Summary
Il protocollo descrive in dettaglio un modello carcinoma murino in vitro di allungamento della trascrizione non genetica difettosa. Qui, l'inibizione cronica del CDK9 viene utilizzata per reprimere l'allungamento produttivo dell'RNA Pol II lungo i geni pro-infiammatori di risposta per imitare e studiare il fenomeno clinicamente superato TEsicuramente, presente in circa il 20% di tutti i tipi di cancro.
Abstract
Abbiamo già riferito che un sottoinsieme di tumori è definito da deregulations trancrionali globali con carenze diffuse nell'allungamento della trascrizione dell'mRNA (TE), che chiamiamo tali tumori come TEsicuramente. In particolare, i tumori del TEsono caratterizzati da trascrizione spuria e elaborazione di mRNA difettosi in un ampio insieme di geni, come le vie interferone/JAK/STAT e TNF/NF-B, portando alla loro soppressione. Il TEsicuramente sottotipo di tumori nel carcinoma a cellule renali e pazienti con melanoma metastatico significativamente correlati con scarsa risposta ed esito in immunoterapia. Data l'importanza di studiareTE sicuramente i tumori - in quanto preannuncia un ostacolo significativo contro l'immunoterapia - l'obiettivo di questo protocollo è quello di stabilire un modello murino in vitroper studiare questi diffusi, non genetici anomalie trascrizionali nei tumori e ottenere nuove intuizioni, nuovi usi per i farmaci esistenti, o trovare nuove strategie contro tali tumori. Dettagliamo l'uso dell'inibizione cronica di CDK9 mediata dal flavopiridol per abrogare la fosfororylazione del residuo di serine 2 sul dominio di ripetizione del terminale C (CTD) della polimerasi RNA II (RNA PolI), sopprimendo il rilascio di RNA Pol II nella trascrizione produttiva Allungamento. Dato che TEsicuramente i tumori non sono classificati sotto una mutazione somatica specifica, un modello farmacologico è vantaggioso e imita al meglio i difetti trascrizionali ed epigenetici diffusi osservati in essi. L'uso di una dose sublethal ottimizzata di flavopiridol è l'unica strategia efficace nella creazione di un modello generalizzabile di interruzione non genetica diffusa nell'allungamento della trascrizione e nella lavorazione dell'mRNA, imitando da vicino il TE clinicamente osservato sicuramente caratteristiche. Pertanto, questo modello di TEpuò sicuramente essere sfruttato per sezionare fattori cellulari che consentono loro di resistere agli attacchi cellulari immuno-mediati.
Introduction
Un passo chiave di limitazione del tasso nell'espressione di quasi tutti i geni attivi è la transizione della polimerasi RNA II (RNA Pol II) dalla pausa promotore-prossidabile all'allungamento produttivo1,2. Dato che la disregolazione epigenetica dell'allungamento trascrizionale aiuta nella progressione di più malignità umane definite tesicuramente, portando a segnalazione non ottimale nelle vie di risposta pro-infiammatorie pari a una scarsa risposta e il risultato dell'immunoterapia3, l'obiettivo generale di questo protocollo è quello di stabilire un utile modello in vitro per studiare queste diffuse anomalie trascrizionali non genetiche nei tumori. In questa luce, l'uso di inibizione farmacologica cronica di CDK9 è una strategia efficace per la creazione di un modello generalizzabile di interruzione non genetica diffusa nell'allungamento della trascrizione e difetti di elaborazione dell'mRNA. La logica alla base dell'uso dell'inibizione cronica del CDK9 è che abroga la fosforillazione del residuo di serine 2 sul dominio di ripetizione del terminale C (CTD) di RNA Pol II, reprimendo così il rilascio di RNA Pol II nell'allungamento della trascrizione produttiva. Inoltre, i tumori TEsicuramente, descritti in precedenza dal nostro gruppo3, non sono classificati sotto alcuna specifica mutazione somatica. Pertanto, un modello non genetico (farmacologico) è vantaggioso e meglio imita i difetti trascrizionali ed epigenetici diffusi osservati in essi. Il metodo qui descrive la generazione e la caratterizzazione del modello di trattamento flavopiridol cronico delle cellule tumorali del murino. Questo metodo interrompe in modo dimostrabile l'allungamento della trascrizione lungo geni caratterizzati da lunghezze genomiche più lunghe, con promotori in bilico ed espressioni inducibili come TNF/NF-B e segnalazione di interferone/STAT, profondamente controllate a livello di trascrizione allungamento 3,4,5. Nel complesso, questo modello ottimizzato di linea cellulare murina di difetti di allungamento trascrizionale - l'unico modello a nostra conoscenza per studiare i tumoriTE definitivamente descritti di recente - guida la resistenza all'attacco immunitario anti-tumore, rendendo un sistema utile da sfruttare e esaminare le vulnerabilità dei difetti non genetici nei meccanismi di trascrizione dei principali nei tumori rispetto all'attacco cellulare immuno-mediato.
