Summary
이 문서에서는 주변 질량 분석법을 기반으로 하는 고유한 실시간 분석 방법에 대한 샘플 준비 방법을 소개합니다. 이 방법을 사용하면 특별한 전처리 없이 생체 내 생물학적 분자를 실시간으로 분석할 수 있습니다.
Abstract
질량 분석법(MS)은 분자량과 구조를 추론하는 데 유용한 질량 대 전하비율(m/z)과같은 분자에 대한 매우 정확한 정보를 제공하기 때문에 분석 화학에서 강력한 도구입니다. 본질적으로 파괴적인 분석 방법이지만, 주변 이온화 기술의 최근 발전으로 인해 조직은 무결성 측면에서 상대적으로 손상되지 않은 상태로 유지하면서 데이터를 수집할 수 있게 되었습니다. 프로브 전기 분무 이온화 (PESI)는 시료의 복잡하고 시간이 많이 소요되는 전처리를 필요로하지 않기 때문에 소위 직접 방법입니다. 미세 바늘은 샘플 피커뿐만 아니라 이온화 방출기역할을합니다. 프로브 팁의 매우 날카롭고 미세한 특성에 따라 샘플의 파괴가 최소화되어 있어 살아있는 생물로부터 실시간 분자 정보를 얻을 수 있습니다. 본 명세서에서는 생물의학 연구 개발에 유용한 PESI-MS 기술의 3가지 적용을 소개합니다. 하나는 의료 진단을위한이 기술의 기본 응용 프로그램인 고체 조직에 대한 응용 프로그램을 포함합니다. 이 기술은 단지 10 mg의 샘플을 필요로하기 때문에, 일상적인 임상 설정에서 매우 유용 할 수 있습니다. 두 번째 응용 프로그램은 인간의 혈액 혈청이 측정되는 체외 의료 진단을위한 것입니다. 유체 샘플을 측정하는 능력은 기존의 분석 기법을 위한 충분한 양의 샘플을 제공할 수 없는 다양한 생물학적 실험에서도 중요합니다. 세 번째 응용 프로그램은 살아있는 동물에서 프로브 바늘의 직접 적용으로 기울어지며, 여기서 특정 장기에서 대사 산물 또는 약물의 실시간 역학을 얻을 수 있습니다. 각 응용 프로그램에서, 우리는 MS에 의해 검출 된 분자를 추론하거나 의료 진단을 얻기 위해 인공 지능을 사용할 수 있습니다.
Introduction
질량 분석법 (MS)은 환원주의의 기술 실현이다; 분석 대상을 분자 종 또는 캐스케이드에 기초하여 해석할 수 있는 단위로 감소시킵니다. 따라서, 그것은 분석 화학의 대표적인 방법입니다. 이온화, 분석, 검출 및 스펙트럼 수집의 네 가지 프로세스로 구성됩니다. 분자의 이온화는 질량 분석법의 첫 번째 과정이기 때문에 일반적으로 처리될 분석물의 형태를 제한합니다. 대부분의 이온화 절차는 유기 시료의 구조, 형태학 및 실시간 생물학적 공정의 파괴를 요구합니다. 예를 들어, 전기 분무 이온화(ESI) MS는 효율적인 이온화를 위해 샘플이 액체 상태에 있어야 합니다1. 따라서 샘플은 분자의 구성을 변경하는 복잡한 생화학 적 준비를 거쳐야합니다. 대안적으로, 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화(MALDI) MS는 얇은 단면 조직2,3의분자 맵을 재구성할 수 있지만, 이온화 효율이 너무 낮아 시료의 모든 분자를 검출할 수 없으며, 특히 지방산을 분석하는 데 는 좋지 않습니다. 이러한 한계를 고려하여, 프로브 전기분무 이온화(PESI)4는 구조적무결성을파괴하지 않고, 생물학적 유기체가 기술적으로 살아있는 상태에서 관찰되는 동안, 그 면에서 생물학적 시스템의 실시간 변화를 관찰하는데 사용될 수 있다. 매우 미세한 바늘은 샘플 피커와 이온 방출기로 동시에 작용하는 이 경우에 사용됩니다. 이것은 복잡한 견본 전처리 순서가 살아있는 시스템의 분자 분대를 반영하는 질량 스펙트럼을 장악하기 위하여 우회될 수 있다는 것을 의미합니다.
