Summary
Описан описано здесь протокол для характеристики модулей биологически синергетических miRNAs и их сборки в короткие трансгены, что позволяет одновременно переэкспрессии для применения генной терапии.
Abstract
Биологическое значение микроРНК (миРНК) в здоровье и болезни в значительной степени зависит от конкретных комбинаций многих одновременно дерегулированных миРНК, а не на действие одной миРНК. Характеристика этих конкретных модулей miRNAs является фундаментальным шагом в максимизации их использования в терапии. Это чрезвычайно актуально, потому что их комбинаторные атрибуты могут быть практически использованы. Описано здесь метод определения конкретной подписи miRNA, относящейся к контролю онкогенных хроматиновых репрессоров при глиобластоме. Подход сначала определяет общую группу miRNAs, которые дерегулированы в опухолях по сравнению с нормальной ткани. Анализ дополнительно уточняется дифференциальными условиями культуры, подчеркивая подгруппу миРНК, которые одновременно выражаются в конкретных клеточных состояниях. Наконец, miRNAs, которые удовлетворяют эти фильтры объединяются в искусственные полицистронные трансгены, которая основана на эшафот естественно существующих генов miRNA кластеров, а затем используется для переэкспрессии этих модулей miRNA в принимающих клеток.
Introduction
miRNAs предлагают непревзойденную возможность для развития широкого подхода генной терапии ко многим заболеваниям1,2,3,включая рак4,5. Это основано на нескольких уникальных особенностей этих биологических молекул, в том числе их небольшой размер6,простой биогенез7, и естественная тенденция к функции в ассоциации8. Многие заболевания характеризуются специфическими шаблонами выражения миРНК, которые часто сходятся на регуляции сложных биологических функций9. Цель этого метода заключается в том, чтобы сначала определить стратегию для выявления групп miRNAs, которые синергетически актуальны для конкретных клеточных функций. Следовательно, в нем обеспечивается стратегия восстановления таких комбинаций miRNA в исследованиях и приложениях ниже по течению.
Этот метод позволяет осуществлять функциональный анализ нескольких миРНК одновременно, используя их одновременное таргетирование большого количества мРНК, тем самым подизнося сложные ландшафты болезней. Этот подход был недавно использован для определения группы из трех miRNAs, что 1) одновременно downregulated в рак мозга и 2) показать сильную модель совместного выражения во время нервной дифференциации, а также в ответ на генотоксический стресс от радиации или Агент алкилирования ДНК. Комбинаторный повторное выражение этого модуля из трех miRNAs метод кластеризации описано ниже приводит к глубокому вмешательству в биологии раковых клеток и может быть легко использован в качестве стратегии генной терапии для доклинических исследований10. Этот протокол может представлять особый интерес для тех, кто участвует в исследованиях miRNA и его трансляционных приложениях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Характеристика функционально связанных miRNAs в Глиобластоме
- Анализ широкого дифференциального выражения miRNA при глиобластоме по сравнению с мозгом
- Во-первых, определить наиболее существенно дерегулированных miRNAs в опухоли. Это может быть достигнуто с помощью по крайней мере трех различных методов:
- Шахта атлас генома рака, найденный в https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga, для секвенирования данных11.
- Выполните анализ микроаррей из свежего оперативного образца12.
- Используйте ранее опубликованные наборы данных13.
ПРИМЕЧАНИЕ: Какой бы метод ни был выбран, выход обеспечивает массовый набор miRNAs, выражение которых статистически коррелирует (прямо или обратно) с биологией опухоли. Эта начальная группа представляет собой пул miRNAs, которые дополнительно анализируются для идентификации подмножества miRNAs, отображающих наиболее строгую функциональную ассоциацию, выполняя более динамичный анализ изменений выражения, как обсутна ниже.
- Во-первых, определить наиболее существенно дерегулированных miRNAs в опухоли. Это может быть достигнуто с помощью по крайней мере трех различных методов:
- Анализ экспрессии miRNA, специфичный для условий
- Индукция клеточной дифференциации:
- Используйте предварительно покрытые поли-D-лизин (PDL) пластиковые блюда в пользу формирования монослойной культуры. Для покрытия посуды растворите PDL в воде при концентрации 100 мкг/мл. Используйте 1 мл раствора на 25 см2 поверхности. Промыть 2x с PBS 6 ч после применения решения PDL.