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Protocol
Il Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali e il Comitato per la biosicurezza istituzionale della Cincinnati Children's Research Foundation hanno approvato tutte le procedure sperimentali sugli animali (protocollo IACUC #2017-0061 e il protocollo IBC #IBC2016-0016), e questi sono stati effettuati esperimenti in conformità con gli standard descritti nella guida NIH alla cura e all'uso degli animali da laboratorio.
1. Inibizione cronica di RNA Pol II mediante trattamento flavopiridol: strategia di base
- Seme B16/F10 cellule del melanoma del topo a bassa densità (0,2 x 106) in una piastra di coltura di 10 cm nel loro mezzo corrispondente (Dulbecco's Modified Eagle Medium [DMEM], 10% siero di bovino fetale [FBS], 1% penicillina e streptomicina [Pen/Strep]) e incubare durante la notte in un'incubatrice umidificata di 37 gradi, 5% CO2.
- Il giorno seguente, lavare le cellule con salina 1x fosfato-buffered (PBS) e aggiungere un nuovo lotto di supporti di coltura con una dose sublethal (stimata come 25 nM) di flavopiridol - un inibitore del fattore di allungamento RNA Pol II p-TEFb (ciclolina T/CDK9) - per una settimana senza ulteriori sotto-coltura.
- Dopo una settimana di trattamento flavopiridol, eseguire saggi confermativi per valutare la capacità del modello di riassumere vari attributi di difetti di allungamento trascrizionale visti in TEsicuramente tumori.
2. Analisi immunoblot confirmatore per valutare la funzione difettosa di RNA Pol II e la compromissione del percorso dell'interferone (IFN) e del fattore di necrosi tumorale (TNF) di segnalazione nel modello TEsicuramente del mouse generato
- Cultura uguale numero (105) di flavopiridol trattati B16/ F10 cellule melanoma topo e cellule parentali B16/ F10 melanoma topo in due diverse serie di 12 benpi (un set per RNA Pol II caratterizzazione funzionale e l'altro set per citochina stimolazione) a 37 gradi centigradi in un'incubatrice umidificata del 5% durante la notte.
- Il giorno dopo, trattare le cellule del set di stimolazione della citochina con il topo IFN-, IFN-z (5 ng/mL) o il TNF -z (5 ng/mL) per 45 min a 37 .
- Ora, estrarre proteine da cellule in set di caratterizzazione funzionale sia della citochina che in quella RNA Pol II utilizzando un buffer di lisi di analisi radioimmunoprecipitazione (RIPA) nel modo seguente:
- Lavare le cellule con 1x PBS e lisrizzarlo con 50 ll del buffer di lisi per pozzo. Raschiare, e poi pellet le cellule lisci a 4 gradi centigradi, 21.130 x g.
- Misurare la proteina nei supernatanti listi cellulari utilizzando un saggio colorimetrico standard per la concentrazione di proteine dopo la lubralificazione del detersivo (Bradford o un saggio simile).
- Caricare la stessa quantità di proteine misurate (15 g) da ogni campione per essere eseguito in un gel di polimembrano (PVDF) del 4%-18% di solfato di sodio e trasferirli su membrane dideluro di polivichinio (PVDF).
- Bloccare le membrane PVDF nel 5% di latte secco in saline-polysorbate 20 (TBST) tris-buffered per 1 h seguito da un'incubazione notturna a 4 s con anticorpi primari (RNA Pol II 1:1000; p-SER2 RNA Pol II 1:1000; p-SER5 RNA Pol II 1:1000; H3K36me3 1:2000; totale H3 1:2000; STAT1 1:1000; p-STAT1 1:1000; NF' B 1:1000; p-NF-B 1:1000; 1:5000) nel 5% di albumina del siero bovino.
- Il giorno seguente, lavare le membrane PVDF con 1x TBST per 15 min a temperatura ambiente (RT), e incubarle con anticorpi secondari appropriati (anti-rat [1:5000] per RNA Pol II, p-SER2 RNA II e p-SER5 RNA Pol II; anti-coniglio (1:5000) per H3K36me3, totale H3, STAT1, p-STAT1, NF-B, e p-NF-B) per 50 min a RT. Rilevare i segnali proteici utilizzando il substrato perossidese di rafano disponibile in commercio (HRP) con chemiluminescenza avanzata.
NOTA: l'uso primario di Actin è coniugato come HRP, quindi può essere sviluppato senza un secondario.
3. Saggio di conferma per valutare i difetti di elaborazione dell'mRNA nelmodello TE del mouse generato
- Seme uguale numero (0,2 x 106) di flavopiridol trattati B16/F10 melanoma cellule e cellule parentali B16/ F10 melanoma in 6-well piastre a 37 gradi centigradi in un 5% CO2 incubatore umidificato durante la notte.
- Estrarre l'RNA totale dalle cellule coltivate al 60% di confluenza utilizzando un reagente di estrazione dell'RNA o un kit (Tabella dei materiali).