PESI-MS에 필적하는 몇 가지 다른 이온화 방법이 있습니다. 하나는 급속 증발 이온화 질량 분광법(REIMS)6. 이 기술은 전기 칼로 조립하고 절개 중에 생성 된 이온 깃털을 수집하기 때문에 수술 중에 잘 작동합니다. REIMS는 수술에 매우 유용하지만, 본질적으로 조직의 전기 절제가 필요한 파괴적인 방법입니다. 따라서, 예비 샘플 또는 실험실 분석에서 세포 및 조직의 상세한 분석에 유용하지 않다. 또한, 조직 파편을 포함하는 많은 양의 깃털을 수집하기 때문에 매번 사용 후 장치의 긴 유지 보수가 필요하므로이 기계의 사용을 특별한 외과 적 수술로 제한합니다. 레이저 탈착 이온화 질량 분석법(LDI-MS)7이라고하는 유사한 방법은 표면 분석에 비침습적이고 유용한 또 다른 기술입니다. 이 기술은 견본의 표면을 스캐닝에 좋기 때문에 MALDI 화상 진찰 질량 분광법8,9와 같은 포괄적인 2차원 분석을 달성합니다. 그러나, LDI-MS는 표면 분석에만 적용가능하기 때문에, PESI-MS는 예를 들어, 조직 내에서 샘플을 분석하는데 유리하다. 또 다른 기술인 MasSpec Pen10은갑상선암 진단에서 높은 특이성과 민감도를 달성하는 것으로 보고되었지만, 프로브의 직경은 mm의 순서이며 표면 분석에 특이적이며 암의 작은 결절이나 깊게 국한된 병변을 검출할 수 없다는 것을 의미합니다. 또한 이 방법은 프로브 펜에 내장된 미세 모세관 유관을 사용하므로 LDI-MS와 유사한 교차 오염을 고려해야 합니다. 유량 프로브 및 이온화 형태면봉(11)과같은 임상 설정에 적용된 다른 기술이 존재하지만, 이들은 널리 퍼지지 않는다.
PESI는 ESI의 극단적 인 소형화이며, 여기서 나노 전기 스프레이의 모세관은 수백 nm의 팁 곡률 반경을 가진 고체 바늘에 수렴된다. 이온화는 테일러 콘을 형성하여 바늘 팁의 매우 제한된 영역에서 이루어지며, 이 때 샘플은 팁의 모든 유체의 이온화가 완료될 때까지12. 금속 바늘의 끝에 있는 경우 금속 바늘과 타말물 사이의 계면에서 과량의 전하가 지속적으로 생성됩니다. 따라서 분자의 순차적 이온화는 표면 활성에 따라 발생합니다. 이 속성은 바늘 팁 크로마토 그램의 일종, 그들의 표면 활동에 따라 타액을 분리. 더 기술적으로, 더 강한 표면 활동을 가진 분자는 테일러 콘의 표면에 와서 이온화 과정이 끝날 때까지 바늘의 표면에 부착 약한 표면 활동을 가진 것보다 일찍 이온화된다. 따라서, 바늘에 의해 포착된 모든 분자의 완전한 이온화는13달성된다. 더욱이, 이 기술은 샘플에 불필요한 용매를 첨가하지 않기 때문에, 수백 개의 펨토리터는 추가 분석을 위해 충분히 강한 질량 스펙트럼을 얻기에 충분하다14. 이러한 특성은 손상되지 않은 생물학적 샘플의 분석에 유리하다. 그러나 PESI-MS의 주요 단점은 톱니 기계와 유사한 수직 축을 따라 바늘의 왕복 이동으로 인해 이온화의 불연속성에 있다. 이온화는 프로브의 팁이 이온 오리피스의 높이가 수평 축에 정렬될 때 가장 높은 지점에 도달할 때만 이루어집니다. 바늘이 샘플을 집어 들고 있는 동안 이온화가 중단되므로 이온화의 안정성은 기존 ESI와 동일하지 않습니다. 따라서 PESI-MS는 프로테오믹스에 이상적인 방법이 아닙니다.
현재까지 PESI-MS는 기초 연구에서 임상 설정에 이르는 광범위한 분야를 포괄하는 생물학적 시스템 분석에 주로 적용되었습니다. 예를 들어, 수술 동안 제조된 인간 조직의 직접 분석은 신장 세포 암종15 및 인두 편평암종16모두에서 트리아실글리세롤의 축적을 나타낼 수 있었다. 이 방법은 또한 지질 단면도에 집중하기 위하여 혈액과 같은 액체 견본을 측정할 수 있습니다. 예를 들어, 일부 분자 토끼에 식이 변화 하는 동안 묘사 되었습니다.; 이 분자의 일부는 임상 진단을 위한 이 시스템의 높은 감도 및 유용성을 나타내는 실험의 초기 단계에서 감소했다고 보고되었다17. 더욱이, 살아있는 동물에게 직접 적용하면 단 1박 만에 간장의 생화학적 변화가 검출되어5. Zaitsu 등18이 실험을 다시 검토5 거의 같은 방법으로 간 대사 프로필을 분석, 안정성및 우리의 원래 방법의 재현성을 강화 결과. 더욱이, 우리는 이 기술을 사용하여 마우스에 있는 주변 비암성 간에서 암 조직을 구별할 수 있었습니다19. 따라서, 이것은 생체 내 및 시험관 내에서 다양한 설정에서 유용한 다목적 질량 분석 기법이다. 또 다른 관점에서 PESI 모듈은 마운팅 어탯치먼트를 조정하여 다양한 질량 분석기에 맞게 만들 수 있습니다. 이 짧은 기사에서는 살아있는 동물을 가진 응용 프로그램을 포함하여 응용 프로그램의 기본 및 예제(그림 1)를소개합니다5.
