Summary
इस प्रोटोकॉल मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं में CRISPR-CAS9 का उपयोग कर परिभाषित विषमयुग्मज न्यूक्लिओटाइड परिवर्तन की पीढ़ी को सुविधाजनक बनाने के लिए एक विधि प्रदान करता है।
Abstract
मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं जीन समारोह और मॉडल विशिष्ट रोग के लिए प्रासंगिक उत्परिवर्तनों का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली प्रदान करते हैं. सटीक विषमयुग्मज आनुवंशिक संशोधनों की पीढ़ी दूसरे एलेले में CRISPR-CAS9 मध्यस्थता अदल गठन के कारण चुनौतीपूर्ण है। यहाँ, हम दो मरम्मत टेम्पलेट्स जिसमें केवल एक वांछित अनुक्रम परिवर्तन व्यक्त करता है का उपयोग करके इस कठिनाई को दूर करने में मदद करने के लिए एक प्रोटोकॉल का प्रदर्शन, जबकि दोनों टेम्पलेट्स चुप उत्परिवर्तनों को रोकने के लिए फिर से काटने और indel गठन होते हैं. इस पद्धति मानव रोग और जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए isogenic नियंत्रण और उत्परिवर्ती मानव स्टेम सेल लाइनों उत्पन्न करने के लिए डीएनए के जीन संपादन कोडिंग क्षेत्रों के लिए सबसे अधिक फायदेमंद है. इसके अलावा, ट्रांसफेक्शन और स्क्रीनिंग के तरीकों का अनुकूलन श्रम और एक जीन संपादन प्रयोग की लागत को कम करने के लिए किया गया है। कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल व्यापक रूप से मानव pluripotent स्टेम सेल मॉडल का उपयोग कई जीनोम संपादन परियोजनाओं के लिए लागू है.
Introduction
मानव भ्रूण स्टेम सेल (ESCs) और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) नवीकरण के लिए अपनी क्षमता के कारण मानव रोग मॉडलिंग के लिए मूल्यवान उपकरण हैं, जबकि विभिन्न वंशों के सेल प्रकार उत्पन्न करने की क्षमता को बनाए रखने1,2 ,3,4. ये मॉडल जीन फलन से पूछताछ करने की संभावना को खोलते हैं और यह समझते हैं कि विशिष्ट उत्परिवर्तन तथा फीनोटाइप विभिन्नरोगोंसे किस प्रकार संबंधितहैं। हालांकि, यह समझने के लिए कि किसी विशिष्ट परिवर्तन को किसी विशेष फीनोटाइप से कैसे जोड़ा जाता है, युग्मित समजनिक नियंत्रण और उत्परिवर्ती सेल लाइनों का उपयोग लाइन परिवर्तनशीलता7,8के लिए लाइन के लिए नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है। ट्रांसक्रिप्शन एक्टिवेटर की तरह effector nucleases (TALENs) और जस्ता उंगली nucleases के लिए प्राथमिक कोशिकाओं सहित विविध आनुवंशिक मॉडल में प्रविष्टि या विलोपन (indels) उत्परिवर्तन उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया है; लेकिन ये न्यूक्लिएस का उपयोग करना और महंगा हो सकता है9,10,11,12,13,14. संकुल की खोज नियमित रूप से अंतराल कम palindromic दोहराने (CRISPR)-CAS9 nuclease जीनोम के लगभग किसी भी क्षेत्र में indel गठन में दक्षता के कारण क्षेत्र में क्रांति ला दी है, उपयोग की सादगी, और लागत में कमी15 , 16 , 17 , 18 , 19.
CRISPR-CAS9 आधारित जीनोम संपादन प्रौद्योगिकी का उपयोग करने में एक चुनौती दूसरी एलीले20में एक अदल उत्परिवर्तन बनाने के बिना एक allele में विशिष्ट उत्परिवर्तनों के उत्पादन या सुधार किया गया है. इस प्रोटोकॉल का प्रमुख लक्ष्य दो एकल-स्लेड ओलिगोन्यूक्लिओटाइड (sODN) मरम्मत टेम्पलेट्स का उपयोग करके इस चुनौती को दूर करने के लिए दूसरे allele में अदल गठन को कम करने के लिए है. दोनों ssODNs CAS9 nuclease द्वारा फिर से काटने को रोकने के लिए चुप उत्परिवर्तनों को रोकने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं, लेकिन केवल एक ब्याज की परिवर्तन होता है. इस विधि दूसरे एलील में अदल गठन को प्रेरित किए बिना एक विशिष्ट विषमयुग्मज आनुवंशिक संशोधन पैदा करने की दक्षता बढ़ जाती है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, छह स्वतंत्र जीनोमिक स्थानों में जीन संपादन प्रयोगों दूसरे allele में indel गठन के बिना एक allele में वांछित जीनोमिक परिवर्तन का सटीक परिचय प्रदर्शित करता है और $ 10% की एक समग्र दक्षता के साथ होता है. वर्णित प्रोटोकॉल Maguire एट अल21से अनुकूलित किया गया है.