- Esaurisci l'rRNA dall'RNA totale estratto nel modo seguente:
NOTA: è stato cooptato un protocollo a basso input da un kit disponibile in commercio per esaurire il rRNA- Impostare un bagno d'acqua o un blocco di calore a 70,75 gradi centigradi, e un altro bagno d'acqua o blocco di calore a 37 gradi centigradi.
- Aggiungete l'RNA totale (100-500 ng in 2 ol di acqua priva di nucleana) con 1 -L di sonda di deplezione di rRNA selettiva e 30 l di buffer di ibridazione in un tubo di microcentrifuga, mescolate delicatamente vortice e incubateli a 70-75 gradi centigradi per 5 min.
- Ora, trasferite i tubi in un blocco termico/calore da 37 gradi centigradi e lasciate raffreddare il campione a 37 gradi per un periodo di 30 minuti.
- Risospendere le perle magnetiche della sonda di deplezione rRNA selettiva mediante vortice, e 75 gradi di perline in un tubo di microcentrifuga senza RNase da 1,5 mL.
- Posizionare la sospensione del tallone su un separatore magnetico per 1 min. Aspirare delicatamente e scartare il supernatante. Ripetere il lavaggio ancora una volta delle perline aggiungendo 75 -L di acqua priva di nuclesie e scartando il supernatante dopo la separazione magnetica.
- Risospendere le perline lavate in 75 , l di buffer di ibridazione, e 25 L di esso ad un altro tubo aliquota e mantenerlo a 37 gradi centigradi per un uso successivo.
- Posizionare le restanti 50 perline l'l su un separatore magnetico per 1 min e scartare il supernatante. Risospendere le perline in 20 gradi di buffer di ibridazione e mantenerle a 37 gradi centigradi per un uso successivo.
- Dopo il raffreddamento della miscela di sonda di deplezione rRNA selettiva/RNA selettivo a 37 gradi centigradi per 30 min, centrifugare brevemente il tubo per raccogliere il campione sul fondo del tubo.
- Trasferire 33 l della miscela di sonda di deplezione rRNA selettiva/RNA selettivo alle perle magnetiche preparate dal passo 3.3.7. Mescolare da vortice a bassa velocità.
- Incubare il tubo a 37 gradi centigradi per 15 min. Durante l'incubazione, mescolare delicatamente il contenuto di tanto in tanto. Seguito da una breve centrifugazione per raccogliere il campione sul fondo del tubo.
- Posizionare il tubo su un separatore magnetico per 1 min per pellet il complesso rRNA-probe. Questa volta non scartare il super-natante. Il supernatante contiene RNA impoverito di rRNA.
- Posizionare il tubo di 25 l. di perline dal punto 3.3.6 su un separatore magnetico per 1 min. Aspirate e scartare il supernatante. Aggiungere il supernatante dal passo 3.3.11 al nuovo tubo di perline. Mescolare da vortice a bassa velocità.
- Incubare il tubo a 37 gradi centigradi per 15 min. Durante l'incubazione, mescolare delicatamente il contenuto di tanto in tanto. Centrifugare brevemente il tubo per raccogliere il campione sul fondo del tubo.
- Posizionare il tubo su un separatore magnetico per 1 min per pellet il complesso rRNA-probe. Non scartare il super-natante. Trasferire il supernatante (circa 53 l) contenente RNA impoverito di rRNA in un nuovo tubo.
- Misurare la concentrazione della resa dell'RNA con uno spettrofotometro.
- Utilizzare la metà dei campioni impoveriti di rRNA come input per perline magnetiche contenenti oligo (dT)25 per estrarre lapolia
NOTA: Questo protocollo di isolamento dell'RNA del messaggero di coda poliA utilizzando sequenze oligo dT legate alla superficie delle perle magnetiche è stato cooptato da un kit disponibile in commercio (Tabella dei materiali).- Risospendere le perle oligo dT nella fiala vortice brevemente per >30 s e trasferire 200 l di perline oligo dT in un tubo. Aggiungere lo stesso volume (200 ) del buffer di associazione e sospendere nuovamente.
- Mettere il tubo in un magnete per 1 min e scartare il supernatante. Ora, rimuovere il tubo dal magnete e risospendere le perle oligo dT lavate in 100 .
- Regolare il volume del campione totale di RNA impoverito di rRNA in ingresso a 100 -L con 10 mM Tris-HCl pH 7.5. A questo punto, aggiungere 100 l di buffer di associazione.
- Riscaldare a 65 gradi centigradi per 2 min per interrompere le strutture secondarie dell'RNA. Ora, immediatamente mettere sul ghiaccio.
- Aggiungere i 200 l'RNA totale alle perline lavate a 100. Mescolare accuratamente e lasciare il legame ruotando continuamente su un rotore per 5 min a RT.
- Posizionare il tubo sul magnete per 1-2 min e rimuovere con attenzione tutto il supernatante e rimuovere con attenzione tutti i supernatali.
- Togliere il tubo dal magnete e aggiungere 200 -L di Washing Buffer.
- Misurare la purezza e la concentrazione della poliA estratta: RNA con uno spettrofotometro.