각 국가의 규정과 법률에 따라, 이 프로토콜의 일부는 각 기관의 기준을 충족하기 위해 개정될 필요가 있을 것이다. 살아있는 유기체에 적용은 살아있는 동물에 있는 조직 또는 기관에 있는 생화확적인 또는 신진 대사 변경을 제공할 수 있기 때문에 가장 흥미롭고 도전적입니다. 이 신청서는 야마나시 대학의 동물 관리 기관위원회의 승인을 받았지만, 2013 년5에서 동물 실험에 대한 규정의 최근 변화로 인해 또 다른 승인이 필요합니다. 따라서 실험 방식의 여러 가지 수정이 권장됩니다. 실험에서 얻어진 질량 스펙트럼에 관해서는, 각 측정 사이의 질량 스펙트럼의 변동을 고려하여, 뉴클레오티드 시퀀싱 커뮤니티에 공통적인 스펙트럼 정보 공유 시스템은 없다. 작업자가 바늘을 다룰 때 특히 바늘 홀더에서 바늘을 제거할 때 바늘을 처리해야 합니다. 바늘을 분리하기위한 특수 장치는이 목적을 위해 매우 유용합니다. PESI 모듈의 구획은 밀폐된 밀폐챔버이기 때문에, 지침에 따라 질량분석기를 조작하면 이온 깃털의 누설이 발생하지 않는다.
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Protocol
야마나시 대학의 동물 관리 기관 위원회는 여기에 명시된 모든 프로토콜과 실험 동물의 사용을 승인했습니다. 야마나시 대학의 기관 윤리 위원회의 승인을 받았습니다.
1. 고체 조직 준비
참고: 시료는 조직 신선도를 유지하기 위해 동물이나 인체에서 제거한 후 얼음위에 보관해야 합니다. 측정이 즉시 해부를 따르지 않는 경우 조직을 -80 °C에 저장하는 것이 좋습니다. 그들은 조직에서 특정 내용을 추출 할 수 있기 때문에, 완충또는 식염수의 어떤 종류에 조직을 배치하는 것이 바람직하지 않다. 알데히드로 고정되거나 파라핀/왁스 또는 저온질에 내장된 조직은 MS 측정에 적합하지 않습니다.
- 메스 나 칼을 사용하여 조직 표본을 약 2 x 2 x 2mm로 자른다. 또는 피부 검사에 사용되는 트레판(일회용 생검 펀치, 보어 크기 3mm)으로 샘플을 펀치아웃합니다. 이 경우 기둥의 길이를 2mm로 자립니다.
참고 : 모든 조직은이 방법을 사용하여 분석 할 수 있습니다. 본 실험에서, 간15 및 신장19는질량 스펙트럼을 얻기 위해 성공적으로 분석되었다. 일반적으로, 실치 장기는 좋은 질량 스펙트럼을 제공, 섬유 구성 요소가 있는 그 하지 않는 동안. - 조직이 혈액으로 오염되면 얼음 차가운 인산완충식염수로 간단히 씻으하십시오.
참고 : 사후 조직 손상을 최소화하려면 실온에서 가능한 한 빨리이 단계를 완료하십시오. 측정이 즉시 이루어지지 않으면 액체 질소에 조직을 동결시키고 -80 °C에 보관하십시오. - 잘라내거나 펀칭된 샘플(약 10 mg)을 플라스틱 마이크로튜브에 넣고 50% 에탄올 100 μL을 추가합니다.
참고: 이 시스템에 사용된 질량 분석법은 정량적 데이터를 제공하지 않기 때문에 샘플의 정확한 중량은 결정되지 않습니다. 대략 10 mg은 실치 조직에 최적입니다. - 마이크로페슬을 사용하여 샘플을 균질화합니다.
- 균질체의 10 μL을 카트리지의 웰에 넣는다(그림2).
- 카트리지를 질량 분석기의 이온화 챔버에 놓고 샘플 이온화에 사용될 스테인리스 스틸 바늘 프로브를 설치합니다(그림2).
참고 : 프로브 바늘은 제조업체에서 공급합니다. 그들은 스테인레스 스틸로 만들어졌으며 약 400 nm의 곡률 반경을 가지고 있습니다. - 챔버 뚜껑을 단단히 닫아 안전 장치를 자동으로 활성화합니다.
- 분석할 시작 아이콘을 클릭하여 온보드 컴퓨터를 시작합니다. 스크린 패널을 사용하여 바늘에 2.3 kV의 전압을 가하여 전기 스프레이를 생성하고 바늘의 주파수가 3 Hz인지 확인하십시오.
