Summary
Denne artikel introducerer prøveforberedelsesmetoder til en unik analysemetode i realtid baseret på det omgivende massespektrometri. Denne metode lader os udføre real-time analyse af de biologiske molekyler in vivo uden nogen særlige præbehandlinger.
Abstract
Massespektrometri (MS) er et kraftfuldt værktøj i analytisk kemi, fordi det giver meget præcise oplysninger om molekyler, såsom masse-til-ladning nøgletal(m / z), som er nyttige til at udlede molekylvægte og strukturer. Selv om det er hovedsagelig en destruktiv analytisk metode, de seneste fremskridt i den omgivende ionisering teknik har gjort det muligt for os at erhverve data, mens forlader væv i en relativt intakt tilstand med hensyn til integritet. Sonde elektrospray ionisering (PESI) er en såkaldt direkte metode, fordi det ikke kræver komplekse og tidskrævende forbehandling af prøver. En fin nål fungerer som en prøve vælger, samt en ionisering udleder. Baseret på den meget skarpe og fine egenskab af sonden tip, ødelæggelse af prøverne er minimal, giver os mulighed for at erhverve real-time molekylære oplysninger fra levende ting in situ. Heri introducerer vi tre anvendelser af PESI-MS teknik, der vil være nyttige for biomedicinsk forskning og udvikling. Den ene indebærer anvendelse på fast væv, som er den grundlæggende anvendelse af denne teknik til den medicinske diagnose. Da denne teknik kræver kun 10 mg af prøven, Det kan være meget nyttigt i de rutinemæssige kliniske indstillinger. Den anden ansøgning er til in vitro medicinsk diagnostik, hvor humant blod serum måles. Evnen til at måle væskeprøver er også værdifuld i forskellige biologiske forsøg, hvor der ikke kan fremlægges en tilstrækkelig mængde prøve til konventionelle analyseteknikker. Den tredje ansøgning læner sig mod direkte anvendelse af sonde nåle i levende dyr, hvor vi kan opnå real-time dynamik metabolitter eller lægemidler i specifikke organer. I hver ansøgning, Vi kan udlede de molekyler, der er blevet opdaget af MS eller bruge kunstig intelligens til at opnå en medicinsk diagnose.
Introduction
Massespektrometri (MS) er en teknologisk erkendelse af reduktionisme; det reducerer analyseformålet til en enhed, der kan fortolkes på grundlag af molekylære arter eller kaskader. Derfor er det en repræsentativ metode til analytisk kemi. Det består af fire processer: ionisering, analyse, detektion og spektrale erhvervelse. Fordi ionisering af molekylet er den første proces i massespektrometri, det generelt begrænser formen af analysander, der skal behandles. De fleste ioniseringsprocedurer kræver ødelæggelse af strukturen, morfologien og biologiske processer i realtid af økologiske prøver. F.eks. kræver elektrosprayionisering (ESI) MS, at prøverne er i flydende tilstand for effektiv ionisering1. Prøverne skal derfor gennemgå et komplekst biokemisk præparat, som ændrer molekylernes sammensætning. Alternativt, mens matrix-assisteret laser desorption ionisering (MALDI) MS kan rekonstruere molekylære kort over tynde opdeltvæv2,3,dens ionisering effektivitet er for lav til at opdage alle molekyler i prøverne, og det er særligt dårlig til at analysere fedtsyrer. I betragtning af disse begrænsninger, sonde elektrospray ionisering (PESI)4 kan bruges til at observere real-time ændringer i biologiske systemer in situ uden at ødelægge den strukturelle integritet5,mens den biologiske organisme observeres er teknisk i en levende tilstand. En meget fin nål bruges i dette tilfælde, der tjener samtidigsom prøvevælger og ionudleder. Det betyder, at de komplekse prøveforbehandlingssekvenser kan omgås for at opnå massespektre, der afspejler de molekylære komponenter i det levende system på stedet.
Der er flere andre ionisering metoder, rivaliserende PESI-MS. Den ene er hurtig fordampningsionisering massespektrometri (REIMS)6. Denne teknik fungerer godt under operationen, fordi det er samlet med en elektrisk kniv og indsamler ion røgfanen genereret under snit. Mens REIMS er meget nyttigt for operationen, det er hovedsagelig en destruktiv metode, der kræver elektrisk ablation af vævet. Det er derfor ikke nyttigt at foretage en detaljeret analyse af celler og væv i en præparativ prøve eller i laboratorieanalyser. Desuden, fordi det indsamler en stor mængde røgfanen, der indeholder vævsrester, det kræver langvarig vedligeholdelse af enhederne efter hver brug, hvilket begrænser brugen af denne maskine til særlige kirurgiske procedurer. En lignende metode, kaldet laser desorption ionisering massespektrometri (LDI-MS)7, er en anden teknik, der er noninvasive og nyttige for overfladen analyse. Fordi denne teknik er god til at scanne overfladen af en prøve, det opnår omfattende to-dimensionelle analyse som MALDI imaging masse spektrometri8,9. Da LDI-MS imidlertid kun finder anvendelse på overfladeanalysen, er PESI-MS en fordel ved at analysere prøverne f.eks. En anden teknik, MasSpec Pen10, blev rapporteret at opnå høj specificitet og følsomhed i diagnosticering af kræft i skjoldbruskkirtlen, men diameteren af sonden er i størrelsesordenen mm, og det er specifikt for overfladen analyse, hvilket betyder, at det ikke kan opdage små knuder af kræft eller dybt lokaliserede læsioner. Da denne metode desuden anvender en mikrokapillær strømkanal, der er indlejret i sondepennen, skal krydskontaminering tages i betragtning i lighed med LDI-MS. Andre teknikker findes, der er blevet anvendt til kliniske indstillinger, såsom flow sonde og ionisering form podning11, men de er ikke udbredt.
