Summary
このプロトコルは、非遺伝的欠陥転写伸びのインビトロマウス癌モデルを詳述する。ここで、CDK9の慢性阻害は、全癌型の約20%に存在する臨床的に過剰なTE間違いなく現象を模倣し、研究するために、炎症反応遺伝子に沿ったRNA Pol IIの生産的な伸びを抑制するために使用される。
Abstract
我々は以前に、癌のサブセットは、mRNA転写伸長(TE)の広範な欠陥を伴う世界的な転写規制緩和によって定義されていると報告しました- 我々は間違いなくTEとしてそのような癌を呼び出します。特に、TE間違いなく癌は、インターフェロン/JAK/STATおよびTNF/NF-B経路などの大きな遺伝子群における偽の転写および欠陥のあるmRNA処理によって特徴付けられ、その抑制につながる。腎細胞癌および転移性黒色腫患者における腫瘍のTEは間違いなく免疫療法における不十分な応答および結果と相関する。TEの間違いなく癌を調査することの重要性を考えると、免疫療法に対する重大な障害を引き起こすので、このプロトコルの目的は、これらの広範な非遺伝的研究を研究するために、インビトロTE間違いなくマウスモデルを確立することです。癌の転写異常と新しい洞察を得る, 既存の薬剤のための新しい用途, またはそのような癌に対する新しい戦略を見つける.RNAポリメラーゼII(RNA Pol II)のC末端反復ドメイン(CTD)上のセリン2残基のリン酸化を損分化する慢性フラボピリドール媒介CDK9阻害の使用を詳述し、RNA Pol IIの放出を生産的な転写に抑制する。伸長。TEは間違いなく特定の体細胞変異に分類されていないことを考えると、薬理学的モデルは有利であり、それらに観察される広範な転写およびエピジェネティックな欠陥を最もよく模倣する。フラボピリドールの最適化された亜致死量の使用は、転写伸長およびmRNA処理欠陥における非遺伝的広範な破壊の一般化可能なモデルを作成する唯一の有効な戦略であり、臨床的に観察されたTEを密接に模倣する間違いなく特性。したがって、TEのこのモデルは間違いなく、免疫媒介細胞攻撃に抵抗するそれらを可能にする、細胞自律的な因子を解剖するために利用することができる。
Introduction
ほぼすべての活性遺伝子の発現における重要な速度制限ステップは、プロモーター近位休止から生産的な伸び1、2へのRNAポリメラーゼII(RNA Pol II)の遷移である。転写伸びのエピジェネティックな調節がTEと定義された複数のヒト悪性腫瘍の進行を確実に助長することを考えると、反応不良に相当する炎症性反応経路における最適でないシグナル伝達を引き起こす免疫療法3への結果は、このプロトコルの包括的な目標は、癌におけるこれらの広範な非遺伝的転写異常を研究するために有用なインビトロモデルを確立することです。この点において、CDK9の慢性薬理学的阻害の使用は、転写伸長およびmRNA処理欠陥における非遺伝的広範な破壊の全身化可能なモデルを作成するための有効な戦略である。慢性CDK9阻害を用いた根拠は、RNA Pol IIのC末端反復ドメイン(CTD)上のセリン2残基のリン酸化を緩和し、したがって、生産的な転写伸びへのRNA Pol IIの放出を抑制する。また、TEは、我々のグループ3によって前述した、間違いなく癌は、任意の特定の体細胞変異下に分類されない。したがって、非遺伝的(薬理学的)モデルは有利であり、それらに観察される広範な転写およびエピジェネティックな欠陥を最もよく模倣する。本明細行の方法は、マウス癌細胞の慢性フラボピリドール治療モデルの生成および特徴付けについて詳述する。この方法は、TNF/NF-κBおよびインターフェロン/STATシグナル伝達のような、より長いゲノム長さによって特徴付けられた遺伝子に沿った転写伸長を実証的に破壊し、そのレベルで深く制御される。転写伸長3,4,5.全体的に、転写伸び欠陥のこの最適化されたマウス細胞ラインモデルは、新たに記述されたTE間違いなく腫瘍を研究する我々の知識に対する唯一のモデルであり、抗腫瘍免疫攻撃に対する耐性を駆動し、悪用する有用なシステムをレンダリングし、がんにおけるコア転写機械における非遺伝的欠陥の脆弱性を調べる。
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Protocol
シンシナティ小児研究財団の動物保護・使用委員会と施設バイオセーフティ委員会は、すべての動物実験手順(IACUCプロトコル#2017-0061およびIBCプロトコル#IBC2016-0016)を承認しました。実験は、実験動物のケアと使用に関するNIHガイドに記載されている基準に従って行われました。
1. フラボピリドール治療によるRNA Pol IIの慢性阻害-基本戦略
