Insect immunity and its signaling: an overview. Invertebrate Survival Journal. 7, 228-238 (2010).
- Burgdorfer, W. Hemolymph Test. A technique for detection of Rickettsiae in ticks. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 19, 1010-1014 (1970).
- Dunham-Ems, S. M., et al. Live imaging reveals a biphasic mode of dissemination of Borrelia burgdorferi within ticks. Journal of Clinical Investigation. 119, 3652-3665 (2009).
- Patton, T. G., et al. Saliva, salivary gland, and hemolymph collection from Ixodes scapularis ticks. Journal of Visualized Experiments. 60, e3894 (2012).