PESI er ekstrem miniaturisering af ESI, hvor kapillæren af nanoelektrosprayen konvergerer på en fast nål med en spidskrumningsradius på flere hundrede nm. Ionisering finder sted i det ekstremt begrænsede område af nålen spidsen ved at danne en Taylor kegle, hvor prøverne forbliver indtil ionisering af al væsken på spidsen er afsluttet12. Hvis analysanden forbliver på spidsen af metalnålen, genereres der kontinuerligt overskydende ladning på grænsefladen mellem metalnålen og analysanden. Derfor forekommer sekventiel ionisering af molekyler afhængigt af deres overfladeaktivitet. Denne egenskab gør nålespidsen til en slags kromatogram, der adskiller analysanden afhængigt af deres overfladeaktivitet. Mere teknisk, molekyler med den stærkere overflade aktivitet kommer til overfladen af Taylor kegle og er ioniseret tidligere end dem med svagere overflade aktivitet, som klæber til overfladen af nålen indtil udgangen af ioniseringsprocessen. Således opnås fuldstændig ionisering af alle molekyler, der er opfanget afnålen, 13. Desuden, fordi denne teknik ikke indebærer tilsætning af overflødige opløsningsmidler til prøven, flere hundrede femtoliter er tilstrækkelige til at få masse spektre stærk nok til yderligere analyse14. Disse egenskaber er fordelagtige for analysen af intakte biologiske prøver. En stor ulempe ved PESI-MS ligger imidlertid i diskontinuiteten i ioniseringen på grund af nålens stempelbevægelse langs den lodrette akse, svarende til en savemaskine. Ionisering finder kun sted, når sondens spids når det højeste punkt, når ionåbningens højde justeres på den vandrette akse. Ionisering ophører, mens nålen opfanger prøver, og så stabiliteten af ionisering er ikke lig med den i konventionelle ESI. Derfor er PESI-MS ikke en ideel metode til proteomics.
Til dato er PESI-MS hovedsagelig blevet anvendt på analyse af biologiske systemer, der dækker en bred vifte af områder fra grundforskning til kliniske miljøer. For eksempel, den direkte analyse af humant væv udarbejdet under operationen var i stand til at afsløre ophobning af triacylglycerol i både nyrecelle karcinom15 og svælg planocellulært karcinom16. Denne metode kan også måle flydende prøver, såsom blod, at fokusere på lipid profil. For eksempel er nogle molekyler blevet afgrænset under kostændringer hos kaniner; det blev rapporteret, at nogle af disse molekyler faldt på meget tidlige stadier af forsøgene, hvilket indikerer den høje følsomhed og nytte n i dette system til klinisk diagnose17. Endvidere, direkte anvendelse på et levende dyr tilladt påvisning af biokemiske ændringer i leveren efter blot en nat fastende5. Zaitsu et al.18 revurderede dette eksperiment5 og analyserede leverens metaboliske profiler på næsten samme måde, med resultater, der styrkede stabiliteten og reproducerbarheden af vores oprindelige metode. Desuden, Vi var i stand til at diskriminere kræftvæv fra omkringliggende ikke-kræft lever i mus ved hjælp af denne teknik19. Derfor er dette en alsidig massespektrometri teknik, der er nyttig i forskellige indstillinger, både in vivo og in vitro. Fra et andet synspunkt kan PESI-modulet laves, så det passer til forskellige massespektrometre ved at justere monteringstilbehøret. I denne korte artikel introducerer vi det grundlæggende og eksempler på anvendelser (figur 1), herunder anvendelser med levende dyr5.