- 측정이 완료될 때까지 30s를 기다립니다.
참고: 데이터 수집이 완료되면 세션이 자동으로 중단됩니다. 분석의 품질은 총 이온 크로마토그램(TIC)에 의해 모니터링됩니다. 측정 시간은 대표적인 질량 스펙트럼을 얻기 위해 정의되며 단축되거나 연장될 수 있다. - 각 시료를 측정한 후 카트리지와 바늘을 생물학적 위험 처리기에서 폐기합니다.
참고: 한 번에 하나의 샘플만 측정할 수 있습니다. 모든 측정 전에 기계를 교정 할 필요는 없습니다. 교정은 6개월에 한 번씩 공급업체의 정기 점검에 따라 달라집니다. - 질량 스펙트럼을 분석하고 아래 단계에 명시된 대로 질량 분광계와 관련된 소프트웨어를 사용하여 질량 스펙트럼 텍스트 데이터를 내보냅니다(재료 표참조).
- 소프트웨어의 데이터 파일 브라우저 창에서 LCD 파일을 클릭합니다.
- 질량 스펙트럼 창에서 단일 피크를 선택하고 클릭하고 추출된 이온 크로마토그램(EIC)을 자동으로 묘사합니다.
- TIC 및 EIC를 확인하고 평균 스펙트럼 아이콘을 클릭하여 질량 스펙트럼을 생성하기 위한 시간 범위 창을 선택합니다.
참고: 이 분석에서, 표적 분자는 질량 대 전하비(m/z)창에나타난다(그림 3). 더욱이, 바늘 운동의 단일 스트로크당 이온화의 지속 시간은 매우 짧기 때문에, 얻어진 모든 질량 스펙트럼은 본질적으로 10s (300 스캔) 이상 스펙트럼평균된다. - 추가 분석을 위해 내보내기 탭을 클릭하여 m/z 및 이온 강도가 포함된 텍스트 파일을 생성합니다. 이 텍스트 파일은 모든 폴더에 저장할 수 있습니다.
참고: 모든 RNA 방부제는 샘플의 기본 스펙트럼 패턴에 영향을 미칩니다. 또한 저장 중에 조직에서 액체로 분자 성분이 용출되는 것을 방지하기 위해 액체 (예 : 인산 완충 식염수)없이 조직을 처리하고 저장하는 것이 좋습니다. 이상적으로는 처리없이 신선하거나 신선한 냉동 샘플을 사용합니다.
2. 체액 (혈청) 준비
참고 :이 전체 절차는 고체 조직에 사용되는 것과 거의 동일합니다. 유체 샘플용 카트리지는 제조업체에서 구할 수 있습니다. 적혈구 (RBC)에 의한 오염은 의도 된 성분 (혈장 또는 혈청)의 스펙트럼 획득 효율을 크게 감소시킬 수 있기 때문에 측정 전에 원심 분리하여 모든 RBC를 제거해야합니다.
- 혈청 샘플 10 μL을 가지고 1.5 mL 마이크로 튜브에 넣습니다.
참고: 신선하고 저장된 세럼을 모두 사용할 수 있습니다. - 1.5 mL 튜브에 50 % 에탄올 190 μL을 추가 한 다음 실온에서 2 분 동안 소용돌이를 넣습니다.
- 4 °C에서 1-5 분 동안 15,000 x g에서 액체를 원심 분리합니다.
- 10 μL의 상급을 카트리지의 우물로 옮김.
- 카트리지를 기계의 이온화 챔버에 놓고 샘플 이온화에 사용할 스테인리스 스틸 바늘 프로브를 설치합니다(그림2).
- 챔버 뚜껑을 단단히 닫아 안전 장치를 자동으로 활성화합니다.
- 이온화하려면 시작 아이콘을 클릭하여 온보드 컴퓨터를 시작합니다.
- 측정이 완료되면 1.10에 설명된 대로 샘플 카트리지와 바늘을 폐기하십시오.
- 아래와 같이 얻은 EIC 세트를분석한다(그림 3).
- 데이터 브라우저에서 LCD 파일을 엽니다.
- 단일 피크를 클릭하여 TIC 및 EIC를 표시합니다.
- 평균 스펙트럼 아이콘을 사용하여 질량 스펙트럼을 생성하기 위한 시간 범위 창을 선택합니다.
- 모니터의 내보내기 탭을 클릭하여 해당 피크의 m/z 및 이온 강도를 모두 포함하는 생성된 파일을 내보냅니다.
참고 : 이 절차는 타액, 소변 및 기타 체액에도 적용 할 수 있습니다.
3. 살아있는 유기체에서 생체 내 PESI-MS에 대한 준비
참고: 이 섹션에서는 살아있는 마우스 모델에서 5-플루오로-2'-데옥시우리딘(5-FdU)의 대사 프로필을 모니터링하는 응용 프로그램이 도입된다. 전체 무균 조건을 사용합니다.
