Imágenes nanoscópicas de secciones de tejido humano a través de la expansión física e isotrópica

Resumen

Las imágenes a nanoescala de muestras de tejido clínico pueden mejorar la comprensión de la patogénesis de la enfermedad. La patología de expansión (ExPath) es una versión de la microscopía de expansión (ExM), modificada por compatibilidad con muestras de tejido sortea estándar, para explorar la configuración a nanoescala de biomoléculas utilizando microscopios limitados de difracción convencional.

Resumen

En la patología moderna, la microscopía óptica desempeña un papel importante en el diagnóstico de enfermedades al revelar estructuras microscópicas de muestras clínicas. Sin embargo, el límite fundamental de difracción física impide el interrogatorio de la anatomía a nanoescala y los cambios patológicos sutiles cuando se utilizan enfoques de imágenes ópticas convencionales. Aquí, describimos un protocolo simple y barato, llamado patología de expansión (ExPath), para imágenes ópticas a nanoescala de tipos comunes de muestras de tejido primario clínico, incluyendo tejido de parafina incrustada fija o fija de formalina (FFPE) Secciones. Este método elude el límite de difracción óptica transformando químicamente las muestras de tejido en híbridos de tejido-hidrogel y expandiéndolas físicamente isotrópicamente a través de múltiples escalas en agua pura. Debido a la expansión, las moléculas previamente irresueltas se separan y por lo tanto se pueden observar utilizando un microscopio óptico convencional.

Introducción

Investigar la organización molecular de los tejidos en un contexto tridimensional (3D) puede proporcionar una nueva comprensión de las funciones biológicas y el desarrollo de la enfermedad. Sin embargo, estos entornos a nanoescala están más allá de las capacidades de resolución de los microscopios limitados de difracción convencionales (200-300 nm), donde la distancia mínima resuelta, d se define por d a/NA. Aquí está la longitud de onda de la luz y NA es la apertura numérica (NA) del sistema de imágenes. Recientemente, la visualización directa de moléculas etiquetadas fluorescentes ha sido posible gracias a las técnicas de imagen de superresolución recientemente desarrolladas^1,2,3, incluyendo el agotamiento de emisiones estimulada (STED), microscopía de localización fotoactivada (PALM), microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM) y microscopía de iluminación estructurada (SIM). Aunque estas técnicas de imagen han revolucionado la comprensión de la función biológica a escala nanométrica, en la práctica, a menudo se basan en equipos costosos y/o especializados y pasos de procesamiento de imágenes, pueden tener un tiempo de adquisición más lento en comparación con imágenes ópticas convencionales, requieren fluoróforos con características específicas (como la capacidad de fotoconmutación y/o alta fotoestabilidad). Además, sigue siendo un desafío realizar imágenes de superresolución 3D en muestras de tejido.

La microscopía de expansión (ExM), introducida por primera vez en 2015⁴, proporciona un medio alternativo de imagen de características a nanoescala (<70 nm) mediante la expansión física de muestras conservadas incrustadas en un hidrogel de polielectrolito hinchable. Aquí, las biomoléculas clave y/o las etiquetas están ancladas in situ a una red de polímeros que se puede expandir isotópicamente después del procesamiento químico. Debido a que la expansión física aumenta la resolución efectiva total, las moléculas de interés se pueden resolver utilizando sistemas de imágenes convencionales con limitación de difracción. Desde la publicación del protocolo original, donde las etiquetas fluorescentes sintetizadas a medida estaban ancladas a la red de polímeros⁴, se han utilizado nuevas estrategias para anclar directamente proteínas (retención de proteínas ExM, o proExM)^{5, 6,7,8,9} y ARN^9,10,11,12 al hidrogel, y aumentar el aumento físico a través de la iteración expansión¹³ o adaptación de la química de gel^8,14,15.

Aquí presentamos una versión adaptada de proExM, llamada patología de expansión (ExPath)^16,que ha sido optimizada para formatos de patología clínica. El protocolo convierte muestras clínicas, incluyendo parafina incrustada en parafina fija de formalina (FFPE), teñidas de hematoxilina y eosina (H&E), y muestras de tejido humano recién congeladas montadas en diapositivas de vidrio, en un estado compatible con ExM. Las proteínas se anclan al hidrogel y se realiza la homogeneización mecánica (Figura 1)¹⁶. Con una expansión lineal de 4 veces de las muestras, las imágenes multicolores de superresolución (70 nm) se pueden obtener utilizando un microscopio confocal convencional con una resolución de sólo 300 nm y también se pueden combinar con otras técnicas de imagen de superresolución.