I henhold til forordningerne og lovgivningen i hvert land skal dele af denne protokol revideres for at opfylde de enkelte institutioners kriterier. Anvendelse på den levende organisme er den mest interessante og udfordrende, fordi det kan give biokemiske eller metaboliske ændringer i væv eller organer i levende dyr in situ. Mens denne ansøgning blev godkendt af den institutionelle komité for dyrepleje ved Universitetet i Yamanashi, i 20135, en anden runde af godkendelse vil nu være nødvendig på grund af de seneste ændringer i reglerne for dyreforsøg. Flere ændringer i forsøgsordningen er derfor tilrådelige. Med hensyn til massespektre opnået i forsøg, under hensyntagen til udsving en masse spektre mellem hver måling i betragtning, er der ingen spektrale informationsdeling system, der er fælles for nukleotid sekventering samfund. Der skal udvises forsigtighed, når operatøren håndterer nålen for at undgå nålestiksulykker, især når nålen fjernes fra nåleholderen. En særlig anordning til at løsne nålen er meget nyttig til dette formål. Da PESI-modulets rum er et lufttæt, lukket kammer, opstår der ikke lækage af ionfjerdmen, hvis massespektrometeret betjenes i henhold til instruktionerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Den institutionelle komité for dyrepleje ved Universitetet i Yamanashi godkendte alle protokoller og brugen af forsøgsdyr, der er angivet heri. Brugen af humane prøver blev godkendt af det institutionelle etiske råd ved Universitetet i Yamanashi.
1. Fremstilling af fast væv
BEMÆRK: Prøverne skal opbevares på is, efter at de er fjernet fra dyret eller menneskekroppen for at bevare vævets friskhed. Hvis målingerne ikke umiddelbart følger dissektion, anbefales det at opbevare væv ved -80 °C. Det er ikke tilrådeligt at placere vævet i nogen form for buffer eller saltvand, fordi de kan udtrække visse indhold fra vævet. Væv, der er fastgjort med aldehyder eller indlejret i paraffin/voks eller kryogel, er ikke egnet til MS-målinger.
- Vævsprøven skæres til ca. 2 x 2 x 2 mm med en skalpel eller kniv. Alternativt, punch ud prøven med en trepan (en engangs biopsi punch, bar størrelse 3 mm), der anvendes til hudundersøgelse. I dette tilfælde skal kolonnens længde trimmes til 2 mm.
BEMÆRK: Ethvert væv kan analyseres ved hjælp af denne metode. I dette eksperiment, lever15 og nyre19, er blevet analyseret med succes for at opnå masse spektre. Generelt, parenkymale organer giver god masse spektre, mens dem, der har fibrøse komponenter ikke. - Hvis vævet er forurenet med blod, skal du vaske kort med iskold fosfatbuffered saltvand.
BEMÆRK: For at minimere postmortem vævsskader, fuldføre dette trin, så hurtigt som muligt, ved stuetemperatur. Hvis der ikke foretages målinger med det samme, fastfryses vævet i flydende nitrogen og opbevares ved -80 °C. - Prøven afskårne eller udstansede prøver (ca. 10 mg) anbringes i et mikrorør af plast og tilsættes 100 μL ethanol.
BEMÆRK: Prøvernes nøjagtige vægt bestemmes ikke, fordi det massespektrometri, der anvendes i dette system, ikke giver kvantitative data. Ca. 10 mg er optimal for det parenkymale væv. - Homogeniser prøven ved hjælp af et mikropest.
- 10 μL af homogenatet anbringes i patronens brønd (figur 2).
- Anbring patronen i massespektrometerets ioniseringskammer, og monter den nålesonde i rustfrit stål, der skal anvendes til prøveionisering (figur 2).
BEMÆRK: Sondennåle leveres af producenten. De er lavet af rustfrit stål og har en krumning radius på ca 400 nm. - Luk kammerlåget fast for automatisk at aktivere sikkerhedsanordningen.
- Start den indbyggede computer ved at klikke på ikonet Start for at analysere. Brug på skærmen paneler, anvende en spænding på 2,3 kV til nålen til at generere elektrospray og sikre, at hyppigheden af nålen er 3 Hz.
- Vent på 30 s, for at målingen er afsluttet.
BEMÆRK: Sessionen ophører automatisk, når dataindsamlingen er fuldført. Kvaliteten af analysen overvåges af et totalt ionkratogram (TIC). Måletiden er defineret for at opnå de repræsentative massespektre og kan forkortes eller forlænges. - Kassetteren og nålen bortskaffes i en biologisk farebortskaffelse efter måling af hver prøve.
BEMÆRK: Der kan kun måles én prøve ad gangen. Det er ikke nødvendigt at kalibrere maskinen før hver måling. kalibrering afhænger af leverandørens regelmæssige kontrol en gang hvert halve år. - Analysere massespektre og eksportere massespektrale tekstdata ved hjælp af den software, der er forbundet med massespektrometeret (se tabel over materialer)som anført i nedenstående trin (figur 3).
- Klik på LCD-filen i datafil browservinduet i softwaren.
- Vælg og klik på en enkelt top på massespektret vinduet og til automatisk at skildre en udvundet ion kromatogram (EIC).
- Kontroller TIC og EIC, og klik på det gennemsnitlige spektrumikon for at vælge vinduet for tidsinterval til generering af massespektret.
BEMÆRK: I denne analyse optræder målmolekylerne i vinduet masse-til-opladning (m/z) (Figur 3). Desuden, fordi varigheden af ionisering pr enkelt takt af nålen bevægelse er meget kort, alle de opnåede massespektre er hovedsagelig gennemsnit spektre over 10 s (300 scanninger). - Generér en tekstfil, der indeholder m/z- og ionintensitet, ved at klikke på fanen Eksporter for yderligere analyse. Denne tekstfil kan gemmes i en hvilken som helst mappe.