- 100 μL의 100 μL의 100 mM 5-FdU 용액을 2개월 된 마우스의 꼬리 정맥에 주입합니다(무게 약 20g).
참고: 성별, 연령 또는 마우스 변형에 대한 선호는 없습니다. 이 프로토콜은 우리가 실험5를수행 한 시간에 승인되었지만,이 실험의 타당성은 수행 될 국가의 윤리적 제한에 달려 있습니다. - 승인된 동물 관리 프로토콜에 따라 마우스를 마취하십시오. 꼬리 꼬집기에 대한 반응이 부족하여 마취의 깊이를 평가하십시오.
참고: 동물 실험을 위한 윤리위원회에서 펜토바르비탈 나트륨의 사용을 허용하지 않는 경우, 케타민 염산염과 같은 대체 방법을 사용할 수 있습니다. - 전기 면도기를 사용하여 복강을 면도하고 수의사 연고를 눈에 바르습니다.
- 마취 된 마우스를 척추 위치에 놓고 수선 테이프를 사용하여 발을 플라스틱 판에 고정시면됩니다. 70 % 알코올의 스크럽으로 수술 부위를 세 번 문질러.
- 가위를 사용하여 복강을 엽니 다. 먼저 다이어프램 바로 위에서 피부를 측면(10mm)으로 자른다. 측면으로 복부 몸 벽과 복막 (약 7mm)의 근육을 잘라 간 표면을 노출 스테인레스 와이어를 사용하여 열린 상처를 개최.
참고 : 간 표면을 정유 할 필요가 없습니다. - 프로브 바늘의 끝을 간 표면에 바릅니다. 바늘의 깊이를 약 0.5mm 깊이로 조정하여 이온화 효율을 최적화하고 TIC 및 스펙트럼 패턴을 동시에 검사합니다. 고전압을 2.3kV로 설정하고 주파수를 제어판 화면에서 3Hz로 설정합니다.
- 플라스틱 플레이트에서 동물을 제거합니다.
- 외과 장 봉합사를 사용하여 상처를 봉합하고 케이지에 마우스를 반환합니다. 마우스가 흉골 의식으로 의식을 되찾을 때까지 방치하지 마십시오. 완전히 회복될 때까지 마우스를 다른 동물의 회사에 반환하지 마십시오.
- EIC에서 이온 강도의 시간 과정과 1.11.1 ~ 1.11.4에서와 같이 EIC 묘사의 절차를 수행합니다.
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Representative Results
그림 3에설명된 바와 같이 PESI-MS 기법에 의해 얻은 데이터는 질량 스펙트럼이며, 이 시스템에서m/z 범위는 10에서 1,200사이입니다. m/z 2,000까지 분자를 검출할 수 있지만, m/z 1,200의 질량 범위에서 이 기술을 사용하여 얻은 피크는 거의 없었습니다. 따라서 m/z 10에서 1,200까지의 피크를 분석했습니다. m/z 800과 900 주위에 봉우리의 눈에 띄는 그룹이 있었다; 전자는 포스파티딜 콜린 (PC) 종과 같은 세포막 성분을 나타내고, 후자는 트리아실 글리세롤 (TAG)을 나타낸다. 도 4는 정상 인간 신장 및 신장 세포 암종(RCC)으로부터의 질량 스펙트럼을 나타낸다. 질량 스펙트럼은 프로토콜 1에 설명된 직접 조직 방법을 사용하여 수득하였다. 명확한 세포 모형 RCC는 세포질에 있는 TAG를 축적하기 때문에, m/z 900의 주위에 스펙트럼의 단은 아주 발음됩니다. 도 4의 결과는 고체 샘플에 대해 도 1에 도입된 추출 방법에 의해 얻어졌다.
간세포암의 지질대사가 질병 진행20시동안 변화하기 때문에, PESI-MS와 결합된 일상적인 생검에 의해 질병의 단계를 모니터링할 수 있다. 도 5의 결과는 정상 간 조직과 HCC 사이의 스펙트럼 패턴의 차이를 나타낸 것이다. 특히, HCC에서 태그의 몇 가지 놀라운 스펙트럼이 있다. 질량 분석기의 분해능이 우수하면 각 스펙트럼의 분자 항인이 정상적인 세포 생리학뿐만 아니라 암의 분자 메커니즘의 해명도 허용할 수 있습니다.