NOTA: Un rapporto 260/280 di 1,90,2,00 e un rapporto 260/230 di 2,00,2,20 per tutti i campioni di RNA sono considerati accettabili. - Utilizzare la restante metà dei campioni impoveriti di rRNA dalla sezione 3.3 come input alle colonne della proteina A (fornite nel kit di immunoprecipitazioni dell'RNA [RIP], Tabella dei materiali) per immunoprecipitare cinque RNA ricoperti primi utilizzando monoclonali 7-metilguanosine anticorpo nel modo seguente:
NOTA: Questo protocollo di isolamento dell'RNA messaggero con un kit di immunoprecipitazioni dell'RNA disponibile in commercio è stato cooptato e ulteriormente modificato.- Lavare la proteina A perline magnetiche ottenute dal kit RIP secondo il protocollo del produttore per pre-legare l'anticorpo alle perline.
- Trasferire 3 g di 7-metilguanosine anticorpo (coniglio IgG fornito nel kit può essere utilizzato il controllo negativo) alle perline in un tubo di microcentrifuga sospeso in 100 - buffer di lavaggio dal kit.
- Incubare con rotazione a bassa velocità per 30 min a RT. Centrifuge tubi brevemente e poi posizionare i tubi su un separatore magnetico, rimuovere e scartare il supernatante.
- Rimuovere i tubi e aggiungere brevemente 500 l di tampone di lavaggio dal kit e dal vortice. Centrifugare i tubi brevemente seguiti dalla separazione magnetica ancora una volta, rimuovere e scartare il supernatante.
- Ripetere nuovamente il passaggio 3.6.4.
- Aggiungere circa 120 ng di rRNA impoverito (dalla sezione 3.3) all'anticorpo di metilguanosina prelavaggio 7. Aggiungere 1 -L di inibitore di RNase. Incubare a RT per 1/1.5 h con lieve agitazione.
- Girare verso il basso le perline a 300 x g per 10 s e rimuovere il supernatante contenente l'mRNA non sbattuto (non-7-metilguanosina) a un nuovo tubo di microcentrifuga.
- Aggiungere 100 l di tampone di lavaggio e lavarlo altre due volte allo stesso modo. Piscina del supernatante raccolto nello stesso tubo di microcentrifuga etichettato senza sbarramenti (non-7-metilguanosina) mRNA. Conservare sul ghiaccio.
- Elute l'mRNA con tappo (7-metilguanosina) dalle perline con 300 l di cuscinetto di lisi di urea (ULB) contenente 7 M di urea, 2% SDS, 0,35 M NaCl, 10 mEDTA e 10 mM Tris, pH 7,5 da perline riscaldanti a 65 m.
- Mescolare 300 l dei campioni eluiti (mRNA sbattuto e non tappato) con 300 luna di fenolo:cloroformioformato:isoamyl alcol (25:24:1; disponibile in commercio) (memorizzato a 4 gradi centigradi). Mescolare bene invertendo e lasciare per circa 10 min quindi mescolare di nuovo delicatamente.
- Centrifuga a 18.928 x g per 2 min e pipette con attenzione lo strato superiore al tubo fresco e scartare strato inferiore.
- Aggiungete ai campioni 300 di fenoli: cloroformio:isoamyl (25:24:1; conservato a 4 gradi centigradi). Mescolare bene invertendo e quindi centrifugare a 18.928 x g per 1 min. con attenzione, pipette lo strato superiore a un tubo fresco e scartare strato inferiore.
- Aggiungere 300 L di 2 porpanolo e 30 luna di acetato di sodio da 3 M (pH 5,2) all'RNA con tappo e non tappato. Invertire il campione un paio di volte e metterlo a -20 gradi centigradi per 20 h.
- Ora, centrifugare i campioni a 18.928 x g per 10 min a 4 gradi centigradi. Rimuovere con cura il supernatante e aggiungere 500 l di 70% di etanolo.
- Centrifuga di nuovo a 18.928 x g per 10 min a 4 gradi centigradi. Scartare con cura il supernatante e asciugare il pellet a RT per meno di 5 min. Risospendere il pellet in acqua priva di nuclea.
- Misurare la purezza e la concentrazione della resa dell'RNA con uno spettrofotometro. Il rapporto 260/280 dovrebbe essere compreso nell'intervallo di 1,90-2,00 e il rapporto 260/230 nell'intervallo di 2,00-2,20 per tutti i campioni di RNA.
4. Saggio confermativo per valutare la risposta del mouse TEsicuramente modello alla morte cellulare mediata FasL
- Seme uguale numero (30,000 cellule) di flavopiridol trattati B16/F10 cellule melanoma topo e cellule parentali B16/F10 melanoma in una piastra di coltura 96-well nel loro mezzo corrispondente (DMEM), e incubare durante la notte in un 37 C, 5% CO2 umidificato incubatrice f.
- Trattare le cellule in una cappa di coltura con diverse concentrazioni di hil suo6FasL (0,1,1000 ng/mL) in presenza di 10 anti-il/mL anti-il suo anticorpo e incubare per 24 h a 37 gradi centigradi, 5% CO2 incubatore umidificato.