BEMÆRK: Eventuelle RNA-konserveringsmidler vil påvirke prøvernes oprindelige spektrale mønster. Desuden er det tilrådeligt at håndtere og opbevare væv uden væske (såsom fosfat-buffered saltvand) for at forhindre eluering af molekylære komponenter fra vævet ind i væsken under opbevaring. Ideelt set anvendes friske eller friske frosne prøver uden behandling.
2. Kropsvæsker (serum) forberedelse
BEMÆRK: Hele denne procedure er næsten identisk med den, der anvendes til fast væv. Patronen til væskeprøven fås hos producenten. Da forureningen med røde blodlegemer (RBC' er) i høj grad kan mindske effektiviteten af spektralerhvervelse af den påtænkte komponent (plasma eller serum), skal du sørge for at eliminere alle RBC'er ved centrifugering før målinger.
- Tag 10 μL af serumprøven og læg den i et 1,5 ml mikrorør.
BEMÆRK: Der kan anvendes både friskt og opbevaret serum. - Tilsæt 190 μL ethanol på 1,5 ml rør, derefter vortex i 2 min ved stuetemperatur.
- Væsken centrifugeres ved 15.000 x g i 1-5 min ved 4 °C.
- Overfør 10 μL supernatant i patronens brønd.
- Anbring patronen i maskinens ioniseringskammer, og monter nålesonden i rustfrit stål, som skal bruges til prøveionisering (figur 2).
- Luk kammerlåget fast for automatisk at aktivere sikkerhedsanordningen.
- Start den indbyggede computer ved at klikke på ikonet Start for at ionisere.
- Prøvepatronen og nålen kasseres som beskrevet i 1.10, når der er foretaget målinger.
- Analysere de opnåede sæt af EIC som anført nedenfor (Figur 3).
- Åbn LCD-filen i databrowseren.
- Klik på et enkelt toppunkt for at få vist TIC og EIC.
- Vælg vinduet for tidsinterval til generering af massespektre ved hjælp af det gennemsnitlige spektrumikon.
- Eksportér den genererede fil, der indeholder både m/z- og ionintensiteten på et tilsvarende højdepunkt, ved at klikke på eksportfanen på skærmen.
BEMÆRK: Denne procedure kan anvendes på spyt, urin, og andre kropsvæsker samt.
3. Forberedelse til in vivo PESI-MS i levende organisme
BEMÆRK: I dette afsnit introduceres et program til overvågning af den metaboliske profil af 5-Fluoro-2'-deoxyuridin (5-FdU) i en levende musemodel. Brug aseptiske tilstande hele vejen igennem.
- Indgyde 100 μL 100 mM 5-FdU opløsning i halen vene af en 2-måneder gammel mus (ca. 20 g vægt).
BEMÆRK: Der er ingen præference for sex, alder eller mus stamme. Mens denne protokol blev godkendt på det tidspunkt, hvor vi udførte eksperimentet5, afhænger gennemførligheden af dette eksperiment af de etiske begrænsninger i det land, hvor det vil blive udført. - Bedøve musen efter din godkendte dyrepleje protokol. Vurdere dybden af anæstesi ved den manglende reaktion på hale klemme.
BEMÆRK: Hvis brugen af natriumpentobarbital ikke er tilladt af det etiske udvalg for dyreforsøg, kan der anvendes alternative metoder, f.eks. - Barber bughulen ved hjælp af en elektrisk barbermaskine og anvende dyrlæge salve til øjnene.
- Sæt den beæstetiske mus i en supine position og fastgør poterne på plastpladen ved hjælp af reparationstape. Skrub operationsstedet med scrubs af 70% alkohol tre gange.
- Skær bughulen op med en saks. Først skærehuden sideværts (10 mm) fra lige over mellemgulvet. Skær musklen i bugvæggen og bughinden (ca. 7 mm) og hold såret åbent ved hjælp af rustfri ledning for at afsløre leveroverfladen.
BEMÆRK: Der er ingen grund til at gennemsyre overfladen af leveren. - Påfør spidsen af sondenålen på leverens overflade. Juster nålens dybde til ca. 0,5 mm dyb for at optimere ioniseringseffektiviteten, idet du samtidig kontrollerer TIC- og spektralmønsteret. Indstil højspænding til 2,3 kV og frekvens til 3 Hz på skærmen på kontrolpanelet.
- Fjern dyret fra plastpladen.
- Sutur såret ved hjælp af en kirurgisk tarm sutur og returnere musen til buret. Lad ikke musen være uden opsyn, før den har genvundet bevidstheden for at opretholde sternal recumbency. Returner ikke musen til selskab med andre dyr, før den er kommet sig helt.
