Generación de modificaciones genómicas definidas utilizando CRISPR-CAS9 en células madre pluripotentes humanas

Las células madre embrionarias humanas (hESC) y las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) son herramientas valiosas para modelar enfermedades humanas debido a su capacidad de renovación, manteniendo al mismo tiempo la capacidad de generar tipos celulares de diferentes linajes^{1,2 ,3,4}. Estos modelos abren la posibilidad de interrogar la función génica, y entender cómo las mutaciones y fenotipos específicos están relacionados con diversas enfermedades^5,6. Sin embargo, para entender cómo una alteración específica está vinculada a un fenotipo particular, el uso de un control isogénico emparejado y líneas celulares mutantes es importante controlar para la variabilidad de línea a línea^7,8. Las nucleasas de efector similares a los activadores de transcripción (TALENs) y las nucleasas de dedos de zinc se han utilizado para generar mutaciones de inserción o deleción (indels) en diversos modelos genéticos, incluidas las células primarias; pero estas nucleasas pueden ser engorrosas de usar y caras^{9,10,11,12,13,14}. El descubrimiento de la nuclearo de repetición palindrómica corta (CRISPR)-CAS9, regularmente interespaciada, ha revolucionado el campo debido a la eficiencia en la formación de indel en prácticamente cualquier región del genoma, la simplicidad de uso y la reducción del costo^{15 , 16 , 17 , 18 , 19}.

Un desafío en el uso de la tecnología de edición del genoma basada en CRISPR-CAS9 ha sido la generación o corrección de mutaciones específicas en un alelo sin crear una mutación indel en el segundo alelo^20. El objetivo principal de este protocolo es superar este desafío mediante el uso de dos plantillas de reparación de oligonucleótidos de una sola cadena (ssODN) para reducir la formación de indel en el segundo alelo. Ambos ssODN están diseñados para contener mutaciones silenciosas para evitar el re-corte por la nucleasa CAS9, pero sólo uno contiene la alteración del interés. Este método aumenta la eficiencia de generar una modificación genética heterocigota específica sin inducir la formación de indel en el segundo alelo. Usando este protocolo, los experimentos de edición de genes en seis ubicaciones genómicas independientes demuestran la introducción precisa del cambio genómico deseado en un alelo sin formación indel en el segundo alelo y se produce con una eficiencia general del 10 %. El protocolo descrito ha sido adaptado de Maguire et al.²¹.

1. Diseño y construcción de ARN guía (gRNA)

NOTA: Cada gRNA se compone de dos oligonucleótidos de 60 pares base (bp) que se recocidos para generar un oligonucleótido de doble cadena (ds) de 100 bp(figura 1A-C). La cronología para el diseño, la generación y la eficiencia de corte de gRNA es de aproximadamente 2 semanas(Figura 2).

1. Seleccione la región de ADN de interés que se va a editar en el genoma e identifique las secuencias de 3-4 23 bp que se ajusten al formato, 5'-G(N₁₉)NGG-3'. Estas secuencias deben ubicarse dentro de 20 bp de la región de interés.
   NOTA: La segmentación se puede realizar en el hilo de sentido o anti-sentido.
2. Evalúe las secuencias de gRNA para la redundancia genómica y la probabilidad fuera de destino utilizando un recurso como CRISPOR (http://crispor.tefor.net).
3. Incorporar la secuencia objetivo de 20 bp (excluyendo el motivo adyacente protoespacial o PAM) en dos oligonucleótidos de 60 mer como se muestra (las secuencias son de 5' a 3' y el rojo y el verde son complementos inversos como se muestra en la Figura 1C).
4. Ordene los dos oligonucleótidos de 60 bp del proveedor de elección. Una vez recibidos los oligonucleótidos, resuspender cada uno a una concentración final de 100 m en ddH₂O. Hacer un stock de trabajo de 10 m.
5. Recocido los dos oligonucleótidos y generar un fragmento de 100 bp dsDNA utilizando ADN polimerasa (Tabla de Materiales). Combinar 5 ml de oligonucleótido hacia delante de 10 oM y 5 ml de oligonucleótido inverso de 10 m en un tubo de banda de reacción en cadena de polimerasa (PCR) e incubar a 95 oC durante 5 min. Enfríe la reacción durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT).
6. Configure el PCR como se describe en el Cuadro 1. Realice la amplificación de PCR en un ciclor térmico utilizando los parámetros descritos en el Cuadro 2.
7. Visualice los productos de PCR en un bromuro de etidio del 1,5% (p/v) (EtBr) electroforoesed a 80-100 V durante 40 min. kit de extracción(Tabla de Materiales).