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Protocol
1. डिजाइन और गाइड आरएनए (gRNA) का निर्माण
नोट: प्रत्येक gRNA दो 60 आधार जोड़ी से बना है (bp) oligonucleotides कि एक 100 bp डबल फंसे (ds) ओलिगोन्यूक्लिओटाइड उत्पन्न करने के लिए annealed हैं (चित्र 1ए-सी). gRNA डिजाइन, पीढ़ी, और परीक्षण काटने दक्षता के लिए समय रेखा लगभग 2 सप्ताह है (चित्र 2).
- जीनोम संपादित किया जा करने के लिए ब्याज के डीएनए क्षेत्र का चयन करें और प्रारूप फिट है कि 3-4 23 बीपी दृश्यों की पहचान, 5'-जी (एन19)NGG-3'। इन दृश्यों ब्याज के क्षेत्र के 20 बीपी के भीतर स्थित होना चाहिए.
नोट: लक्ष्यीकरण भावना या विरोधी भावना किनारा पर किया जा सकता है. - CRISPOR (http://crispor.tefor.net) जैसे संसाधन का उपयोग करके जीनोमिक अतिरेक और ऑफ़-टार्गेट प्रायडिकी के लिए gRNA अनुक्रमों का मूल्यांकन करें.
- 20 बीपी लक्ष्य अनुक्रम (प्रोटोस्पेसर आसन्न आकृति या पीएएम को छोड़कर) को दो 60-मर ओलिगोन्यूक्लिओटाइडमें शामिल करें जैसा कि दिखाया गया है (दृश्य 5' से 3' और लाल और हरे रंग के रिवर्स पूरक हैं जैसा कि चित्र 1Cमें दिखाया गया है) ।
- पसंद के विक्रेता से दो 60 बीपी ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स आदेश। एक बार ओलिगोन्यूक्लिओटाइड प्राप्त हो जाने पर, प्रत्येक को डीडीएच2ओ में 100 डिग्री सेल्सियस की अंतिम सांद्रता के लिए पुन: निलंबित करें। 10 डिग्री सेल्सियस का कार्य स्टॉक करें।
- दो ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स को एनल करें और डीएनए पॉलिमरेज (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके 100 बीपी डीएसडीए टुकड़ा उत्पन्न करें। 10 डिग्री सेल्सियस आगे ओलिगोन्यूक्लिओटाइड के 5 डिग्री एल और 10 डिग्री सेल्सियस रिवर्स ओलिगोन्यूक्लिओटाइड को एक पॉलिमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर) स्ट्रिप ट्यूब में और इनक्यूबेट को 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर मिलाएं। कमरे के तापमान (आरटी) पर 10 मिनट के लिए प्रतिक्रिया को शांत करें।
- तालिका 1में वर्णित PCR सेट करें. तालिका 2में उल्लिखित पैरामीटरों का उपयोग करते हुए एक थर्मल साइकिलर में पीसीआर प्रवर्धन करें।
- पीसीआर उत्पादों को 1.5% (w/v) इथियम ब्रोमाइड (EtBr) agarose जेल इलेक्ट्रोफोर्स पर 40 मिनट के लिए 80-100 V पर कल्पना करें। 100 बीपी बैंड (चित्र 3ए),एक एलईडी प्रकाश बॉक्स पर कल्पना, एक रेजर ब्लेड का उपयोग कर जेल से और एक जेल का उपयोग कर शुद्ध निष्कर्षण किट (सामग्री की तालिका)।
2. स्क्रीनिंग के लिए पीसीआर प्राइमर का डिजाइन
- आगे और रिवर्स पीसीआर प्राइमर है कि विशेष रूप से ब्याज की जीन के एक 400-500 बीपी क्षेत्र बढ़ाना करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं का उपयोग कर संपादित डीएनए की स्क्रीनिंग प्रदर्शन (तालिका 2). स्क्रीनिंग पीसीआर प्रदर्शन करते समय एक साफ amplicon की पुष्टि करने के लिए किसी भी नियंत्रण iPSC लाइन से अलग डीएनए का प्रयोग करें।
- 1 h के लिए 80-100 V पर इलेक्ट्रोफोरोसिस के बाद एक 1.5% (w/v) जेल पर पीसीआर उत्पादों को विज़ुअलाइज़ करें।
नोट: संपादित क्लोन के अनुक्रमण स्क्रीनिंग प्राइमर सेट की पुष्टि के बाद बनाया गया है कि एक नेस्टेड प्राइमर का उपयोग किया जाता है। नमूने अनुक्रमण के लिए एक वाणिज्यिक स्रोत के लिए भेजा जाता है.
