Este método describe la preparación de muestras a partir de células cultivadas y tejidos animales, extracción y derivación de la coenzima A en las muestras, seguida de cromatografía líquida de alta presión para la purificación y cuantificación de la coenzima A derivada por detección de absorbancia o fluorescencia.
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Artículo de método
Cuantificación de la coenzima A en células y tejidos
En este artículo
Resumen
Resumen
Investigaciones emergentes han revelado que el suministro de coenzima celular A (CoA) puede llegar a ser limitante con un impacto perjudicial en el crecimiento, metabolismo y supervivencia. La medición del CoA celular es un desafío debido a su relativamente baja abundancia y la conversión dinámica de coa libre a tioestés de CoA que, a su vez, participan en numerosas reacciones metabólicas. Se describe un método que navega a través de posibles escollos durante la preparación de la muestra para producir un ensayo con una amplia gama lineal de detección que es adecuado para su uso en muchos laboratorios biomédicos.
Introducción
La coenzima A (CoA) es un cofactor esencial en todos los organismos vivos y se sintetiza a partir del ácido pantoténico, también llamado pantotenato (la sal de ácido pantoténico) o vitamina B5. El CoA es el principal portador intracelular de ácidos orgánicos, incluyendo ácidos de cadena corta como acetato y succinato, ácidos de cadena ramificada como propionato y metilmalnato, ácidos grasos de cadena larga como palmitato y oleato, ácidos grasos de cadena muy larga como ácidos grasos de cadena muy larga como ácidos grasos de cadena muy larga como ácidos grasos de cadena muy larga como ácidos grasos poliinsaturados, y xenobióticos como el ácido valproico. El ácido orgán....
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Protocolo
El procedimiento animal mencionado en este protocolo se realizó de acuerdo con los protocolos 323 y 556 y fue aprobado específicamente por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Hospital de Investigación Infantil de St. Jude.
1. Preparación de soluciones
NOTA: Utilice agua ultrapura para todas las soluciones y cuando se indique en los procedimientos.
- Preparar 1 mM de hidróxido de potasio (KOH) en agua.
- Preparar 0,25 M KOH en agua.
- Preparar 1 M Trizma-HCl en agua y ajustar a pH 8.0.
- Preparar 100 mM monobromobimane (mBBr) en acetonitrilo (Grado Optima). Las ....
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Resultados
Se ha desarrollado un método relativamente rápido y fiable para la detección de CoA total en células y tejidos cultivados mediante la derivación del tiol de CoA a un agente fluorescente utilizando mBBr, y luego purificando el CoA-bimane derivatizado utilizando HPLC de fase inversa. Primero se genera una curva estándar, donde se inyectan individualmente cantidades conocidas y crecientes del estándar CoA-bimane y las áreas bajo los picos de los cromatogramas CoA-bimane se trazan en función de la entrada CoA-bimane
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Discusión
Aquí demostramos un procedimiento fiable, paso a paso para cuantificar el CoA total en células y tejidos animales con una amplia gama de detección lineal que es accesible en muchos laboratorios que tienen un HPLC con un detector de salida de absorbancia o fluorescencia. Alternativamente, la espectrometría de masas es una técnica común para evaluar los tioesters de CoA y CoA, pero no está ampliamente disponible debido al costo de la instrumentación y los conocimientos especializados necesarios para el desarrollo de la met.......
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Divulgaciones
MWF, CS y SJ escribieron el documento, MWF y CS proporcionaron los datos y las cifras, COR diseñó los experimentos y revisó críticamente el manuscrito. SJ y COR son inventores de una solicitud de patente pendiente (PCT/US17/39037) "Pequeños moduladores de moléculas de quinasas pantotenatos" en poder del Hospital de Investigación Infantil DeS.
Agradecimientos
Los autores reconocen la financiación para la investigación patrocinada proporcionada por CoA Therapeutics, Inc., una subsidiaria de BridgeBio LLC, la subvención de los Institutos Nacionales de Salud GM34496, y las Organizaciones Benéficas Asociadas Sirias Libanesas Estadounidenses.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 2-(2-piridil)-etil gel de sílice columna SPE | Millipore-Sigma | 54127-U | |
| coenzima | A Avanti Polar Lipids | 870700 | |
| Gemini C18 3 μ m 100 y Aring; columna de HPLC | Phenomenex | 00F-4439-E0 | |
| monobromobimano | ThermoFisher Scientific | M-1378 | |
| Sonda Omni-Tip disruptor tisular | Omni International | 32750H | |
| Parafilm | Fisher | S37440 | |
| PowerGen 125 rotor motorizado homogeneizador ThermoFisher | Scientific | NC0530997 | |
| Spin-X filtro de tubo centrífugo | CoStar | 8161 | |
| Trizma-HCl | Fisher | T395-1 | |
| Waters 2475 detector de fluorescencia | Waters | 2475 | |
| Waters 2489 detector UV-Vis | Waters | 2489 | |
| Waters E2695 módulo de separaciones | Waters | e2695 |
Referencias
- Abiko, Y. Metabolic Pathways. Greenburg, D. M. 7, Academic Press, Inc. Ch. 7 1-25 (1975).
- Leonardi, R., Zhang, Y. -M., Rock, C. O., Jackowski, S. Coenzyme A: Back in action. Progress in Lipid Research. 44, 125-153 (2005).
- Jackowski, S., Rock, C. O.
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Reimpresiones y permisos