- Rimuovere le cellule morte lavando con 1x buffer PBS. Fissare le cellule attaccate in 4% paraformaldeide per 20 min a RT. Scartare il 4% di paraformaldeide (non c'è bisogno di lavare), e macchia con soluzione viola cristallo (20% metanolo, 0.5% cristallo viola in 1x PBS) per 30 min.
- Rimuovere la macchia in eccesso risciacquando delicatamente le piastre nell'acqua del rubinetto. Tenere le piastre ad asciugare a RT.
- Ri-dissolvere il viola cristallino in 100 -L di 1x surfactant nonionico disciolto in 1x PBS, e misurare la densità cellulare misurando l'assorbimento a 570 nm in un lettore di microplacche.
5. Analisi esplorativa per valutare la risposta del mouse TEsicuramente modello per antigene specifico attacco citotossico T-cell
- Isolamento e attivazione dell'attacco a i tasti TTotoxic (CTL) OT-I CD8
- Purificare le cellule CD8 e dalle milza dei topi OT-I TCR Tg RAG-1 e z mediante la separazione delle cellule magnetiche utilizzando un kit di isolamento delle celle T CD8 del mouse come segue:
- Raccogli due milza da due topi OT-I Tcr RAG-1/o in supporti RPMI completi.
- Schiacciare la milza in un filtro da 70 m tenuto su un tubo da 50 mL riempito con 20 mL di RPMI, utilizzando la parte posteriore di una siringa fino a quando solo il grasso viene lasciato indietro nel filtro.
- Centrifugare il flusso attraverso a 220 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Scartare il super-attardato.
- Aggiungere 1 mL di tampone di lisi dei globuli rossi (RBC) al pellet mledile dal passo precedente centrifugazione e pipetta la miscela per 1 min.
- Neutralizzare la soluzione aggiungendo fino a 10 mL di RPMI.
- Centrifuga a 220 x g per 5 min a 4 gradi centigradi. Scartare il supernatante e risospendere in 10 mL di RPMI.
- Prendi una piccola aliquota per il conteggio. Centrifugare il rimanente a 220 x g per 5 min a 4 gradi centigradi.
- Per ogni milione di cellule contate, risospendere il pellet in 1 mL di buffer di sistema di separazione magnetica disponibile in commercio (mojo buffer o un buffer simile).
- Preparare un cocktail anticorpale di volume 100 gradi l per ogni 1 mL di cellule pellete al punto 5.1.1.8. Il cocktail anticorpale comprende: biotina anti-CD4, CD105, CD45R/B220, CD11c, CD49b, TER-119, CD19, CD11b, TCR - e CD44.
- Aggiungere questo cocktail alle celle a pelletto da 1 mL e tenere il ghiaccio per 15 min.
- Aggiungete 100 lofan di perline magnetiche (streptavidin) ogni 100 lbus del cocktail anticorpale aggiunto alle celle di milza pellete risospese da 1 mL. Tenere sul ghiaccio per 15 min.
- Aggiungere 7 mL di buffer di sistema di separazione magnetica disponibile in commercio. Ora, aliquota di circa 3/4 mL della miscela ad un tubo fresco. Mescolare bene e fissarlo al magnete per 5 min.
- Decant il liquido (contiene cellule CD8) in un tubo fresco sul ghiaccio. Ora, i restanti 3,4 mL di miscela dal passo 5.1.1.12 al tubo e fissarlo al magnete per 5 min. Decant il liquido (secondo lotto di cellule CD8 o più isolati) allo stesso tubo contenente il primo lotto di cellule CD8 .
- Fibroblasto aderente aderente di semi APC-(MEC. B7. SigOVA) per esprimere una specifica linea di origine ovalbumina (OVA), oVA-restricted peptide epitopo OVA257-264 (SIINFEKL), insieme alla molecola co-stimolante B7.1, a 75.000 cellule per pozzo in piastre da 24 pozzetti, a 37 gradi centigradi, 5% CO2 incubatore umido.
NOTA: Il fibroblasto aderente utilizzato è un dono del laboratorio della dott.ssa Edith Janssen presso CCHMC. La linea è stata creata originariamente nel laboratorio del Dr. Stephen P. Schoenberger in La Jolla Institute for Allergy and Immunology6. - Dopo 24 h, lavare il mostrato di APC una volta con il mezzo (IMDM) modificato di Iscove disponibile in commercio con buffer HEPES, pyruvate di sodio, L-glutamina e alto glucosio) e aggiungere 0,5 x 106 cellule ingenue OT-I CD8 , dal passaggio 5.1.1.13) in 2 mL di IMDM completato da 50 mM s-ME, 2 mL EDTA, 4 mM L-glutamine e HEPES e 10% FBS.
- Dopo 20 h, raccogliere delicatamente le cellule OT-I non aderenti (raccogliendo i media nel piatto di coltura con cellule OT-I galleggianti e pellendo le cellule a 191 x g per 2 min; contare le cellule OT-I vitali) e trasferirle per la co-coltura.