- Плита человеческих нервных стволовых клеток в равных количествах (100000 клеток / 5 мл) либо в стволовых клетках (нейробазальная среда B27 дополнение 20 нг/мЛ EGF/FGF), астроцитарная дифференциация среды (DMEM - 10% FBS), либо нейронной дифференциации среды (нейробазальная среда B27 добавка, 2 мм ретинойной кислоты)14. Протокол для дифференциации олигодендроцитов требует добавления IGF-1 (200 нг/мл) после удаления EGF/FGF14,15.
- После клеточного покрытия, поместите в инкубатор в течение 1 недели при 37 градусах Цельсия, 5% CO2.
- Извлечение РНК:
- Через 7 дней удалите клетки из инкубатора и удалите среду.
- Вымойте клетки с помощью PBS (5 мл). Затем добавьте 1 мл лизисного реагента (см. Таблица Материалов),чтобы линзировать клетки и соскребать клетки в 1,5 мл микрофуга трубки с помощью клеточного скребок. Держите трубки, содержащие лисидные клетки при комнатной температуре (RT) в течение 5 мин.
- Приступить к полной изоляции РНК в соответствии с инструкциями производителя.
- анализ экспрессии miRNA:
- Количественное дифференциальное выражение конкретных miRNAs определены в шаге 1.1 среди трех моделей дифференциации в режиме реального времени PCR, используя зонды TaqMan и следуя протоколам производителя для обратной транскрипции и pcR усиления ( Рисунок 1).
- Индукция клеточной дифференциации:
- Проверка кластеров miRNA с помощью стрессовых проблем
- Культура G34 глиобластомы стволовых клеток в нейробазальной среде B27 дополнения 20 нг /мЛ EGF / FGF. Начните с 1 х 106 клеток в 5 мл в 25 см2 низкой колбе крепления.
- Начиная с 48 ч после покрытия, добавить удвоение концентрации ДНК алкилятинг агента темозоломид (ТМЗ) каждые 5 дней, а именно:
- Начните с 5 мкм в течение 5 дней. Через 5 дней, удалить среду и заменить свежей среде без темозоломид, чтобы выжившие клетки, чтобы восстановиться. После 48 ч добавьте 10 мкм ТМЗ и инкубинуте еще 5 дней.
- Повторите шаг 1.3.2.1, удваивая концентрацию ТМЗ каждый раз, пока не будет достигнута концентрация не менее 100 мкм и клетки не станут устойчивыми к препарату10.
- В параллельном эксперименте облучают клетки G34 следующим образом:
- Начиная с 48 ч после покрытия 1 х 106 клеток в 5 мл в 25 см2 низкой колбы крепления, облученные клетки с 2 Gy энергии (любой облучение, обеспечивающее фотонные выбросы является приемлемым). Верните клетки в инкубатор и не мешайте. После 48 ч, облучать клетки снова с дополнительными 2 Gy энергии.
- Повторите шаг 1.3.3.1 4x до тех пор, пока не будет введено в общей сложности 10 Ги энергии.
- Верните клетки в инкубатор и дайте им восстановиться в свежей среде, по крайней мере за 5 дней до анализа ниже по течению.
- После индукции сопротивления, лиза клетки с помощью лиза реагента и экстракт общей РНК в соответствии с протоколом производителя.
- Проанализируйте экспрессию конкретных miRNAs, выявленных в разделах 1.1-1.2, описанных в шаге 1.2.1(Рисунок 2).
- Характеристика функциональной конвергенции кластерных миРНК
- Получить прогнозируемый таргеттом каждого miRNAs, определяемый в разделах 1.2-1.3, полученных с помощью инструментов прогнозирования миРНК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно мы прибегаем к TargetScan, так как его алгоритм периодически обновляется16. Дополнительные инструменты прогнозирования miRanda17, miRDB18, и DIANA-miRPath19. Все эти программы являются бесплатными, веб-приложений.- На первой странице Targetscan выберите miRNA, представляющий интерес, из предварительно заселенного меню drop-down. Нажмите кнопку Отправка.
- Скачать полученный список целей в виде электронной таблицы с помощью ссылки таблицы загрузки (Дополнительная диаграмма 1).
- Чтобы уменьшить вероятность ложноположительных прогнозов, включите только цели в столбец сохраненных сайтов в анализы ниже по течению. Кроме того, дальнейшая строгость может быть получена с помощью дополнительных программ прогнозирования miRNA (см. выше) и только включая цели, которые являются общими для всех алгоритмов.
