Summary
Ce protocole fournit une méthode pour faciliter la génération de changements définis de nucléotide hétérozygote ou homozygote à l'aide de CRISPR-CAS9 dans les cellules souches pluripotentes humaines.
Abstract
Les cellules souches pluripotentes humaines offrent un système puissant pour étudier la fonction génique et modéliser des mutations spécifiques pertinentes à la maladie. La génération de modifications génétiques hétérozygotes précises est difficile en raison de la formation d'indéléves médiées par CRISPR-CAS9 dans le deuxième allèle. Ici, nous démontrons un protocole pour aider à surmonter cette difficulté en utilisant deux modèles de réparation dans lesquels un seul exprime le changement de séquence souhaité, tandis que les deux modèles contiennent des mutations silencieuses pour empêcher la re-coupe et la formation d'indel. Cette méthodologie est plus avantageuse pour l'édition de gènes codant les régions de l'ADN pour générer le contrôle isogénique et les lignées de cellules souches humaines mutantes pour étudier la maladie humaine et la biologie. En outre, l'optimisation des méthodologies de transfection et de dépistage a été réalisée pour réduire le travail et le coût d'une expérience d'édition de gènes. Dans l'ensemble, ce protocole est largement applicable à de nombreux projets d'édition du génome utilisant le modèle de cellules souches pluripotentes humaines.
Introduction
Les cellules souches embryonnaires humaines (HESC) et les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) sont des outils précieux pour modéliser les maladies humaines en raison de leur capacité de renouvellement, tout en maintenant la capacité de générer des types cellulaires de lignées différentes1,2 ,3,4. Ces modèles ouvrent la possibilité d'interroger la fonction génique, et de comprendre comment des mutations spécifiques et des phénotypes sont liés à diverses maladies5,6. Cependant, pour comprendre comment une altération spécifique est liée à un phénotype particulier, l'utilisation d'un contrôle isogénique jumelé et des lignées cellulaires mutantes est important pour contrôler la variabilité ligne à ligne7,8. Des nucléases effectrices de type activateur de transcription (TALENs) et des nucléases de doigts de zinc ont été utilisées pour générer des mutations d'insertion ou de suppression (indels) dans divers modèles génétiques, y compris les cellules primaires; mais ces nucléases peuvent être encombrantes à utiliser et coûteux9,10,11,12,13,14. La découverte de la nucléase palindromic (CRISPR)-CAS9, régulièrement en chevêp, a révolutionné le domaine en raison de l'efficacité de la formation d'indélétaux dans pratiquement n'importe quelle région du génome, de la simplicité d'utilisation et de la réduction du coût15 , 16 Annonces , 17 Annonces , 18 ans, états-unis qui , 19.
Un défi dans l'utilisation de la technologie d'édition du génome basée sur CRISPR-CAS9 a été la génération ou la correction de mutations spécifiques dans un allèle sans créer une mutation indel dans le deuxième allèle20. L'objectif principal de ce protocole est de surmonter ce défi en utilisant deux modèles de réparation d'oligonucléotide à brin unique (ssODN) pour réduire la formation d'indel dans le deuxième allèle. Les deux ssODN sont conçus pour contenir des mutations silencieuses pour empêcher le re-découpage par la nucléase CAS9, mais un seul contient la modification de l'intérêt. Cette méthode augmente l'efficacité de générer une modification génétique hétérozygote spécifique sans induire la formation d'indélétaux dans le deuxième allèle. À l'aide de ce protocole, des expériences d'édition de gènes dans six endroits génomiques indépendants démontrent l'introduction précise du changement génomique souhaité dans un allèle sans indel dans le deuxième allèle et se produit avec une efficacité globale de 10 %. Le protocole décrit a été adapté de Maguire et coll.21.
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Protocol
1. Conception et construction de l'ARN de guide (gRNA)
REMARQUE: Chaque gRNA est composé de deux 60 paires de base (bp) oligonucléotides qui sont annealed pour générer un 100 bp double échoué (ds) oligonucléotide (Figure 1A-C). Le délai pour la conception, la génération et l'efficacité de coupe de test de gRNA est d'environ 2 semaines (figure 2).