- Udfør tidsforløbet i ionintensiteten i EIC og proceduren for EIC-fremstilling som i 1.11.1 til 1.11.4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som vist i figur 3er de data, der er indhentet ved PESI-MS-teknikken, massespektre, hvis m/z varierer fra 10 til 1.200 i dette system. Mens man kan opdage molekyler op til m / z 2.000, der var få toppe opnået ved hjælp af denne teknik over masseområdet m / z 1.200. Derfor analyserede vi toppe fra m/ z 10 til 1.200. Der var iøjnefaldende grupper af toppe omkring m / z 800 og 900; førstnævnte repræsenterer cellemembrankomponenter, såsom fosfatylcholin (PC) arter, og sidstnævnte repræsenterer triacyl glycerol (TAG). Figur 4 viser massespektre fra en normal nyre fra mennesker og en nyrecellekarcinom (RCC). Massespektre blev opnået ved hjælp af den direkte vævsmetode, der er beskrevet i protokol 1. Da den klare celletype RCC akkumulerer TAG i cytoplasmaet, udtales en gruppe spektre omkring m/z 900. Resultatet i figur 4 blev opnået ved hjælp af den ekstraktionsmetode, der blev indført i figur 1 for faste prøver.
Fordi lipid metabolismen af hepatocellulære karcinom ændringer under sygdomsprogression20,er det muligt at overvåge stadier af sygdommen ved rutinemæssig biopsi kombineret med PESI-MS. Resultatet i figur 5 viser forskellene i spektrale mønster mellem normalt levervæv og HCC. Især er der flere bemærkelsesværdige spektre af TAG i HCC. Hvis opløsningen af massespektrometeret er overlegen, er det muligt, at den molekylære anmærkning af hvert spektrum vil gøre det muligt at belyse kræftens molekylære mekanisme samt normal cellulær fysiologi.
Real-time overvågning af narkotika metabolisme kan udføres ved hjælp af PESI. I vores eksperimenter blev farmakodynamikken i anti-oncotic agent 5-FdU overvåget over 10 s efter at være blevet injiceret gennem halen vene af en mus. Meget hurtig påvisning af spektre blev observeret kun få sekunder efter injektion af lægemidlet (Figur 6), hvilket indebærer hurtig transport af lægemidlet via blodbanen til leveren. Intensiteten af natriumadducts af 5-FdU aftaget med en kort defekt af ionsignalet i optagelsen på omkring 6-7 s efter start af målingen. Dette var på grund af den varierende dybde af PESI nålen i leveren parenkym, som var resultatet af kroppens bevægelser af den bedøvede mus. Derfor skal det sørges for at justere dybden af PESI-nålen til realtidsmåling af levende dyr. Der er ingen anbefalet måde at finde den optimale dybde af nålen, men det bliver tydeligt med praksis.
Blodprøver fra tre personer blev analyseret af PESI-MS. I dette tilfælde blev 10 μL serum blandet med 190 μL ethanol på 50 % og derefter anvendt til PESI-MS-analyse. Mens de overordnede spektrale mønstre synes at dele flere fælles toppe(figur 7),er der mange minutter forskelle i spektre fra disse tre personer. De er et fingeraftryk af hver person i form af metaboliske aktiviteter. For detaljerede oplysninger om molekylære identiteter, er det nødvendigt at bruge en high-end maskine. Massespektrometeret, der blev anvendt i forsøgene, gav ikke en høj nok opløsning til at identificere molekylerne.
Hvis der er kontaminering med polymerforbindelser, giver de oprindelige spektre i figur 4 anledning til overlejrede periodiske og iøjnefaldende toppe, der slører spektrene fra den oprindelige prøve (figur 8). For at påvise dette eksperimentelt, tilføjede vi polypropylen glycerol triol (PPGT) til 2,5% for at reproducere et tilfælde af forurening. Næsten alle de specifikke spektre, der ses i figur 8, blev maskeret ved tilsætning af PPGT.
