Generación de modificaciones genómicas definidas utilizando CRISPR-CAS9 en células madre pluripotentes humanas

Summary

Este protocolo proporciona un método para facilitar la generación de cambios de nucleótidos heterocigotos u homocigotos definidos utilizando CRISPR-CAS9 en células madre pluripotentes humanas.

Abstract

Las células madre pluripotentes humanas ofrecen un potente sistema para estudiar la función génica y modelar mutaciones específicas relevantes para la enfermedad. La generación de modificaciones genéticas heterocigotos precisas es difícil debido a la formación de indel mediada por CRISPR-CAS9 en el segundo alelo. Aquí, demostramos un protocolo para ayudar a superar esta dificultad mediante el uso de dos plantillas de reparación en las que sólo una expresa el cambio de secuencia deseado, mientras que ambas plantillas contienen mutaciones silenciosas para evitar el re-corte y la formación de indel. Esta metodología es más ventajosa para que las regiones de codificación de genes del ADN generen control isogénico y líneas de células madre humanas mutantes para el estudio de enfermedades humanas y biología. Además, se han realizado metodologías de optimización de la transfección y el cribado para reducir el trabajo de parto y el costo de un experimento de edición de genes. En general, este protocolo es ampliamente aplicable a muchos proyectos de edición del genoma que utilizan el modelo de células madre pluripotentes humanas.

Introduction

Las células madre embrionarias humanas (hESC) y las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) son herramientas valiosas para modelar enfermedades humanas debido a su capacidad de renovación, manteniendo al mismo tiempo la capacidad de generar tipos celulares de diferentes linajes^{1,2 ,3,4}. Estos modelos abren la posibilidad de interrogar la función génica, y entender cómo las mutaciones y fenotipos específicos están relacionados con diversas enfermedades^5,6. Sin embargo, para ente....

Protocol

1. Diseño y construcción de ARN guía (gRNA)

NOTA: Cada gRNA se compone de dos oligonucleótidos de 60 pares base (bp) que se recocidos para generar un oligonucleótido de doble cadena (ds) de 100 bp(figura 1A-C). La cronología para el diseño, la generación y la eficiencia de corte de gRNA es de aproximadamente 2 semanas(Figura 2).

1. Seleccione la región de ADN de interés que se va a editar en el genoma e identifique las secuencias de 3-4 23 bp que se ajusten al formato, 5'-G(N₁₉)NGG-3'. Estas secuencias deben ubicarse dentro de 20 bp de la región d....

Results

Generación de gRNAs y cribado para indels

Cada gRNA se clonará en un vector plásmido y se expresará utilizando el promotor U6. La enzima de restricción AflII se utiliza para linealizar el plásmido (adigeno #41824) y se encuentra después del promotor U6. La banda de 100 bp generada después de recocido los dos oligos de 60 bp se clona en el vector de expresión gRNA utilizando el ensamblaje de ADN. Una vez que se generan los plásmidos del ARNG, se transinfectan en hESC o.......

Discussion

En este protocolo, se demuestra el uso de CRISPR-CAS9 junto con dos plantillas de reparación ssODN para generar cambios específicos del genoma heterocigoto u homocigoto en células madre pluripotentes humanas. Este método dio lugar a la generación exitosa de líneas celulares isogénicas que expresan cambios genómicos heterocigotos con una eficiencia cercana al 10%. Este protocolo ha sido optimizado tanto para ESC seres humanos como para iPSC cultivados en MEF irradiados que apoyan el crecimiento celular y la supervivencia .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubo de poliestireno de 5 ml de fondo redondo con tapón de filtro de células	Corning	352235
placas de cultivo de tejidos de poliestireno de 6 pocillos	Corning	353046
Endonucleasa de restricción AflII	New England Biolabs	R0520
Agarosa	VWR	N605
DMEM/F12 medio	ThermoFisher	11320033
dNTPs	Roche	11969064001
Aparato
Kit de extracción de gel	Macherey-Nagel	740609
Gibson Kit de montaje	New England Biolabs	E2611
gRNA_Cloning Vector	Addgene	41824
LB placas de agar que contienen 50 μ g/ml Kanamicina
Reactivo de tallo de lipofectamina	ThermoFisher	(STEM00001)
Matrigel Factor de crecimiento reducido (GFR)	Corning	354230
Fibroblastos embrionarios murinos (MEFs)
Kit de limpieza de PCR y extracción en gel de nucleospina	Macherey-Nagel	740609
Incubadora de agitación orbital
vector pCas9_GFP	Addgene	44719
tubos de tira de PCR EE	. UU. Scientific	1402-2900
Phusion ADN polimerasa de alta fidelidad y 5× Tampón de phusión	New England Biolabs	M0530
PurelinkTM Kit de minipreparación de plásmido rápido	Invitrogen	K210011
proteinasa K	Qiagen	Qiagen 19133
StellarTM células de Escherichia coli electrocompetentes	Takara	636763
medio SOC	New England Biolabs	B9020S
Enzima TrypLE Express	ThermoFisher	12605036
Y-27632 inhibidor de diclorhidrato/ROCK (ROCKi)	Tocris	1254