- Sélectionnez la région d'adn d'intérêt à modifier le génome et identifiez 3-4 23 bp séquences qui correspondent au format, 5'-G(N19)NGG-3'. Ces séquences devraient être situées à moins de 20 pb de la région d'intérêt.
REMARQUE : Le ciblage peut être effectué sur le brin de sens ou d'anti-sens. - Évaluer les séquences de gRNA pour la redondance génomique et la probabilité hors cible à l'aide d'une ressource comme CRISPOR (http://crispor.tefor.net).
- Incorporez la séquence cible de 20 pb (à l'exclusion du motif adjacent protospacer ou PAM) dans deux oligonucléotides de 60 mers comme indiqué (les séquences sont de 5' à 3' et les rouges et verts sont des compléments inverses comme indiqué dans la figure 1C).
- Commandez les deux oligonucléotides de 60 pb auprès du vendeur de choix. Une fois que les oligonucléotides sont reçus, resuspendre chacun à une concentration finale de 100 M en ddH2O. Faire un stock de travail de 10 'M.
- Anneal les deux oligonucléotides et de générer un fragment de 100 bp d'ADN à l'aide de polymérase d'ADN (Tableau des matériaux). Combiner 5 'L'oligonucléotide avant de 10 'M et 5 'L'oligonucléotide inverse de 10 'M dans un tube à bande de réaction en chaîne de polymérase (PCR) et incuber à 95 oC pendant 5 min. Refroidir la réaction pendant 10 min à température ambiante (RT).
- Configurez le PCR tel que décrit dans le tableau 1. Effectuer l'amplification du PCR dans un cycleur thermique en utilisant les paramètres décrits dans le tableau 2.
- Visualisez les produits PCR sur un bromure d'éhidium de 1,5 % (w/v) ethidium (EtBr) gel d'agarose électrophoré à 80-100 V pendant 40 min. Accise la bande de 100 pb (Figure 3A), visualisée sur une boîte lumineuse LED, à partir du gel à l'aide d'une lame de rasoir et purifie à l'aide d'un gel kitd'extraction( Tableau des Matériaux ).
2. Conception des amorces de PCR pour le criblage
- Effectuer le dépistage de l'ADN modifié à l'aide d'amorces PCR avant et inversées qui sont spécifiquement conçues pour amplifier une région de 400-500 pb du gène d'intérêt (tableau 2). Utilisez l'ADN isolé de toute ligne iPSC de contrôle pour confirmer un amplicon propre lors de l'exécution du PCR de criblage.
- Visualisez les produits PCR sur un gel de 1,5 % (w/v) après électrophoresis à 80-100 V pour 1 h.
REMARQUE : Le séquençage des clones modifiés est effectué à l'aide d'une amorce nichée qui est conçue après confirmation de l'ensemble d'amorces de criblage. Les échantillons sont envoyés à une source commerciale pour le séquençage.
3. Préparation du plasmide vectoriel gRNA-cloning
- Pour linéariser le vecteur de clonage, prenez un tube centrifugeur de 1,5 ml et ajoutez 1 à 5 g d'ADN du vecteur de clonage gRNA avec 4 l de l'enzymede restriction Afl II et 1,5 l d'enzyme de restriction AflII. Apportez la réaction à 24 'L de ddH2O. Mélanger la réaction en pipetting de haut en bas. Incuber à 37 oC pendant la nuit (O/N).
- Electrophorese sur un gel agarose de 1% à 80-100 V pour 1 h et bandes d'accise (la taille prévue de la bande est de 3519 pb).
- Extraire et purifier comme dans l'étape 1.6.
4. Assemblage du vecteur gRNA
- Configurez les réactions et assemblez des fragments d'ADN à l'aide du kit d'assemblage (Tableau des matériaux) à 1:5 ratios de vecteur de clonage digéré aflII à 100 bp gel purifié insert, tel que décrit dans le tableau 3.