- 種子B16/F10マウス黒色腫細胞の低密度(0.2 x 106)を対応する培地中の10cm培養プレート(DMEM)、10%のウシ血清[FBS]、1%ペニシリンおよびストレプトマイシン[ペン/ストレップ])およびインキュベート37 °Cで、5%CO2加湿インキュベーター。
- 翌日、1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を洗浄し、RNA Pol II伸長因子p-TEFb(サイクリンT/CDK9)の阻害剤であるフラボピリドールの亜致死用量(推定25nM)を用いて培養培地の新しいバッチを追加し、それ以上の1週間を過ごさない。サブカルチャ。
- フラボピリドール治療の1週間後、TEで見られる転写伸び欠陥の様々な属性を要約するモデルの能力を評価するために確認アッセイを行い、間違いなく癌である。
2. 生成マウスTEにおけるインターフェロン(IFN)経路および腫瘍壊死因子(TNF)経路シグナル伝達の欠陥RNA Pol II機能および障害を評価するための確認免疫ブロットアッセイ
- フラボピリドールの培養等数(105)は、B16/F10マウス黒色腫細胞および親B16/F10マウス黒色腫細胞を12ウェルプレートの2つの異なるセットで処理した(RNA Pol IIの機能特性特性化のための1セットとサイトカイン用の他のセット)刺激)5%CO2加湿インキュベーターで一晩37°Cで。
- 翌日、マウスIFN-γ、IFN-α(5ng/mL)、またはTNF-α(5ng/mL)を37°Cで45分間用するサイトカイン刺激セットで細胞を処理する。
- さて、放射性免疫沈殿アッセイ(RIPA)リシスバッファーを用いて、サイトカインとRNA Pol IIの両方の機能特性特性セットの細胞からタンパク質を抽出します。
- 1x PBSで細胞を洗浄し、ウェルあたり50 μLのリシスバッファーで細胞をlyseします。スクレープ、次いで4°C、21,130 x gで細胞をペレットする。
- 洗剤可溶化後のタンパク質濃度に対する標準的な色分法アッセイ(ブラッドフォードまたは同様のアッセイ)を用いて、細胞溶解上清中のタンパク質を測定する。
- 各サンプルから測定されたタンパク質(15 μg)を同量にロードし、4%−18%ナトリウムドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ポリアクリルアミドゲルで実行し、それらをポリビニリジンジフッ化物(PVDF)膜に移します。
- トリスバッファー付き生理生理生理生殖器20(TBST)で5%ドライミルクでPVDF膜をブロックし、その後一次抗体で4°Cで一晩インキュベーションを行う(RNA Pol II 1:1000;p-SER2 RNA Pol II 1:1000;p-SER5 RNA Pol II 1:1000;H3K36me3 1:2000;合計 H3 1:2000;STAT1 1:1000;p-STAT1 1:1000;NFκB 1:1000;p-NFκB 1:1000;β-アクチン1:5000)5%ウシ血清アルブミン中。
- 翌日、室温(RT)で1x TBSTでPVDF膜を1x TBSTで洗浄し、適切な二次抗体(RNA Pol II、p-SER2 RNA Pol II、p-SER5 RNA Pol II、およびp-SER5 RNA Pol II;抗ウサギ(1:5000)をH3K3333でインキュベートします。STAT1、p-STAT1、NFκB、およびp-NFκB)をRTで50分間検出し、市販のワサビペルオキシダーゼ(HRP)基板を用いてタンパク質シグナルを検出し、化学発光を強化した。
注:β-アクチン一次使用はHRP結合であり、従って二次的ななしで開発することができる。
3. 生成されたマウスTEのmRNA処理欠陥を評価するための確認アッセイ
- フラボピリドールの種子等数(0.2 x 106)は、B16/F10マウス黒色腫細胞および親用B16/F10マウス黒色腫細胞を37°Cで6ウェルプレートで一晩5%CO2加湿インキュベーターで処理した。
- RNA抽出試薬またはキット(材料の表)を用いて60%の合流性で培養細胞から総RNAを抽出する。
- 以下の方法で抽出された総RNAからrRNAを枯渇させる:
注:低入力プロトコルは、市販のキットからrRNAを枯渇させるために共同で選択されました- 1つの水浴またはヒートブロックを70~75°Cに、別の水浴またはヒートブロックを37°Cに設定します。
- 選択的rRNA枯渇プローブの1μLとマイクロ遠心管内のハイブリダイゼーションバッファーの30 μLを用いて総RNA(ヌクレアーゼフリー水の2μLで100−500ng)を加え、ボルテックスによって穏やかに混合し、5分間70−75°Cでインキュベートします。