- Purificare le cellule CD8 e dalle milza dei topi OT-I TCR Tg RAG-1 e z mediante la separazione delle cellule magnetiche utilizzando un kit di isolamento delle celle T CD8 del mouse come segue:
- Co-cultura delle cellule CD8 con cellule B16/F10/OVA
- Seed OT-I-derivato cellule CD8 , con un rapporto di 1:1 (300.000 cellule ciascuna) in una co-coltura con B16/F10 (mancando l'antigene ovalbumin), non trattate B16/F10-OVA, e cellule B16/F10-OVA pre-trattate con flavopiridol (25 nM) per 1 settimana, in 6-bene 20 h a 37 gradi centigradi in un'incubatrice umidificata di CO2 del 5%.
- Dopo 20 h, rimuovere le cellule OT-I-derivato CD8 s (raccogliendo i media nel piatto di coltura con galleggiante OT-I derivati cellule CD8). Lavare le cellule B16/F10-OVA aderenti in 1x PBS.
- Prova a fare in modo che i tre gruppi di cellule B16/F10-OVA associate in 0,05% EDTA contengano la triplessina per 5 min.
- Macchiare le cellule B16/F10-OVA raccolte incubandole in PBS freddo (contenente lo 0,5% FBS e 0,05% azide di sodio) con colorante di viabilità e anticorpi etichettati pertinenti (colorante viliabile fissa torbiera e780, mouse coniugato AF647 CD8 e BV421-concatenato CD45 ).
- Analizzare la fattibilità dei tre gruppi di cellule B16/F10-OVA per citometria di flusso.
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Representative Results
Qui, forniamo uno schema dettagliato (Figura 1) per stabilire un modello di celluleSICURAmente TE ottenuto dal trattamento subletale cronico sub-letale (Figura 2) con flavopiridol a 25 nM. Nella Figura 3, su 3 giorni di trattamento con flavopiridol, le cellule OVA B16 mostrano caratteristiche parziali di TEsicuramente ma dopo una settimana di trattamento, le cellule OVA B16/F10 mostrano una profonda perdita di fosforilazione in posizione serine 2 sulla CTD di RNA Pol II lungo con una significativa diminuzione di H3K36me3, una modifica dell'istore implicata nella definizione dei confini esonesi e un inibitore delle trascrizioni criptiche in fuga. Di conseguenza, il modello di cellule TE mostradifetti critici di elaborazione dell'mRNA con rapporti manifestamente aumentati di mRNA con limite improprio e non poli-adenlato(Figura 4A, B). Inoltre, la repressione specifica dei geni chiave del percorso di risposta infiammatoria e il percorso di morte delle cellule mediato da FasL sono visti nella Figura 5 e Figura 6. La resistenza imposta all'interferone (IFN-z, IFNz) e la tNF-z stimolato il fosforo delle STAT1 e nfàB, e la resistenza alla morte cellulare da parte del recettore della morte FasL riduce drasticamente la citotossicità di un attacco di cellule immunitarie controTE Tumori. Queste tecniche di conferma sono progettate per testare l'entità dell'influenza che la perturbazione cronica dell'allungamento della trascrizione ha su una vasta gamma di geni che rispondono agli stimoli, e se tale perturbazione in un determinato modello di linea cellulare del topo sia sufficientemente adeguata da provocare una carenza acuta di mRNA funzionali nei geni di segnalazione della risposta infiammatoria, imitando clinicamente le essenzialità di base del TEsicuramente i tumori. Sulla base del nostro studio sul trattamento flavopiridol, la soppressione del fosforilo al secondo residuo di serino (pSER2) di RNA Pol II CTD è fondamentale, in quanto segna l'allungamento della trascrizione. Una dose sublethal per qualsiasi linea cellulare carcinoma topo deve raggiungere una riduzione dei livelli di pSER2 oltre ad avere un effetto insignificante sul tasso di crescita e vitalità della linea cellulare. Anche se vediamo costantemente una riduzione dei livelli di pSER2 e H3K36me3 sui trattamenti 25 nM flavopiridol, non garantisce una repressione dei livelli di pSTAT1 e pNFB (rispettivamente su stimolazioni IFN, IFN , IFN , IFN e TNF). Ogni linea cellulare del carcinoma del topo è unica (cellule B16/F10 OVA o CT26 coltivate in laboratori diversi in un periodo di tempo possono avere effetti leggermente alterati) e possono avere JAK1 o CCNT1 che salvano parzialmente gli effetti del flavopiridol nel sopprimere il geni della via di risposta infiammatoria. In questi casi, per comprendere la temporalità degli effetti mediati da jaK1 o CCNT1, potrebbe essere necessario controllare la cinetica dei livelli pSTAT1 e pNFB. Di conseguenza, JAK1 e/o CCNT1 potrebbe essere necessario essere abbattuti per stabilire questo modello.