2. Diseño de imprimaciones PCR para cribado

1. Realizar pruebas de detección del ADN editado utilizando imprimaciones PCR delanteras y inversas diseñadas específicamente para amplificar una región de 400-500 bp del gen de interés (Tabla 2). Utilice ADN aislado de cualquier línea iPSC de control para confirmar un amplificador limpio al realizar el cribado de PCR.
2. Visualice los productos de PCR en un gel del 1,5% (p/v) después de la electroforesis a 80-100 V durante 1 h.
   NOTA: La secuenciación de clones editados se realiza utilizando una imprimación anidada diseñada después de la confirmación del conjunto de imprimación de cribado. Las muestras se envían a una fuente comercial para la secuenciación.

3. Preparación del plásmido vectorial gRNA_cloning

1. Para linealizar el vector de clonación, tome un tubo de centrífuga de 1,5 ml y agregue 1-5 g de ADN del vector gRNA_cloning junto con 4 l del tampón de enzima de restricción AflII y 1,5 ml de enzima de restricción AflII. Traiga la reacción a 24 sl de ddH₂O. Mezcle la reacción pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Incubar a 37oC durante la noche (O/N).
2. Electroforesa en un gel de agarosa del 1% a 80-100 V para 1 h y bandas de impuestos especiales (tamaño esperado de la banda es de 3519 bp).
3. Extraiga y puriifíque como en el paso 1.6.

4. Montaje del vector gRNA

1. Configure reacciones y ensamble fragmentos de ADN utilizando el kit de montaje(Tabla de materiales) en las relaciones 1:5 del vector de clonación de ARNg digerido AflII a un inserto purificado de gel de 100 bp, como se describe en la Tabla 3.
2. Incubar la reacción a 50 oC durante 15 min. Diluir la reacción 1:3 en ddH₂O y utilizar 3 l para la transformación bacteriana, según las instrucciones del fabricante(Tabla de materiales). Células de placa en placas de kanamicina LB/agar.
3. Escoge de 3 a 5 colonias por rRUB. Inocular cada colonia en 4 ml de LB y cultivar O/N a 37 oC en una incubadora de temblor orbital.
4. Purificar el ADN plásmido usando un kit de aislamiento de plásmido miniprep, y secuencia cada ARNm usando las siguientes imprimaciones para asegurar la clonación exitosa: Adelante: GTACAAAAAAGCAGGCTTTAAAGG; Reverso: TGCCAACTTTGTACAAGAAAGCT.

5. Prueba de la eficiencia de corte del RNR

1. Placa hESCs en fibroblastos embrionarios murinos irradiados (MEF) en una placa de 6 pocillos, como se describió anteriormente²¹. Cuando las células alcancen una confluencia del 70-80%, prepare la mezcla maestra de transfección descrita en la Tabla 4.
2. Mezclar con pipeteo e incubar a RT durante 15 min. Añadir gota a las células e incubar a 37 oC durante 48 h (con un cambio de medio después de 24 h).
3. Células de cosecha para clasificación después de 48 h.
   1. Retire los MEF enzimáticamente(Tabla de Materiales)con una incubación RT de 3 min.
   2. Enjuague las células 1x con el medio hESC (Tabla 5) y raspa en medio hESC + 10 M Y-27632 dihidrocloruro(Tabla de Materiales).
   3. Células de pelet a 300 x g durante 3 min y resuspenden en 0,5 ml de medio hESC + 10 m y dihidrocloruro.
   4. Filtrar en un tubo de 5 ml a través de una tapa de colador de celda de 35 m.
4. Usando la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), la compuerta en las células vivas y ordenar las células positivas de la proteína fluorescente verde (GFP).
5. Transfiera un máximo de 1,5 x 10⁴ células ordenadas directamente a una placa de 10 cm² recubierta con matriz de membrana de sótano 1:3(Tabla de materiales)y MEF irradiados en medio hESC(Tabla 5) que contiene dihidrocloruro Y-27632.
6. Cambie el medio diariamente utilizando el medio hESC(Tabla 5) sin dihidrocloruro Y-27632 y recoja manualmente los clones después de 10-15 días, cuando las colonias tienen un diámetro de 1 mm.
   1. Con una pipeta P200 y un microscopio, raspe cuidadosamente un solo clon y extraiga células en la pipeta.
   2. Disperse las células pipeteando suavemente 3-4x en una placa de 96 pocillos en el medio elaborado con la colonia.
   3. Dispensar en tubos de tiras de PCR para cribado y peletizar las células por centrifugación a 10.000 x g durante 5 min. Recoger 20 colonias por rARREGLO.

