Las interacciones de gpCR-arrestin son un campo emergente en el descubrimiento de fármacos GPCR. Se utilizan métodos precisos, precisos y fáciles de configurar para supervisar dichas interacciones en los sistemas vivos. Mostramos un ensayo de complemento estructural para monitorear las interacciones de la captura de GPCR en células vivas en tiempo real, y se puede extender a cualquier GPCR.
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Artículo de método
Monitoreo de las interacciones de GPCR--arrestin1/2 en sistemas de vida en tiempo real para acelerar el descubrimiento de fármacos
En este artículo
Resumen
Resumen
Las interacciones entre los receptores acoplados a la proteína G (GPCR) y las arrestinas son procesos vitales con implicaciones fisiológicas de gran importancia. En la actualidad, la caracterización de nuevos fármacos hacia sus interacciones con las arrestinas y otras proteínas citosólicas es extremadamente valiosa en el campo del descubrimiento de fármacos GPCR, especialmente durante el estudio del agonismo sesgado GPCR. Aquí, mostramos la aplicación de un nuevo ensayo de complementación estructural para monitorear con precisión las interacciones de receptores--arrestin en sistemas vivos en tiempo real. Este método es simple, preciso y se puede extender fácilmente a cualquier GPCR de interés y también tiene la ventaja de que supera interacciones inespecíficas debido a la presencia de un promotor de baja expresión presente en cada sistema vectorial. Este ensayo de complemento estructural proporciona características clave que permiten un seguimiento preciso y preciso de las interacciones entre receptores y arrestina, por lo que es adecuado en el estudio del agonismo sesgado de cualquier sistema GPCR, así como de la "fosforilación" de GPCR c-terminus, por lo que es adecuado en el estudio del agonismo sesgado de cualquier sistema GPCR, así como de la c-terminusción GPCR códigos' escritos por diferentes GPCR-kinases (GRKs) y modificaciones post-traduccionales de arrestinas que estabilizan o desestabilizan el complejo de receptores-arrestina.
Introducción
Los GPCR representan el objetivo de casi el 35% de los fármacos actuales en el mercado1,2 y una comprensión clara de su farmacología es crucial en el desarrollo de nuevos fármacos terapéuticos3. Uno de los aspectos clave en el descubrimiento de fármacos GPCR, particularmente durante el desarrollo de agonistas sesgados es la caracterización de nuevos ligandos hacia las interacciones entre receptores y arrestinas4 y las interacciones de arrestina con otras proteínas citosólicas, tales como como clathrin5.
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Protocolo
1. Estrategia de diseño de primer
- Imprimaciones de diseño para introducir genes de interés en pBiT1.1-C [TK/LgBiT], pBiT2.1-C [TK/SmBiT], pBiT1.1-N [TK/LgBiT] y pBiT2.1-N [TK/SmBiT] Vectores.
- Seleccione al menos uno de estos tres sitios como una de las dos enzimas de restricción únicas necesarias para la clonación direccional debido a la presencia de un codón de parada en trama que divide el sitio de multicloning como se muestra en la Figura 111.
- Incorporar la secuencia de nucleótidos en las imprimaciones como se muestra en la Tabla 1 para codificar los residuos del vi....
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Resultados
Mediante el procedimiento que se presenta aquí, se supervisaron las interacciones entre un GPCR prototípico y dos isoformas de arrestina. Las construcciones de glucagón como el receptor de péptidos (GLP-1r) se hicieron utilizando imprimaciones que contenían sitios de restricción de enzimas NheI y EcoRI y se clonaron en los vectores pBiT1.1-C [TK/LgBiT] y pBiT2.1-C [TK/SmBiT] mientras que en el caso de los vectores pBiT1.1-C [TK/LgBiT] y pBiT2.1-C [TK/SmBiT] mientras que en el caso de los vectores pBiT1.1-C [TK/LgBiT] y p.......
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Discusión
Usando el método que se presenta aquí, las interacciones entre cualquier GPCR y el valor 1/2 se pueden monitorear en sistemas vivos en tiempo real utilizando este ensayo de complementación estructural de GPCR--arrestin. En este sentido, pudimos observar el reclutamiento diferencial de arrestina entre las dos isoformas de arrestina por el GLP-1r (Un prototípico clase B GPCR), también observamos una disociación del complejo del receptor---arrestin a los pocos minutos después de alcanzar el máximo señal luminiscente.
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Divulgaciones
Los autores no declaran intereses en competencia.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Programa de Investigación (NRF- 2015M3A9E7029172) de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el Ministerio de Ciencia, TIC y Planificación Futura.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Antibióticos penicilina estreptomicina | Welgene | LS202-02 | Penicilina/estreptomicina |
| Incubadora bacteriana | JEIO Tech | IB-05G | Incubadora (Air-Jacket), básica |
| Medio de cultivo celular | Welgene | LM 001-05 | DMEM Medio de cultivo celular |
| Medio de transfección de cultivo celular | Gibco | 31985-070 | Optimem 1X medio |
| Incubadora de CO2 | NUAIRE | NU5720 | Incubadora de CO2 de calor |
| directo Baño de agua digital | Lab Tech | LWB-122D | Baño de agua digital técnica de laboratorio |
| Lectura de pruebas de ADN polimerasa | ELPIS Biotech | EBT-1011 | PfU Polimerasa |
| ADN kit de purificación de ADN | Cosmogenetech | CMP0112 | miniprepLaboPass Purificartion Kit de purificación Mini |
| ADN Mini ADN Taq Polimerasa | Enzinomía | P750 | nTaq ADN polimerasa |
| Restricción enzimática BglII | New England Biolabs | R0144L | BglII |
| Tampón de restricción enzimática | New England Biolabs | B72045 | CutSmart 10X Tampón |
| Restricción enzimática EcoRI | New England Biolabs | R3101L | EcoRI-HF |
| Restricción enzimática NheI | New England Biolabs | R01315 | NheI |
| Restricción enzimática XhoI | New England Biolabs | R0146L | XhoI |
| Suero fetal bovino | Gibco Canadá | 12483020 | Suero fetal bovino |
| Gel/PCR DNA MiniKit | Real Biotech Corporation | KH23108 | HiYield Gel/PCR DNA |
| MiniKit Ligasa | ELPIS Biotech | EBT-1025 | T4 DNA Ligase |
| Microscopio | óptico Olympus | Microscopio CKX53SF CKX53 Reactivo | |
| transfección lipídica | Olympus Invitrogen | 11668-019 | Luminómetro Lipofectamine 2000 |
| Biotek/Fisher Scientific | 12504386 | Synergy 2 Lectores de microplacas multimodo | |
| Sistema NanoBiT | Promega | N2014 | NanoBiT PPI MCS Starter System |
| Sustrato de nanoluciferasa | Promega | N2012 | Nano-Glo Sistema de ensayo de células vivas |
| PCR Termociclador | Eppendorf | 6336000015 | Maestro ciclador Nexus SX1 |
| Poly-L-lisina | Sigma Aldrich | P4707-50ML | Solución de poli-L-lisina |
| Tripsina EDTA | Gibco | 25200-056 | Trysin EDTA 10X |
| Cultivo de glóbulos blancos Placas de 96 pocillos | Corning | 3917 | Placa de ensayo Placa de 96 pocillos |
Referencias
- Sriram, K., Insel, P. A. GPCRs as targets for approved drugs: How many targets and how many drugs? Molecular Pharmacology. 93 (4), 251-258 (2018).
- Hauser, A. S., Attwood, M. M., Rask-Andersen, M., Schiöth, H. B., Gloriam, D. E. Trends in GPCR ....
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