Summary
Questo articolo introduce metodi di preparazione di esempio per un metodo analitico unico in tempo reale basato sulla spettrometria di massa ambientale. Questo metodo ci permette di eseguire analisi in tempo reale delle molecole biologiche in vivo senza particolari pretrattamenti.
Abstract
La spettrometria di massa (MS) è un potente strumento nella chimica analitica perché fornisce informazioni molto accurate sulle molecole, come i rapporti massa-carica (m/z), utili per dedurre pesi e strutture molecolari. Mentre è essenzialmente un metodo analitico distruttivo, recenti progressi nella tecnica di ionizzazione ambientale ci hanno permesso di acquisire dati lasciando il tessuto in uno stato relativamente intatto in termini di integrità. La ionizzazione dell'elettrospray a sonda (PESI) è un cosiddetto metodo diretto perché non richiede un pretrattamento complesso e dispendioso in termini di tempo dei campioni. Un ago sottile funge da raccoglitore campione, nonché come emettitore di ionizzazione. Sulla base della proprietà molto nitida e fine della punta della sonda, la distruzione dei campioni è minima, permettendoci di acquisire le informazioni molecolari in tempo reale da esseri viventi in situ. Qui, introduciamo tre applicazioni della tecnica PESI-MS che saranno utili per la ricerca e lo sviluppo biomedico. Uno riguarda l'applicazione al tessuto solido, che è l'applicazione di base di questa tecnica per la diagnosi medica. Poiché questa tecnica richiede solo 10 mg del campione, può essere molto utile nelle impostazioni cliniche di routine. La seconda applicazione è per la diagnostica medica in vitro in cui viene misurato il siero del sangue umano. La capacità di misurare campioni di liquidi è preziosa anche in vari esperimenti biologici in cui non è possibile fornire un volume sufficiente di campione per le tecniche analitiche convenzionali. La terza applicazione si appoggia verso l'applicazione diretta di aghi sonda in animali viventi, dove possiamo ottenere la dinamica in tempo reale di metaboliti o farmaci in organi specifici. In ogni applicazione, possiamo dedurre le molecole che sono state rilevate dalla SM o utilizzare l'intelligenza artificiale per ottenere una diagnosi medica.
Introduction
La spettrometria di massa (MS) è una realizzazione tecnologica del riduzionismo; riduce l'oggetto dell'analisi a un'unità che può essere interpretata sulla base di specie molecolari o cascate. Pertanto, è un metodo rappresentativo di chimica analitica. È costituito da quattro processi: ionizzazione, analisi, rilevamento e acquisizione spettrale. Poiché la ionizzazione della molecola è il primo processo nella spettrometria di massa, generalmente limita la forma degli analiti da elaborare. La maggior parte delle procedure di ionizzazione richiedono la distruzione della struttura, della morfologia e dei processi biologici in tempo reale di campioni organici. Ad esempio, la ionizzazione dell'elettrospray (ESI) MS richiede che i campioni siano in uno stato liquido per una ionizzazione efficiente1. I campioni, quindi, devono passare attraverso una complessa preparazione biochimica, che altera la composizione delle molecole. In alternativa, mentre la SM per la desorptizione laser assistita da matrice può ricostruire mappe molecolari del tessuto sezionatosottile2,3, la sua efficienza di ionizzazione è troppo bassa per rilevare tutte le molecole nei campioni ed è particolarmente scarsa nell'analisi degli acidi grassi. Considerando queste limitazioni, la ionizzazione dell'elettrospray a sonda (PESI)4 può essere utilizzata per osservare i cambiamenti in tempo reale nei sistemi biologici in situ senza distruggere l'integrità strutturale5, mentre l'organismo biologico osservato è tecnicamente in uno stato vivente. In questo caso viene utilizzato un ago molto fine che funge simultaneamente da raccoglitore di campioni e come emettitore di ioni. Ciò significa che le complesse sequenze di pretrattamento del campione possono essere bypassate per ottenere spettri di massa che riflettano i componenti molecolari del sistema vivente in situ.