- Incuber la réaction à 50 oC pendant 15 min. Diluer la réaction 1:3 en ddH2O et utiliser 3 l pour la transformation bactérienne, selon les instructions du fabricant (Tableau des matériaux). Cellules de plaque sur des plaques de kanamycine LB/agar.
- Choisissez 3-5 colonies par gRNA. Inoculer chaque colonie dans 4 ml de LB et faire pousser O/N à 37 oC dans un incubateur orbital.
- Purifez l'ADN plasmide à l'aide d'un kit d'isolement plasmide miniprep, et séquencez chaque gRNA à l'aide des amorces suivantes pour assurer le succès du clonage : Vers l'avant : GTACAAAAAAAGCAGGCTTTAAAGG; Inverse: TGCCAACTTTGTACAAGAAAGCT.
5. Testez l'efficacité de coupe de gRNA
- Plaques hESCs sur les fibroblastes embryonnaires murines irradiés (MEFs) dans une plaque de 6 puits, comme précédemment décrit21. Lorsque les cellules atteignent 70-80% de confluence, préparer le mélange maître de transfection décrit dans le tableau 4.
- Mélanger par pipetting et incuber à RT pendant 15 min. Ajouter les cellules dans le sens goutte à goutte et incuber à 37 oC pendant 48 h (avec un changement de support après 24 h).
- Récolter les cellules pour le tri après 48 h.
- Retirez les MEF enzymatiquement (Table of Materials) avec une incubation de 3 min RT.
- Rincer les cellules 1x avec le milieu hESC (tableau 5) et gratter dans le milieu hESC - 10 M Y-27632 dihydrochlorure ( Tableaudes matériaux).
- Pellet cellules à 300 x g pendant 3 min et resuspendre dans 0,5 mL de milieu hESC - 10 M Y-27632 dihydrochlorure.
- Filtrer dans un tube de 5 ml à l'autre à l'intermédiaire d'un bouchon de 35 m.
- À l'aide du tri des cellules activées par la fluorescence (FACS), porte sur les cellules vivantes et triez les cellules positives de la protéine fluorescente verte (GFP).
- Transférer un maximum de 1,5 x 104 cellules triées directement dans un plat de 10 cm2 recouvert de matrice membranaire de 1:3 sous-sol (Tableau des matériaux) et des MEF irradiés dans le milieu hESC (tableau 5) contenant du dihydrochlorure Y-27632.
- Changer de milieu quotidien à l'aide du milieu hESC (tableau 5) sans dihydrochlorure Y-27632 et cueillir manuellement les clones après 10-15 jours, lorsque les colonies mesurent 1 mm de diamètre.
- À l'aide d'une pipette et d'un microscope P200, gratter soigneusement un seul clone et attirer les cellules dans la pipette.
- Disperser les cellules en tapotage doucement 3-4x dans une plaque de puits 96 dans le milieu établi avec la colonie.
- Distribuer dans des tubes à bande PCR pour le criblage et granuléles les cellules par centrifugation à 10 000 x g pendant 5 min. Choisissez 20 colonies par gRNA.
6. Dépistage des clones
- Isoler l'ADN en couvant des granulés de cellules dans 20 l de tampon de protéase K (tableau 5) (1 h à 55 oC et 10 min à 95 oC) et le vortex vigoureusement. Centrifugeuse à 10 000 x g pendant 5 min et collecte le supernatant.
- Effectuer le criblage PCR (section 2) dans un volume total de 20 L utilisant un mélange principal comprenant des amorces conçues pour amplifier la région d'intérêt et 5 l de la digeste de protéase K. Utilisez l'ADN génomique isolé de la lignée cellulaire qui a été modifiée par gène comme un contrôle.
- Évaluer les changements de taille des produits PCR après 1 h d'électrophoresis à 70-90 V sur un gel agarose de 2,5 % (w/v)(figure 3B,C). Toute différence de taille est indicative du clivage.
7. Modification précise du génome dans les cellules souches pluripotentes à l'aide de l'ADN oligo à brin unique (ssODNs)
- Conception 100 bp ssODNs centré autour de la séquence gRNA la plus efficace déterminée à avoir la meilleure efficacité de coupe.