6. Examen de clones

1. Aislar el ADN mediante la incubación de gránulos celulares en 20 ml de tampón de proteína K(Tabla 5) (1 h a 55 oC y 10 min a 95 oC) y vórtice vigorosamente. Centrífuga a 10.000 x g durante 5 min y recoger el sobrenadante.
2. Realizar el cribado de PCR (sección 2) en un volumen total de 20 l utilizando una mezcla maestra que incluya imprimaciones diseñadas para amplificar la región de interés y 5 l de la digerida K de la proteinasa. Utilice ADN genómico aislado de la línea celular que fue editado como un control.
3. Evaluar los cambios de tamaño de los productos de PCR después de 1 h de electroforesis a 70-90 V en un gel de agarosa del 2,5% (p/v)(Figura 3B,C). Cualquier diferencia de tamaño es indicativa de escote.

7. Edición precisa del genoma en células madre pluripotentes utilizando ADN de oligo de una sola hebra (ssODN)

1. Diseño 100 bp ssODNs centrados en la secuencia de ARNm más eficiente determinada para tener la mejor eficiencia de corte.
2. Evitar el re-escote de la ODN recombinada mediante la introducción de mutaciones silenciosas en la secuencia del ARNR. Una sola mutación silenciosa en la secuencia de PAM es suficiente, pero si no es posible, 3-4 mutaciones silenciosas funcionarán.
   NOTA: Para facilitar el cribado de clones específicos, la introducción de un sitio de restricción dentro de 20 bp de la secuencia de ARNm es ideal.
3. Diseñe un ODN con los cambios de base deseados para crear la mutación de interés y un ODN sin los cambios base.
   NOTA: Estos cambios no deben ser superiores a 20 bp del sitio de corte CRISPR/CAS9 previsto, ya que la recombinación disminuye considerablemente a mayores distancias.
4. Pida los dos ssODN del proveedor de elección y resuspenda en agua para hacer existencias de 1 g/L. Almacene las existencias a -20 oC.

8. Configuración de transfección

1. Para transfectar el ssODN y los plásmidos CRISPR-CAS9, placar la línea celular objetivo en una placa de 6 pocillos en MEF irradiados para alcanzar 70-80% de confluencia después de una incubación de O/N.
2. Configure la reacción de transfección como se describe en la Tabla 6. Mezclar la reacción pipeteando e incubar durante 15 minutos en RT. Añadir la mezcla de reacción de transfección gota a las células.
3. Después de 48 h, prepare las celdas para la clasificación celular como se describe en la sección 5.3.
4. Recoger colonias 10 días después de enchapar células individuales usando una pipeta de 200 ml. Transfiera 100 l de células a un pozo de una placa de 24 o 48 pocillos previamente recubierto con gelatina e MEF irradiados en medio hESC con dihidrocloruro Y-27632. Utilice los 100 s restantes para el aislamiento del ADN como se describe en la sección 6.

9. Comprobación de mutaciones en colonias individuales

1. Para comprobar la integración correcta del ssODN, tome 5 ml de ADN aislado de cada colonia para realizar la PCR utilizando las imprimaciones de cribado diseñadas en la sección 2. Purificar los productos PCR(Tabla de Materiales)y preparar la digestión enzimática de restricción utilizando el sitio de enzimas único creado en el ssODN.
   NOTA: Esta digestión también incluye el tampón de enzimas de restricción y la concentración recomendada por el fabricante de enzimas de restricción en un volumen de 40 l.
2. Mezclar la reacción pipeteando e incubar a la temperatura recomendada por el fabricante durante 1-3 h.
3. Visualice los productos de PCR digeridos en un gel de agarosa EtBr del 1,5% (p/v) electroforoesed a 80-100 V durante 40 min. Si se ha producido una integración correcta del ssODN, secuencia mutaciones específicas mediante una imprimación anidada.

Generación de gRNAs y cribado para indels

Cada gRNA se clonará en un vector plásmido y se expresará utilizando el promotor U6. La enzima de restricción AflII se utiliza para linealizar el plásmido (adigeno #41824) y se encuentra después del promotor U6. La banda de 100 bp generada después de recocido los dos oligos de 60 bp se clona en el vector de expresión gRNA utilizando el ensamblaje de ADN. Una vez que se generan los plásmidos del ARNG, se transinfectan en hESC o iPSC junto con un plásmido CRISPS-CAS9 GFP (adigeno #44719). Las células GFP+ se clasifican después de 2 días para enriquecer las células transinfectadas y se clasifican (ver sección 5). Después de 10-14 días, las colonias derivadas de una sola célula se recogen y se utilizan para aislar el ADN para detectar la formación de indel generada para cada RNA. Una amplificación de PCR con imprimaciones que abarcan el sitio gRNA se utiliza para visualizar la formación de indel utilizando un gel de agarosa del 2,5% (p/v) con EtBr, electroforosizado a 70-90 V durante 1 h.