Ci sono diversi altri metodi di ionizzazione che rivaleggiano con PESI-MS. Uno è la spettrometria di massa evaporativa rapida evaporativa (REIMS)6. Questa tecnica funziona bene durante l'intervento chirurgico perché è assemblato con un coltello elettrico e raccoglie il pennacchio di ioni generato durante l'incisione. Mentre REIMS è molto utile per l'intervento chirurgico, è essenzialmente un metodo distruttivo che richiede l'ablazione elettrica del tessuto. Pertanto, non è utile per l'analisi dettagliata di cellule e tessuti in un campione preparativo o in analisi di laboratorio. Inoltre, poiché raccoglie una grande quantità di pennacchio contenente detriti tissutali, richiede una lunga manutenzione dei dispositivi dopo ogni utilizzo, limitando così l'uso di questa macchina a procedure chirurgiche speciali. Un metodo simile, chiamato spettrometria di massa di desorption laser desorption (LDI-MS)7, è un'altra tecnica che non è invasiva e utile per l'analisi della superficie. Poiché questa tecnica è efficace nella scansione della superficie di un campione, ottiene un'analisi bidimensionale completa come la spettrometria di massa di imaging MALDI8,9. Tuttavia, poiché LDI-MS è applicabile solo all'analisi della superficie, IL PESI-MS è vantaggioso per l'analisi dei campioni, ad esempio all'interno del tessuto. Un'altra tecnica, la MasSpec Pen10, è stata segnalata per ottenere un'elevata specificità e sensibilità nella diagnosi del cancro della tiroide, ma il diametro della sonda è nell'ordine di mm ed è specifico per l'analisi della superficie, il che significa che non è in grado di rilevare piccoli noduli di cancro o lesioni profondamente localizzate. Inoltre, poiché questo metodo utilizza un canale di flusso microcapillare incorporato nella penna della sonda, la contaminazione incrociata deve essere presa in considerazione, in modo simile a LDI-MS. Esistono altre tecniche che sono state applicate a impostazioni cliniche, come la sonda di flusso e il modulo di ionizzazione tamponato11, ma non sono diffusi.
IL PESI è la miniaturizzazione estrema dell'ESI, in cui il capillare del nano-elettrospray converge su un ago solido con un raggio di curvatura della punta di diverse centinaia di nm. La ionizzazione avviene nell'area estremamente ristretta della punta dell'ago formando un cono Taylor, su cui rimangono campioni fino a quando la ionizzazione di tutto il fluido sulla punta è completata12. Se l'analita rimane sulla punta dell'ago metallico, la carica in eccesso viene continuamente generata all'interfaccia tra l'ago metallico e gli analiti. Pertanto, la ionizzazione sequenziale delle molecole si verifica a seconda della loro attività superficiale. Questa proprietà rende l'ago punta una sorta di cromatogramma, separando gli analiti a seconda della loro attività superficiale. Più tecnicamente, le molecole con l'attività superficiale più forte arrivano alla superficie del cono Taylor e vengono ionizzate prima di quelle con un'attività superficiale più debole, che aderiscono alla superficie dell'ago fino alla fine del processo di ionizzazione. Così, la ionizzazione completa di tutte le molecole raccolte dall'ago è raggiunto13. Inoltre, poiché questa tecnica non comporta l'aggiunta di solvente superfluo al campione, diverse centinaia di femtolitri sono sufficienti per ottenere spettri di massa abbastanza forti per ulteriori analisi14. Queste proprietà sono vantaggiose per l'analisi di campioni biologici intatti. Tuttavia, uno svantaggio maggiore dell'AMM risiede nella discontinuità nella ionizzazione a causa del movimento reciproco dell'ago lungo l'asse verticale, simile a una macchina di segatura. La ionizzazione avviene solo quando la punta della sonda raggiunge il punto più alto quando l'altezza dell'orifizio io. La ionizzazione cessa mentre l'ago raccoglie i campioni, e quindi la stabilità della ionizzazione non è uguale a quella nell'ESI convenzionale. Pertanto, IL PESI-MS non è un metodo ideale per la proteomica.
Ad oggi, IL PESI-MS è stato applicato principalmente all'analisi dei sistemi biologici, coprendo un'ampia gamma di campi, dalla ricerca di base agli ambienti clinici. Ad esempio, l'analisi diretta del tessuto umano preparato durante l'intervento è stato in grado di rivelare l'accumulo di triacylglycerolo sia nel carcinoma a cellule renali15 che nel carcinoma squamoso pharyeal16. Questo metodo può anche misurare campioni liquidi, come il sangue, per concentrarsi sul profilo lipidico. Ad esempio, alcune molecole sono state delineate durante i cambiamenti dietetici nei conigli; è stato riferito che alcune di queste molecole sono diminuite nelle fasi molto iniziali degli esperimenti, indicando l'elevata sensibilità e utilità di questo sistema per la diagnosi clinica17. Inoltre, l'applicazione diretta ad un animale vivente ha permesso la rilevazione di cambiamenti biochimici del fegato dopo appena una notte di digiuno5. Questo esperimento 5 harivisitato questo esperimento5 e ha analizzato i profili metabolici del fegato quasi allo stesso modo, con risultati che hanno rafforzato la stabilità e la riproducibilità del nostro metodo originale. Inoltre, siamo stati in grado di discriminare il tessuto tumorale dal fegato non canceroso circostante nei topi utilizzando questa tecnica19. Pertanto, si tratta di una tecnica di spettrometria di massa versatile che è utile in vari ambienti, sia in vivo che in vitro. Da un altro punto di vista, il modulo può essere realizzato per adattarsi a vari spettrometri di massa regolando l'attacco di montaggio PESI. In questo breve articolo vengono presentate le nozioni di base e gli esempi di applicazioni (Figura 1), incluse le applicazioni con animali viventi5.