약물 대사의 실시간 모니터링은 PESI를 사용하여 수행될 수 있다. 본 실험에서, 항온코틱제 5-FdU의 약력작용은 마우스의 꼬리 정맥을 통해 주입된 후 10s 이상 모니터링되었다. 분광기의 매우 신속한 검출은 약물을 주입한 후 단 몇 초 만에 관찰되었다(도6),간으로 혈류를 통해 약물의 신속한 수송을 암시한다. 5-FdU의 나트륨 유도체의 세기는 측정을 시작한 후 약 6-7s에서 기록에서 이온 신호의 간략한 결함으로 약해졌다. 이것은 마취된 마우스의 신체 움직임의 결과인 간 자중골에 있는 PESI 바늘의 다양한 깊이 때문이었습니다. 따라서, 살아있는 동물의 실시간 측정을 위해 PESI 바늘의 깊이를 조정하기 위해 주의를 기울여야 한다. 바늘의 최적의 깊이를 찾는 권장 되는 방법은 없습니다., 하지만 그것은 연습으로 명백해진다.
3명의 개별에게서 혈액 샘플은 PESI-MS에 의해 분석되었습니다. 이 경우, 10 μL의 혈청을 50% 에탄올의 190 μL과 혼합한 다음 PESI-MS 분석에 사용하였다. 전체 스펙트럼 패턴은 몇 가지 공통 피크를 공유하는 것처럼보이지만(그림 7),이 세 사람으로부터 스펙트럼에 많은 미세한 차이가 있다. 그들은 신진 대사 활동의 관점에서 각 사람의 지문입니다. 분자 정체성에 대한 자세한 정보를 보려면 고급 기계를 사용할 필요가 있습니다. 실험에 사용된 질량 분석기는 분자를 식별하기에 충분한 고해상도를 제공하지 못했습니다.
고분자 화합물에 의한 오염이 있는 경우, 그림 4의 원래 스펙트럼은 원래 샘플에서 스펙트럼을 흐리게 하는 중첩된 주기적 및 눈에 띄는 피크를 야기합니다(그림8). 이를 실험적으로 입증하기 위해 폴리프로필렌 글리세롤 트리올(PPGT)을 2.5%에 추가하여 오염 사례를 재현했습니다. 도 8에서 볼 수 있는 거의 모든 특정 스펙트럼은 PPGT의 첨가에 의해 가려졌다.
그림 1: 샘플 전처리 흐름의 개략적인 개요입니다. 샘플의 경우 특수 샘플 카트리지는 안정적인 데이터 수집에 이상적입니다. 액체 시료 분석은 용액을 카트리지에 넣기만 하면 PESI-MS를 수행하는 가장 쉬운 방법입니다. 고체 조직에이 방법을 적용하는 방법에는 두 가지가 있습니다. 조직에 PESI를 직접 적용하면 매우 쉽고 빠르며 추출 방법은 샘플 종에 따라 스펙트럼을 훨씬 더 안정적으로 수집 할 수 있습니다. 이 절차에서, 조직 샘플의 작은 조각은 50 % 에탄올의 100 μL마이크로 튜브에 넣고 마이크로 페슬로 균질화. 생성된 균질화의 10 μL은 질량 분석법에 사용된다. 살아있는 동물을 분석하는 경우, 50 % 에탄올의 30 μL이 대상 기관의 혈청 표면에 배치되고 측정이 뒤따릅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: PESI-MS의 개요 및 기본 구성 요소입니다. PESI 모듈이 장착된 질량 분석기입니다. 이온화 부품은 이온 입구, 바늘 홀더 및 샘플 홀더가 배치되는 밀폐된 챔버에 설치됩니다. 바늘은 기성용이며 일회용 스테인레스 스틸 바늘은 바늘 홀더에 고정됩니다. 샘플 카트리지를 챔버에 배치한 직후 질량 분석기에서 설정됩니다. 바늘의 평균 곡률은 400 nm입니다. 샘플을 배치하기위한 카트리지는 일회용이며 플라스틱 폴리머로 만들어집니다. 그것은 액체 샘플 (빨간색 화살표)를 배치하기위한 작은 우물을 가지고있다. 고체 샘플을 웰에 넣은 후, 카세트를 접어서 샘플을 꼬집고 우물을 밀봉한다. 액체 샘플 카트리지의 경우 접을 필요가 없는 다른 카트리지가 사용되며 고체 샘플보다 우수한 권장 버전입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: PESI-MS용 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)입니다. 총 이온 크로마토그램(TIC)으로부터 질량 스펙트럼을 생성하는 모든 절차는 관련 소프트웨어와 함께 수행될 수 있다. 데이터 브라우저에서 LCD 파일을 연 후 TIC를 표시할 수 있으며 질량 스펙트럼을 생성하기 위한 시간 범위를 선택할 수 있습니다. 생성된 질량 스펙트럼은 질량 대 충전비율(m/z)및 이온 강도를 모두 포함하는 텍스트 데이터로 내보낼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 인간 신장 세포 암은 중성 지질의 특징적인 피크를 나타낸다. 인간 신장 세포 암 종 조직 (RCC)에서 스펙트럼에 상대적으로 강한 피크가 있었다 그 주변 비 암 조직에서 확인되지 않았다. 이 피크는 주로 질량 대 충전 비율(m/z)900에서 트리아실 글리세롤 (TAG)을 나타냅니다. 스펙트럼 수집은 직접 분석에 의해 양성 이온 모드를 사용하여 수행되었다. 고전압은 2.3 kV로 설정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: 정상 간 조직 및 인간 간세포 암종(HCC)에서 획득한 데이터의 예. 상부 패널은 신생물 병변이 존재하지 않았지만 만성 간염 및 간 경변증 환자에서 인간 간 조직의 스펙트럼을 묘사합니다. 하부 패널은 동일한 환자로부터 HCC의 평균 스펙트럼을 나타낸다. 한눈에 보면, 이 두 가지는 매우 유사한 스펙트럼 패턴을 가지고 있지만, 스펙트럼 패턴에는 많은 작은 차이가 있습니다. 압시사(abscissa)는 질량 대 전하비율(m/z)을나타내며 좌표는 각 스펙트럼의 상대 강도를 묘사합니다. 스펙트럼의획득은 도 2C에도시된 바와 같이 조직을 추출한 후 양성 이온 모드를 사용하여 수행되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 약물 대사의 실시간 측정. 5-FdU의 대사 변화는 마우스의 꼬리 혈관에 정맥 주사. 나트륨 인염을 가진 5-FdU의 매우 신속하고 민감한 검출은 그(것)들에서 달성되었습니다. 측정 중 불안정한 이온화로 인해 신호 중단은 약 6-7초로 표시될 수 있습니다.