- Empêcher le re-clivage de l'ODN recombiné en introduisant des mutations silencieuses dans la séquence de gRNA. Une seule mutation silencieuse dans la séquence PAM est suffisante, mais si ce n'est pas possible, 3-4 mutations silencieuses fonctionneront.
REMARQUE : Pour faciliter le criblage des clones ciblés, l'introduction d'un site de restriction dans un rayon de 20 bp de la séquence de gRNA est idéale. - Concevoir un ODN avec le changement de base souhaité (s) pour créer la mutation de l'intérêt et un ODN sans le changement de base.s).
REMARQUE : Ces changements ne devraient pas dépasser 20 pb par rapport au site de coupe CRISPR/CAS9 prévu, car la recombinaison diminue considérablement à de plus grandes distances. - Commandez les deux ssODN du vendeur de choix et suspendez-les dans l'eau pour faire 1 stock de g/L. Stockez les stocks à -20 oC.
8. Configuration de la transfection
- Pour transfect le ssODN et les plasmides CRISPR-CAS9, plaquez la ligne cellulaire cible dans un plat de 6 puits sur des MEF irradiés pour atteindre 70-80% de confluence après une incubation O/N.
- Configurez la réaction de transfection décrite dans le tableau 6. Mélanger la réaction par pipetting et incuber pendant 15 min à RT. Ajouter le mélange de réaction de transfection goutte à goutte aux cellules.
- Après 48 h, préparer les cellules pour le tri cellulaire tel que décrit dans la section 5.3.
- Choisissez les colonies 10 jours après le placage des cellules individuelles à l'aide d'une pipette de 200 l. Transférer 100 l de cellules dans un puits d'une plaque de puits de 24 ou 48 précédemment recouverte de gélatine et de MEF irradiés dans le milieu hESC avec du dihydrochlorure Y-27632. Utiliser les 100 l restants pour l'isolement de l'ADN tel que décrit à la section 6.
9. Vérification des mutations dans les colonies individuelles
- Pour vérifier la réussite de l'intégration du ssODN, prenez 5 L d'ADN isolés de chaque colonie pour effectuer le PCR à l'aide des amorces de criblage conçues à la section 2. Purifier les produits PCR (Table of Materials) et préparer la digestion enzymatique de restriction en utilisant le site enzymatique unique créé dans le ssODN.
REMARQUE : Cette digestion inclut également le tampon d'enzyme de restriction et la concentration recommandée du fabricant de l'enzyme de restriction dans un volume de 40 l. - Mélanger la réaction en pipetilage et incuber à la température recommandée par le fabricant pendant 1-3 h.
- Visualisez les produits PCR digérés sur un gel d'agarose EtBr électrophoresed à 80-100 V pendant 40 min. Si l'intégration réussie du ssODN s'est produite, séquencez des mutations spécifiques à l'aide d'une amorce nicheuse.
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Representative Results
Génération de gARN et dépistage des indels
Chaque gRNA sera cloné dans un vecteur plasmide et exprimé à l'aide du promoteur U6. L'enzyme de restriction AflII est utilisée pour linéariser le plasmide (addgene #41824) et est située après le promoteur U6. La bande de 100 pb générée après l'annexion des deux oligos de 60 pb est clonée dans le vecteur d'expression gRNA à l'aide de l'assemblage de l'ADN. Une fois que les plasmides gRNA sont générés, ils sont transfectés en hESCs ou iPSCs avec un plasmide DEG CRISPS-CAS9 (addgene #44719). Les cellules GFPSontD sont triées au bout de 2 jours pour les enrichir pour les cellules transfectées et plaquées (voir la section 5). Après 10-14 jours, les colonies dérivées d'une seule cellule sont cueillies et utilisées pour isoler l'ADN pour dépister la formation d'indel générée pour chaque gRNA. Une amplification de PCR avec des amorces couvrant le site de gRNA est employée pour visualiser la formation d'indel utilisant un gel d'agarose de 2.5% (w/v) avec EtBr, électrophoresed à 70-90 V pendant 1 h.