3. gRNA-क्लोनिंग वेक्टर प्लास्मिड की तैयारी
- क्लोनिंग वेक्टर linearize करने के लिए, एक 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब ले और एएफएलद्वितीय प्रतिबंध एंजाइम के 4 $L के साथ-साथ gRNA-क्लोनिंग वेक्टर के डीएनए के 1-5 $g जोड़ें और Aflद्वितीय प्रतिबंध एंजाइम के 1.5 $L. डीडीएच2ओ के 24 डिग्री सेल्सियस के लिए अभिक्रिया को ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा प्रतिक्रिया को मिलाइए। 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट (O/
- 1 ज और एक्साइज बैंड के लिए 80-100 वी पर 1% agarose जेल पर इलेक्ट्रोफोरेस (अपेक्षित बैंड आकार $ 3519 बीपी है)।
- निकालें और चरण 1.6 में के रूप में शुद्ध.
4. gRNA सदिश की विधानसभा
- प्रतिक्रियाओं को सेट अप करें और एसेम्बली किट (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके डीएनए के टुकड़ों को आफ़्रीकेतके 1:5 अनुपातों पर इकट्ठा करें जो कि एएफएलII डाइजेस्ट जीआरएनए क्लोनिंग वेक्टर के 100 बीपी जेल शुद्ध सम्मिलित करने के लिए हैं, जैसा कि तालिका 3 में वर्णित है।
- 15 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया को इनक्यूबेट करें, प्रतिक्रिया को डीडीएच2व् में पतला करें और निर्माता के निर्देशों(सामग्री की तालिका)के अनुसार जीवाणु परिवर्तन के लिए 3 डिग्री सेल्सियस का उपयोग करें। kanamycin LB/agar प्लेटों पर प्लेट सेल।
- प्रति gRNA 3-5 कालोनियों उठाओ. प्रत्येक कॉलोनी को 4 एमएल एल बी में टीका लगाएं और कक्षीय झटकों में 37 डिग्री सेल्सियस पर ओ/
- शुद्ध प्लाज्मिड डीएनए एक miniprep प्लाज्मिड अलगाव किट का उपयोग कर, और अनुक्रम प्रत्येक gRNA निम्नलिखित प्राइमर का उपयोग करने के लिए सफल क्लोनिंग सुनिश्चित करने के लिए: आगे: GTACAAAAAGCCTTAAGG; उलट: TGCCAACTTGTACAAGAAGCT.
5. टेस्ट gRNA काटने दक्षता
- 6-वेल प्लेट में विकिरणित मरिन भ्रूणीय फाइब्रोब्लास्ट्स (एमईएफ) पर प्लेट HESCs, जैसा कि पहलेवर्णित 21. जब कोशिकाएं 70-80% संगम तक पहुँचती हैं, तो सारणी 4में उल्लिखित ट्रांसफेक्शन मास्टर मिश्रण तैयार करें।
- 15 मिनट के लिए आरटी में पाइपिंग और इनक्यूबेट द्वारा मिक्स करें। कोशिकाओं में ड्रॉपवार जोड़ें और 48 एच के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें (24 ज के बाद मीडिया परिवर्तन के साथ)।
- 48 एच के बाद छँटाई के लिए हार्वेस्ट सेल।
- एक 3 मिनट आरटी ऊष्मायन के साथ MEFs enzymaticly निकालें (सामग्री की तालिका).
- कुल्ला कोशिकाओं 1x के साथ हेसेक मध्यम (तालिका 5) और HESC माध्यम में परिमार्जन + 10 डिग्री एम Y-27632 dihydrochloride ( सामग्रीकी तालिका) .
- 3 मिनट के लिए 300 x ग्राम पर गोली कोशिकाओं और 0.5 एमएल के एचईएससी मध्यम + 10 डिग्री एम वाई-27632 डाइहाइड्रोक्लोराइड में पुन: स्फूर्ति।
- 35 मीटर सेल-स्ट्रेनर कैप के माध्यम से 5 एमएल ट्यूब में फ़िल्टर करें।
- फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई का उपयोग करना (FACS), लाइव कोशिकाओं पर गेट और हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) सकारात्मक कोशिकाओं को सॉर्ट.
- अधिकतम 1.5 x 104 सॉर्ट किए गए कोशिकाओं को 10 बउ2 डिश में सीधे स्थानांतरित करें जो 1:3 बेसमेंट मेम्ब्रेन मैट्रिक्स ( सामग्रीकी तालिका) और एचईएससी माध्यम में विकिरणित एमईएफ ( सारणी5) जिसमें Y-27632 डाइहाइड्रोक्लोराइड युक्त है।
- वाई-27632 डाइहाइड्रोक्लोराइड के बिना ई-27632 डाइहाइड्रोक्लोराइड के बिना मध्यम दैनिक को बदलें और 10-15 दिनों के बाद क्लोन को मैन्युअल रूप से चुनें, जब कालोनियों का व्यास 1 मिमी है।
- एक P200 पिपेट और माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, ध्यान से एक क्लोन परिमार्जन और पिपेट में कोशिकाओं को आकर्षित.
