Summary
此处描述的是一种将生物协同miRNA模块及其组装成短转基因的模块的特征，允许基因治疗应用同时过度表达。
Abstract
微RNA（miRNA）在健康和疾病中的生物学相关性明显依赖于许多同时解除调节的miRNA的特定组合，而不是单个miRNA的作用。这些特定的miRNA模块的表征是最大化其在治疗中的应用的一个基本步骤。这非常相关，因为它们的组合属性实际上可以加以利用。此处描述的方法定义与胶质细胞瘤中致癌染色质抑制器控制相关的特定 miRNA 签名。该方法首先定义了一般组miRNA，与正常组织相比，在肿瘤中解除调节。分析通过不同的培养条件得到进一步改进，强调在特定细胞状态下同时共同表达的miRNA子组。最后，满足这些滤光片的miRNA被组合成一个人工多cistronic转基因，该基因基于自然存在的miRNA簇基因的脚手架，然后用于将这些miRNA模块过度表达到接收细胞中。
Introduction
miRNA为开发一种广泛的基因治疗方法提供了无可比拟的机会，治疗许多疾病1、2、3，包括癌症4，5。这是基于这些生物分子的几个独特特征，包括其小尺寸6，简单的生物成因7，和自然倾向在关联8中发挥作用。许多疾病的特点是特定的miRNA表达模式，这往往收敛于复杂生物功能的调节9。此方法的目的是首先定义一个策略，以确定与特定细胞功能协同相关的 miRNA 组。因此，它为在下游研究和应用中重新建立这种miRNA组合提供了一个策略。
该方法允许同时对多个miRNA进行功能分析，同时针对大量mRNA，从而概括疾病的复杂景观。这种方法最近被用来定义一组三miRNA，其中1）同时在脑癌中降低调节，2）在神经分化期间表现出强烈的共表达模式，以及对辐射或脱氧核糖核酸烷基化剂。下面描述的聚类方法对三个miRNA模块的这一模块的重新表达，对癌细胞的生物学产生了深刻的干扰，并可以很容易地用作临床前研究的基因治疗策略。该协议可能特别感兴趣的那些参与miRNA研究及其翻译应用。
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Protocol
1. 胶质母细胞瘤中功能相关miRNA的特征
- 胶质细胞瘤与大脑广泛差分miRNA表达的分析
- 首先，确定肿瘤中最显著解除调节的miRNA。这可以通过至少三种不同的方法实现：
- 挖掘癌症基因组图谱，发现https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga，测序数据11。
- 从新鲜操作样本12执行微阵列分析。
- 使用以前发布的数据集13。
注：无论选择哪种方法，输出都提供一组大量的miRNA，其表达式在统计上与肿瘤生物学相关（直接或反向）。此初始组构成 miRNA 池，通过执行表达式更改的更动态分析，进一步分析以识别显示最严格功能关联的 miRNA 子集，如下所述。
- 首先，确定肿瘤中最显著解除调节的miRNA。这可以通过至少三种不同的方法实现：
- 条件特异性 miRNA 表达分析
- 诱导细胞分化：
- 使用预涂层的多 D-莱氨酸 （PDL） 塑料餐具，以利于形成单层培养体。对于盘涂层，以100μg/mL的浓度将PDL溶解在水中。每 25 cm2表面使用 1 mL 溶液。应用 PDL 溶液后，用 PBS 6 h 冲洗 2 次。
- 在干细胞培养基（神经基培养基+ B27补充 = 20 纳克/mL EGF/FGF）、星形分化介质 （DMEM = 10% FBS） 或神经元分化介质（神经基培养基 + B27）中，以等量（100，000个细胞/5 mL）进行平板人类神经干细胞补充， = 2 μM 视黄酸）14.寡核苷酸分化协议要求在EGF/FGF去除14、15之后添加IGF-1（200纳克/mL）。
- 细胞电镀后，在孵化器中置于37°C，5%CO2下孵化器1周。
- RNA提取：
- 7天后，从培养箱中取出细胞并取出培养基。
- 用PBS（5 mL）清洗细胞。然后，加入1 mL的赖舍试剂（见材料表）来赖舍细胞，并使用细胞刮刀将细胞刮入1.5 mL微熔管中。将含有分管的管在室温 （RT） 下保存 5 分钟。
- 按照制造商的说明进行完全RNA分离。
- miRNA表达分析：
- 通过实时PCR，使用TaqMan探头，并遵循制造商的逆转录和PCR扩增协议，在步骤1.1中通过实时PCR量化在步骤1.1中确定的特定miRNA的差分表达（图 1.