Génération de 100 bp ssODN pour introduire des mutations spécifiques
Deux oligos ssODN sont conçus autour de l'ARNc avec la coupe la plus efficace. Chaque gRNA est de 100 pb et contient des mutations silencieuses, de préférence à la séquence PAM, pour éviter de re-couper (Figure 4A). Une mutation silencieuse dans la séquence PAM peut générer un site de restriction unique, ce qui permet de dépister l'intégration réussie dans un ou deux allèles (Figure 4B).
résultats de la recombinaison ssODN
À l'aide de ce protocole, la fréquence des événements de ciblage de six gènes différents utilisant l'approche ssODN est indiquée dans la figure 5. En examinant la modification génomique au site de gRNA dans les deux allèles, des résultats différents ont été attendus comprenant la recombinaison du ssODN de type sauvage (WT), du ssODN mutant et de la formation d'indel. Les clones dans lesquels un seul allèle avait subi la recombinaison, le résultat le plus commun était la formation d'indel dans le deuxième allèle (10-42%). Les clones qui avaient l'intégration des ssODN dans les deux allèles ont mené à trois résultats différents : 1) l'intégration du SsODN de WT dans les deux allèles (0-8%), 2) intégration du ssODN mutant dans les deux allèles (0-25%), et 3) intégration du WT et mutant ssODN WT (8-21%).
Figure 1 : Aperçu de la génération de gRNA. (A) Dans la région d'intérêt, la conception de quatre gRNAs se terminant en GG qui ne sont pas plus de 20 bp à part. (B) Chaque gRNA de 23 bp a une séquence PAM de NGG à la fin 3' (C) Les amorces de 60 pb sont composées d'une séquence de 40 pb complémentaire au plasmide de l'épine dorsale gRNA et de la séquence de 20 pb sans la séquence PAM. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Chronologie du protocole pour la génération de gRNA et le dépistage des clones. La chronologie de la génération de gRNA et des clones de criblage est montrée. Concevoir et clocher les plasmides d'expression de gRNA prend approximativement une semaine. Environ 48 heures après la transfection dans les CSP humains, les cellules GFPSontD sont triées et plaquées pour limiter la dilution. Les colonies doivent être visibles entre 7 et 10 jours et à environ 20 jours, les clones peuvent être cueillis pour le dépistage, l'expansion et la confirmation de la séquence. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : test gRNA pour l'efficacité de la coupe. (A) Pour la construction de gRNA, une bande de 100 pb est excisée à partir d'un gel agarose de 1,5 %. (B) Après la transfection cellulaire, la validation de la coupe de gRNA est visualisée à l'aide d'un gel agarose de 2,5 %. Un produit PCR de 180 pb est utilisé pour vérifier la formation d'indels dans lequel un contrôle non coupé et différents clones sont analysés pour les décalages de bande indicatifs de la formation d'indel. (C) Différents GRNAs peuvent avoir des efficacités de coupe différentes. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Génération et criblage des mutations à l'aide de deux ssODN. (A) Pour éviter la recoupe CRISPR-CAS9 des allèles modifiés, la séquence PAM peut être modifiée à l'aide d'une mutation silencieuse G to A. Cette modification ajoute un site de restriction EcoRI unique qui peut être utilisé pour le dépistage. En plus de cette mutation silencieuse, le ssODN mutant contient le changement de base souhaité. (B) Le dépistage de la recombinaison d'oligonucléotides à l'aide de la digestion enzymatique de restriction EcoRI peut donner lieu à trois résultats possibles : pas de coupe représentée par une bande WT à 650 pb, recombinaison dans un allele représenté par une bande non coupée de 650 pb et deux bandes plus petites ou l'insertion dans les deux alleles représentés par seulement de plus petites bandes. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : efficacité et résultats de l'intégration ssODN. L'efficacité de l'intégration et les résultats de l'approche ssODN ont été déterminés en analysant six gènes différents. Si un seul ssODN intégré, la formation d'indel a été habituellement détectée dans l'autre allèle. Si deux ssODN s'intégraient, trois résultats possibles ont été détectés, comme indiqué. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| réactif | Volume (L) |
| dNTPs (10 mM) | 0.4 |
| Taq polymérase | 0.2 |
| Tampon PCR | 4.0 |
| Oligos Annealed (10 m) | 10.0 |
| ddH2O | 5.4 |
Tableau 1 : gRNA clonant les conditions de PCR.