- 次に、チューブを37°Cの水浴/ヒートブロックに移し、サンプルを30分の期間にわたって37°Cに冷却します。
- 渦によって選択的rRNA枯渇プローブ磁気ビーズを再中断し、1.5 mL RNaseフリーマイクロ遠心管内のビーズのアリコート75 μLを再停止する。
- ビーズ懸濁液を磁気セパレータに1分間置き、ビーズを落ち着かせるようにします。優しく吸引し、上清を廃棄します。75 μLのヌクレアーゼフリー水を加え、磁気分離後に上清を廃棄してビーズをもう一度洗い直します。
- ハイブリダイゼーションバッファーの75 μLで洗浄されたビーズを再中断し、アリコート25 μLを別のチューブに再濁させ、後で使用するために37°Cで維持します。
- 残りの50μLビーズを磁気セパレータに1分間置き、上清を捨てます。ハイブリダイゼーションバッファーの20 μLでビーズを再中断し、後で使用するために37 °Cでそれを維持します。
- RNA/選択的rRNA枯渇プローブ混合物を30分間37°Cに冷却した後、チューブを短時間遠心分離し、チューブの底部にサンプルを収集する。
- RNA/選択的rRNA枯渇プローブ混合物の33 μLをステップ3.3.7から調製された磁気ビーズに移します。低速渦で混ぜます。
- チューブを37°Cで15分間インキュベートします。インキュベーション中は、時折内容物を優しく混ぜます。チューブの底部にサンプルを収集するための短い遠心分離が続きます。
- チューブを磁気セパレータに1分間置き、rRNAプローブ複合体をペレットします。この時間は上清を捨てない。上清にはrRNA枯渇RNAが含まれています。
- ステップ3.3.6からビーズの25 μLのチューブを磁気セパレータに1分間置き、上清を廃棄します。ステップ 3.3.11 からビーズの新しいチューブに上清を追加します。低速渦で混ぜます。
- チューブを37°Cで15分間インキュベートします。インキュベーション中は、時折内容物を優しく混ぜます。簡単にチューブを遠心分離し、チューブの底部にサンプルを収集します。
- チューブを磁気セパレータに1分間置き、rRNAプローブ複合体をペレットします。上清を捨てないようにしてください。rRNA枯渇RNAを含む上清(約53μL)を新しいチューブに移します。
- 分光光度計によるRNA収率の濃度を測定する。
- オリゴ(dT)25を含む磁気ビーズへの入力としてrRNA枯渇サンプルの半分を使用して、ポリA+RNAを以下の方法で抽出します。
注:磁気ビーズの表面に結合されたオリゴdT配列を使用してポリAテールメッセンジャーRNAを単離するこのプロトコルは、市販のキット(材料の表)から共同で選ばれた。- >30 s の短い渦を使用してバイアル内のオリゴ dT ビーズを再中断し、200 μL のオリゴ dT ビーズをチューブに転送します。同じボリューム (200 μL) のバインディング バッファーを追加し、再サスペンドします。
- チューブを磁石に1分間入れ、上清を捨てます。次に、磁石からチューブを取り出し、洗浄したオリゴdTビーズを100μLの結合バッファーで再中断します。
- 入力rRNA枯渇総RNAサンプルの体積を10mMトリス-HCl pH 7.5で100 μLに調整します。次に、100 μL のバインディング バッファーを追加します。
- 2分間65°Cに熱し、二次RNA構造を破壊する。さあ、すぐに氷の上に置きます。
- 100 μL 洗浄ビーズに総RNAの200 μLを追加します。完全に混合し、RTで5分間ローターで連続的に回転させることによって結合を可能にする。
- 1-2分間磁石の上にチューブを置き、慎重にすべての上清を削除し、慎重にすべての上清を削除します。
- 磁石からチューブを取り出し、洗浄バッファーの200 μLを追加します。
- 分光光度計により抽出されたポリA+RNAの純度と濃度を測定します。
注: 260/280 の比率は 1.90−2.00、すべての RNA サンプルに対して 2.00−2.20 の 260/230 の比率は許容できると見なされます。 - セクション3.3からのrRNA枯渇サンプルの残りの半分をタンパク質Aカラムへの入力として使用する(RNA免疫沈殿[RIP]キット、材料の表に記載)は、モノクローナル7-メチルグアノシンを使用して5素位キャップRNAを免疫沈殿させる以下の方法で抗体:
注:市販のRNA免疫沈殿キットを用いてm7GキャップメッセンジャーRNAを分離するこのプロトコルは、共同で選択され、さらに改変されました。- 製造元のプロトコルに従ってRIPキットから得られたタンパク質A磁気ビーズを洗浄し、抗体をビーズに事前に結合する。
- 7-メチルグアノシン抗体の3μg(キットに設けられているウサギIgGは陰性制御を用いることができる)をキットから100μL洗浄バッファーに懸濁したマイクロ遠心管内のビーズに移す。