Secondo i regolamenti e le leggi di ciascun paese, parti di questo protocollo dovranno essere riviste per soddisfare i criteri di ciascuna istituzione. L'applicazione all'organismo vivente è la più interessante e stimolante perché può fornire cambiamenti biochimici o metabolici nei tessuti o negli organi negli animali viventi in situ. Mentre questa domanda è stata approvata dal comitato istituzionale per la cura degli animali presso l'Università di Yamanashi, nel 20135, un altro ciclo di approvazione sarà ora necessario a causa dei recenti cambiamenti nelle normative per gli esperimenti sugli animali. Sono pertanto consigliabili apportare diverse modifiche al regime sperimentale. Per quanto riguarda gli spettri di massa ottenuti negli esperimenti, tenendo conto delle fluttuazioni degli spettri di massa tra ogni misurazione, non esiste un sistema di condivisione delle informazioni spettrali comune alla comunità di sequenziamento dei nucleotidi. La cura deve essere presa quando l'operatore gestisce l'ago per evitare incidenti aghi, soprattutto quando si rimuove l'ago dal supporto dell'ago. Un dispositivo speciale per staccare l'ago è molto utile per questo scopo. Poiché il compartimento del modulo PESI è ermetico, la perdita del pennacchio ionica non si verifica se lo spettrometro di massa viene azionato secondo le istruzioni.
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Protocol
Il comitato istituzionale per la cura degli animali dell'Università di Yamanashi ha approvato tutti i protocolli e l'uso di animali sperimentali indicati nel presente documento. L'utilizzo del campione umano è stato approvato dal comitato etico istituzionale dell'Università di Yamanashi.
1. Preparazione del tessuto solido
NOTA: I campioni devono essere tenuti sul ghiaccio dopo la loro rimozione dal corpo animale o umano per preservare la freschezza del tessuto. Se le misurazioni non seguono immediatamente la dissezione, si consiglia di conservare il tessuto a -80 gradi centigradi. Non è consigliabile posizionare il tessuto in qualsiasi tipo di tampone o salina, perché possono estrarre determinati contenuti dal tessuto. Il tessuto che è stato fissato con aldeidi o incorporato in paraffina/ cera o criogel non è adatto per le misurazioni della SM.
- Tagliare l'esemplare di tessuto a circa 2 x 2 x 2 mm utilizzando un bisturi o un coltello. In alternativa, estrarre il campione con un trepan (un punzone biopsia usa e getta, dimensione del foro 3 mm) utilizzato per l'esame della pelle. In questo caso, tagliare la lunghezza della colonna a 2 mm.
NOTA: Qualsiasi tessuto può essere analizzato utilizzando questo metodo. In questo esperimento, fegato15 e rene19, sono stati analizzati con successo per ottenere spettri di massa. Generalmente, gli organi parenchyschi danno buoni spettri di massa, mentre quelli che hanno componenti fibrosi non lo fanno. - Se il tessuto è contaminato dal sangue, lavare brevemente con una salina salina con tamponamenti di fosfato ghiacciato.
NOTA: Per ridurre al minimo il danno ai tessuti post-mortem, completare questo passaggio il prima possibile a temperatura ambiente. Se le misurazioni non vengono effettuate immediatamente, congelare il tessuto in azoto liquido e conservarlo a -80 gradi centigradi. - Mettere il campione tagliato o perforato (circa 10 mg) in un microtubo di plastica e aggiungere 100 -L di 50% di etanolo.
NOTA: Il peso esatto dei campioni non è determinato perché la spettrometria di massa utilizzata in questo sistema non fornisce dati quantitativi. Circa 10 mg è ottimale per il tessuto parenchymal. - Omogeneizzare il campione utilizzando un micropestle.
- Collocare 10 l dell'omogenea nel pozzo della cartuccia (Figura 2).
- Posizionare la cartuccia nella camera di ionizzazione dello spettrometro di massa e installare la sonda ad ago in acciaio inossidabile che verrà utilizzata per la ionizzazione del campione (Figura 2).