Protocolo

1. Preparación de reactivos y soluciones de stock

1. Prepare los componentes de la solución gelificante.
   NOTA: Las concentraciones de solución se indican en g/mL (p/v por ciento).
   1. Realice las siguientes soluciones de stock: 38% (p/v) acrilato de sodio (SA), 50% (p/v) acrilamida (AA), 2% (p/v) N,N-metilenbisacrilamida (Bis) y 29,2% (p/v) cloruro de sodio (NaCl). Disolver los compuestos en agua doblemente desionizada (ddH₂O). Utilice los importes de la Tabla 1 como referencia; soluciones preparadas se pueden escalar o reducir en volumen según sea necesario. Por ejemplo, para hacer 10 ml de una solución SA del 38% (w/v), agregue 1,9 g de SA a un cilindro de 10 ml graduado y agregue ddH₂O a un volumen de 5 ml.
   2. Prepare 9,4 ml de solución monómero a una concentración de 1,06x como se muestra en la Tabla 1.
      NOTA: Esto resultará en una concentración de 1x después de la adición del iniciador, acelerador e inhibidor. El stock de monómeros se puede almacenar a 4 oC durante un máximo de 3 meses, o a -20 oC para el almacenamiento a largo plazo.
   3. Preparar las siguientes soluciones de stock por separado en ddH₂O: 0,5% (p/v) del inhibidor 4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidin-1-oxyl (4HT), que inhibe la gelación para permitir la difusión de la solución gelificante en los tejidos, 10% (v/v) de la iniciador tetrametiletilendiamina (TEMED), que acelera la generación radical por persulfato de amonio (APS), y 10% (w/v) APS que inicia el proceso de gelificante.
      NOTA: Las soluciones de stock de 4HT y TEMED se pueden preparar en alícuotas de 1 ml y almacenarse a -20 oC durante al menos 6 meses. APS se ha encontrado para perder eficacia después de almacenamiento a largo plazo y se prepara mejor en pequeñas cantidades (<0.1 mL) inmediatamente antes de gelificar.
2. Preparar tampón de digestión (50 mM Tris pH 8.0, 25 mM EDTA, 0.5% [w/v] tensioactivo no iónico, 0.8 M NaCl) combinando 25 mL de 1 M Tris pH 8 (3.03 g de base Tris en 25 mL de ddH₂O), 25 mL de EDTA (0.5 M pH 8) , 2,25 g de tensioactivo no iónico, y 23,38 g de NaCl. Añadir ddH₂O para un volumen total de 500 mL.
   NOTA: La solución se puede escalar o reducir hacia arriba según sea necesario y almacenarse a 4 oC. La proteinasa K (ProK) se añadirá inmediatamente antes del paso de digestión.
3. Preparar una solución de citrato sódico de 20 ml combinando 2.941 g de citrato sódico tribásico dihidrato con 500 ml de ddH₂O y ajustando el pH a 8,0 a temperatura ambiente (RT). Escale el volumen de stock según sea necesario.
4. Preparar una solución de stock de 6-((acriloyl)amino)ácido hexanoico, éster de succinimidilo (acriloyl-X, SE; AcX), el compuesto de anclaje. Disolver AcX en 500 ml de dimetilsulfóxido anhidro (DMSO) para una concentración final de 10 mg/ml.
   NOTA: La solución se puede almacenar en un entorno desecado a -20 oC en alícuotas de 20 ol.
5. Si no utiliza tampones disponibles comercialmente para inmunostaining, prepare el tampón de bloqueo. Utilice un tampón de bloqueo de 5% (v/v) de suero animal normal y 0,1% (p/v) tensioactivo no iónico en 1 solución salina con fosfato (PBS) y seleccione el suero en función del animal huésped de los anticuerpos secundarios. Por ejemplo, para preparar un tampón de bloqueo de 500 ml para anticuerpos criados en cabra, combine 25 ml de suero de cabra, 0,45 g de tensioactivo no iónico y 1 x PBS a un volumen de 500 ml.