Generación de ssODN de 100 bp para introducir mutaciones específicas

Dos oligos ssODN están diseñados alrededor del ARNm con el corte más eficiente. Cada gRNA es de 100 bp y contiene mutaciones silenciosas, preferiblemente en la secuencia de PAM, para evitar el re-corte(Figura 4A). Una mutación silenciosa en la secuencia PAM puede generar un sitio de restricción único, que ayuda a detectar la integración exitosa en uno o dos alelos(Figura 4B).

ssODN resultados de recombinación

Usando este protocolo, la frecuencia de los eventos de segmentación para seis genes diferentes utilizando el enfoque de dos ssODN se muestra en la Figura 5. Al examinar la modificación genómica en el sitio del ARG en ambos alelos, se esperaban diferentes resultados, incluyendo la recombinación del ssODN de tipo salvaje (WT), el ssODN mutante y la formación de indel. Los clones en los que sólo un alelo había sido sometido a una recombinación, el resultado más común fue la formación de indel en el segundo alelo (10-42%). Los clones que tenían integración de los ssODN en ambos alelos condujeron a tres resultados diferentes: 1) integración del ssODN WT en ambos alelos (0-8%), 2) integración del ssODN mutante en ambos alelos (0-25%), y 3) integración tanto de la WT como de la ssODN WT mutante (8-21%).

Figura 1: Visión general de la generación de ARNB. (A) En la región de interés, diseñe cuatro gRNA que terminen en GG que no estén separados por más de 20 bp. (B) Cada gRNA de 23 bp tiene una secuencia PAM de NGG en el extremo 3'. (C) Las imprimaciones de 60 bp se componen de una secuencia de 40 bp complementaria al plásmido de la columna vertebral del ARNG y a la secuencia del ARNG de 20 bp sin la secuencia PAM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Cronología del protocolo para la generación de GRNA y el cribado de clones. Se muestra la línea de tiempo para la generación de gRNA y clones de cribado. El diseño y clonación de plásmidos de expresión de ARNG tarda aproximadamente una semana. Aproximadamente 48 horas después de la transfección en PSC humanos, las células GFP+ se clasifican y se clasifican al limitar la dilución. Las colonias deben ser visibles entre 7-10 días y aproximadamente en el día 20, los clones se pueden recoger para la detección, expansión y confirmación de secuencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: prueba de ARNB para la eficiencia de corte. (A) Para la construcción de ARNm, una banda de 100 bp se extrae de un gel de agarosa del 1,5%. (B) Después de la transfección celular, la validación del corte de GRNA se visualiza utilizando un gel de agarosa del 2,5%. Un producto PCR de 180 bp se utiliza para comprobar la formación de indel en la que se analiza un control sin cortar y diferentes clones para los cambios de banda indicativos de la formación de indel. (C) Diferentes gRNAs pueden tener diferentes eficiencias de corte. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Generación y cribado de mutaciones utilizando dos ssODN. (A) Para evitar el recorte CRISPR-CAS9 de los alelos editados, la secuencia PAM se puede modificar utilizando una mutación silenciosa de G a A. Esta modificación añade un sitio de restricción EcoRI único que se puede utilizar para la detección. Además de esta mutación silenciosa, el ssODN mutante contiene el cambio base deseado. (B) El cribado para la recombinación de oligonucleótidos utilizando la digestión enzimática de restricción EcoRI puede dar lugar a tres posibles resultados: ningún corte representado por una banda WT a 650 bp, recombinación en un alelo representado por una banda sin cortar de 650 bp y dos bandas más pequeñas o inserción en ambos alelos representados por sólo bandas más pequeñas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Eficiencia y resultados de integración de ssODN. La eficiencia de la integración y los resultados del enfoque de dos ssODN se determinaron mediante el análisis de seis genes diferentes. Si sólo se integra un ssODN, la formación indel se detectó generalmente en el otro alelo. Si se integran dos ssODN, se detectaron tres posibles resultados, como se muestra. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Condiciones de PCR de clonación de ARG.

Tabla 2: Parámetros de ciclo de PCR.

Tabla 3: condiciones de reacción de montaje del ARNm.

Tabla 4: Mezcla maestra de transfección celular.

Tabla 5: Medio de cultivo celular y tampón de digestión K de la proteinasa.

Tabla 6: mezcla maestra de transfección de células ssODN.

Los autores no tienen nada que revelar.