NOTA: Gli aghi sonda sono forniti dal produttore. Sono fatti di acciaio inossidabile e hanno un raggio di curvatura di circa 400 nm. - Chiudere saldamente il coperchio della camera per attivare automaticamente il dispositivo di sicurezza.
- Avviare il computer di bordo facendo clic sull'icona Start da analizzare. Utilizzando i pannelli sullo schermo, applicare una tensione di 2,3 kV all'ago per generare l'elettrospray e assicurarsi che la frequenza dell'ago sia di 3 Hz.
- Attendere 30 s per il completamento della misurazione.
NOTA: la sessione cessa automaticamente al termine dell'acquisizione dei dati. La qualità dell'analisi è monitorata da un cromatogramma iogramma (TIC). Il tempo di misurazione è definito per ottenere gli spettri di massa rappresentativi e può essere ridotto o esteso. - Smaltire la cartuccia e l'ago in uno smaltitore a rischio biologico dopo aver misurato ogni campione.
NOTA: è possibile misurare un solo campione alla volta. Non è necessario calibrare la macchina prima di ogni misurazione; calibrazione dipende dal regolare check-up da parte del fornitore una volta ogni sei mesi. - Analizzare gli spettri di massa ed esportare i dati di testo spettrale di massa utilizzando il software associato allo spettrometro di massa (vedere Tabella dei materiali) come indicato nei passaggi seguenti ( Figura3).
- Fare clic sul file lcd nella finestra del browser del file di dati del software.
- Scegliere e fare clic su un singolo picco sulla finestra dello spettro di massa e per rappresentare automaticamente un cromatogramma iomatico estratto (EIC).
- Controllare il TIC e EIC e fare clic sull'icona dello spettro medio per selezionare l'intervallo di tempo per la generazione dello spettro di massa.
NOTA: in questa analisi, le molecole bersaglio appaiono nella finestra del rapporto massa-carica (m/z) (Figura 3). Inoltre, poiché la durata della ionizzazione per singolo colpo di movimento dell'ago è molto breve, tutti gli spettri di massa ottenuti sono essenzialmente spettri mediati su 10 s (300 scansioni). - Generare un file di testo contenente intensità m/z e ione facendo clic sulla scheda Esporta per ulteriori analisi. Questo file di testo può essere memorizzato in qualsiasi cartella.
NOTA: Qualsiasi conservante di RNA influenzerà il modello spettrale nativo dei campioni. Inoltre, è consigliabile maneggiare e conservare il tessuto senza liquidi (come la salina tamponata da fosfati) per evitare l'elusione di componenti molecolari dal tessuto nel liquido durante lo stoccaggio. Idealmente, vengono utilizzati campioni congelati freschi o freschi senza alcun trattamento.
2. Preparazione dei fluidi corporei (siero)
NOTA: L'intera procedura è quasi identica a quella utilizzata per il tessuto solido. La cartuccia per il campione di fluido è disponibile presso il produttore. Poiché la contaminazione da globuli rossi (RBC) può ridurre notevolmente l'efficienza dell'acquisizione spettrale del componente previsto (plasma o siero), assicurarsi di eliminare tutti gli RBC centrifugando prima delle misurazioni.
- Prendere 10 ll del campione di siero e metterlo in un microtubo da 1,5 mL.
NOTA: È possibile utilizzare sia il siero fresco che quello memorizzato. - Aggiungere 190 luna del 50% di etanolo al tubo da 1,5 mL, quindi vortice per 2 min a temperatura ambiente.
- Centrifugare il liquido a 15.000 x g per 1-5 min a 4 gradi centigradi.
- Trasferire 10 oL di supernatant nel pozzo della cartuccia.
- Posizionare la cartuccia nella camera di ionizzazione della macchina e installare la sonda ad ago in acciaio inox che verrà utilizzata per la ionizzazione del campione (Figura 2).
- Chiudere saldamente il coperchio della camera per attivare automaticamente il dispositivo di sicurezza.
- Avviare il computer di bordo facendo clic sull'icona Start per ionizzare.
- Eliminare la cartuccia campione e l'ago come descritto in 1,10 una volta effettuate le misurazioni.
- Analizzare i set di EIC ottenuti come indicato di seguito (Figura 3).
- Aprire il file lcd nel browser dei dati.
- Fare clic su un singolo picco per visualizzare il TIC e l'EIC.
- Selezionare l'intervallo di tempo per la generazione di spettri di massa utilizzando l'icona dello spettro medio.
- Esportare il file generato contenente l'intensità m/z e ione di un picco corrispondente facendo clic sulla scheda di esportazione sul monitor.
NOTA: Questa procedura può essere applicata anche a saliva, urina e altri fluidi corporei.