2. Preparación de diapositivas de tejido sórteo y recién preparadas para ExPath

1. Convierta el tejido en un formato compatible con ExPath. Elija uno de los cuatro pasos siguientes (2.1.1-2.1.4) en función de cómo se preparó la muestra: diapositivas FFPE, diapositivas FFPE manchadas o diapositivas de tejido congelado no fijadas o fijas en solución óptima de temperatura de corte (OCT).
   NOTA: Estos se basan en pasos de recuperación estándar para muestras de patología y no son específicos del protocolo ExPath.
   1. Muestras clínicas FFPE
      1. Preparar 30 ml de 95% de etanol, 70% etanol y 50% etanol. Mida 30 ml de xileno, 100% etanol y ddH₂O.
      2. Coloque la diapositiva con la muestra en una cónica de 50 ml utilizando fórceps y agregue 15 ml de xileno. Tapar el tubo y colocarlo horizontalmente en un agitador orbital a aproximadamente 60 rpm e incubar a RT durante 3 minutos para cada solución. Repita con el xileno de 15 ml restante.
      3. Repita el paso 2.1.1.2 con 100% etanol, 95% etanol, 70% etanol, 50% etanol y ddH₂O en lugar de xileno.
   2. Diapositivas permanentes manchadas y montadas
      1. Coloque el portaobjetos en una placa Petri de 100 mm y cubra con xileno. Retire con cuidado el cubreobjetos con una cuchilla de afeitar. Si el cubreobjetos no se retira fácilmente, vuelva a colocar la corredera en el xileno hasta que el cubreobjetos se afloje.
      2. Procesar utilizando los pasos para las muestras FFPE (pasos 2.1.1.1-2.1.1.3).
         NOTA: En el caso de las diapositivas teñidas H&E, las manchas se eliminan durante el proceso de expansión.
   3. Diapositivas de tejido congelado no fijadas en solución de PTU
      1. Fijar el tejido en acetona a -20 oC durante 10 min.
      2. Lave las muestras con 1 solución de PBS 3 veces durante 10 minutos cada una en RT.
   4. Diapositivas de tejido clínico congeladas previamente fijadas
      1. Incubar los portaobjetos durante 2 minutos a RT para derretir la solución OCT.
      2. Lave la muestra con 1 solución de PBS 3 veces durante 5 minutos cada una en RT.
2. Realice un tratamiento térmico para la recuperación de antígenos en todas las muestras después de la conversión del formato.
   1. Agregue una solución de citrato de 20 mM (pH 8 en RT) en un recipiente resistente al calor, como un frasco de tinción deslizante.
      NOTA: Debe haber suficiente solución para cubrir el tejido montado en la corredera (50 ml para un frasco de tinción de diapositiva estándar).
   2. Calentar la solución de citrato a 100 oC en el microondas y colocar el portaobjetos en la solución. Transfiera inmediatamente el recipiente a una cámara de incubación e incubar a 60 oC durante 30 min.
      NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Los toboganes se pueden colocar en platos Petri y cubiertos en 1x PBS y almacenarse a 4 oC.
3. Mancha rinde la muestra utilizando protocolos de tinción estándar de inmunofluorescencia (IF)/inmunohistoquímica (IHC).
   NOTA: Las concentraciones específicas de anticuerpos primarios y secundarios y las duraciones de tinción dependen de las concentraciones sugeridas por el fabricante o de la optimización para el experimento específico.
   1. Utilice una pluma hidrófoba para dibujar un límite alrededor de la sección o secciones de tejido en la diapositiva para minimizar el volumen de solución necesaria para cubrir el tejido. Coloque el portaobjetos en un plato lo suficientemente grande como para ajustarlo. Para un portaobjetos estándar de 3 pulgadas, utilice una placa Petri de 100 mm.
      NOTA: La pluma hidrófoba no interfiere con la polimerización de la muestra ni con el proceso de digestión.
   2. Incubar el tejido con tampón de bloqueo durante 1 h a 37 oC, 2 h a RT o 4 oC durante la noche para reducir la unión inespecífica.
   3. Diluir los anticuerpos primarios a la concentración deseada en la cantidad adecuada de tampón de bloqueo preparado (u otro tampón de tinción preferido). Incubar los tejidos con la solución primaria de anticuerpos durante al menos 3 h a RT o 37 oC, o durante la noche a 4 oC.
      NOTA: Las muestras deben colocarse en un recipiente humidificado (como un plato de Petri con una toallita húmeda) para evitar que el tejido se seque. Típicamente, los anticuerpos se han diluido a 1:100-1:500 en 200-500 l de tampón, dependiendo del tamaño del tejido y el anticuerpo utilizado.
   4. Lave el tejido con tampón de bloqueo preparado (u otro tampón de lavado preferido) 3 veces durante 10 minutos a RT.
   5. Diluir los anticuerpos secundarios (y 300 nM 4o,6-diamidino-2-fenilindolo [DAPI] si se desea), en el tampón de bloqueo preparado (u otro tampón de tinción preferido) a una concentración de aproximadamente 10 g/ml. Incubar el tejido de la solución secundaria de anticuerpos durante al menos 1 h a RT o 37 oC.
      NOTA: El tiempo se puede ajustar dependiendo de los anticuerpos utilizados y el grosor del tejido. Los anticuerpos secundarios que contienen colorantes de cianina (Cy3, Cy5, Alexa 647) no son compatibles con el protocolo ExM cuando se aplica pre-polimerización. Los colorantes sugeridos incluyen Alexa 488 (verde), Alexa 546 (naranja/rojo) y Atto 647N o CF633 (rojo lejano). DAPI debe volver a aplicarse después de la expansión, ya que se lava durante el proceso de expansión.
   6. Lave el tejido con tampón de bloqueo preparado (u otro tampón de lavado preferido) 3 veces durante 10 minutos cada uno en RT.
      NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Los toboganes se pueden colocar en platos Petri y cubiertos en 1x PBS y almacenarse a 4 oC.
   7. Realice imágenes fluorescentes utilizando un microscopio de campo ancho convencional, un microscopio confocal u otro sistema de imágenes de su elección.
      NOTA: Este paso es necesario para determinar la longitud biológica utilizando el factor de expansión comparando imágenes anteriores y posteriores a la expansión. Para facilitar las imágenes posteriores a la expansión, se deben seleccionar regiones de interés fácilmente identificables y se deben recopilar imágenes con un aumento bajo y alto.