- कॉलोनी के साथ तैयार किए गए माध्यम में 96 अच्छी प्लेट में 3-4x को धीरे से पाइप करके कोशिकाओं को तितर-बितर करें।
- स्क्रीनिंग के लिए पीसीआर स्ट्रिप ट्यूबों में वितरण और 5 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं गोली. प्रति gRNA 20 कालोनियों उठाओ.
6. क्लोन स्क्रीनिंग
- 20 डिग्री सेल्सियस प्रोटीनके बफर(तालिका 5) (1 ज 55 डिग्री सेल्सियस पर और 95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट) और भंवर में कोशिका छर्रों को इनक्यूबेट करके डीएनए को अलग करना। 5 मिनट के लिए 10,000 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज और supernatant इकट्ठा।
- स्क्रीनिंग पीसीआर (अनुभाग 2) की कुल मात्रा में प्रदर्शन 20 डिग्री सेल्सियस ब्याज के क्षेत्र और प्रोटीने K डाइजेस्ट के 5 डिग्री सेल्सियस बढ़ाना करने के लिए डिज़ाइन किया गया प्राइमर सहित एक मास्टर मिश्रण का उपयोग कर। एक नियंत्रण के रूप में जीन संपादित किया गया था कि कोशिका रेखा से अलग जीनोमिक डीएनए का प्रयोग करें.
- पीसीआर उत्पादों के आकार परिवर्तन का मूल्यांकन 1 h इलेक्ट्रोफोरोसिस के बाद 70-90 V पर 2.5% (w/v) agarose जेल (चित्र 3B, C)। किसी भी आकार अंतर दरार का संकेत है.
7. एकल किनारा ओलिगो डीएनए (sSODNs) का उपयोग कर pluripotent स्टेम कोशिकाओं में सटीक जीनोम संपादन
- डिजाइन 100 बीपी ssODNs सबसे कुशल GRNA अनुक्रम के आसपास केंद्रित सबसे अच्छा काटने दक्षता के लिए निर्धारित किया है.
- GRNA अनुक्रम में मूक उत्परिवर्तनों को शुरू करने से पुन: संयुक्त ODN के पुन: cleavage को रोकने के। पीएएम अनुक्रम में एक भी मूक उत्परिवर्तन पर्याप्त है, लेकिन यदि संभव नहीं तो 3-4 मूक उत्परिवर्तन काम करेंगे।
नोट: लक्षित क्लोन की स्क्रीनिंग की सुविधा के लिए, GRNA अनुक्रम के $ 20 बीपी के भीतर एक प्रतिबंध साइट की शुरूआत आदर्श है. - ब्याज का उत्परिवर्तन और आधार परिवर्तन (ओं) के बिना एक ODN बनाने के लिए वांछित आधार परिवर्तन (ओं) के साथ एक ODN डिजाइन.
नोट: इन परिवर्तनों की भविष्यवाणी CRISPR/CAS9 कट साइट से $ 20 bp से अधिक नहीं होना चाहिए, के रूप में पुनर्संयोजन अधिक से अधिक दूरी पर काफी दूर चला जाता है. - पसंद के विक्रेता से दो ssODNs आदेश और पानी में resuspend करने के लिए 1 g/ -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर स्टॉक।
8. ट्रांसफेक्शन सेटअप
- एसएसओडीएन और CRISPR-CAS9 प्लाज्मिड को ट्रांसफेक्ट करने के लिए, एक ओ/एन इनक्यूबेशन के बाद 70-80% संगम तक पहुंचने के लिए विकिरणित एमईएफ पर 6-वेल डिश में लक्ष्य सेल लाइन को प्लेट करें।
- सारणी 6में वर्णित ट्रांसफ़ेक्शन अभिक्रिया को सेट की गई है। आरटी पर 15 मिनट के लिए पाइपिंग और इनक्यूबेट द्वारा प्रतिक्रिया को मिलाएं। कोशिकाओं में ट्रांसफेक्शन प्रतिक्रिया मिश्रण ड्रॉपवार जोड़ें।
- 48 ज के बाद, कक्ष छँटाई के लिए कोशिकाओं को तैयार करें जैसा कि अनुभाग 5.3 में वर्णित है।
- एक 200 डिग्री एल पिपेट का उपयोग कर एकल कोशिकाओं चढ़ाना के बाद कालोनियों $ 10 दिन उठाओ। वाई-27632 डाइहाइड्रोक्लोराइड के साथ हेसेक माध्यम में जिलेटिन और विकिरणित एमईएफ के साथ पहले लेपित 24 या 48 अच्छी तरह से प्लेट की एक अच्छी तरह से कोशिकाओं के 100 डिग्री एल स्थानांतरण। धारा 6 में वर्णित के रूप में डीएनए अलगाव के लिए शेष 100 $L का प्रयोग करें।
9. एकल कालोनियों में उत्परिवर्तन के लिए जाँच