Figur 1: Skematisk oversigt over et prøvepræparatflow. For prøver er en specialiseret prøvepatron ideel til erhvervelse af stabile data. Væskeprøveanalyse er den nemmeste måde at udføre PESI-MS på ved blot at placere opløsningen i patronen. Der er to metoder til anvendelse af denne metode til fast væv. Den direkte anvendelse af PESI på vævet er meget let og hurtigt, mens ekstraktionsmetoden gør det muligt at opnå en langt mere stabil erhvervelse af spektre afhængigt af prøvearterne. I denne procedure anbringes et lille stykke vævsprøve i et mikrorør med 100 μL ethanol og homogeniseres med mikropest. 10 μL af den resulterende homogenat anvendes derefter til massespektrometri. Ved analyse af et levende dyr anbringes 30 μL ethanol på målorganets serosaloverflade efterfulgt af måling. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Oversigt og grundlæggende komponenter i PESI-MS. Et massespektrometer udstyret med et PESI modul. Ioniseringsdelen installeres i et lukket kammer, hvor ionindløb, nåleholder og prøveholder anbringes. Nålen er færdiglavet, og den engangsnål i rustfrit stål fastgøres til kanyleholderen. Det er indstillet i massespektrometeret lige efter at prøvepatronen er angivet i kammeret. Den gennemsnitlige krumningvinkel på nålen er 400 nm. Patronen til placering af prøven er engangstændere og fremstillet af plastpolymerer. Det har en lille brønd til placering af den flydende prøve (rød pil). Når du har sat den faste prøve i brønden, foldes kassetten for at klemme prøven og forsegle brønden. For en flydende prøve patron, en anden bruges, der ikke kræver foldning, og dette er en anbefalet version, der er overlegen i forhold til faste prøver. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Grafisk brugergrænseflade (GUI) til PESI-MS. Alle procedurer for generering af massespektre fra det samlede ionkratogram (TIC) kan udføres med den tilhørende software. Efter åbning af LCD-filen i databrowseren kan TIC vises, og tidsintervallet kan vælges til generering af massespektre. De genererede massespektre kan eksporteres som tekstdata, der indeholder både masse-til-opladningsforhold (m/z) og ionintensitet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Human renal celle karcinom viser karakteristiske toppe af neutrale lipider. Der var relativt stærke toppe i spektre fra humant nyrecellekarcinomvæv (RCC), som ikke blev identificeret i det omgivende ikke-kræftvæv. Disse toppe repræsenterer hovedsageligt triacylglycerol (TAG) på omkring masse-til-opladning ratio (m / z) 900. Spektral erhvervelse blev udført ved hjælp af den positive ion mode ved direkte analyse. Høj spænding blev sat til 2,3 kV. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Eksempel på data, der er erhvervet i normalt levervæv og leverkarcinom (HCC). Det øverste panel skildrer spektre fra et humant levervæv, hvor en neoplastisk læsion ikke var til stede, men fra en patient med kronisk hepatitis og skrumpelever. Det nederste panel viser hcc's gennemsnitlige spektre fra den samme patient. På et øjeblik, mens disse to har meget ens spektrale mønstre, der er mange små forskelle i spektrale mønster. Abscissa viser masse-til-opladning-forholdet (m/z), og koordinatet viser den relative intensitet af hvert spektrum. Erhvervelse af spektre blev udført ved hjælp af den positive iontilstand efter ekstraktion af vævet, som vist i figur 2C. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Real-time målinger af narkotika metabolisme. Metaboliske ændringer i 5-FdU injiceres intravenøst i halen beholderen af en mus. Meget hurtig og følsom påvisning af 5-FdU med natriumadduct blev opnået i leveren in situ. På grund af ustabil ionisering under måling, kan ophør af signalet bemærkes på omkring 6-7 s. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Eksempler på data fra tre personer. Humanserum fra tre personer blev analyseret ved hjælp af PESI-MS. Der var klare forskelle i de spektrale mønstre blandt individer. Der blev indhentet data ved hjælp af den positive iontilstand. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Polymerforbindelser forstyrrer præcis dataindsamling. På grund af den periodiske fremkomst af spektrale toppe overlejret på den oprindelige prøve, bliver det svært at fortolke data præcist. I dette tilfælde fremstår spektre, der stammer fra polypropylentriolglycerol (PPGT), som en støjende overlejring. Disse forbindelser, der normalt anvendes til kalibrering, maskere de oprindelige spektre fra leveren. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om PESI er et derivat af ESI for massespektrometri4, er det mest fordelagtigt at overvåge metabolomiiii realtid samt til analyse af biokemiske reaktioner uden at udføre komplekse eller tidskrævende præbehandlinger5,14,15,17. Det er en nem og øjeblikkelig massespektrometri teknik, der kan anvendes på den integrerede tilstand af levende organismer. Da det ikke kræver komplekse kaskader af prøvepræbehandlinger, er der en langt større mulighed for at vurdere hele prøvens molekylære sammensætning, fordi vi undgår ethvert muligt tab af prøve, der kan forekomme i konventionelle ESI, hvilket kræver komplekse trin af prøvebehandlinger ved hjælp af store mængder organiske opløsningsmidler. Derfor giver PESI os mulighed for at få meget mere information fra prøven, hvis alle betingelser er korrekt kontrolleret.
Vi skal først nævne nogle af de tekniske aspekter, der er nødvendige for at opnå gode resultater, når vi overvejer PESI-MS-analyse. Den mest kritiske faktor i PESI er vedligeholdelse af ioniseringeffektivitet under analysen. For at opnå dette er det tilrådeligt at justere og optimere afstanden mellem spidsen af nålen og prøvefladen, at generere en stabil TIC ved at henvise til computerskærmen under analysen. For at gøre dette er det nødvendigt at ændre nålens dybde på en trinvis måde for at opnå maksimal TIC. Da ioniseringens varighed er forholdsvis kort i forhold til ESI, er PESI ikke ideel til reproducerbarhed eller kvantificering. For det andet, fordi formen af nålen spidsen spiller en meget vigtig rolle i ionisering ved at danne en ideel Taylor kegle, der tjener som ion kilde, skal man sørge for ikke at deformere nålen spidsen. Deformation af spidsen kan føre til lavere ioniseringeffektivitet.