- RT. 遠心分離管で30分間低速回転でインキュベートし、その後、磁気セパレータにチューブを置き、上清を取り除き、廃棄します。
- チューブを取り外し、キットと渦から500μLの洗浄バッファーを簡単に追加します。チューブを短時間遠心分離し、その後もう一度磁気分離を行い、上清を取り除いて廃棄します。
- 手順 3.6.4 をもう一度繰り返します。
- (セクション3.3から)枯渇したrRNAの約120 ngを、予め洗浄された7-メチルグアノシン抗体結合ビーズに加える。RNase阻害剤の1 μLを追加します。軽度の撹拌で1-1.5hのRTでインキュベートします。
- ビーズを300x gで10秒でスピンダウンし、上限のないmRNA(非7-メチルグアノシン)mRNAを含む上清を新しいマイクロ遠心管に取り除きます。
- 100 μLの洗浄バッファーを追加し、同様に2回洗浄します。集めた上清を、非キャッピング(非7-メチルグアノシン)mRNAと同じマイクロ遠心管にプールする。氷の上に保管してください。
- 7M尿素、2%SDS、0.35M NaCl、10 mM EDTAおよび10 mMトリスを含む尿素リシスバッファー(ULB)の300 μLを有するビーズからキャップされた(7-メチルグアノシン)mRNAを溶出し、pH 7.5を65°Cで加熱して2mにする。
- 300 μLの熱化サンプル(キャップおよび上限なしmRNA)とフェノールの300 μLを混ぜ合わせて:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1;市販)(4°Cで保存)。反転してよく混ぜ、約10分間放置し、もう一度穏やかに混ぜます。
- 18,928 x gで2分間遠心分離機を使用し、最上層を慎重に新鮮なチューブにピプトし、下層を廃棄します。
- 300 μL のフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1;4°Cで保存)をサンプルに加えます。反転してよく混ぜ、18,928 x gで1分間遠心分離機を慎重に、トップ層を新鮮なチューブにピプトし、下層を捨てます。
- 2-ポルパノールの300 μLと3M酢酸ナトリウム(pH 5.2)の30μLをキャップおよび上限なしのRNAに加えます。サンプルを数回反転し、20時間-20°Cに置きます。
- さて、4°Cで10分間18,928 x gでサンプルを遠心分離します。上清を慎重に取り出し、70%エタノールの500μLを加えます。
- 4 °Cで10分間18,928 x gで再び遠心分離機。上清を慎重に廃棄し、RTでペレットを5分未満乾燥させ、核リースフリー水でペレットを再懸濁します。
- 分光光度計でRNA収量の純度と濃度を測定します。260/280 比は、すべての RNA サンプルに対して 1.90−2.00 の範囲、および 2.00−2.20 の範囲の 260/230 の比率である必要があります。
4. マウスTEの応答を評価する確認アッセイは、間違いなくFasL媒介細胞死に対するモデルである
- フラボピリドールの種子等数(30,000細胞)は、対応する培地(DMEM)中の96ウェル培養プレート中のB16/F10マウス黒色腫細胞および親性B16/F10マウス黒色腫細胞を処理し、37°C、5%CO2加湿で一晩インキュベートするインキュベーター。
- 10 μg/mL抗His抗体の存在下でhの6FasL(0.1−1000 ng/mL)の異なる濃度の培養フード内の細胞を処理し、37°C、5%CO2加湿インキュベーターで24時間インキュベートします。
- 1x PBSバッファーで洗浄することにより、死んだ細胞を除去します。付属細胞を4%パラホルムアルデヒドで20分間RTで20分間固定し、4%のパラホルムアルデヒド(洗浄不要)を廃棄し、結晶バイオレット溶液(20%メタノール、1x PBSで0.5%結晶バイオレット)で30分間染色します。
- 水道水でプレートを軽くすすいで余分な汚れを取り除きます。RTで乾燥させるためにプレートを保ちます。
- 1x PBSに溶解した1xニオニオニック界面活性剤の100μLで結晶バイオレットを再溶解し、マイクロプレートリーダー内の570nmで吸光度を測定して細胞密度を測定する。
5. 抗原特異的細胞傷害性T細胞攻撃に対するマウスTEの反応を評価する探索的アッセイ
- OT-I CD8+細胞傷害性T細胞攻撃(CTL)の単離と活性化
- マウスCD8 T細胞分離キットを用いて磁気細胞分離によりOT-I TCR Tg RAG-1−/−マウスの脾臓からCD8+細胞を精製する:
- 完全なRPMI媒体の2つのOT-I TCR Tg Tg RAG-1−−−−およびマウスから2つの脾臓を収穫する。