3. En situ Polimerización de Especímenes

1. Incubar la muestra en solución de anclaje.
   1. Preparar la solución de anclaje (normalmente 250 l es suficiente para cubrir la sección de tejido) diluyendo la solución de material AcX en 1x PBS a una concentración de 0,03 mg/ml para muestras fijadas con fijadores no aldehídos o 0,1 mg/ml para muestras fijadas con fijadores de aldehído , que tienen menos aminas libres disponibles para reaccionar con AcX.
   2. Coloque el portaobjetos en una placa Petri de 100 mm y pipetee la solución de anclaje sobre el tejido. Incubar durante al menos 3 h a RT o durante la noche a 4oC.
2. Incubar las muestras en solución gelificante.
   1. Preparar al menos 100 veces el exceso de volumen de solución gelificante. Por 200 l, combinar lo siguiente, en orden: 188 l de solución de monómero, 4 l de solución de stock de 0,5% 4HT (1:50 dilución, concentración final: 0,01%), 4 l de solución de stock TEMED al 10% (1:50 de dilución, concentración final 0,2%) y 4 l de solución de stock 10% APS (1:500% de solución de stock DE TEMED (1:50% de solución de stock (1:500% de solución de stock (1:500% dilución, concentración final 0,2%).
      NOTA: La solución gelificante debe hacerse inmediatamente antes de su uso. La solución debe mantenerse a 4 oC y la solución APS debe añadirse en último lugar, para evitar el gelificante prematuro.
   2. Retire el exceso de solución de la sección de tejido y coloque el portaobjetos en una placa Petri de 100 mm. Añadir una solución gelificante fresca y fría a la muestra e incubar la mezcla en el tejido durante 30 min a 4 oC, para permitir la difusión de la solución en el tejido.
3. Construir una cámara en el portaobjetos alrededor de la muestra(Figura 2A) sin alterar la solución gelificante.
   1. Haga espaciadores para la cámara de gelificante cortando delgadamente trozos de vidrio de cubierta usando un cuchillo de diamante.
      NOTA: Para facilitar la toma de imágenes después de la expansión, los espaciadores deben estar cerca de espesor de la muestra de tejido para reducir la cantidad de gel en blanco por encima del tejido. El vidrio número 1.5 se puede utilizar para muestras clínicas estándar (5 a 10 m). Las piezas de vidrio de la cubierta se pueden apilar para muestras más gruesas.
   2. Fije los espaciadores a ambos lados del tejido con gotas de agua (-10 l).
   3. Coloque cuidadosamente una tapa de vidrio de la cubierta sobre la diapositiva, asegurándose de evitar atrapar burbujas de aire sobre el tejido(Figura 2B).
4. Incubar la muestra a 37oC en un ambiente humidificado (como un plato de Petri cerrado con una toallita húmeda) durante 2 h.
   NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. La cámara deslizante se puede almacenar dentro de una placa Petri sellada a 4 oC.