| Programme PCR | |
| Étape 1 | 98 oC pour 30 s |
| Étape 2 | 98 oC pour 10 s |
| Étape 3 | 55 oC pour 20 s |
| Étape 4 | 72 oC pour 30 s |
| Étape 5 | Répéter les étapes 2 à 4 pour 30 cycles |
| Étape 6 | 72 oC pour 5 min |
| Étape 7 | Tenir à 4 oC |
Tableau 2 : Paramètres de cyclisme PCR.
| réactif | Volume (L) |
| vecteur linéaire de gRNA utilisant L'AflII (c.-à-d. 50 ng/L) | 1.0 |
| 100 pb d'ADN (c.-à-d. 250 ng/L) | 1.0 |
| Master mix 2x | 10.0 |
| ddH2O | q.s. à 20 |
Tableau 3 : conditions de réaction d'assemblage de gRNA.
| réactif | quantité |
| DMEM/F12 | 50,0 l |
| vector pCas9-GFP (addgene plasmide 44719) | 0,5 g |
| plasmide gRNA | 0,5 g |
| réactif de transfection lipidique | 3.0 L |
Tableau 4 : Mélange maître de transfection cellulaire.
| hESC moyen | |
| réactif | Concentration finale |
| DMEM/F12 | |
| Remplacement de sérum Knockout (KDR) | 15% (v/v) |
| Acides aminés non essentiels | 100 m |
| Pyruvate de sodium | 1 mM |
| Glutamine | 2 mM |
| -mercaptoéthanol | 0,1 mm |
| bFGF humain (facteur de croissance de base du fibroblaste) | 10 ng/mL |
| 10x Proteinase K tampon | |
| Tris.HCl pH:7.4 | 50 mM |
| PH de sulfate d'ammonium : 9.3 | 15 mM |
| MgCl2 | 2,5 mm |
| Entre-deux 20 | 0,1 % (v/v) |
| Protéase K | 100 g/mL |
Tableau 5 : Milieu de culture cellulaire et tampon de digestion protéinase K.
| réactif | quantité |
| DMEM/F12 | 50,0 l |
| vector pCas9-GFP (addgene plasmide 44719) | 0,5 g |
| plasmide gRNA | 0,5 g |
| ssODN (0,5 g de chaque ssODN) | 1,0 g |
| réactif de transfection lipidique | 3.0 L |
Tableau 6 : mélange maître de transfection de cellules ssODN.
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Discussion
Dans ce protocole, l'utilisation de CRISPR-CAS9 ainsi que de deux modèles de réparation ssODN pour générer des changements spécifiques du génome hétérozygote ou homozygotes est démontrée dans les cellules souches pluripotentes humaines. Cette méthode a eu comme conséquence la génération réussie des lignées cellulaires isogéniques exprimant des changements génomiques hétérozygotes avec une efficacité proche de 10%. Ce protocole a été optimisé pour les ESC humains et les iPSC cultivés sur des MEF irradiés qui soutiennent la croissance et la survie des cellules après la culture des cellules à faible densité après le tri cellulaire. La mort cellulaire peut être réduite au minimum en maintenant les cellules avec 10 ng/mL bFGF et Y-27632 dihydrochlorure. Il est possible que ce protocole soit adapté aux systèmes de culture sans alimentation, mais une optimisation plus poussée peut être nécessaire.
L'efficacité de la transfection peut être variable d'une ligne cellulaire à l'autre, mais l'utilisation de 3 g d'ADN et de 3 l d'un réactif de transfection lipidique a généralement donné les meilleurs résultats d'une efficacité de transfection comprise entre 0,5 et 2 %. Cependant, si l'efficacité de transfection est plus faible, l'optimisation de la quantité d'ADN et de réactif lipidique peut être effectuée. D'autres réactifs de transfection peuvent également être testés par l'enquêteur.