- 70 μmフィルターで脾臓をつぶし、20 mLのRPMIで満たされた50 mLチューブに保持し、脂肪だけがフィルターに残るまで注射器の背面を使用します。
- 4 °Cで5分間220 x gで流れを遠心分離します。上清を捨てます。
- 前の遠心分離工程から脾臓ペレットに赤血球(RBC)リシスバッファーの1 mLを加え、混合物を1分間ピペットにする。
- RPMIの最大10 mLを加えることによって解決を中和する。
- 4 °Cで5分間220 x gの遠心分離機。上清を廃棄し、RPMIの10mLで再懸濁します。
- カウントするための小さなアリコートを取ります。残りを220xgで4°Cで5分間遠心分離する。
- カウントされた100万個毎の細胞について、市販の磁気分離システムバッファ(Mojoバッファーまたは同様のバッファ)の1mLでペレットを再中断する。
- ステップ5.1.1.8でペレット細胞の1mL毎に体積100μLの抗体カクテルを調出します。抗体カクテルには、ビオチン抗CD4、CD105、CD45R/B220、CD11c、CD49b、TER-119、CD19、CD11b、TCR γ/δ、およびCD44が含まれる。
- このカクテルを1mLペレット化した細胞に加え、氷の上に15分間置きます。
- 1mL再懸濁したペレット脾臓細胞に添加した抗体カクテルの100μLごとに100μLの磁気(ストレプトアビジン)ビーズを添加する。15分間氷の上に置いてください。
- 市販の磁気分離システムバッファの7 mLを追加します。さて、アリコートは、混合物の約3−4mLを新鮮なチューブにする。よく混ぜ、磁石に5分間固定します。
- 液体(CD8+細胞を含む)を氷上の新鮮なチューブにデカントします。さて、ステップ5.1.1.12からチューブに混合物の残りの3−4 mLをアリコートし、5分間磁石に固定し、液体(CD8+細胞の第2バッチを単離したCD8+細胞の第2バッチ)を氷上に保持したCD8+細胞の第1バッチを含む同じチューブに固定します。
- 種子設計付着線維芽細胞APC-(MEC.B7SigOVA)ラインは、特異的オブアルブミン(OVA)由来、H-2Kb制限ペプチドエピトープOVA257-264(SIINFEKL)、共刺激分子B7.1と共刺激分子B7.1と共刺激分子B7.1と共刺激分子B7.1で、24ウェルプレートでウェル当たり75,000細胞で、37°C、5%CO2加湿した。
注:使用される付着線維芽細胞は、CCHMCのエディス・ヤンセン博士の研究室からの贈り物です。ラインはもともとアレルギーと免疫学のためのラホヤ研究所のスティーブン・P・シェーンバーガー博士の研究室で作成されました6. - 24時間後、HEPESバッファー、ピルビン酸ナトリウム、L-グルタミンおよび高グルコースで市販されているイコーブの改変ダルベッコ培地(IMDM)でAPCの単層を一度洗浄し、0.5 x 106ナイーブOT-I CD8+細胞を2Mの2Mに加えます( ステップ5.1.1.1.13から)50 mM β-ME、2 mL EDTA、4 mM L-グルタミンおよびHEPESおよび10%FBSを補充する。
- 20時間後、非付着性OT-I細胞を穏やかに収穫し(浮遊OT-I細胞を用いて培養皿に培養物を集め、細胞を191 x gで2分間ペレット化し、生細胞を数え、共培養のためにそれらを移す)。
- マウスCD8 T細胞分離キットを用いて磁気細胞分離によりOT-I TCR Tg RAG-1−/−マウスの脾臓からCD8+細胞を精製する:
- B16/F10-OVA細胞とのCD8+細胞の共培養
- 種子OT-I由来CD8+細胞は、B16/F10(抗オブアルブミンを欠いている)との共培養における1:1(各300,000細胞)の割合で、未処理のB16/F10-OVA、およびB16/F10-OVA細胞をフラボピリドール(25nM)で前処理し、1週間で完全な6Mで処理した。5%CO 2加湿インキュベーターで37°Cで20hの培温。
- 20時間後、OT-I由来CD8+細胞を取り出します(浮遊OT-I由来CD8+細胞を含む培養皿に培養皿に培養物を集めることによって)。付着したB16/F10-OVA細胞を1x PBSで洗浄します。
- トリプシンを含む0.05%EDTAで接続されたB16/F10-OVA細胞の3つの群を5分間191xgでトリプシン化した細胞を5分間試用する。
- 収穫したB16/F10-OVA細胞を冷たいPBS(0.5%FBSおよび0.05%のアジドナトリウムを含む)で、生存性染色剤および関連する標識抗体(固定可能な生存率染色剤e780、AF647-共役マウスCD8およびBV421-conjugatedマウス)でインキュベートすることによって染色する).