4. Digestión de muestra

1. Retire la tapa de la cámara de gelificante deslizando suavemente una cuchilla de afeitar debajo de la cubierta y levantando lentamente la cubierta de la superficie del gel. Recorte el gel en blanco alrededor del tejido para minimizar el volumen. Corte el gel asimétricamente para realizar un seguimiento de la orientación del gel después de la homogeneización, ya que la muestra se volverá transparente.
   1. Diluir ProK por 1:200 en tampón de digestión (concentración final 4 U/ml) antes de su uso. Preparar suficiente solución para sumergir completamente el gel; un solo pozo de una placa de cultivo de células de plástico de cuatro pocillos requiere al menos 3 ml por pozo.
   2. Incubar la muestra en un recipiente cerrado que contenga el tampón de digestión durante 3 h a 60 oC. Si la muestra no se desprende de la corredera durante la digestión, utilice una cuchilla de afeitar para retirar suavemente la muestra.
      NOTA: La muestra debe estar completamente sumergida en el tampón de digestión para evitar que la muestra se seque y se coloque en un recipiente cubierto (caja de diapositivas pequeña, pozo de plástico, plato Petri, etc.) que se pueda sellar con película.

5. Expansión de muestras e imágenes

1. Utilice un pincel suave para transferir la muestra en 1pbS en un recipiente compatible con el sistema de imágenes deseado y lo suficientemente grande como para acomodar el gel completamente expandido. Asegúrese de que el tejido se coloca con el lado de la muestra hacia abajo si la toma de imágenes en un sistema invertido o hacia arriba si la toma de imágenes en un sistema vertical para minimizar la distancia desde el objetivo de imagen hasta la muestra. Voltear el gel con un pincel suave si es necesario.
   NOTA: La iluminación lateral de un LED se puede utilizar para hacerlos visibles en líquido. Una placa estándar de 6 pocillos puede acomodar muestras que tienen un diámetro pre-expandido inferior a 0,6 cm. Se debe utilizar una placa de pozo inferior de vidrio para tomar imágenes en un sistema invertido.
2. Lave las muestras en 1pbS a RT durante 10 minutos. Si lo desea, vuelva a manchar la muestra con 300 nM DAPI a medida que el proceso de digestión lava la mancha DAPI. Retire PBS y manchar con 300 nM DAPI diluido en 1pbS durante 20 minutos en RT, seguido de un lavado de 10 minutos con 1pbS en RT.
   NOTA: Las muestras pueden ser cubiertas con 1pbS y almacenadas a 4 oC antes de continuar con el siguiente paso.
3. Para ampliar las muestras, reemplace el PBS y lave con un volumen excesivo de ddH₂O (al menos 10 veces el volumen final del gel) 3 x 5 veces durante 10 minutos cada uno, en RT.
   NOTA: Después del^lavado 3 o^4, la expansión del espécimen debe comenzar a meseta. Para el almacenamiento, para prevenir el crecimiento bacteriano, el ddH₂O se puede complementar con 0.002% -0.01% azida sódica (NaN₃). En este caso, el factor de expansión final se reduce de forma reversible en un 10%.
4. Realice imágenes por fluorescencia utilizando un microscopio de campo ancho convencional, un microscopio confocal u otro sistema de imágenes de su elección.
   NOTA: Para evitar que los geles se desvíen, el exceso de líquido se puede eliminar del pozo. Los geles también se pueden inmovilizar con agarosa de fusión baja de 1,5-2%. Preparar agarosa de baja fusión en agua en un recipiente 2 x 4 veces el volumen de la solución. Caliente la solución en un baño de agua de 40oC o en un microondas durante 10 a 20 s para derretir la solución. Pipetear la agarosa derretida alrededor de los bordes del gel. Después de permitir que la agarosa se endurezque a RT o 4 oC, agregue agua a la muestra para evitar la deshidratación.