Una volta che il modello flavopiridol è stabilito e caratterizzato utilizzando i suddetti saggi, forniamo un saggio esplorativo per verificare se il modello a cellule TEconferisce resistenza all'attacco di cellule T citotossiche (CTL). Sulla base del nostro protocollo ottimizzato, le cellule del flavopiridol trattate B16/F10 sovrastionavano stabilmente il gene OVA (OVA B16) co-incubato con i CTL CD8 " attivati (specifici per l'epipologo OVA257-264) con tossicità selettiva alle cellule che esprimono OVA (un regalo del Dr. Il laboratorio6di Stephen P. Schoenberger non era suscettibile alla lisi tumorale mediata da OT-I ctL. Le cellule OVA B16/F10 (non pretrattate con flavopiridol) hanno subito una massiccia morte cellulare in questo sistema, mentre le cellule parentali B16/F10 sono sopravvissute, in quanto non esprimono antigene OVA (Figura 7). È chiaro dall'esito del test esplorativo suggerito che te indotta da flavopiridol cronico puòsicuramente conferire un mezzo per sfuggire all'attacco immunitario anti-tumorale anche in vivo. Questo può essere ulteriormente testato in modelli di tumore in vivo per verificare la propensione dei modelli TEsicuramente per sfuggire alle risposte immunitarie antitumorali innate e adattativi. I trattamenti anti-asialo potrebbero essere utilizzati per regolare l'attività delle cellule NK in vivo nei topi portatori tumorali. Inoltre, la terapia del checkpoint immunitario (anti-CTLA4 e anti-PD1) può essere somministrata a TEsicuramente topi con cuscinetto tumorale.
In totale, i test TEdecisamente confermativi insieme al saggio esplorativo suggerito insieme dimostrano l'utilità di incorporare questo modello di cellule TEsicuramente in tutta una serie di altre condizioni di test-immune dai tumori. Questo modello può aiutare a analizzare i dettagli molecolari derivanti dall'allungamento trascrizionale difettoso nelle cellule tumorali e la loro risposta alle interazioni delle cellule immunitarie.
Figura 1: Rappresentazione schematica del flusso di lavoro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Caratteristiche di crescita cellulare delle cellule B16 OVA trattate cronicamente con flavopiridol a basso dosaggio: Viability (misurata dal reagente di sostenibilità) delle cellule di controllo e di flavopiridol B16 OVA nei giorni indicati dopo il trattamento. Questa cifra è stata modificata da Modur etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: saggio confermativo per valutare l'RNA Pol II e il profilo dell'istono: Immunoblot dei marchi di istoni e RNA Pol II indicati nelle cellule B16 OVA trattate con flavopiridol per 72 h o 1 settimana. Questa cifra è stata modificata da Modur etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Saggio confermativo per valutare gravi difetti nell'elaborazione dell'mRNA. Rapporti di concentrazioni di mRNA da 5 a 5 e da 5 (A) e da 3 non polianegati a 3 e postatinati (B) concentrazioni di mRNA dopo l'esaurimento del rRNA nelle linee cellulari indicate. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard basata su tre repliche tecniche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Saggio confermativo per valutare il profilo di stimolazione della citochina. Immunoblot di STAT1, pSTAT1, NFàB e p NFàB in controllo e flavopiridol cellule OVA pre-trattate stimolate con IFN-z, IFN o TNF-z per 30 min at (5 ng/mL). Questa cifra è stata modificata da Modur etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Analisi confermata per valutare la resistenza alla FasL ha mediato la morte delle cellule in vitro. Cellule OVA b16 pretrattate di controllo e flavopiridol trattate con FasL per 24 h lettura misurata dal cavalletto di fattibilità. Questa cifra è stata modificata da Modur etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Analisi esplorativa per valutare la resistenza di TEsicuramente modello all'attacco mediato a cellule T citotossico antigene-limitato in vitro. A sinistra: schema diagrammatico del saggio esplorativo. A destra: la relativa vitalità delle cellule B16/F10-OVA co-coltivate con CD8 attivati : CTL (rapporto 1:1) isolati dalle milza dei topi OT-I. P:Welch due campioni t-test. Questa cifra è stata modificata da Modur etal. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il controllo dell'allungamento dell'RNA Pol II è emerso come una leva decisiva per regolare l'espressione genica reattiva allo stimolo a beneficio delle cellule maligne5,7,8. Superare la pausa promotore-proximal all'allungamento e la successiva produzione di mRNA richiede l'attività della chinasi di P-TEFb9,10,11. Il nostro modello utilizza il flavopiridol (25 nM), un inibitore della chinasi essenziale dipendente dalla ciclina CDK9, per imitare i difetti osservati durante l'allungamento di Pol II in TEsicuramente i tumori, un fenotipo precedentemente sconosciuto nei tumori scoperti dal nostro gruppo in precedenza3.
L'attività della chinasi CDK9 è nota da tempo essenziale per la fosforolalazione dei residui di serine 2 nella CTD della grande sottounità di Pol II. Criticamente, siamo riusciti a ottimizzare l'inibizione cronica trattata con flavopiridol di CDK9 (25 nM per 1 settimana) in B16/F10 OVA tale che, oltre a inibire il fosforilazione CTD, il trattamento di flavopiridol da 25 nM per 1 settimana previene un corretto modifiche dell'mRNA in modo imprevisto e abroga efficacemente l'allungamento produttivo dipendente da p-TEFb lungo geni lunghi come la segnalazione di risposta pro-infiammatoria, alterando significativamente i loro modelli di espressione sia all'mRNA che livelli proteici. Per quanto ne sappiamo, non esiste un altro modello descritto nella letteratura che realizzi effettivamente lo stesso risultato.