3. Preparazione per IL PESI-MS in vivo nell'organismo vivente
NOTA: In questa sezione viene introdotta un'applicazione per monitorare il profilo metabolico di 5-Fluoro-2'-deossiuridina (5-FdU) in un modello murino vivente. Utilizzare condizioni asettiche in tutto.
- Infondere 100 L di 100 mMM 5-FdU soluzione nella vena posteriore di un topo di 2 mesi (circa 20 g di peso).
NOTA: non c'è preferenza per il sesso, l'età o lo sforzo del mouse. Mentre questo protocollo è stato approvato al momento in cui abbiamo effettuato l'esperimento5, la fattibilità di questo esperimento dipende dalle restrizioni etiche del paese in cui verrà eseguito. - Anestesizza il topo seguendo il tuo protocollo di cura degli animali approvato. Valutare la profondità dell'anestesia dalla mancanza di risposta al pizzico della coda.
NOTA: Se l'uso del pentobarbital di sodio non è consentito dal comitato etico per esperimenti sugli animali, possono essere utilizzati metodi alternativi, come l'idrocloruro di chetamina. - Rasare la cavità addominale utilizzando un rasoio elettrico e applicare unguento veterinario agli occhi.
- Mettere il topo anetizzato in posizione supina e fissare le zampe sulla piastra di plastica utilizzando nastro adesivo. Scrub il sito chirurgico con scrub di 70% alcol tre volte.
- Tagliare la cavità addominale con le forbici. In primo luogo, tagliare la pelle lateralmente (10 mm) da appena sopra il diaframma. Tagliare lateralmente il muscolo della parete del corpo addominale e il peritoneo (ca. 7 mm) e tenere la ferita aperta utilizzando filo inossidabile per esporre la superficie del fegato.
NOTA: Non è necessario perfondere la superficie del fegato. - Applicare la punta dell'ago della sonda sulla superficie del fegato. Regolare la profondità dell'ago a circa 0,5 mm di profondità per ottimizzare l'efficienza ionizzazione, controllando contemporaneamente il TIC e il modello spettrale. Impostare l'alta tensione a 2,3 kV e la frequenza a 3 Hz sullo schermo del pannello di controllo.
- Rimuovere l'animale dalla piastra di plastica.
- Suturare la ferita utilizzando una sutura chirurgica dell'intestino e riportare il topo alla gabbia. Non lasciate il topo incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza per mantenere la recumbency sternale. Non restituire il topo alla compagnia di altri animali fino a quando non ha completamente recuperato.
- Eseguire il corso temporale dell'intensità degli ioni nell'EIC e la procedura di rappresentazione EIC come in 1.11.1 a 1.11.4.
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Representative Results
Come illustrato nella Figura 3, i dati ottenuti dalla tecnica DEI PESI-MS sono gli spettri di massa, la cui gamma m/z va da 10 a 1.200 in questo sistema. Mentre si possono rilevare molecole fino a m/z 2.000, ci sono stati pochi picchi ottenuti utilizzando questa tecnica sulla gamma di massa di m/z 1.200. Pertanto, abbiamo analizzato picchi da m/z 10 a 1.200. C'erano gruppi cospicui di picchi intorno m/z 800 e 900; il primo rappresenta i componenti della membrana cellulare, come le specie di colina fosfatidina (PC), e il secondo rappresenta il glicerolo triacyl (TAG). La figura 4 mostra gli spettri di massa di un normale rene umano e un carcinoma a cellule renali (RCC). Gli spettri di massa sono stati ottenuti utilizzando il metodo del tessuto diretto spiegato nel protocollo 1. Poiché il tipo di cellula trasparente RCC accumula TAG nel citoplasma, un gruppo di spettri intorno m/z 900 è molto pronunciato. Il risultato nella Figura 4 è stato ottenuto dal metodo di estrazione introdotto nella Figura 1 per i campioni solidi.
Poiché il metabolismo lipidico del carcinoma epatocellulare cambia durante la progressione della malattia20,è possibile monitorare le fasi della malattia mediante biopsia di routine combinata con PESI-MS. Il risultato nella Figura 5 illustra le differenze nel modello spettrale tra il tessuto epatico normale e l'HCC. Soprattutto, ci sono diversi spettri notevoli di TAG in HCC. Se la risoluzione dello spettrometro di massa è superiore, è possibile che l'annotazione molecolare di ogni spettro consenta di chiarire il meccanismo molecolare del cancro, così come la normale fisiologia cellulare.