- sSODN के सफल एकीकरण के लिए जाँच करने के लिए, अनुभाग 2 में डिजाइन स्क्रीनिंग प्राइमर का उपयोग कर पीसीआर प्रदर्शन करने के लिए प्रत्येक कॉलोनी से अलग डीएनए के 5 डिग्री एल ले। पीसीआर उत्पादों को शुद्ध करें (सामग्री की तालिका) और ssODN में बनाई गई अद्वितीय एंजाइम साइट का उपयोग कर प्रतिबंध एंजाइम पाचन तैयार करते हैं।
नोट: यह पाचन भी प्रतिबंध एंजाइम बफर और निर्माता की सिफारिश की एकाग्रता प्रतिबंध एंजाइम की एक मात्रा में शामिल 40 $L. - 1-3 एच के लिए निर्माता की सिफारिश की तापमान पर पाइपटिंग और इनक्यूबेट द्वारा प्रतिक्रिया मिक्स करें।
- एक 1.5% (w/v) EtBr agarose जेल 40 मिनट के लिए 80-100 वी पर electrophoresed पर पचपीसी उत्पादों कल्पना. यदि sODN का सफल एकीकरण हुआ है, तो नेस्टेड प्राइमर का उपयोग करके विशिष्ट उत्परिवर्तनों को अनुक्रम करें.
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Representative Results
जी.आर.एन.ए. का उत्पादन और इन्डलों के लिए स्क्रीनिंग
प्रत्येक gRNA एक प्लाज्मिड वेक्टर में क्लोन किया जाएगा और U6 प्रमोटर का उपयोग कर व्यक्त किया. Aflद्वितीय प्रतिबंध एंजाइम प्लाज्मिड linearize करने के लिए प्रयोग किया जाता है (#41824 addgene) और U6 प्रमोटर के बाद स्थित है. दो 60 बीपी ओलिगो सगे को अनाप-शनाप करने के बाद उत्पन्न 100 बीपी बैंड डीएनए असेंबली का उपयोग करके gRNA अभिव्यक्ति वेक्टर में क्लोन किया जाता है। एक बार GRNA प्लाज्मिड उत्पन्न कर रहे हैं, वे एक CRISPS-CAS9 GFP प्लाज्मिड (एडजीन #44719) के साथ hESCs या iPSCs में transfected हैं. GFP + कोशिकाओं transfected कोशिकाओं के लिए समृद्ध करने के लिए 2 दिनों के बाद हल कर रहे हैं और चढ़ाया (अनुभाग 5 देखें). 10-14 दिनों के बाद, एकल सेल व्युत्पन्न कालोनियों उठाया और प्रत्येक gRNA के लिए उत्पन्न indel गठन के लिए स्क्रीन करने के लिए डीएनए को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जाता है। GRNA साइट फैले प्राइमर के साथ एक पीसीआर प्रवर्धन का उपयोग इंडेल गठन को 2.5% (w/v) एटबीआर के साथ agarose जेल का उपयोग करने के लिए किया जाता है, 1 h के लिए 70-90 वी पर इलेक्ट्रोफोर्स्ड।
विशिष्ट उत्परिवर्तनों को पेश करने के लिए 100 बीपी एसएसडीओडीएन की पीढ़ी
दो sODN oligos सबसे कुशल काटने के साथ GRNA के आसपास डिजाइन किए हैं. प्रत्येक gRNA 100 बीपी है और मूक उत्परिवर्तन ों में शामिल है, अधिमानतः PAM अनुक्रम में, फिर से काटने से बचने के लिए (चित्र 4A)। PAM अनुक्रम में एक मूक उत्परिवर्तन एक अद्वितीय प्रतिबंध साइट है, जो एक या दो alleles में सफल एकीकरण के लिए स्क्रीन करने में मदद करता है उत्पन्न कर सकते हैं (चित्र 4B).
sSODN पुनर्संयोजन परिणाम
इस प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, दो एसओडीएन दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए छह विभिन्न जीनों के लिए लक्ष्यीकरण घटनाओं की आवृत्ति चित्र 5 में दर्शायागया है। दोनों alleles में gRNA साइट पर जीनोमिक संशोधन की जांच करके, विभिन्न परिणामों wildtype (WT) ssODN, उत्परिवर्ती ssODN और indel गठन के पुनर्संयोजन सहित उम्मीद कर रहे थे. क्लोन जिसमें केवल एक एलील पुनर्संयोजन आया था, सबसे आम परिणाम दूसरे एलील (10-42%) में अदल गठन था। क्लोन है कि दोनों alleles में ssODNs के एकीकरण था तीन अलग अलग परिणामों के लिए नेतृत्व: 1) दोनों alleles में WT ssODN के एकीकरण (0-8%), 2) दोनों alleles में उत्परिवर्ती ssODN के एकीकरण (0-25%), और 3) दोनों WT और उत्परिवर्ती sODSN के एकीकरण (8-21%).