- Классифицировать результирующих targetomes в соответствии с Ген онтологии категорий с помощью ToppGene Suite20 для оценки обогащения путей, которые являются общими для каждого miRNA.
- Вставьте список целей, полученных от шага 1.4.1 в окне "Учебный набор генов", используя символ HGNC в качестве типа входа. Нажмите Отправить Программа предоставит таблицу вывода, показывающую наиболее значимые категории "Go" для введенного списка генов(Дополнительная диаграмма 2).
- Чтобы, наконец, установить вклад каждого miRNA в регулирование общего пути или клеточного процесса (в данном случае, регулирование хроматина), проверьте каждый таргеттом, полученный в шаге 1.4.1 против полного списка генов, участвующих в конкретном клеточном процессе ( т.е. регулирование хроматина), используя функцию диаграммы Венна, представленную на веб-сайте биоинформатики и эволюционной геномики http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта программа позволяет пересечение нескольких групп в то же время(рисунок 3). Конкретные уникальные цели, предоставляемые каждой miRNA затем аннотируются и отбираются для вниз по течению функциональных экспериментов.- На первой странице программы, загрузить или скопировать / вставить список, если целевые мРНК для каждого miRNA или интерес к соответствующим окнам. Назовите каждый список уникальным идентификатором.
- Нажмите Отправить. Программа обеспечит визуальный выход диаграммы Венна с числом генов в каждом секторе, а также полный список мРНК для каждого поднабора и пересечения комбинаций.
- Получить прогнозируемый таргеттом каждого miRNAs, определяемый в разделах 1.2-1.3, полученных с помощью инструментов прогнозирования миРНК.
2. Сборка модулей miRNA в полицистронный трансгенный кластер
-
Приготовление трансгенных эшафотов на основе кластерного локуса miR-17-92
- Получить нуклеотидную последовательность скопления miR-17-92 из браузера генома Ensembl21. Выберите базовую пару 800 фунтов ,основной" последовательности, охватывающей все шесть закодированных шпильки miRNA локуса и по крайней мере 200-нуклеотидных фланговых последовательностей как вверх по течению (5') и вниз по течению (3') основной последовательности.
- Вставьте последовательность выше в любую программу редактирования слов.
- Определите последовательность каждого из шести родных шпильок, извлекая их в miRBase22. Отметьте каждую из этих последовательностей в пределах диапазона ранее идентифицированной последовательности «ядра». Любые последовательности между каждой шпилькой представляют собой последовательности прокладки, которые важны для правильной обработки трансгена.
- Удалите родные последовательности шпильки из "основной" последовательности, за исключением 3-5 нуклеотидов на 5' и 3'концах каждой шпильки, которая будет служить в качестве приемца для новых шпильки.
-
Строительство нового трансгена, кодирующего несколько miRNA выбора
- Получение шпильки последовательности miRNAs предназначен быть overexpressed в трансгене от miRBase. Внимательно обратите внимание на конкретные нуклеотиды, которые являются местами расщепления микропроцессоров.
- Замените удаленные шпильки (шаг 2.1.4) шпильками последовательностей желаемых миРНК, полученных в шаге 2.2.1.
- Добавление желаемых последовательностей ограничений в обоих фланговых областях трансгена, чтобы облегчить подклонирование в векторы доставки выбора. Убедитесь, что выбранные последовательности ограничений не присутствуют в самой последовательности.
- Для отрицательного контроля используйте 20 нуклеотидные последовательности, чтобы заменить естественную 20-нуклеотидную последовательность каждой зрелой миРНК. Создайте эти скремблированные последовательности с помощью онлайн-инструмента, такого как https://genscript.com/tool/create-scrambled-sequence.
-
Проверка двумерной структуры трансгена
- Копировать полную трансгенную последовательность в RNA структуры прогнозирования программы RNAweb Fold23.
- Используя стандартные настройки программы, нажмите Proceed.
- Проанализируйте графический выход, особенно на наличие четко определенных шпильок и наличие двухцепочечных стволовых структур по крайней мере 11 нуклеотидов, приближенных к месту расщепления микропроцессора. Кроме того, посмотрите на отсутствие ветвления точек в шпильке последовательности(Рисунок 4).