- フローサイトメトリーによりB16/F10-OVA細胞の3群の生存率を解析する。
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Representative Results
ここでは、25nMでフラボピリドールを使用した慢性サブ致死(図2)治療により得られたTE確実細胞モデルを確立するための詳細なスキーム(図1)を提供する。図3では、フラボピリドールによる3日間の治療において、B16 OVA細胞はTEの部分特性を明らかにしたが、治療の1週間後、B16/F10 OVA細胞はRNA Pol IIのCTD上のセリン2位置におけるリン酸化の重大な損失を示す。H3K36me3の有意な減少を伴う-エキソン境界の定義に関与するヒストン修飾と逃げ出す不可解な転写の阻害剤。その結果、TEは間違いなく細胞モデルが不適切にキャップされ、非ポリアデニル化mRNAの比が明らかに増加した重要なmRNA処理欠陥を示す(図4A、B)。また、主要な炎症反応経路遺伝子およびFasL媒介細胞死経路の特異的な抑圧は、図5および図6に見られる。インターフェロン(IFN-α、IFNγ)およびTNF-αに対する課せられた耐性は、STAT1およびNFκBのリン酸化を刺激し、死受容体リガンドFasLによる細胞死に対する耐性は、TEに対する免疫細胞攻撃の細胞毒性を確実に減少させる。腫瘍。これらの確認技術は、転写伸びの慢性摂動が広範囲の刺激応答性遺伝子に及ぼす影響の程度をテストするように設計されており、所定のマウス細胞株モデルにおけるそのような摂動が十分であるかどうかは、十分である。炎症反応シグナル伝達遺伝子における機能性mRNAの急性疾患を誘発し、TEの基本的な本質を臨床的に模倣する。フラボピリドール治療の我々の研究に基づいて、RNA Pol II CTDの第2セリン残基(pSER2)におけるリン酸化の抑制は、転写伸長を示すので重要である。任意の与えられたマウス癌細胞株の致死量は、細胞株の増殖および生存率にわずかな影響を及ぼすことに加えて、pSER2レベルの低下を達成しなければならない。我々は一貫して25 nMフラボピリドール治療でpSER2およびH3K36me3レベルの減少を見ているが、それはpSTAT1およびpNFκBレベルの両方の抑圧を保証するものではない(IFN-α、IFNγおよびTNF-α刺激)。各マウス癌細胞株は一意である(B16/F10 OVAまたはCT26細胞が一定期間にわたって異なる実験室で培養された場合、わずかに変化した効果を持っている可能性がある)、JAK1またはCCNT1のいずれかが部分的にフラボピライドールの効果を抑制する炎症反応経路遺伝子。このような場合、pSTAT1およびpNFκBレベルの運動学は、JAK1またはCCNT1のいずれかによってフラボピリドール媒介効果およびその救助の時間性を理解するために、異なる時点(5−70分)でチェックする必要があります。したがって、JAK1および/またはCCNT1は、このモデルを確立するためにノックダウンする必要があります。
フラボピリドールモデルが確立され、前述のアッセイを使用して特徴付けられたら、TE間違いなく細胞細胞モデルが細胞傷害性T細胞(CTL)攻撃に対する耐性を付与するかどうかをテストするための探索的アッセイを提供します。当社の最適化されたプロトコルに基づいて、フラボピリドールは、OVA発現細胞に選択的毒性を有する活性化CD8+CTL(OVA257-264エピトープに特異的)と共インキュベートされたOVA遺伝子(B16 OVA)を安定的に過剰発現するB16/F10細胞を処理した(Drからの贈り物)。スティーブン・P・シェーンバーガーの研究室6)はOT-I CTL媒介性腫瘍リシスの影響を受けなかった。B16/F10 OVA細胞(フラボピリドールで前処理されていない)は、このシステムで大量の細胞死を受け、B16/F10親細胞はOVA抗原を発現しないので生き残った(図7)。慢性フラボピリドール誘発TEは、生体内でも抗腫瘍免疫攻撃から脱出する手段を確実に与えることができるという、提案された探索的アッセイの結果から明らかである。これは、生体内腫瘍モデルでさらに試験し、TEの傾向を確認し、自然および適応性抗腫瘍免疫応答を逃れるために。抗アジアロ治療は、腫瘍ベアリングマウスにおける生体内のNK細胞の活性を調節するために使用することができる。また、免疫チェックポイント療法(抗CTLA4および抗PD1)は、TE間違いなく腫瘍ベアリングマウスに投与することができる。