चित्र 1: gRNA पीढ़ी का अवलोकन. (क)ब्याज के क्षेत्र में, जीजी में समाप्त होने वाले चार जी.आर.एन.ए.एस. (ख) 23 बीपी के प्रत्येक gRNA 3 के अंत में NGG का एक PAM अनुक्रम है. (ग) 60 बीपी प्राइमर में एक 40 बीपी अनुक्रम शामिल है जो आरएनए रीढ़ की हड्डी प्लाज्मिड और पीएएम अनुक्रम के बिना 20 बीपी जीआरएनए अनुक्रम के पूरक हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: gRNA पीढ़ी और क्लोन स्क्रीनिंग के लिए प्रोटोकॉल समयरेखा. GRNA पीढ़ी और स्क्रीनिंग क्लोन के लिए समय रेखा दिखाया गया है. डिजाइनिंग और क्लोनिंग GRNA अभिव्यक्ति प्लाज्मिड लगभग एक सप्ताह लगते हैं। मानव PSCs में transfection के बाद लगभग 48 घंटे, GFP + कोशिकाओं को हल कर रहे हैं और सीमित कमजोर पड़ने पर चढ़ाया. कालोनियों 7-10 दिनों के बीच दिखाई देना चाहिए और लगभग दिन 20 पर, क्लोन स्क्रीनिंग के लिए उठाया जा सकता है, विस्तार, और अनुक्रम पुष्टि. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: दक्षता काटने के लिए gRNA परीक्षण. (ए) gRNA निर्माण के लिए, एक 100 बीपी बैंड एक 1.5% agarose जेल से excised है. (बी) सेल ट्रांसफेक्शन के बाद, gRNA काटने का सत्यापन 2.5% agarose जेल का उपयोग कर कल्पना की है। एक 180 बीपी पीसीआर उत्पाद अदल गठन जिसमें एक बिना खतना के नियंत्रण और विभिन्न क्लोन बैंड बदलाव इंडेल गठन का संकेत के लिए विश्लेषण कर रहे हैं के लिए जाँच करने के लिए प्रयोग किया जाता है। (ग) विभिन्न जीआरएनए में अलग-अलग कटिंग क्षमता हो सकती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4: दो ssODNs का उपयोग कर उत्परिवर्तनों की पीढ़ी और स्क्रीनिंग. (ए)CRISPR-CAS9 संपादित alleles के फिर से काटने से बचने के लिए, पीएएम अनुक्रम एक मूक उत्परिवर्तन के लिए एक जी का उपयोग कर संशोधित किया जा सकता है। इस संशोधन के एक अद्वितीय EcoRI प्रतिबंध साइट है कि स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता कहते हैं. इस मूक उत्परिवर्तन के अलावा, उत्परिवर्ती ssODN वांछित आधार परिवर्तन होता है. (बी) ईकोआरआई प्रतिबंध एंजाइम पाचन का उपयोग कर ओलिगोन्यूक्लिओटाइड पुनर्संयोजन के लिए स्क्रीनिंग तीन संभावित परिणामों में परिणाम कर सकते हैं: $ 650 बीपी पर एक डब्ल्यूटी बैंड द्वारा प्रतिनिधित्व कोई काटने, 650 बीपी और दो के एक बिना खतना के बैंड द्वारा प्रतिनिधित्व एक allele में पुनर्संयोजन छोटे बैंड या केवल छोटे बैंड द्वारा प्रतिनिधित्व दोनों alleles में प्रविष्टि. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 5: sSODN एकीकरण दक्षता और परिणाम. एकीकरण दक्षता और दो ssODN दृष्टिकोण के परिणाम छह अलग जीन का विश्लेषण करके निर्धारित किए गए थे. यदि केवल एक sODN एकीकृत, अदल गठन आमतौर पर अन्य एलीले में पाया गया था. यदि दो sODNs एकीकृत, तीन संभावित परिणामों का पता लगाया गया, के रूप में दिखाया गया. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| अभिकर्मक | वॉल्यूम ($L) |
| डीएनटीपी (10 एमएम) | 0.4 |
| ताक पॉलिमरेज | 0.2 |
| पीसीआर बफर | 4.0 |
| अनीलित ओलिगोस (10 डिग्री मी) | 10.0 |
| डीडीएच2हे | 5.4 |
तालिका 1: gRNA क्लोनिंग पीसीआर शर्तों।
| पीसीआर प्रोग्राम | |
| चरण 1 | 30 एस के लिए 98 डिग्री सेल्सियस |
| चरण 2 | 10 s के लिए 98 डिग्री सेल्सियस |
| चरण 3 | 20 s के लिए 55 डिग्री सेल्सियस |
| चरण 4 | 30 एस के लिए 72 डिग्री सेल्सियस |
| चरण 5 | 30 चक्रों के लिए चरण 2 $4 दोहराएँ |
| चरण 6 | 5 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस |
| चरण 7 | 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो |
तालिका 2: PCR साइकिल चालन पैरामीटर.