3. Получение Трансгенов путем синтеза ДНК
- После проектирования и силико проверки кластера химерных miRNA, получить рабочую последовательность с помощью синтеза ДНК от коммерческих поставщиков24 и приступить к вниз по течению клонирования в векторы и трансгенной доставки. Мы использовали лентивирусные векторы для доставки in vitro10 и адено-ассоциированных вирусов (AAVs) для внутричерепной доставки in vivo25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот метод позволил характеристику модуля из трех miRNAs, которые последовательно downregulated в опухолях головного мозга, которые совместно выражены специально во время дифференциации нейронов (Рисунок 1) и участвует в реакции выживания опухоли после терапии(рисунок 2). Это достигается путем регулирования сложного онкогенного хроматина репрессивного пути. Эта модель совместного выражения предложила сильную синергетической активности между этими тремя miRNAs(рисунок 3). Следовательно, пользуясь небольшим размером и простым биогенезом миРНК, вторая часть этого протокола была использована для разработки трансгена(рисунок 4), который мог бы одновременно резюмировать выражение трех миРНК в клетках глиобластомы, как in vitro, так и in vivo, со значительным вмешательством в биологию опухолей и многообещающей трансляционной применимостью(рисунок 5A,B,C)10. Кроме того, было продемонстрировано, что трансгенный кластер также функционален в модели рака молочной железы(рисунок 5D,E).
Рисунок 1: Характеристика функционального модуля miRNA при глиобластоме. (A) Вулканический участок, представляющий дифференциально выраженные миРНК в образцах глиобластомы человека (n No 516) против нормального мозга (n No 10), полученного от TCGA. В зеленом являются miRNAs с 4-кратной разницей. Красный круг представляет собой 10 наиболее значительно downregulated miRNAs в глиобластоме. (B) Относительная экспрессия 10 miRNAs, выбранных в (A) во время индукции различных путей дифференциации в нервных стволовых клетках, показывая четкое регулирование модулей miR-124, miR-128 и miR-137 во время индукции нейронной дифференциации. Среднее sD от трех биологических репликаток (p slt; 0.05; qp lt; 0.01; qp slt; 0.001; Студенческий t-тест, двуххвостый). Эта цифра была изменена с разрешения от ссылки10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Подтверждение моделей совместного выражения модулей miRNA во время генотоксического стресса. Относительное выражение трех миРНК, определенных на рисунке 1 в нескольких клетках глиобластомы и клеточных линиях (G62-мезенхимальный; MGG4-проневрюл; U251, U87 про-нейронных, и T98G мезенхимально-подобных линий клеток глиобластомы) после индукции устойчивости к темозоломид (ТМЗ, розовые полосы) или ионизирующего излучения (RT, зеленые полосы). Сообщено середины с SD от 2 независимо репликатов. Эта цифра была изменена с разрешения от ссылки10. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Анализ функциональной конвергенции таргетомов совместно выраженных миРНК. Венская диаграмма вывода из биоинформатики и эволюционной геномики веб-сайт, одновременно пересекая целевой помечены miRNAs с mRNAs, составляющих категорию GO интерес (в данном случае, хроматин репрессоры). mRNAs, однозначно ориентированные на одиночные миРНК, были выбраны для дальнейших функциональных исследований ниже по течению. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: 2D-структура сконструированной последовательности miRNA, кодирующей кластер трех miRNAs. Графический выход из программы RNAweb Fold. Обратите внимание на наличие трех четко определенных структур стволовой петли, которые представляют шпильки каждой соответствующей miRNA (miR-124, miR-128, miR-137), кодированных трансгеном. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 5: Доказательства обработки трансгенов и ее ниже по течению биологического эффекта. (A) Относительная количественная оценка экспрессии miRNA после трансдукции опосредованного трансдукции G34 глиобластомы с трансгенным кластером miRNA (кластер 3) или отрицательным контролем (ctrl). Сообщается, средства из трех независимых экспериментов SD. (B) Флуоресценция микроскоп фотографии G34 глиобластомы сфер, выражающих отрицательный контроль трансгена против кластера 3 трансгена. Шкала бар No 100 мкм. (C) In vivo рост внутричерепных человеческих G34 клеток ксенотрансплантатов, выражающих либо контроль или кластер 3 трансгенов. Шкала бар No 1 мм. Эта цифра была воспроизведена с разрешения10. (D) Относительная количественная оценка экспрессии miRNA после трансевтерационной трансдукции клеток mdA-MB-231 рака молочной железы с трансгенным кластером miRNA (кластер 3) или отрицательным контролем (ctrl). (E) Флуоресценция микроскоп изображения MDA-MB-231 рак молочной железы клетки, выражающие отрицательный контроль трансгена против кластера 3 трансгена. Шкала бар 100 мкм. Все эксперименты проводились в триплицятах (пч злт; 0,05; Злт; 0,01; 0,01; Студенческий t-тест, двуххвостый, несколько сравнений). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Дополнительная диаграмма 1: Рабочий процесс TargetScan. (A) Главная страница скриншот, показывающий варианты выбора для поиска miRNA. (B) Представитель результатов поиска для miR-137. Список генов-мишеней находится в левой колонке. Красная коробка обозначает гены с сохраненными сайтами таргетинга (предполагая более высокую достоверность реального таргетинга). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть эту цифру. (Право нажмите, чтобы скачать.)