Questo modello diTE facile da stabilire e generalizzabile può quindi essere sfruttato per sezionare, sia modifiche trascrizionali che epigenetiche che consentono a TE di adattarsisicuramente agli attacchi cellulari immunomediati. Inoltre, questo modello murino mantiene il suo TEsicuramente-come la riduzione dei livelli totale e fosforo- RNA Pol II 21 giorni dopo il rilascio di flavopiridol in vivo analisicrescita 3 (non menzionato nel protocollo qui), suggerendo l'entità di stabilità di questo modello non genetico per ulteriori sperimentazioni in vivo. Tuttavia, occorre prestare attenzione a ottimizzare l'esatta dose sublethal di flavopiridol per altre linee murine (ad esempio, circa 20 nM trattamento flavopiridol per 1 settimana è la dose subletale per MC38 murine carcinoma line; non utilizzato in questo protocollo), l'impatto dell'impatto nella cellula di variazione cellulare densità di placcatura, le condizioni di coltura e le condizioni di stimolazione delle citochine possono variare a seconda delle linee murine. Il protocollo qui descritto fornisce un quadro di base per ridurre al minimo le variabili note per essere critiche per la generazione di funzionalitàsimilia TE dall'inibizione cronica del CDK9. Inoltre, linee cellulari di carcinoma umano, come T47D e CAL51 sono state testate con trattamenti flavoidol a breve termine (3 giorni) che danno origine a simili profili TEsicuramente-come RNA Pol II, indicando l'utilità dell'inibizione cronica a base di flavopiridol di CDK9 mediato allungazione trascrizione nella creazione di linee umane anche modello per studiare TEsicuramente.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato in parte supportato da NCI (CA193549) e CCHMC Research Innovation Pilot premi a Kakajan Komurov, e Department of Defense (BC150484) premio a Navneet Singh. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente le opinioni ufficiali del National Cancer Institute o del Dipartimento della Difesa. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| hhis6FasL | Cell Signaling | 5452 | |
| 10X TBS | Bio-Rad | 170-6435 | |
| 12 well plates | Falcon | 353043 | |
| 20% methanol | Fisher Chemical | A412-4 | |
| 24-well plates | Falcon | 351147 | |
| 4–18% SDS polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561086 | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 5% dry milk | Bio-Rad | 170-6404 | |
| 7-Methylguanosine antibody | BioVision | 6655-30T | |
| 96-well plates | Cellstar | 655180 | |
| AF647-conjugated mouse CD8 | Biolegend | 100727 | |
| antibiotic and antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| anti-His antibody | Cell Signaling | 2366 P | |
| Anti-Rabit | Cell Signaling | 7074 | Dilution 1:5000 |
| Anti-Rat | Cell Signaling | 7077S | Dilution 1:5000 |
| Bradford assay Kit | Bio-Rad | 5000121 | |
| BSA | ACROS Organics | 24040-0100 | |
| BV421-conjugated mouse CD45 | Biolegend | 109831 | |
| crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| Dynabeads Oligo (dT)25 | Ambion | 61002 | |
| FBS | Gibco | 45015 | |
| Fixable Live/Dead staining dye e780 | eBioscience | 65-0865-14 | |
| Flavopiridol | Selleckchem | S1230 | |
| H3k36me3 | Abcam | ab9050 | Dilution 1:2000 |
| IFN-α | R&D systems | 12100-1 | |
| IFN-γ | R&D systems | 485-MI-100 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit | Biolegend | 480007 | |
| NF-κB | Cell Signaling | 8242s | Dilution 1:1000 |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| p-NF-κB | Cell Signaling | 3033s | Dilution 1:1000 |
| p-Ser2-RNAPII | Active Motif | 61083 | Dilution 1:500 |
| p-Ser5-RNAPII | Active Motif | 61085 | Dilution 1:1000 |
| p-STAT1 | Cell Signaling | 7649s | Dilution 1:1000 |
| RiboMinu Eukaryote Kit | Ambion | A10837-08 | |
| RIPA buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | |
| RNAPII | Active Motif | 61667 | Dilution 1:1000 |
| STAT1 | Cell Signaling | 9175s | Dilution 1:1000 |
| TNF-α | R&D systems | 410-MT-010 | |
| total H3 | Cell Signaling | 4499 | Dilution 1:2000 |
| Tri reagent | Sigma | T9424 | |
| Triton | Sigma | T8787-50ML | |
| Tween 20 | AA Hoefer | 9005-64-5 | |
| β-Actin | Cell Signaling | 12620S | Dilution 1:5000 |
| β-ME | G Biosciences | BC98 |
References
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