全体として、TEは間違いなく、提案された探索的アッセイと一緒に他の腫瘍免疫試験条件の全体のホストにこのTE間違いなく細胞モデルを組み込むことの有用性を実証する。このモデルは、腫瘍細胞の転写伸びの欠陥と免疫細胞相互作用に対する応答に起因する分子詳細を解析するのに役立ちます。
図 1: 作業フローの概略表現。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:低用量フラボピリドールで慢性的に処置されたB16 OVA細胞の細胞増殖特性:投与後の示された日におけるコントロールおよびフラボピリドール処理細胞B16 OVAの生存率(生存率試薬によって測定される)。この図は Modur ら3から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:RNA Pol IIおよびヒストンプロファイルを評価するための確認アッセイ:72時間または1週間フラボピリドールで処理されたB16 OVA細胞における示されたヒストンおよびRNA Pol IIマークの免疫ブロット。この図は Modur ら3から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:mRNA処理における重篤な欠陥を評価するための確認アッセイ。示された細胞株におけるrRNA枯渇後の5'上限(A)および3'非ポリアデニル化3'-ポリアデニル化(B)mRNA濃度に対する5′上限なしの比率。誤差バーは、3つのテクニカル反復に基づく標準偏差を表します。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:サイトカイン刺激プロファイルを評価するための確認アッセイ。コントロールおよびフラボピリドール前処理B16 OVA細胞におけるSTAT1、pSTAT1、pFκBの免疫ブロットは、IFN-α、IFNγまたはTNF-αで30分間刺激した(5 ng/mL)。この図は Modur ら3から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:インビトロでのFasL媒介細胞死に対する耐性を評価する確認アッセイ。コントロールおよびフラボピリドール前処理B16 OVA細胞を24時間読み出しについてFasLで処理し、生存率アッセイにより測定した。この図は Modur ら3から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:TEの耐性を評価する探索的アッセイは、インビトロでの抗原制限細胞傷害性T細胞媒介性攻撃に対するTEの耐性を間違いなくモデル化する。左:探索的アッセイの図式スキーム。右:OT-Iマウスの脾臓から単離した活性化CD8+CTLs(1:1比)と共培養したB16/F10-OVA細胞の相対生存率。P: ウェルチ2サンプルt-テスト。この図は Modur ら3から変更されています。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
RNA Pol II伸長制御は、悪性細胞5、7、8の利益に対する刺激応答性遺伝子発現を調節するための決定的なレバーとして出現した。伸びに対するプロモーター近位休止を克服し、その後のmRNA産生は、P-TEFb9、10、11のキナーゼ活性を必要とする。我々のモデルは、本質的なサイクリン依存性キナーゼCDK9の阻害剤であるフラボピリドール(25 nM)を利用して、TEのPol II伸長中に観察された欠陥を模倣する間違いなく癌(我々のグループによって発見された癌の未知の表現型)を模倣する。以前の3.