| अभिकर्मक | वॉल्यूम ($L) |
| रैखिकीकृत gRNA वेक्टर AflII का उपयोग कर (अर्थात्, 50 एनजी/ | 1.0 |
| 100 बीपी डीएनए (यानी, 250 एनजी/ | 1.0 |
| मास्टर मिश्रण 2x | 10.0 |
| डीडीएच2हे | क्यू.एस. 20 |
तालिका 3: gRNA विधानसभा प्रतिक्रिया की स्थिति.
| अभिकर्मक | राशि |
| डीएमईएम/ | 50.0 जेडएल |
| pCas9]GFP वेक्टर (एडजीन प्लाज्मिड 44719) | 0.5 डिग्री |
| एनआरएनए प्लाज़्मिड | 0.5 डिग्री |
| लिपिड संक्रमण अभिकर्मक | 3.0 $L |
तालिका 4: सेल transfection मास्टर मिश्रण.
| एचएसईएससी माध्यम | |
| अभिकर्मक | अंतिम एकाग्रता |
| डीएमईएम/ | |
| नॉकआउट सीरम प्रतिस्थापन (KDR) | 15% (v/ |
| अनावश्यक अमीनो एसिड | 100 डिग्री मी. |
| सोडियम पाइरुटेट | 1 एम.एम. |
| ग्लूटामाइन | 2 एम.एम. |
| जेड-मर्केटोथेनॉल | 0.1 एमएम |
| bFGF मानव (मूल फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक) | 10 एनजी/ |
| 10x प्रोटीनाज के बफर | |
| Tris.HCl पीएच:7.4 | 50mm |
| अमोनियम सल्फेट पीएच: 9.3 | 15 एमएम |
| एमजीसीएल2 | 2.5 एम.एम. |
| ट्वेन 20 | 0.1% (v/ |
| प्रोटीनाज के | 100 ग्राम/ |
तालिका 5: सेल संस्कृति मध्यम और प्रोटीने K पाचन बफर.
| अभिकर्मक | राशि |
| डीएमईएम/ | 50.0 जेडएल |
| pCas9]GFP वेक्टर (एडजीन प्लाज्मिड 44719) | 0.5 डिग्री |
| एनआरएनए प्लाज़्मिड | 0.5 डिग्री |
| ssODN (0.5 प्रत्येक ssODN के ग्राम) | 1.0 $g |
| लिपिड संक्रमण अभिकर्मक | 3.0 $L |
तालिका 6: ssODN सेल transfection मास्टर मिश्रण.
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Discussion
इस प्रोटोकॉल में, दो ssODN मरम्मत टेम्पलेट्स के साथ CRISPR-CAS9 का उपयोग विशिष्ट विषमयुग्मज या समयुग्मज जीनोम परिवर्तन उत्पन्न करने के लिए मानव pluripotent स्टेम कोशिकाओं में प्रदर्शन किया है. इस विधि के परिणामस्वरूप isogenic सेल लाइनों की सफल पीढ़ी के करीब एक दक्षता के साथ विषमयुग्मज जीनोमिक परिवर्तन व्यक्त 10%. इस प्रोटोकॉल दोनों मानव ESCs और iPSCs विकिरणित MEFs जो सेल छँटाई के बाद कम घनत्व पर कोशिकाओं culturing के बाद सेल विकास और अस्तित्व का समर्थन पर हो के लिए अनुकूलित किया गया है. सेल मौत 10 ng/mL BFGF और Y-27632 डाइहाइड्रोक्लोराइड के साथ कोशिकाओं को बनाए रखने के द्वारा कम से कम किया जा सकता है. यह संभव है कि इस प्रोटोकॉल फीडर मुक्त संस्कृति प्रणालियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, लेकिन आगे अनुकूलन आवश्यक हो सकता है.