Il monitoraggio in tempo reale del metabolismo dei farmaci può essere eseguito utilizzando PESI. Nei nostri esperimenti, la farmacodinamica dell'agente anti-oncotico 5-FdU è stata monitorata oltre 10 s dopo essere stata iniettata attraverso la vena posteriore di un topo. Rilevamento molto rapido di spettri è stato osservato solo pochi secondi dopo l'iniezione del farmaco (Figura 6), implicando il trasporto rapido del farmaco attraverso il flusso sanguigno al fegato. L'intensità degli adddotti di sodio di 5-FdU è diminuita con un breve difetto del segnale iosone nella registrazione a circa 6-7 s dopo l'inizio della misurazione. Ciò è dovuto alla diversa profondità dell'ago PESI nel parenchyma epatico, che era il risultato dei movimenti del corpo del topo anetizzato. Pertanto, è necessario prestare attenzione per regolare la profondità dell'ago PESI per la misurazione in tempo reale degli animali viventi. Non esiste un modo consigliato per trovare la profondità ottimale dell'ago, ma diventa evidente con la pratica.
Campioni di sangue provenienti da tre individui sono stati analizzati da PESI-MS. In questo caso, 10 l di siero sono stati mescolati con 190 -L del 50% di etanolo e poi utilizzati per l'analisi PESI-MS. Mentre i modelli spettrali complessivi sembrano condividere diversi picchi comuni (Figura 7), ci sono molte differenze minime negli spettri da queste tre persone. Sono un'impronta digitale di ogni persona in termini di attività metaboliche. Per informazioni dettagliate sulle identità molecolari, è necessario utilizzare una macchina di fascia alta. Lo spettrometro di massa utilizzato negli esperimenti non ha fornito una risoluzione sufficientemente elevata per identificare le molecole.
Se vi è contaminazione da composti polimerici, gli spettri originali nella Figura 4 danno luogo a picchi periodici e evidenti sovrapposti che sfocano gli spettri dal campione originale (Figura 8). Per dimostrarlo sperimentalmente, abbiamo aggiunto il triolo di glicerolo di polipropilene (PPGT) al 2,5% per riprodurre un caso di contaminazione. Quasi tutti gli spettri specifici visti nella Figura 8 sono stati mascherati dall'aggiunta di PPGT.
Figura 1: Panoramica schematica di un flusso di preparazione di esempio. Per i campioni, una cartuccia campione specializzata è ideale per l'acquisizione stabile dei dati. L'analisi del campione di liquido è il modo più semplice per eseguire IL PESI-MS, semplicemente posizionando la soluzione nella cartuccia. Ci sono due metodi per applicare questo metodo al tessuto solido. L'applicazione diretta di PESI al tessuto è molto facile e veloce, mentre il metodo di estrazione consente di ottenere un'acquisizione molto più stabile degli spettri a seconda delle specie campione. In questa procedura, un piccolo pezzo del campione di tessuto viene messo in un microtubo con 100 luna del 50% di etanolo e omogeneizzato con un micropestle. 10 l dell'omogenea risultante viene quindi utilizzato per la spettrometria di massa. Nel caso di analisi di un animale vivente, la superficie sierziana dell'organo bersaglio è di 30-L del 50%. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Panoramica e componenti di base di PESI-MS. Uno spettrometro di massa dotato di un modulo PESI. La parte di ionizzazione è installata in una camera chiusa dove sono collocati l'inserimento ioletto, il supporto dell'ago e il supporto del campione. L'ago è pronto e l'ago usa e getta in acciaio inossidabile è fissato al supporto dell'ago. Viene impostato nello spettrometro di massa subito dopo aver posizionato la cartuccia di campione nella camera. L'angolo di curvatura medio dell'ago è di 400 nm. La cartuccia per il posizionamento del campione è usa e getta e fatta di polimeri di plastica. Ha un piccolo pozzo per posizionare il campione liquido (freccia rossa). Dopo aver messo il campione solido nel pozzo, la cassetta viene piegata per pizzicare il campione e sigillare il pozzo. Per una cartuccia di campione liquido, ne viene utilizzata una diversa che non richiede la piegatura, e questa è una versione consigliata che è superiore ai campioni solidi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: interfaccia utente grafica (GUI) per PESI-MS. Tutte le procedure per la generazione di spettri di massa dal cromatogramma iomo (TIC) totale possono essere eseguite con il software associato. Dopo aver aperto il file lcd nel browser dati, è possibile visualizzare il TIC e selezionare l'intervallo di tempo per la generazione di spettri di massa. Gli spettri di massa generati possono essere esportati come dati di testo contenenti sia il rapporto massa-carica (m/z) che l'intensità degli ioni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Il carcinoma a cellule renali umane mostra picchi caratteristici di lipidi neutri. C'erano picchi relativamente forti negli spettri del tessuto carcinoma a cellule renali umane (RCC) che non sono stati identificati nel tessuto non canceroso circostante. Questi picchi rappresentano principalmente il triacylglycerol (TAG) a circa il rapporto massa-carica (m/z) 900. L'acquisizione spettrale è stata eseguita utilizzando la modalità ioscione positivo mediante analisi diretta. L'alta tensione è stata impostata su 2,3 kV. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Esempio di dati acquisiti nei normali tessuti epatici e nel carcinoma epatocellulare umano (HCC). Il pannello superiore raffigura gli spettri di un tessuto epatico umano in cui non era presente una lesione neoplastica, ma da un paziente con epatite cronica e cirrosi epatica. Il pannello inferiore mostra gli spettri medi di HCC dallo stesso paziente. A colpo d'occhio, mentre questi due hanno modelli spettrali molto simili, ci sono molte piccole differenze nel modello spettrale. L'abscissa mostra il rapporto massa-carica (m/z) e la coordinata raffigura l'intensità relativa di ogni spettro. L'acquisizione di spettri è stata eseguita utilizzando la modalità iouno positivo dopo l'estrazione del tessuto, come illustrato nella Figura 2C. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Misurazioni in tempo reale del metabolismo dei farmaci. I cambiamenti metabolici nel 5-FdU iniettati per via endovenosa nel recipiente di coda di un topo. Rilevamento molto rapido e sensibile di 5-FdU con addotto di sodio è stato raggiunto nel fegato in situ. A causa della ionizzazione instabile durante la misurazione, la cessazione del segnale può essere notata a circa 6-7 s. Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Esempi di dati provenienti da tre persone. Il siero umano di tre individui è stato analizzato utilizzando PESI-MS. C'erano chiare differenze nei modelli spettrali tra gli individui. I dati sono stati ottenuti utilizzando la modalità ios positivo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: I composti polimerici interferiscono con l'acquisizione precisa dei dati. A causa dell'emergere periodico di picchi spettrali sovrapposti all'esemplare originale, diventa difficile interpretare con precisione i dati. In questo caso, gli spettri derivati dal glicerolo di trioli di polipropilene (PPGT) appaiono come una sovrapposizione rumorosa. Questi composti, di solito utilizzati per la calibrazione, mascherano gli spettri originali dal fegato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Anche se PESI è un derivato di ESI per la spettrometria di massa4, è più vantaggioso per il monitoraggio della metabolomica in tempo reale, così come per l'analisi delle reazioni biochimiche senza eseguire alcun pretrattamento complesso o dispendioso in termini di tempo5,14,15,17. È una tecnica di spettrometria di massa facile e istantanea che può essere applicata allo stato integrato degli organismi viventi. Poiché non richiede cascate complesse di pretrattamenti del campione, c'è una possibilità molto maggiore di valutare la composizione molecolare dell'intero campione, perché evitiamo qualsiasi possibile perdita di campione che può verificarsi nell'ESI convenzionale, che richiede fasi complesse di pretrattamenti campione utilizzando grandi quantità di solventi organici. Pertanto, PESI ci permette di ottenere molte più informazioni dal campione se tutte le condizioni sono adeguatamente controllate.
Dobbiamo innanzitutto menzionare alcuni degli aspetti tecnici necessari per ottenere buoni risultati quando si considera l'analisi PESI-MS. Il fattore più critico nella PESI è il mantenimento dell'efficienza di ionizzazione durante l'analisi. Per raggiungere questo obiettivo, si consiglia di regolare e ottimizzare la distanza tra la punta dell'ago e la superficie del campione, per generare un TIC stabile facendo riferimento al monitor del computer durante l'analisi. Per fare questo, è necessario cambiare la profondità dell'ago in modo graduale per ottenere il massimo TIC. Poiché la durata della ionizzazione è relativamente breve rispetto a ESI, IL PESI non è ideale per la riproducibilità o la quantificazione. In secondo luogo, poiché la forma della punta dell'ago svolge un ruolo molto importante nella ionizzazione formando un cono Taylor ideale che funge da fonte di ioni, occorre fare attenzione a non deformare la punta dell'ago. La deformazione della punta può portare a una minore efficienza ionizzazione.