Дополнительная цифра 2: Рабочий процесс ToppGene Suite. (A) Главная страница скриншот с указанием окна поиска, где список генов, которые будут проанализированы вставляется. (B) Представитель результат поиска для miR-137 таргом, показывая наиболее статистически значимых генов онтологии (GO) категорий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть эту цифру. (Право нажмите, чтобы скачать.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол основан на том, что вместо того, чтобы функционировать в изоляции, miRNAs биологически актуальны, работая в группах, и эти группы транскрипционно определяются конкретными клеточными контекстами26. Для обоснования такого подхода с точки зрения перевода вводится протокол наблюдения, позволяющий воссоздать эту многомиРНК-модель в клетках/тканях. Это возможно, воспользовавшись относительно простым биогенезом miRNAs, при котором распознавание характерной шпильки miRNA микропроцессором необходимо и достаточно для правильной обработки miRNA27. В то же время, это минимальное требование позволяет использовать генетические эшафот естественных скоплений miRNA в качестве основы для выражения желаемых модулей miRNA, которые содержатся в коротких последовательностях ДНК, которые могут быть установлены в любых векторах доставки выбора. Основным требованием этого протокола является поддержание структуры шпильки и достаточной длины компонента ствола, чтобы обеспечить соответствующее расщепление.
Существует два основных критических соображения, касающихся выполнения этого протокола. Первый момент – точное определение оптимальных комбинаций miRNA. Это определяется тщательным анализом не только подписи экспрессии miRNA клеток или тканей по сравнению с элементами управления, но и любых одновременных изменений экспрессии, наблюдаемых в качестве экспериментального манипулирования клетками. После определения набора miRNAs также имеет важное значение для того, чтобы установить, что искусственная модуляция каждого сингулярно не изменяет выражение других.
Второй критический аспект касается построения химерных последовательностей для искусственного повторения этой функциональной кластеризации miRNA. Принципиально важно соблюдать структурные требования оборудования обработки miRNA, которое является наличием достаточно длинной последовательности ствола (измеряя по крайней мере 11 нуклеотидов) у происхождения каждой шпилькиmiRNA 18,а также поддержание оригинала междукать последовательности родного скопления miRNA эшафот. По нашему опыту, выполнение этих двух требований последовательно дало соответствующие РНК складывания(рисунок 4) и привело к успешному многомирнговым экспрессии.
Основным ограничением этого метода является конечное количество miRNAs, которые могут быть сгруппированы вместе в функциональный трансген. Мы успешно спроектировали последовательности, переэкспрессивающие до шести различных miRNAs, но наблюдали некоторое снижение эффективности обработки по мере увеличения количества шпильок. До сих пор была использована генетическая структура кластера miR-17-92, потому что это та, которая кодирует наибольшее количество шпильки (шесть) в самой короткой последовательности ДНК (800 базовых пар)8. Как Есть и другие природные кластеры miRNA, предполагается, что они также могут быть использованы для этой цели28. Наконец, было отмечено, что изменение последовательности интервалов между шпилькой уменьшает их обработку, поэтому существуют некоторые ограничения относительно того, в какой степени родная структура может быть изменена.
Наиболее значительным и выгодным аспектом этого предлагаемого метода является то, что он позволяет проектирование трансгенов, которые способны одновременно переэкспрессировать несколько желаемых miRNAs в основном с использованием в силико подход, ограничивая необходимость утомительно и трудоемкие шаги молекулярного клонирования, как ранее описано29,30,31. Описанный протокол прост в исполнении и не требует специального оборудования или навыков.