Mens PESI er fordelagtigt, fordi det kan anvendes direkte på friske prøver (f.eks lever, nyre, og hjerne) og levende organisme uden særbehandling, Det er relativt følsomme over for andre udefrakommende forurenende stoffer, fordi det kan ionisere næsten alle komponenter, der er indeholdt i en væske21,22,23. Det vil sige ulempen ved fordelen ved at springe prøve forbehandling betyder, at PESI-MS er en ulempe i flere situationer, der ofte opstår i biologiske eksperimenter. Som forklaret i protokolafsnittet er PESI følsom over for kontaminering med RNA-konserveringsmidler, aldehyder og polymerforbindelser såsom kryogels, der ofte anvendes til histologisk præparat. Blodpropper kan klæbe til PESI nålen og ofte maskere de tilsigtede spektre. Desuden frigør hæmolyse af RBC'er hæmoglobin, og den dissociaerede ferric ion giver anledning til meget stærkere spektre end dem, der stammer fra de tilsigtede analysander. Polymerforbindelser giver også periodiske spektrale toppe, der overlejrer spektre, der stammer fra de tilsigtede analysander, hvilket gør det meget sværere at fortolke de reelle data på grund af støjen (figur 8). For at undgå problemer i erhvervelsen af massespektre, er det tilrådeligt at følge vores protokol, idet der tages særligt hensyn til henvisninger til forureningen. I den forbindelse er anvendelsen af PESI i nogle tilfælde begrænset.
En anden ulempe ved PESI ligger i sin relativt ustabile ioniseringproces, som kræver, at vi justerer sondens dybde til analysanden. Desuden kan denne teknik dække et meget begrænset område i en enkelt analyse. På grund af den meget lille størrelse af nålespidsen, der anvendes direkte på vævet, er PESI-MS-analysen ikke så omfattende som 2D-analysen, der kan opnås med et MALDI-TOF MS-baseret billeddannelsesmassespektrometri eller DESI-baseret billeddannelse7,8. PESI kan dog rekonstruere et billede af hippocampal dannelse, selv om det tager flere timer23, fordi 2D-scanning af en prøve tager lang tid, hovedsagelig på grund af denne teknik ustabile ionisering effektivitet. Under hensyntagen til dette, masse spektral billeddannelse af PESI-MS er ikke et værdifuldt program.
Med hensyn til de elektrokemiske egenskaber af PESI, volumen og koncentration af prøven, der klæber til nålen spidsen er kritisk18,da undertrykkelsen effekt er noget svækket ved nedskæringer elektrospray størrelse. I betragtning af at PESI er miniaturisering af ESI, prøver skal ideelt set fortyndes for at undgå at danne en gylle på spidsen. Det er derfor nødvendigt at tilsætninge ca. 30 μL ethanol med 50 % ethanol for at opnå en effektiv ionisering, når metoden med direkte væv anvendes (figur 2B). Dette maksimerer ioniseringseffektiviteten og opnår næsten fuldstændig ionisering af molekylerne fastgjort til spidsen af nålen.
At vælge den mest hensigtsmæssige metode til databehandling er meget vigtigt, når du bruger dette system24. Med hensyn til gennemførelsen af maskinlæring til enhver sygdomsdiagnose er det nødvendigt at oprette en database for at fastlægge en reference til klassificering eller kategorisering af sygdomme7. For eksempel har vi brugt støtte vektor maskine eller logistisk regression til at foretage en diagnose af primær lever maligniteter25.
PESI-MS er en alsidig og nem teknik, der har et stort potentiale for narkotika screening, dopingtest, fødevaresikkerhed test af landbrugsprodukter26, og nogle miljøtest. Da denne ioniseringsenhed er kompatibel med andre spektrometre ved at forberede en vedhæftet fil til hvert specifikt instrument, kan PESI anvendes til forskellige formål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Den tilsvarende forfatter blev finansieret af Shimadzu, en producent og leverandør af PESI-MS instrument.
Acknowledgments
Vi takker Ayumi Iizuka for driften af PESI-MS og Kazuko Sawa-nobori for hendes sekretærbistand. Vi takker Bronwen Gardner, Ph.D., fra Edanz Group (www.edanzediting.com/ac) for at redigere et udkast til dette manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (5-FdU) | Sigma-Aldrich | F8791-25MG | 25mg |
| disposable biposy punch (Trepan) | kai Europa GmbH | BP-30F | bore size 3mm |
| ethanol | nacalai tesque | 14710-25 | extra pure reagent |
| LabSolutions | Shimadzu | ver. 5.96, Data analyzer | |
| micropestle | United Scientific Supplies | S13091 | |
| microtube | Treff | 982855 | 0.5 mL clear |
| PESI-MS (Direct Probe Ionization-MS) | Shimadzu | DPiMS-2020 | Mass spectrometer equipped with PESI |
| PPGT solition | Shimadzu | ND | Attached to DPiMS-2020 |
References
- Fenn, J. B., Mann, M., Meng, C. K., Wong, S. F., Whitehouse, C. M. Electrospray ionization for mass spectrometry of large biomolecules. Science. 246, 64-71 (1989).