Mentre IL PESI è vantaggioso perché può essere applicato direttamente a campioni freschi (ad esempio fegato, rene e cervello) e organismo vivente senza un trattamento speciale, è relativamente sensibile ad altri contaminanti esogeni perché può ionizzare quasi tutti i componenti contenuti in un fluido21,22,23. Cioè, il rovescio della medaglia del vantaggio di saltare il pretrattamento del campione significa che IL PESI-MS è in svantaggio in diverse situazioni che si incontrano spesso negli esperimenti biologici. Come spiegato nella sezione del protocollo, è sensibile alla contaminazione da conservanti di RNA, aldeidi e composti polimerici come i criogel spesso utilizzati per la preparazione istologica. I coaguli di sangue possono aderire all'ago PESI e spesso mascherare gli spettri previsti. Inoltre, l'emolisi delle RBC libera l'emoglobina, e lo ione ferrico dissociato dà origine a spettri molto più forti di quelli derivati dagli analiti previsti. I composti polimerici forniscono anche picchi spettrali periodici che sovrappongono gli spettri derivati dagli analiti previsti, rendendo molto più difficile interpretare i dati reali a causa del rumore (Figura 8). Per evitare problemi nell'acquisizione di spettri di massa, si consiglia di seguire il nostro protocollo, prendendo nota di riferimenti speciali alla contaminazione. A questo proposito, l'applicazione di PESI è limitata in alcuni casi.
Un altro svantaggio di PESI risiede nel suo processo di ionizzazione relativamente instabile, che ci richiede di regolare la profondità dell'ago della sonda agli analiti. Inoltre, questa tecnica può coprire un'area molto limitata in un'unica analisi. A causa delle dimensioni molto ridotte della punta dell'ago che viene applicata direttamente al tessuto, l'analisi PESI-MS non è così completa come l'analisi 2D che può essere ottenuta con una spettrometria di massa di imaging MALDI-TOF basata su MS o imaging basato su DESI7,8. PESI, tuttavia, può ricostruire un'immagine della formazione dell'ippocampo, anche se ci vogliono diverse oree 23 perché la scansione 2D di un campione richiede molto tempo, soprattutto a causa dell'efficienza di ionizzazione instabile di questa tecnica. Tenendo conto di questo, l'imaging spettrale di massa di PESI-MS non è un'applicazione preziosa.
Per quanto riguarda le proprietà elettrochimiche di PESI, il volume e la concentrazione del campione che aderisce alla punta dell'ago è critico18, poiché l'effetto di soppressione è in qualche modo attenuato dal ridimensionamento della dimensione dell'elettrospray. Considerando che IL PESI è la miniaturizzazione dell'ESI, i campioni devono idealmente essere diluiti per evitare di formare un liquame sulla punta. Pertanto, è necessaria l'aggiunta di circa 30 lun del 50% di etanolo per ottenere una ionizzazione efficiente quando viene impiegato il metodo dei tessuti diretti (Figura 2B). Questo massimizza l'efficienza di ionizzazione e raggiunge la ionizzazione quasi completa delle molecole attaccate alla punta dell'ago.
La scelta del metodo di elaborazione dei dati più appropriato è molto importante quando si utilizza questo sistema24. Per quanto riguarda l'implementazione dell'apprendimento automatico per qualsiasi diagnosi di malattia, la costruzione di un database è necessaria per stabilire un riferimento per classificare o classificare le malattie7. Ad esempio, abbiamo usato la macchina vettoriale di supporto o la regressione logistica per fare una diagnosi di neoplasie primarie del fegato25.
PESI-MS è una tecnica versatile e facile che ha un grande potenziale per lo screening farmacologico, test antidoping, test di sicurezza alimentare di prodotti agricoli26,e alcuni test ambientali. Poiché questa unità di ionizzazione è compatibile con altri spettrometri preparando un accessorio per ogni strumento specifico PESI, può essere applicata a vari scopi.
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Disclosures
L'autore corrispondente è stato finanziato da Shimadzu, un produttore e fornitore di strumento PESI-MS.
Acknowledgments
Ringraziamo Ayumi Iizuka per aver operato il PESANTE-MS e Kazuko Sawa-nobori per la sua assistenza di segreteria. Ringraziamo Bronwen Gardner, Ph.D., del Gruppo Edanz (www.edanzediting.com/ac) per aver redatto una bozza di questo manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (5-FdU) | Sigma-Aldrich | F8791-25MG | 25mg |
| disposable biposy punch (Trepan) | kai Europa GmbH | BP-30F | bore size 3mm |
| ethanol | nacalai tesque | 14710-25 | extra pure reagent |
| LabSolutions | Shimadzu | ver. 5.96, Data analyzer | |
| micropestle | United Scientific Supplies | S13091 | |
| microtube | Treff | 982855 | 0.5 mL clear |
| PESI-MS (Direct Probe Ionization-MS) | Shimadzu | DPiMS-2020 | Mass spectrometer equipped with PESI |
| PPGT solition | Shimadzu | ND | Attached to DPiMS-2020 |
References
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