Учитывая признанную важность миРНК в молекулярной биологии и их потенциал в терапевтическом применении, этот протокол представляет интерес для большой аудитории исследователей. Ожидается, что такой подход будет способствовать проведению будущих исследований, в которых основное внимание уделяется комбинаторным свойствам милНА, и будет служить простым и надежным инструментом для их осуществления. Что еще более важно, эти кластерные трансгены представляют собой идеальные грузы для переносчиков генной терапии. Доказательства успешной доставки in vivo кластера 3-miRNA уже получены с помощью прямого внутриопухолевого внутричерепного впрыска векторов AAV (неопубликованные данные). Таким образом, предполагается, что этот метод значительно повысит переводческие аспекты исследования miRNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не сообщают о конфликте интересов.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить членов Лаборатории нейроонкологии Харви Кушинга за поддержку и конструктивную критику. Эта работа была поддержана NINDS гранты K12NS80223 и K08NS101091.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% low melting temperature agarose | IBI Scientific | IB70058 | |
| 0.45 µM sterile filter unit | Merck Millipore | SLH033RS | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Eppendorf | 22431081 | |
| 6-Well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Athymic mice (FoxN1 nu/nu) | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| Cell culture flask | Greiner Bio-One | 660175 | |
| Cell Scraper, 16cm | Sarstedt | 83.1832 | |
| Cesium 137 irradiator | JL Sheperd and Associates | Core Facility (Harvard Medical School) | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 439142-4L | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11995040 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline | Gibco | 14190144 | |
| Eosin Y solution | Sigma-Aldrich | E4009 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEK-293 | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1573 | |
| Hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | 1051750500 | |
| Human primary glioma stem-like cells (GBM62) | Provided by Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA) | ||
| Human primary glioma stem-like cells (MGG4) | Provided by Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA) | ||
| Lentiviral vector pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP | System Biosciences | CD511B-1 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Microcentrifuge refrigerated | Eppendorf | model no. 5424 R, cat. no.5404000138 | |
| Mounting medium | Thermo Fisher Scientific | 4112APG | |
| Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 3117-0380PK | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000c | |
| Neural Progenitor cells (NPC) | Provided by Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA) | ||
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Nikon eclipse Ti motorized fluorescent microscope system | Nikon, Japan | 14314 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985088 | |
| PCR tubes | Sigma-Aldrich | CLS6571-960EA | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri-Dishes 94/16 | Greiner Bio-One | 632180 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma- Aldrich | P4707 | |
| Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | AF-100-18B | |
| Retinoic acid | Gibco | 12587-010 | |
| RNA Miniprep Kit | Direct-zol | R2050 | |
| S1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1852196 | |
| Small Animal Image-Guided Micro Irradiator | Xstrahal Life Sciences, UK | Core facility (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA) | |
| Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75000100 | |
| StemPro Accutase | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| StepOne Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376357 | |
| SterilGARD biosafety cabinet | The Baker Company | SG403A-HE | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| T98-G | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1690 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4366596 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4324018 | |
| Temozolomide | Tocris Bioscience | 2706 | |
| Tissue-Tek optimum cutting temperature | Fisher Scientific | NC9636948 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Lysis reagent |
| U251-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-17 | |
| U87-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-14 | |
| ViraPower Lentivector Expression system | Thermo Fisher Scientific | K4970-00 | |
| Water, HPLC grade | Fisher | W54 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 |
References
- Wu, Y. E., Parikshak, N. N., Belgard, T. G., Geschwind, D. H. Genome-wide, integrative analysis implicates miRNA dysregulation in autism spectrum disorder. Nature Neuroscience. 19, 1463-1476 (2016).
- Esteller, M.
- Moradifard, S., Hoseinbeyki, M., Ganji, S. M., Minuchehr, Z. Analysis of miRNA and Gene Expression Profiles in Alzheimer's Disease: A Meta-Analysis Approach. Scientific Reports. 8, 4767 (2018).
- Calin, G. A., et al. Frequent deletions and down-regulation of micro- RNA genes miR15 and miR16 at 13q14 in chronic lymphocytic leukemia. Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America. 99, 15524-15529 (2002).
- Croce, C. M. Causes and consequences of miRNA dysregulation in cancer. Nature Reviews Genetics. 10, 704-714 (2009).