CDK9キナーゼ活性は、長い間、Pol IIの大サブユニットのCTDにおけるセリン2残基のリン酸化に不可欠であることが知られている。批判的に、我々はB16/F10 OVAにおけるCDK9(1週間25nM)の慢性阻害を最適化することに成功し、CTDリン酸化を阻害することに加えて、25nMフラボピリドール治療を1週間の適切な転写後を防ぐことに成功した。予期せぬ方法でmRNAを改変し、p-TEFb依存的な生産的伸びを、プロ炎症反応シグナル伝達遺伝子などの長い遺伝子に沿って効果的に消し合い、mRNAおよび両方の発現パターンを有意に変化させるタンパク質レベル。私たちの知るうまで、同じことを効果的に達成する文献に記載されている他のモデルはありません。
TE のこの簡単に確立し、一般化可能なモデルは間違いなく解剖するために利用することができ、転写およびエピジェネティック修飾の両方を、TEは間違いなく癌が免疫媒介性細胞攻撃に適応することを可能にする。さらに、このマウスモデルは、生体内成長アッセイ3におけるフラボピリドール放出後21日後の総およびホスホ-RNA Pol IIレベルの減少のようなTEを確実に保持し、この安定性の程度を示唆している。生体内実験のさらなる非遺伝的モデル。しかし、他のマウスラインに対するフラボピリドールの正確な致死量を最適化するために注意が必要です(例えば、1週間の約20nMフラボピリドール治療はMC38マウス癌株の亜致死用量であり、このプロトコルでは使用されていない)、細胞の変動の影響めっき密度、培養条件、およびサイトカイン刺激条件は、マウスラインによって異なる場合があります。ここで説明するプロトコルは、慢性的なCDK9阻害によるTEの生成に不可欠であることが知られている変数を最小限に抑えるための基本的なフレームワークを提供します。さらに、T47DやCAL51などのヒト癌細胞株は、同様のTEを生み出す短期的な(3日間)フラボピリドール治療で試験された-RNA Pol IIプロファイルのような、フラボピリドールベースの慢性阻害の有用性を示すCDK9の転写伸びは、TEを間違いなく研究するモデル人間の線を作成する際に伸びを仲介しました。
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Disclosures
著者は何も開示していない。
Acknowledgments
この作品は、NCI(CA193549)とCCHMCリサーチイノベーションパイロット賞のカカジャン・コムロフ賞、国防総省(BC150484)がナヴニー・シンに授与されました。内容は著者の責任のみであり、必ずしも国立がん研究所または国防総省の公式見解を表すものではありません。資金提供者は、研究の設計、データ収集と分析、出版の決定、または原稿の準備に何の役割も持ちはありませんでした。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| hhis6FasL | Cell Signaling | 5452 | |
| 10X TBS | Bio-Rad | 170-6435 | |
| 12 well plates | Falcon | 353043 | |
| 20% methanol | Fisher Chemical | A412-4 | |
| 24-well plates | Falcon | 351147 | |
| 4–18% SDS polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561086 | |
| 4% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 5% dry milk | Bio-Rad | 170-6404 | |
| 7-Methylguanosine antibody | BioVision | 6655-30T | |
| 96-well plates | Cellstar | 655180 | |
| AF647-conjugated mouse CD8 | Biolegend | 100727 | |
| antibiotic and antimycotic | Gibco | 15240-062 | |
| anti-His antibody | Cell Signaling | 2366 P | |
| Anti-Rabit | Cell Signaling | 7074 | Dilution 1:5000 |
| Anti-Rat | Cell Signaling | 7077S | Dilution 1:5000 |
| Bradford assay Kit | Bio-Rad | 5000121 | |
| BSA | ACROS Organics | 24040-0100 | |
| BV421-conjugated mouse CD45 | Biolegend | 109831 | |
| crystal violet | Sigma | C3886-100G | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| Dynabeads Oligo (dT)25 | Ambion | 61002 | |
| FBS | Gibco | 45015 | |
| Fixable Live/Dead staining dye e780 | eBioscience | 65-0865-14 | |
| Flavopiridol | Selleckchem | S1230 | |
| H3k36me3 | Abcam | ab9050 | Dilution 1:2000 |
| IFN-α | R&D systems | 12100-1 | |
| IFN-γ | R&D systems | 485-MI-100 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Immobilon Western Chemiluminescent HRP Substrate | Millipore | WBKLS0500 | |
| MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit | Biolegend | 480007 | |
| NF-κB | Cell Signaling | 8242s | Dilution 1:1000 |
| PBS | Gibco | 14190-144 | |
| p-NF-κB | Cell Signaling | 3033s | Dilution 1:1000 |
| p-Ser2-RNAPII | Active Motif | 61083 | Dilution 1:500 |
| p-Ser5-RNAPII | Active Motif | 61085 | Dilution 1:1000 |
| p-STAT1 | Cell Signaling | 7649s | Dilution 1:1000 |
| RiboMinu Eukaryote Kit | Ambion | A10837-08 | |
| RIPA buffer | Santa Cruz Biotechnology | sc-24948 | |
| RNAPII | Active Motif | 61667 | Dilution 1:1000 |
| STAT1 | Cell Signaling | 9175s | Dilution 1:1000 |
| TNF-α | R&D systems | 410-MT-010 | |
| total H3 | Cell Signaling | 4499 | Dilution 1:2000 |
| Tri reagent | Sigma | T9424 | |
| Triton | Sigma | T8787-50ML | |
| Tween 20 | AA Hoefer | 9005-64-5 | |
| β-Actin | Cell Signaling | 12620S | Dilution 1:5000 |
| β-ME | G Biosciences | BC98 |
References
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