Resultados

Si el protocolo se ha llevado a cabo con éxito(Figura 1), las muestras aparecerán como un gel plano y transparente después de la homogeneización mecánica(Figura 3A) y pueden expandirse por un factor de 3 a 4,5x en agua(Figura 3B), proporcionando una resolución efectiva de 70 nm dependiendo del factor de expansión final y el sistema de imágenes utilizado^5,

Discusión

Aquí, presentamos el protocolo ExPath^16,una variante de proExM⁵ que se puede aplicar a los tipos más comunes de muestras de biopsia clínica utilizadas en patología, incluyendo FFPE, H&E y muestras congeladas frescas en diapositivas de vidrio. La conversión de formatos, la recuperación de antígenos y la inmunomanchación de las muestras siguen protocolos comúnmente utilizados que no son específicos de ExPath. A diferencia del protocolo proExM original^9,

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
4-hidroxi-TEMPO (4HT)	Sigma Aldrich	Inhibidor	176141
Placa de fondo de vidrio de 6 pocillos (cubreobjetos #1.5)	Cellvis	P06-1.5H-N
Acetona	Fischer Scientifc	A18-500
Acrilamida	Sigma Aldrich	A8887
Acriloil-X, SE (AcX)	Invitrogen	A20770
Agarosa	Fischer Scientifc	BP160-100
Persulfato de amonio (APS)	Sigma Aldrich	A3678	Initiatior
Anticuerpo anti-ACTN4 producido en conejo	Sigma Aldrich	HPA001873
Anticuerpo anti-colágeno IV producido en ratón	Santa Cruz Biotech	sc-59814
Anticuerpo anti-Vimentina producido en pollo	Abcam	ab24525
Bolígrafo hidrofóbico Aqua Hold II	Dispositivo científico	980402
mama Matriz de tejidos para enfermedades comunes	Abcam	ab178113
DAPI (1 mg/mL)	Thermo Scientific	62248	Tinción nuclear
Cuchillo de diamante n.º 88 CM	General Tools	31116
Etanol	Pharmco	111000200
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 0,5 m	VWR	BDH7830-1
FFPE Muestra de riñón	USBiomax	HuFPT072
Pinza
cabra anti-pollo IgY (H+L), altamente adsorbida CF488A	Biotium	20020
IgY anti-pollo para cabras (H+L), altamente adsorbida CF633	Biotium	20121
Cabra anti-Conejo IgG (H+L) Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11010
MAXbind Medio de tinción	Active Motif	15253	Se puede sustituir por el tampón staning no comercial de su elección.
MAXblock Blocking Medium Active	Motif	15252	Se puede sustituir por el tampón de bloqueo no comercial de su elección.
MAXwash Washing Medium Active	Motif	15254	Se puede sustituir por el tampón de lavado no comercial de su elección.
Micro cubierta de vidrio #1 (24 mm x 60 mm)	VWR	48393 106
Micro cubierta de vidrio #1.5 (24 mm x 60 mm)	VWR	48393 251
N,N,N′,N′- Tetrametiletilendiamina (TEMED)	Sigma Aldrich	T9281	Accelerator
N,N′-Metilenebisacecrilamida	Sigma Aldrich	M7279
Suero	de cabra normalJackson Immunoresearch	005-000-121	Para preparar tampón de bloqueo. Dependiente del huésped animal de anticuerpos secundarios.
Nunclon 4 pocillos x 5 mL Plato de cultivo celular MultiDish	Thermo Fisher	167063	Plato de cultivo de plástico multipocillo
Nunclon Plato de cultivo celular de 6 pocillos	Thermo Fisher	140675
Nunc 15 mL  Termo Cónico		Fisher 339651
Nunc 50 mL  Termo cónico	Fisher	339653
Agitador
Pincel
Medidor
Solución salina tamponada de fosfato (PBS), solución 10x	Fischer Scientifc	BP399-1
Placa de Petri de plástico (100 mm)	Fischer Scientifc	FB0875713
Proteinasa K ( Grado de biología molecular)	Thermo Scientific	EO0491
Hoja de afeitar	Fischer Scientifc	12640
Safelock Tubos de microcentrífuga 1,5 mL	Thermo Fisher	3457
Tubos de microcentrífuga Safelock 2,0 mL	Thermo Fisher	3459
Acrilato de sodio	Sigma Aldrich	408220
Cloruro de sodio	Sigma Aldrich	S6191
Citrato de sodio tribásico dihidratado	Sigma Aldrich	C8532-1KG
Tris Base	Fischer Scientifc	BP152-1
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
Aglutinina de germen de trigo marcada con CF640R	Biotium	29026
Xilenos	Sigma Aldrich	214736