그림 7: 세 개인의 데이터 예입니다. 3명의 개인으로부터의 인간 혈청은 PESI-MS를 사용하여 분석되었다. 개별 중 스펙트럼 패턴에 있는 명확한 다름이 있었습니다. 데이터는 양이온 모드를 사용하여 얻어졌다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8: 폴리머 화합물은 정확한 데이터 수집을 방해합니다. 원래 표본에 중첩된 스펙트럼 피크의 주기적인 출현으로 인해 데이터를 정확하게 해석하기가 어려워집니다. 이 경우, 폴리프로필렌 트리올 글리세롤(PPGT)으로부터 유래된 스펙트럼은 시끄러운 오버레이로서 나타난다. 일반적으로 교정에 사용되는 화합물은 간에서 원래 스펙트럼을 마스크합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
PESI는 질량 분석법4에대한 ESI의 유도체이지만, 실시간 대사체학을 모니터링하는 데 가장 유리할 뿐만 아니라, 복잡하거나 시간이 많이 소요되는 전처리를 수행하지 않고 생화학 반응을 분석하는 데 가장 유리하다5,14,15,17. 그것은 살아있는 유기체의 통합 상태에 적용될 수 있는 쉽고 즉각적인 질량 분광법 기술입니다. 시료 전처리의 복잡한 캐스케이드를 필요로 하지 않기 때문에, 우리는 많은 양의 유기 용매를 사용하여 샘플 전처리의 복잡한 단계를 필요로 하는 기존의 ESI에서 발생할 수 있는 견본의 가능한 손실을 피하기 때문에, 전체 견본의 분자 조성을 평가하는 훨씬 더 큰 가능성이 있다. 따라서 PESI는 모든 조건이 적절하게 제어되는 경우 시편으로부터 훨씬 더 많은 정보를 얻을 수 있습니다.
먼저 PESI-MS 분석을 고려할 때 좋은 결과를 얻는 데 필요한 몇 가지 기술적 측면을 언급해야 합니다. PESI에서 가장 중요한 요소는 분석 중 이온화 효율의 유지 관리입니다. 이를 달성하기 위해, 바늘의 끝과 샘플 표면 사이의 거리를 조정하고 최적화하고, 분석 중에 컴퓨터 모니터를 참조하여 안정적인 TIC를 생성하는 것이 바람직하다. 이렇게하려면 최대 TIC를 달성하기 위해 단계적으로 바늘의 깊이를 변경해야합니다. 이온화 기간은 ESI에 비해 상대적으로 짧기 때문에 PESI는 재현성 또는 정량화에 적합하지 않습니다. 둘째, 바늘 끝의 형상이 이온화에 매우 중요한 역할을 하기 때문에 이온 공급원역할을 하는 이상적인 테일러 콘을 형성함으로써, 바늘 팁을 변형시키지 않도록 주의해야 한다. 팁의 변형은 낮은 이온화 효율로 이어질 수 있습니다.