L'efficacité de la génération d'indel variera selon les gARN et peut être influencée par l'emplacement génomique. Dans la grande majorité des cas, si quatre ARNR sont conçus, au moins une et plusieurs fois 2 à 3, fonctionnera efficacement. De plus, avant de tester les gARN, il est important d'optimiser la stratégie PCR pour visualiser les indels avec un produit d'ADN à bande unique propre. Pour le dépistage ssODN base d'édition du génome, il est préférable d'ajouter un site d'enzymes de restriction lors de l'introduction d'une mutation silencieuse(s), mais si ce n'est pas possible, la suppression d'un site enzymatique de restriction peut également être utilisé. En outre, la réparation dirigée par homologie nécessite des cellules de cycle activement de sorte que la densité cellulaire des cultures avant la transfection est essentielle pour améliorer la fréquence des clones réparés à l'aide du modèle ssODN introduit.
Certaines des limites de ce protocole sont liées à la position dans le génome qui sera éditée. Lorsque les régions de codage sont modifiées, les ssODN porteurs de mutations silencieuses empêchent le Cas9 de recouper le site modifié et les mutations silencieuses ne modifient pas le produit protéique. Cependant, l'édition dans les régions réglementaires ou non codantes utilisant cette méthodologie devient plus difficile car les mutations silencieuses ne sont pas possibles. Si la base à modifier fait partie d'une séquence PAM, cela peut être fait avec succès, mais seuls les changements homozygous peuvent être générés efficacement.
Le protocole décrit ici est utile pour générer ou corriger des mutations de codage hétérozygotes sans l'ajout d'indels involontaires dans le deuxième allèle. Ce protocole facilitera l'utilisation des CSP humains pour étudier un large éventail de sujets allant de la biologie du développement à la modélisation des maladies génétiques. L'utilisation de lignes isogéniques est essentielle pour définir les fonctions d'une mutation codante donnée sans effets de confusion en raison de milieux génétiques différents.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par le National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI), les National Institutes of Health par le biais de subventions U01HL099656 (P.G. et D.L.F.) et U01HL134696 (P.G. et D.L.F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-ml polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap | Corning | 352235 | |
| 6-well polystyrene tissue culture dishes | Corning | 353046 | |
| AflII restriction endonuclease | New England Biolabs | R0520 | |
| Agarose | VWR | N605 | |
| DMEM/F12 medium | ThermoFisher | 11320033 | |
| dNTPs | Roche | 11969064001 | |
| Fluorescence-activated cell sorter (FACS) apparatus | |||
| Gel extraction kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Gibson Assembly Kit | New England Biolabs | E2611 | |
| gRNA_Cloning Vector | Addgene | 41824 | |
| LB agar plates containing 50 μg/ml kanamycin | |||
| Lipofectamine Stem Reagent | ThermoFisher | (STEM00001) | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 354230 | |
| Murine embryonic fibroblasts (MEFs) | |||
| Nucleospin Gel Extraction and PCR Clean-up Kit | Macherey-Nagel | 740609 | |
| Orbital shaking incubator | |||
| pCas9_GFP vector | Addgene | 44719 | |
| PCR strip tubes | USA Scientific | 1402-2900 | |
| Phusion High Fidelity DNA Polymerase and 5× Phusion buffer | New England Biolabs | M0530 | |
| PurelinkTM Quick Plasmid Miniprep Kit | Invitrogen | K210011 | |
| Proteinase K | Qiagen | Qiagen 19133 | |
| StellarTM electrocompetent Escherichia coli cells | Takara | 636763 | |
| SOC medium | New England Biolabs | B9020S | |
| TrypLE Express Enzyme | ThermoFisher | 12605036 | |
| Y-27632 dihydrochloride/ROCK inhibitor (ROCKi) | Tocris | 1254 |
References
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