- 诱导细胞分化：
- 通过压力特定挑战验证 miRNA 簇
- 培养G34胶质细胞瘤干细胞在神经巴底培养 + B27补充 + 20 纳克/mL EGF/FGF.从 1 x 106细胞在 5 mL 中开始在 25 厘米2低附件烧瓶。
- 电镀后48小时开始，每5天加入双倍浓度的DNA烷基化剂特莫佐洛米德（TMZ），如下所示：
- 从 5 μM 开始，5 天。5天后，取出培养基，用没有特莫佐洛米德的新鲜培养基替换，使存活的细胞得以恢复。48小时后，加入10μM TMZ，再孵育5天。
- 重复步骤1.3.2.1，每次将TMZ浓度加倍，直到达到至少100μM的浓度，细胞对药物10产生抗药性。
- 在并行实验中，辐照 G34 细胞如下：
- 在 25 cm2低附着瓶中电镀 1 x 106个 5 mL 的电池后 48 h 开始，使用 2 Gy 能量的辐照电池（任何提供光子发射的辐照器都是可以接受的）。将细胞返回到孵化器，请勿打扰。48小时后，再次用额外的2Gy能量照射细胞。
- 重复步骤 1.3.3.1 4x，直到总共施用 10 Gy 能量。
- 将细胞返回到孵化器，让细胞在新鲜培养基中恢复至少5天，然后再进行下游分析。
- 诱导电阻后，使用赖舍试剂的赖舍细胞，并根据制造商的协议提取总RNA。
- 分析步骤 1.2.1 中所述第 1.1-1.2 节中标识的特定 miRNA 的表达式（图 2）。
- 聚类miRNA功能收敛的特征
- 获得使用miRNA靶向预测工具获得的第1.2-1.3节中定义的每个miRNA的预测靶点。
注：我们通常求助于TargetScan，因为它的算法会定期更新16。其他预测工具是米兰达17号、miRDB18和DIANA-miRPath19。所有这些程序都是免费的，基于 Web 的应用程序。- 从 Targetscan 的首页，从预先填充的下拉菜单中选择感兴趣的 miRNA。单击"提交"按钮。
- 使用下载表链接（补充图 1）将生成的目标列表作为电子表格下载。
- 为了减少误报预测的可能性，在下游分析中仅包括保留站点列中的目标。此外，通过使用其他 miRNA 预测程序（见上文），并且仅包括所有算法共有的目标，可以获得进一步的严格性。
- 使用 ToppGene Suite20根据基因本体学类别对结果靶点进行分类，以评估每个 miRNA 共有的通路的富集性。
- 在"训练基因集"窗口中粘贴从步骤 1.4.1 获得的目标列表，使用 HGNC 符号作为输入类型。单击"提交>开始"。该程序将提供一个输出表，显示输入的基因列表最重要的"Go"类别（补充图2）。
- 为了最终确定每个miRNA对调节共同通路或细胞过程的贡献（在本例中为染色质调节），对照特定细胞过程所涉及的基因的完整列表检查步骤1.4.1中获得的每个靶位体（即染色质调节），使用生物信息学和进化基因组学网站提供的Venn图功能http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn。
注：此程序允许同时多个组的交集 （图 3）。然后，对每个miRNA提供的特定唯一目标进行说明和选择，用于下游功能实验。- 在程序的首页，上传或复制/粘贴列表，如果目标mRNA的每个miRNA或兴趣在各自的窗口。使用唯一标识符命名每个列表。
- 单击"提交"。该程序将提供一个Venn图的可视化输出，其中包含每个扇区的基因数，以及每个子集和交点组合的mRNA的完整列表。
- 获得使用miRNA靶向预测工具获得的第1.2-1.3节中定义的每个miRNA的预测靶点。
2. 将miRNA模块组装成多晶硅转基因集群
-
基于miR-17-92星团位的转基因支架制备
- 从Ensembl基因组浏览器21获取miR-17-92簇的核苷酸序列。选择 +800 碱基对"核心"序列，包括球位的所有六个编码 miRNA 发夹和至少 200 个核苷酸侧翼序列，包括核心序列的上游 （5'） 和下游 （3'）。
- 将上述序列粘贴到任何单词编辑程序中。
- 通过在 miRBase22中检索六个本机发夹中每个发夹的顺序来定义它们的顺序。在先前标识的"核心"序列的跨度内标记每个序列。每个发夹之间的任何序列都代表间隔序列，这对正确处理转基因非常重要。
- 从"核心"序列中删除本机发夹序列，但每个发夹的 5' 和 3' 端处的 3-5 核苷酸除外，这些核苷酸将作为新发夹的接受者。
-
构建新的转基因编码多个 MIRNA 选择
- 从miRBase获得拟在转基因中过度表达的miRNA发夹序列。仔细注意微处理器裂解的位点的特定核苷酸。
- 将拆下的发夹（步骤 2.1.4）替换为步骤 2.2.1 中获取的所需 miRNA 的发夹序列。
- 在转基因的两侧侧区域添加所需的限制序列，以方便子克隆到所选择的传递载体中。验证所选限制序列在序列本身中不存在。
- 对于负对照，使用20核苷酸炒序列来取代每个成熟miRNA的天然20核苷酸序列。使用在线工具（如https://genscript.com/tool/create-scrambled-sequence）生成这些乱炒序列。
-
验证转基因的二维结构
- 将完整的转基因序列复制到RNA结构预测软件程序RNAweb折叠23。