PESI는 특별한 치료 없이 신선한 시료(예를 들어 간, 신장 및 뇌) 및 살아있는 유기체에 직접 적용될 수 있기 때문에 유리하지만, 유체21,22,23에포함된 거의 모든 성분을 이온화할 수 있기 때문에 다른 외인성 오염물질에 상대적으로 민감하다. 즉, 샘플 전처리를 건너뛰는 이점의 단점은 PESI-MS가 생물학적 실험에서 종종 발생하는 여러 상황에서 불리한 점에 있다는 것을 의미한다. 프로토콜 섹션에서 설명한 바와 같이, PESI는 조직학적 제제에 자주 사용되는 cryogels와 같은 RNA 방부제, 알데히드 및 폴리머 화합물에 의한 오염에 민감하다. 혈전은 PESI 바늘에 부착할 수 있고 종종 의도한 스펙트럼을 가릴 수 있습니다. 더욱이, RBC의 용혈은 헤모글로빈을 해방하고, 해리된 페릭 이온은 의도된 분석물에서 파생된 것보다 훨씬 더 강한 스펙트럼을 일으킵니다. 고분자 화합물은 또한 의도된 분석물에서 파생된 스펙트럼을 오버레이하는 주기적인 스펙트럼 피크를 제공하므로 노이즈로 인해 실제 데이터를 해석하기가 훨씬 더 어려워집니다(그림8). 질량 스펙트럼의 획득에 있는 어떤 문제를 피하기 위하여는, 오염에 대한 참조의 특별한 주의를 취하고, 우리의 프로토콜을 따르는 것이 좋습니다. 이와 관련하여, PESI의 적용은 경우에 따라서 제한된다.
PESI의 또 다른 단점은 상대적으로 불안정한 이온화 공정에 있으며, 이는 프로브 바늘의 깊이를 분석물로 조정해야 합니다. 또한 이 기술은 단일 분석에서 매우 제한된 영역을 커버할 수 있습니다. 조직에 직접 적용되는 바늘 팁의 크기가 매우 작기 때문에 PESI-MS 분석은 MALDI-TOF MS 기반 이미징 질량 분석법 또는 DESI 기반 이미징7,8을통해 달성될 수 있는 2D 분석만큼 포괄적이지 않다. PESI는, 그러나, 해마 대형의 심상을 재구성할 수 있습니다, 비록 견본의 2D 스캐닝이 이 기술의 불안정한 이온화 효율성 때문에, 주로 시간이 오래 걸리기 때문에23 시간이 걸리더라도. 이를 고려하여 PESI-MS에 의한 질량 스펙트럼 이미징은 귀중한 응용 분야가 아닙니다.
PESI의 전기화학적 특성에 관해서는, 바늘 팁에 부착되는 시료의 부피와 농도가18에중요하며, 전기분무 크기를 축소하여 억제 효과가 다소 감쇠되기 때문에 매우 중요하다. PESI가 ESI의 소형화임을 고려할 때, 팁에 슬러리가 형성되지 않도록 샘플을 이상적으로 희석해야 합니다. 따라서, 직접 조직 방법이 사용될 때 효율적인 이온화를 달성하기 위해서는 약 30 μL의 50% 에탄올이필요하다(도 2B). 이것은 이온화 효율을 최대화하고 바늘의 끝에 부착된 분자의 거의 완전한 이온화를 달성한다.
이 시스템24를사용할 때 가장 적합한 데이터 처리 방법을 선택하는 것이 매우 중요합니다. 모든 질병 진단에 대한 기계 학습의 구현에 관해서는, 데이터베이스의 구축은 질병을 분류하거나 분류하기위한 참조를 설정하는 데 필요하다7. 예를 들어, 우리는 1차 간악성종양(25)의진단을 하기 위해 지지 벡터 기계 또는 물류 회귀를 사용하였다.
PESI-MS는 약물 스크리닝, 도핑 테스트, 농산물26의식품 안전 테스트 및 일부 환경 테스트에 대한 잠재력이 있는 다재다능하고 쉬운 기술입니다. 이 이온화 장치는 각 특정 기기에 대한 부착물을 준비하여 다른 분광계와 호환되므로 PESI는 다양한 용도로 적용할 수 있습니다.
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Disclosures
해당 저자는 PESI-MS 계측기의 제조업체이자 공급업체인 Shimadzu의 지원을 받았습니다.
Acknowledgments
이즈카 아유미씨는 PESI-MS와 사와노보리 가즈코의 비서 지원을 받아 운영해 주신 것에 대해 감사드립니다. 이 원고의 초안을 편집해 주신 에단츠 그룹(www.edanzediting.com/ac)의 브론웬 가드너 박사께 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (5-FdU) | Sigma-Aldrich | F8791-25MG | 25mg |
| disposable biposy punch (Trepan) | kai Europa GmbH | BP-30F | bore size 3mm |
| ethanol | nacalai tesque | 14710-25 | extra pure reagent |
| LabSolutions | Shimadzu | ver. 5.96, Data analyzer | |
| micropestle | United Scientific Supplies | S13091 | |
| microtube | Treff | 982855 | 0.5 mL clear |
| PESI-MS (Direct Probe Ionization-MS) | Shimadzu | DPiMS-2020 | Mass spectrometer equipped with PESI |
| PPGT solition | Shimadzu | ND | Attached to DPiMS-2020 |
References
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