Generación de cardiomiocitos derivados de HiPSC ventricular y preparaciones celulares de alta calidad para la caracterización del manejo del calcio

Jae Gyun Oh; Jaydev Dave; Changwon Kho; Francesca Stillitano

doi:10.3791/60135

Artículo de método

Generación de cardiomiocitos derivados de HiPSC ventricular y preparaciones celulares de alta calidad para la caracterización del manejo del calcio

DOI:

10.3791/60135

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17 de enero de 2020

Jae Gyun Oh¹ , Jaydev Dave¹ , Changwon Kho¹ , Francesca Stillitano¹

¹Cardiovascular Research Center, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

En este artículo

Resumen

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Aquí describimos y validamos un método para generar consistentemente cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos robustos y caracterizar su función. Estas técnicas pueden ayudar a desarrollar información mecanicista sobre las vías de señalización, proporcionar una plataforma para la detección de drogas a gran escala y modelar de forma fiable las enfermedades cardíacas.

Resumen

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Los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por el hombre (iPSC-CP) proporcionan una valiosa fuente humana para estudiar la ciencia básica de las vías de manejo y señalización del calcio (Ca^2+),así como los ensayos de toxicidad y detección de fármacos de alto rendimiento. En este documento, proporcionamos una descripción detallada de las metodologías utilizadas para generar iPSC-CP de alta calidad que pueden reproducir consistentemente características moleculares y funcionales a través de diferentes líneas celulares. Además, se describe un método para evaluar de forma fiable su caracterización funcional mediante la evaluación de las propiedades de manipulación de Ca^2+. Las condiciones de bajo oxígeno (O_2),la selección de lactato y el tiempo prolongado en el cultivo producen cardiomiocitos ventriculares de alta pureza y alta calidad. Al igual que los cardiomiocitos adultos aislados de ratas (ARCM), los iPSC-CP de 3 meses de edad presentan una mayor amplitud de Ca^2+, una tasa más rápida de retoma de Ca²⁺ (decay-tau) y una respuesta lusitrópica positiva a la estimulación adrenérgica en comparación con el día 30 iPSC-CP. La estrategia es técnicamente simple, rentable y reproducible. Proporciona una plataforma robusta para modelar enfermedades cardíacas y para el cribado de fármacos a gran escala para apuntar a Ca²⁺ manipulando proteínas.

Introducción

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Los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por el hombre (iPSC-CP) son una atractiva plataforma basada en el hombre para modelar una gran variedad de enfermedades cardíacas in vitro¹^,²^,³^,⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸. Además, los iPSC-CP se pueden utilizar para la predicción de las respuestas de los pacientes a fármacos novedosos o existentes, para detectar compuestos de éxito, y desarrollar nuevo....

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Protocolo

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Los experimentos con cardiomiocitos adultos de ratas en este estudio se llevaron a cabo con protocolos aprobados del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Escuela de Medicina de Icahn en Mount Sinai. Los cardiomiocitos adultos de ratas fueron aislados de los corazones de rata Sprague Dawley por el método basado en Langendorff como se describió anteriormente¹⁶.

1. Preparación de medios

Prepare los medios hiPSC.
1. Equilibrar el suplemento y la temperatura basal media-ambiente (RT). Asegúrese de que el suplemento se ha desconscongelado por completo. Mezclar 400 ml del medio basa....

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Resultados

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El protocolo descrito en la Figura 1A generó cardiomiocitos altamente puros que adquieren un fenotipo ventricular/adulto con tiempo en cultivo. Según se evalúa mediante la tinción de inmunofluorescencia para las isoformas de la cadena de luz reguladora de miosina auricular y ventricular 2 (MLC2A y MLC2V, respectivamente), la mayoría de las células generadas por este protocolo fueron MLC2A-positivas en el día 30 después de la inducción de la diferenciación cardíaca, mientras .......

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Discusión

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Los pasos críticos para utilizar iPSC-CM humanos como modelos experimentales son: 1) generar cardiomiocitos (CM) de alta calidad que pueden garantizar el rendimiento consistente y resultados reproducibles; 2) permitir que las células maduren en cultivo durante al menos 90 días para evaluar adecuadamente su fenotipo; 3) realizar estudios electrofisiológicos, por ejemplo, mediciones transitorias de calcio (Ca^2+),para proporcionar una caracterización funcional fisiológicamente relevante de los iPSC-CP humanos. De.......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Esta investigación fue apoyada por la Subvención de Desarrollo Científico de la AHA 17SDG33700093 (F.S.); Premio de Los Becarios Mount Sinai KL2 para el Desarrollo de la Carrera de Investigación Clínica y Traslacional KL2TR001435 (F.S.); NIH R00 HL116645 y AHA 18TPA34170460 (C.K.).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Anti-Actina, α-Anticuerpo del músculo liso, monoclonal	de ratón Sigma Aldrich	A5228
Alexa Fluor 488 cabra anti ratón	Invitrogen	A11001
Alexa Fluor 555 cabra anti conejo	Invitrogen	A21428
B27 Suplemento	Gibco	17504-044
B27(-) insulina Suplemento	Gibco	A18956-01
CHIR-99021	Selleckchem	S2924
DAPI tinción nuclear	ThermoFisher	D1306
DMEM/F12 (1:1) (1X) + L-Glutamina + 15mM Hepes	Gibco	11330-032
Elevador de células de doble extremo, cuchilla plana y J-Hook	Celltreat	229306

Calentador fluídico en línea	Instrumento de célula viva	IL-H-10
Fura-2, AM	Invitrogen	F1221
Matriz con calificación hESC	354277	Matrigel de	Corning
Medios de hPSC	Gibco	A33493-01	StemFlex Medio basal
IWR-1	Sigma Aldrich	I0161
Cámara de adquisición de imágenes de células vivas	Instrumento de células vivas	EC-B25
MLC-2A, anticuerpo monoclonal de ratón	Sistemas sinápticos	311011
Sistema de calcio y contractilidad de miocitos	Ionoptix	ISW-400
Anticuerpo de cadena ligera de miosina 2, policlonal de conejo (MLC2V)	Proteintech	10906-1-AP
Nalgene Unidades de filtro desechables estériles de flujo rápido con membrana	PESThermoFisher	124-0045
PBS con Calcio y Magnesio	Corning	21-030-CV
PBS sin Calcio y Magenio	Corning	21-031-CV
Cubierta de vidrio premium Slips	Lab Scientific	7807
RPMI medio 1640 (-) D-glucosa (1X)	Gibco	11879-020
RPMI medio 1640 (1X)	Gibco	11875-093
L-lactato de sodio	Sigma Aldrich	L7022
StemFlex Suplemento	Gibco	A33492-01
Thiazovivin	Tocris	3845
Tripsina-EDTA (0.25%)	ThermoFisher	25200056
Solución de Tyrode	Boston Bioproducts	BSS-355w	Ajuste el pH a 7.2. Agregue 1.2mM de cloruro de calcio

Falcon Placa de cultivo de tejidos multipocillo, 6 pocillos Corning 353046 Matriz de

Referencias

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Karakikes, I., et al. Correction of human phospholamban R14del mutation associated with cardiomyopathy using targeted nucleases and combination therapy. Nature Communications. 6, 6955(2015).
Moretti, A., et al.

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Cardiomiocitos similares a los ventriculares cardiomiocitos derivados de iPSC condiciones de bajo ox geno selecci n por lactato cuantificaci n por citometr a de flujo tinci n con Fura 2 AM perfusi n con soluci n de Tyrode expresi n de isoformas de MLC2 protocolo de diferenciaci n card aca

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