- 使用标准程序设置，单击"继续"。
- 分析图形输出，特别是对于存在定义明确的发夹和存在至少 11 个接近微处理器裂解位点的双链茎结构。此外，查找发夹序列中是否存在分支点 （图 4）。
3. 通过DNA合成获得转基因
- 在设计并验证嵌合miRNA簇后，利用商业供应商24的DNA合成获得工作序列，然后进行下游克隆，进入载体和转基因传递。我们已使用慢病毒载体进行体外分娩10和腺相关病毒（AAV）在体内颅内分娩25。
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Representative Results
这种方法允许对三个miRNA模块进行表征，这些模块在脑肿瘤中一直向下调节，在神经元分化期间具体表达（图1），并参与后肿瘤生存反应治疗 （图 2）。这是通过调节复杂的致病染色质抑制途径来实现的。这种共表达模式表明这三个miRNA之间有很强的协同活性（图3）。因此，利用miRNA的体积小和简单的生物发生，该协议的第二部分用于设计一个转基因（图4），可以同时重述胶质细胞细胞中三个miRNA的表达，体外和体内，对肿瘤生物学有重大干扰，具有广阔的转化适用性（图5A，B，C）10。此外，还证明转基因组在乳腺癌模型中也起作用（图5D，E）。
图1：胶质细胞瘤中功能miRNA模块的表征。（A）火山图表示人类胶质细胞瘤样本（n = 516）中不同表达的miRNA与从TCGA获得的正常大脑（n = 10）。在绿色是miRNA与大于4倍的差异。红色圆圈表示胶质细胞瘤中10个最显著降低的miRNA。（B）在神经干细胞中不同分化途径诱导期间，在（A）中选择的10个miRNA的相对表达，显示在神经分化诱导期间miR-124、miR-128和miR-137模块的透明调节。均值 = 来自三个生物复制的 SD（\p < 0.05;_p < 0.01;#p < 0.001;\p < 0.0001;学生的t-测试，双尾）。此图已根据引用10的权限进行了修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：确认基因毒性应激期间miRNA模块的共表达模式。图1中定义的三个miRNA在多个胶质细胞瘤细胞和细胞系中的相对表达（G62-间质;MGG4-前神经;U251、U87亲神经样和T98G间质性胶质细胞瘤细胞系）诱导对特莫佐洛米德（TMZ，粉红色棒）或电离辐射（RT，绿色棒）的抗性。报告是从两个独立的复制与SD的手段。此图已根据引用10的权限进行了修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：共表达miRNA目标函数收敛分析。从生物信息学和进化基因组学网站输出的Venn图输出，同时跨越标记miRNA的目标主题，mRNA构成GO类的兴趣（在本例中，染色质抑制器）。选择单 miRNA 唯一针对的 mRNA 进行进一步的下游功能研究。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：编码三个miRNA簇的工程miRNA序列的二维结构。来自 RNAweb 折叠程序的图形输出。请注意，存在三个定义良好的茎环结构，它们表示由转基因编码的每个 miRNA （miR-124、miR-128、miR-137） 的发夹。请点击此处查看此图的较大版本。
图5：转基因加工及其下游生物效应的证据。（A） 在通过益核酸病毒介导的转导后，miRNA表达的相对定量与转基因miRNA簇（簇3）或阴性对照（ctrl）进行转导。报告是指来自三个独立实验的SD. （B） G34胶质细胞瘤球体的荧光显微镜图像，表达负对照转基因与聚3转基因。刻度条 = 100 μm. （C） 颅内人类 G34 细胞异种移植物的体内生长，表达控制或群集 3 转基因。刻度条 = 1 毫米。这个数字已复制许可10。（D） 在通过慢病毒介导的MDA-MB-231乳腺癌细胞转导后，对具有转基因miRNA簇（簇3）或阴性对照（ctrl）的miRNA表达进行相对定量。（E） 表达阴性对照转基因与聚3转基因的MDA-MB-231乳腺癌细胞的荧光显微镜图像。刻度条 = 100 μm。所有实验均以三元数进行（\p < 0.05;\p < 0.01;学生的t-测试，双尾，多重比较）。请点击此处查看此图的较大版本。
补充图1：目标扫描工作流。（A） 主页屏幕截图，显示 miRNA 搜索的选择选项。（B） miR-137 的代表性搜索结果。目标基因列表位于左列中。红盒子表示具有保守靶点的基因（暗示对真实定位的更高的信心）。请点击此处查看此图。（右键单击下载。
补充图2：托普金套件工作流。（A） 主页屏幕截图显示插入要分析的基因列表的搜索框。（B） miR-137靶源的代表性搜索结果，显示最具统计学意义的基因本体（GO）类别。请点击此处查看此图。（右键单击下载。
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Discussion