- Karas, M., Bachman, D., Bahr, U., Hillenkamp, F. Matrix-Assisted Ultraviolet Laser Desorption of Non-Volatile Compounds. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 78, 53-68 (1987).
- Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100000 by laser ionization time-of flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2, 151-153 (1988).
- Hiraoka, K., Nishidate, K., Mori, K., Asakawa, D., Suzuki, S. Development of probe electrospray using a solid needle. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 21, 3139-3144 (2007).
- Yoshimura, K., Chen, L. C., Yu, Z., Hiraoka, K., Takeda, S. Real time analysis of living animals by electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 417, 195-201 (2011).
- Balog, J., et al. Intraoperative tissue identification using rapid evaporative ionization mass spectrometry. Science Translational Medicine. 5, 194ra93 (2013).
- Boughton, B. A., Hamilton, B. Spatial metabolite profiling by matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 291-321 (2017).
- Shimma, S., Sugiura, Y., Hayasaka, T., Hoshikawa, Y., Noda, T., Setou, M. MALDI-based imaging mass spectrometry revealed abnormal distribution of phospholipids in colon cancer liver metastasis. Journal of Chromatography. B, Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 855, 98-103 (2017).
- Sugiyama, E., Setou, M. Visualization of brain gangliosides using MALDI imaging mass spectrometry. Methods in Molecular Biology. 1804, 223-229 (2018).
- Zhang, J., et al. Nondestructive tissue analysis for ex vivo and in vivo cancer diagnosis using a handheld mass spectrometry system. Science Translational Medicine. 9, 406 (2017).
- Pirro, V., Jarmusch, A. K., Vincenti, M., Cooks, R. G. Direct drug analysis from oral fluid using swab touch spray mass spectrometry. Analytica Chimca Acta. 861, 47-54 (2015).
- Chen, L. C., et al. Characterization of probe electrospray generated from a solid needle. Journal of Physical Chemistry. B. 112, 11164-11170 (2008).
- Mandal, M. K., Chen, L. C., Hiraoka, K. Sequential and exhaustive ionization of analytes with different surface activity by probe electrospray ionization. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 22, 1493-1500 (2011).
- Yoshimura, K., Chen, C. L., Asakawa, D., Hiraoka, K., Takeda, S. Physical properties of the probe electrospray ionization (PESI) needle applied to the biological samples. Journal of Mass Spectrometry. 44, 978-985 (2009).
- Yoshimura, K., et al. Analysis of renal cell carcinoma as a first step for mass spectrometry-based diagnostics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23, 1741-1749 (2012).
- Ashizawa, K., et al. Construction of mass spectra database and diagnosis algorithm for head and neck squamous cell carcinoma. Oral Oncology. 75, 111-119 (2017).
- Johno, H., et al. Detection of potential new biomarkers of atherosclerosis by probe electrospray ionization mass spectrometry. Metabolomics. 14, 38 (2018).
- Zaitsu, K., et al. Intact endogenous metabolite analysis of mice liver by probe electrospray ionization/triple quadrupole tandem mass spectrometry and its preliminary application to in vivo real-time analysis. Analytical Chemistry. 88, 3556-3561 (2016).
- Yoshimura, K., et al. Real time diagnosis of chemically induced hepatocellular carcinoma using a novel mass spectrometry-based technique. Analytical Biochemistry. 441, 32-37 (2013).
- Nakagawa, H., et al. Lipid metabolic reprogramming in hepatocellular carcinoma. Cancers. 10, 447-461 (2018).
- Mandal, M. K., Chen, L. C., Hashimoto, Y., Yu, Z., Hiraoka, K. Detection of biomolecules from solutions with high concentration of salts using probe electrospray and nano-electrospray ionization mass spectrometry. Analytical Methods. 2, 1905-1912 (2010).
- Yoshimura, K., Chen, L. C., Johno, H., Nakajima, M., Hiraoka, K., Takeda, S. Development of non-proximate probe electrospray ionization for real-time analysis of living animal. Mass Spectrometry. 3, S0048 (2014).
- Chen, L. C., et al. Ambient imaging mass spectrometry by electrospray ionization using solid needle as sampling probe. Journal of Mass Spectrometry. 44, 1469-1477 (2009).
- Yoshimura, K., Chen, C. L., Asakawa, D., Hiraoka, K., Takeda, S. Physical properties of the probe electrospray ionization (PESI) needle applied to the biological samples. Journal of Mass Spectrometry. 44, 978-985 (2009).
- Takeda, S., Yoshimura, K., Hiraoka, K. Innovations in analytical oncology - Status quo of mass spectrometry-based diagnostics for malignant tumor. Journal of Analytical Oncology. 1, 74-80 (2012).
- Hiraoka, K., et al. Component profiling in agricultural applications using an adjustable acupuncture needle for sheath-flow probe electrospray ionization/mass spectrometry. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 67, 3275-3283 (2019).