- Ambros, V. miRNAs: tiny regulators with great potential. Cell. 107, 823-826 (2001).
- Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. Regulation of miRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 5-20 (2019).
- He, L., et al. A miRNA polycistron as a potential human oncogene. Nature. 435, 828-833 (2005).
- Santos, M. C., et al. miR-124, −128, and −137 orchestrate neural differentiation by acting on overlapping gene sets containing a highly connected transcription factor network. Stem Cells. 34, 220-232 (2016).
- Bhaskaran, V., et al. The functional synergism of miRNA clustering provides therapeutically relevant epigenetic interference in glioblastoma. Nature Communications. 10 (1), 442 (2019).
- Kim, T. M., Huang, W., Park, R., Park, P. J., Johnson, M. D. A developmental taxonomy of glioblastoma defined and maintained by MiRNAs. Cancer Research. 71 (9), 3387-3399 (2011).
- Dell'Aversana, C., Giorgio, C., Altucci, L. MiRNA Expression Profiling Using Agilent One-Color Microarray. Methods in Molecular Biology. 1509, 169-183 (2017).
- Silber, J., et al. miR-124 and miR-137 inhibit proliferation of glioblastoma multiforme cells and induce differentiation of brain tumor stem cells. BMC Medicine. 6 (14), (2008).
- Hester, M. E., et al. Two factor reprogramming of human neural stem cells into pluripotency. PLoS ONE. 4 (9), e7044 (2009).
- Hsieh, J., et al. IGF-I instructs multipotent adult neural progenitor cells to become oligodendrocytes. Journal of Cell Biology. 164 (1), 111-122 (2004).
- Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. Predicting effective miRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 4, e05005 (2015).
- Betel, D., Wilson, M., Gabow, A., Marks, D. S., Sander, C. The miRNA.org resource: targets and expression. Nucleic Acids Research. 36, D149-D153 (2008).
- Wong, N., Wang, X. miRD(B) an online resource for miRNA target prediction and functional annotations. Nucleic Acids Research. 43 (D1), D146-D152 (2015).
- Vlachos, I. S., et al. DIANA-miRPath v3.0: deciphering miRNA function with experimental support. Nucleic Acids Research. 43 (W1), W460-W466 (2015).
- Chen, J., Bardes, E. E., Aronow, B. J., Jegga, A. G. ToppGene Suite for gene list enrichment analysis and candidate gene prioritization. Nucleic Acids Research. 305, W305-W311 (2009).
- Aken, B. L., et al.
- Kozomara, A., Birgaoanu, M., Griffiths-Jones, S. miRBase: from miRNA sequences to function. Nucleic Acid Research. 47, D155-D162 (2019).
- Lorenz, R., et al.
- Hughes, R. A., Ellington, A. D. Synthetic DNA synthesis and assembly: Putting the synthetic in synthetic biology. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (1), a023812 (2017).
- Crommentuijn, M. H., et al. Intracranial AAV-sTRAIL combined with lanatoside C prolongs survival in an orthotopic xenograft mouse model of invasive glioblastoma. Molecular Oncology. 10 (4), 625-634 (2016).
- Ivey, K. N., Srivastava, D. MiRNAs as regulators of differentiation and cell fate decisions. Cell Stem Cell. 7, 36-41 (2010).
- Han, J., et al. Molecular Basis for the Recognition of Primary miRNAs by the Drosha-DGCR8 Complex. Cell. 125, 887-901 (2006).
- Barroso-del Jesus, A., Lucena-Aguilar, G., Menendez, P. The miR-302-367 cluster as a potential stemness regulator in ESCs. Cell Cycle. 8, 394-398 (2009).
- Liu, Y. P., Haasnoot, J., Brake, O., Berkhout, B., Konstantinova, P. Inhibition of HIV-1 by multiple shRNAs expressed from a single miRNA polycistron. Nucleic Acid Research. 36, 2811-2824 (2008).
- Chen, S. C., Stern, P., Guo, Z., Chen, J. Expression of Multiple Artificial MiRNAs from a Chicken miRNA126-Based Lentiviral Vector. PLoS ONE. 6 (7), e22437 (2011).
- Yang, X., Marcucci, K., Anguela, X., Couto, L. B. Preclinical Evaluation of An Anti-HCV miRNA Cluster for Treatment of HCV Infection. Molecular Therapy. 21, 588-601 (2013).
