Las imágenes a nanoescala de muestras de tejido clínico pueden mejorar la comprensión de la patogénesis de la enfermedad. La patología de expansión (ExPath) es una versión de la microscopía de expansión (ExM), modificada por compatibilidad con muestras de tejido sortea estándar, para explorar la configuración a nanoescala de biomoléculas utilizando microscopios limitados de difracción convencional.
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Artículo de método
Imágenes nanoscópicas de secciones de tejido humano a través de la expansión física e isotrópica
En este artículo
Resumen
Resumen
En la patología moderna, la microscopía óptica desempeña un papel importante en el diagnóstico de enfermedades al revelar estructuras microscópicas de muestras clínicas. Sin embargo, el límite fundamental de difracción física impide el interrogatorio de la anatomía a nanoescala y los cambios patológicos sutiles cuando se utilizan enfoques de imágenes ópticas convencionales. Aquí, describimos un protocolo simple y barato, llamado patología de expansión (ExPath), para imágenes ópticas a nanoescala de tipos comunes de muestras de tejido primario clínico, incluyendo tejido de parafina incrustada fija o fija de formalina (FFPE) Secciones. Este método elude el límite de difracción óptica transformando químicamente las muestras de tejido en híbridos de tejido-hidrogel y expandiéndolas físicamente isotrópicamente a través de múltiples escalas en agua pura. Debido a la expansión, las moléculas previamente irresueltas se separan y por lo tanto se pueden observar utilizando un microscopio óptico convencional.
Introducción
Investigar la organización molecular de los tejidos en un contexto tridimensional (3D) puede proporcionar una nueva comprensión de las funciones biológicas y el desarrollo de la enfermedad. Sin embargo, estos entornos a nanoescala están más allá de las capacidades de resolución de los microscopios limitados de difracción convencionales (200-300 nm), donde la distancia mínima resuelta, d se define por d a/NA. Aquí está la longitud de onda de la luz y NA es la apertura numérica (NA) del sistema de imág....
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Protocolo
1. Preparación de reactivos y soluciones de stock
-
Prepare los componentes de la solución gelificante.
NOTA: Las concentraciones de solución se indican en g/mL (p/v por ciento).- Realice las siguientes soluciones de stock: 38% (p/v) acrilato de sodio (SA), 50% (p/v) acrilamida (AA), 2% (p/v) N,N-metilenbisacrilamida (Bis) y 29,2% (p/v) cloruro de sodio (NaCl). Disolver los compuestos en agua doblemente desionizada (ddH2O). Utilice los importes de la Tabla 1 como referencia; soluciones preparadas se pueden escalar o reducir en volumen según sea necesario. Por ejemplo, para hacer 10 ml de una solución SA d....
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Resultados
Si el protocolo se ha llevado a cabo con éxito(Figura 1), las muestras aparecerán como un gel plano y transparente después de la homogeneización mecánica(Figura 3A) y pueden expandirse por un factor de 3 a 4,5x en agua(Figura 3B), proporcionando una resolución efectiva de 70 nm dependiendo del factor de expansión final y el sistema de imágenes utilizado5,
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Discusión
Aquí, presentamos el protocolo ExPath16,una variante de proExM5 que se puede aplicar a los tipos más comunes de muestras de biopsia clínica utilizadas en patología, incluyendo FFPE, H&E y muestras congeladas frescas en diapositivas de vidrio. La conversión de formatos, la recuperación de antígenos y la inmunomanchación de las muestras siguen protocolos comúnmente utilizados que no son específicos de ExPath. A diferencia del protocolo proExM original9,
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Divulgaciones
YZ y OB son dos de los inventores que han presentado y obtenido protección por patente en un subconjunto de las tecnologías descritas aquí (patentes estadounidenses US20190064037A1, WO2018157074A1 y WO2018157048A1).
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el fondo de start-up de la Facultad de la Universidad Carnegie Mellon (YZ) y el Nuevo Premio Innovador del Director de NIH (DP2 OD025926-01 a YZ).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 4-hidroxi-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | Inhibidor | 176141 |
| Placa de fondo de vidrio de 6 pocillos (cubreobjetos #1.5) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acetona | Fischer Scientifc | A18-500 | |
| Acrilamida | Sigma Aldrich | A8887 | |
| Acriloil-X, SE (AcX) | Invitrogen | A20770 | |
| Agarosa | Fischer Scientifc | BP160-100 | |
| Persulfato de amonio (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| Anticuerpo anti-ACTN4 producido en conejo | Sigma Aldrich | HPA001873 | |
| Anticuerpo anti-colágeno IV producido en ratón | Santa Cruz Biotech | sc-59814 | |
| Anticuerpo anti-Vimentina producido en pollo | Abcam | ab24525 | |
| Bolígrafo hidrofóbico Aqua Hold II | Dispositivo científico | 980402 | |
| mama Matriz de tejidos para enfermedades comunes | Abcam | ab178113 | |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | Tinción nuclear |
| Cuchillo de diamante n.º 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Etanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 0,5 m | VWR | BDH7830-1 | |
| FFPE Muestra de riñón | USBiomax | HuFPT072 | |
| Pinza | |||
| cabra anti-pollo IgY (H+L), altamente adsorbida CF488A | Biotium | 20020 | |
| IgY anti-pollo para cabras (H+L), altamente adsorbida CF633 | Biotium | 20121 | |
| Cabra anti-Conejo IgG (H+L) Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | |
| MAXbind Medio de tinción | Active Motif | 15253 | Se puede sustituir por el tampón staning no comercial de su elección. |
| MAXblock Blocking Medium Active | Motif | 15252 | Se puede sustituir por el tampón de bloqueo no comercial de su elección. |
| MAXwash Washing Medium Active | Motif | 15254 | Se puede sustituir por el tampón de lavado no comercial de su elección. |
| Micro cubierta de vidrio #1 (24 mm x 60 mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cubierta de vidrio #1.5 (24 mm x 60 mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetrametiletilendiamina (TEMED) | Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Metilenebisacecrilamida | Sigma Aldrich | M7279 | |
| Suero | de cabra normalJackson Immunoresearch | 005-000-121 | Para preparar tampón de bloqueo. Dependiente del huésped animal de anticuerpos secundarios. |
| Nunclon 4 pocillos x 5 mL Plato de cultivo celular MultiDish | Thermo Fisher | 167063 | Plato de cultivo de plástico multipocillo |
| Nunclon Plato de cultivo celular de 6 pocillos | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc 15 mL Termo Cónico | Fisher 339651 | ||
| Nunc 50 mL Termo cónico | Fisher | 339653 | |
| Agitador | |||
| Pincel | |||
| Medidor | |||
| Solución salina tamponada de fosfato (PBS), solución 10x | Fischer Scientifc | BP399-1 | |
| Placa de Petri de plástico (100 mm) | Fischer Scientifc | FB0875713 | |
| Proteinasa K ( Grado de biología molecular) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Hoja de afeitar | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Tubos de microcentrífuga 1,5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Tubos de microcentrífuga Safelock 2,0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Acrilato de sodio | Sigma Aldrich | 408220 | |
| Cloruro de sodio | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Citrato de sodio tribásico dihidratado | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Tris Base | Fischer Scientifc | BP152-1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Aglutinina de germen de trigo marcada con CF640R | Biotium | 29026 | |
| Xilenos | Sigma Aldrich | 214736 |
Referencias
- Hell, S. W. Far-Field Optical Nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79 (1), 2.1.1-2.1.25 (2017).
- Schermelleh, L., Heintzmann,....
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Reimpresiones y permisos