ट्रांसफेक्शन दक्षता सेल लाइन से सेल लाइन तक चर हो सकती है, लेकिन डीएनए के 3 डिग्री ग्राम और लिपिड ट्रांसफेक्शन रिएजेंट के 3 डिग्री एल का उपयोग आम तौर पर 0.5-2% ट्रांसफेक्शन दक्षता के बीच का सबसे अच्छा परिणाम दिया। हालांकि, अगर transfection दक्षता कम है, डीएनए और लिपिड अभिकर्मक की राशि का अनुकूलन किया जा सकता है. अन्य transfection अभिकर्मकों भी अन्वेषक द्वारा परीक्षण किया जा सकता है.
अदल पीढ़ी की दक्षता अलग-अलग जीआरएनए के साथ अलग-अलग होगी और जीनोमिक स्थान से प्रभावित हो सकती है। मामलों के विशाल बहुमत के भीतर, अगर चार gRNAs डिजाइन किए हैं, कम से कम एक और कई बार 2 से 3, कुशलता से काम करेंगे. इसके अतिरिक्त, परीक्षण gRNAs से पहले, पीसीआर रणनीति का अनुकूलन एक साफ एकल बैंड डीएनए उत्पाद के साथ indels कल्पना करने के लिए महत्वपूर्ण है. स्क्रीनिंग sSODN आधारित जीनोम संपादन के लिए, यह सबसे अच्छा है एक प्रतिबंध एंजाइम साइट जोड़ने के लिए जब एक मूक उत्परिवर्तन (ओं) शुरू, लेकिन यदि संभव नहीं है, एक प्रतिबंध एंजाइम साइट के विलोपन के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, होमियोलॉजी निर्देशित मरम्मत के लिए सक्रिय रूप से साइकिल कोशिकाओं की आवश्यकता होती है ताकि ट्रांसफेक्शन से पहले संस्कृतियों का सेल घनत्व शुरू किए गए एसएसओडीएन टेम्पलेट का उपयोग करके मरम्मत किए गए क्लोन की आवृत्ति को बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है।
इस प्रोटोकॉल की कुछ सीमाएं जीनोम में उस स्थिति से संबंधित हैं जिसे संपादित किया जाएगा। जब कोडिंग क्षेत्रों को संशोधित कर रहे हैं, sSODN चुप उत्परिवर्तनों ले जाने के संपादित साइट फिर से काटने से Cas9 को रोकने और मूक उत्परिवर्तनों प्रोटीन उत्पाद में परिवर्तन नहीं है. हालांकि, इस पद्धति का उपयोग कर नियामक या गैर-कोडिंग क्षेत्रों में संपादन अधिक कठिन हो जाता है क्योंकि मूक उत्परिवर्तन संभव नहीं हैं। आधार संपादित किया जा करने के लिए एक PAM अनुक्रम का हिस्सा है, तो यह सफलतापूर्वक किया जा सकता है, लेकिन केवल समयुग्मज परिवर्तन कुशलता से उत्पन्न किया जा सकता है।
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल उत्पन्न करने के लिए उपयोगी है या दूसरी allele में अवांछित indels के अलावा के बिना विषमयुग्मज कोडिंग उत्परिवर्तनों को सही. इस प्रोटोकॉल मानव PSCs के उपयोग के लिए विकास जीव विज्ञान से आनुवंशिक रोगों के मॉडलिंग के लिए विषयों की एक विस्तृत श्रृंखला का अध्ययन करने की सुविधा होगी. समजनिक रेखाओं का उपयोग भिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के कारण प्रभाव को भ्रमित किए बिना दिए गए कोडन उत्परिवर्तन के कार्यों को परिभाषित करने के लिए महत्वपूर्ण है।
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Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
इस शोध के राष्ट्रीय दिल, फेफड़े, और रक्त संस्थान (NHLBI), अनुदान U01HL099656 (P.G. और D.L.F.) और U01HL134696 (पी.जी. और D.L.F.) के माध्यम से स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों से धन द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| 6-well polystyrene tissue culture dishes | Corning | 353046 | |
| AflII restriction endonuclease | New England Biolabs | R0520 | |
| Agarose | VWR | N605 | |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 11320033 | |
| dNTPs | Roche | 11969064001 | |
| Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus | |||
| Gel extraction kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Gibson Assembly Kit | New England Biolabs | E2611 | |
| gRNA_Cloning Vector | Addgene | 41824 | |
| LB agar plates containing 50 μg/ml kanamycin | |||
| Lipofectamine Stem Reagent | ThermoFisher | (STEM00001) | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
| Murine embryonic fibroblasts (MEFs) | |||
| Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Orbital shaking incubator | |||
| pCas9_GFP vector | Addgene | 44719 | |
| PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2900 | |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5× Phusion buffer | New England Biolabs | M0530 | |
| PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K210011 | |
| Proteinase K | Qiagen | Qiagen 19133 | |
| StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells | Takara | 636763 | |
| SOC medium | New England Biolabs | B9020S | |
| TrypLE Express Enzyme | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi) | Tocris | 1254 |
References
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