该协议基于这样一种概念，即miRNA不是孤立地运作，而是通过小组工作在生物学上相关，这些组是由特定的细胞上下文26转录确定的。为了从翻译的角度证明这种方法的合理性，引入了一种后续协议，允许在细胞/组织中重新使用这种多miRNA模式。这是可以利用miRNA相对简单的生物发生，通过微处理器识别特征miRNA发夹是必要的，并足以正确miRNA处理27。同时，这一最低要求允许使用自然产生的miRNA簇的遗传支架作为表达所需miRNA模块的主干，这些模块包含在可安装在任何传递载体的短DNA序列中选择。该协议的主要要求是保持发夹结构和足够的长度的茎组件，以允许适当的裂解。
关于此协议的执行，有两个主要的关键注意事项。第一点是精确确定最佳 miRNA 组合。这是通过仔细分析细胞或组织的miRNA表达特征与对照组相比，而且通过观察细胞被实验操作时观察到的任何同时表达变化来确定的。一旦定义了一组miRNA，确定每个奇异的人工调制不会改变其他单一的表达也是至关重要的。
第二个关键方面涉及构建嵌合序列，以人工重述这种功能miRNA聚类。遵守 miRNA 加工机械的结构要求至关重要，即每个 miRNA 发夹18的来源存在足够长的茎序列（至少测量 11 个核苷酸），以及保持原始原生 miRNA 簇支架的间距序列。根据我们的经验，满足这两个要求一致产生了适当的RNA折叠（图4），并产生了成功的多miRNA表达。
该技术的主要局限性是可以聚集到功能转基因中的有限数量的miRNA。我们已经成功地设计了序列，过度表达多达六个不同的miRNA，但随着发夹数量的增加，处理效率有所下降。到目前为止，miR-17-92簇的遗传结构已被使用，因为它是在最短的DNA序列（+800碱基对）8中编码最多的发夹（6）的一个编码。由于还有其他天然的miRNA簇，预计它们也可以用于这个目的28。最后，观察到，修改发夹之间的间距序列会减少其处理，因此在可以修改本机结构的程度方面存在一些限制。
该方法最重要和最有利的方面是，它允许转基因工程，能够同时过度表达多个期望的miRNA，主要使用在silico方法，限制了繁琐和耗时的分子克隆步骤，如前所述29，30，31。所述协议易于执行，不需要专门的设备或技能。
考虑到miRNA在分子生物学中的重要性及其在治疗应用中的潜力，该协议引起了广大研究人员的兴趣。预计这种方法将鼓励今后的研究侧重于miRNA的组合性质，并将成为执行其简单而可靠的工具。更重要的是，这些聚类转基因是基因治疗载体的理想货物。通过直接注射AAV载体（未公布的数据），已经获得了3-miRNA簇在体内成功分娩的证据。因此，预计该技术将显著促进miRNA研究的转化方面。
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Disclosures
提交人报告没有利益冲突。
Acknowledgments
作者希望感谢哈维库欣神经肿瘤学实验室的成员的支持和建设性的批评。这项工作得到了NINDS授予K12NS80223和K08NS101091给P.P.P.的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.4% low melting temperature agarose | IBI Scientific | IB70058 | |
| 0.45 µM sterile filter unit | Merck Millipore | SLH033RS | |
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Eppendorf | 22431081 | |
| 6-Well plates | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Athymic mice (FoxN1 nu/nu) | Envigo | 069(nu)/070(nu/+) | |
| B-27 Supplement | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| Cell culture flask | Greiner Bio-One | 660175 | |
| Cell Scraper, 16cm | Sarstedt | 83.1832 | |
| Cesium 137 irradiator | JL Sheperd and Associates | Core Facility (Harvard Medical School) | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 439142-4L | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 11995040 | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline | Gibco | 14190144 | |
| Eosin Y solution | Sigma-Aldrich | E4009 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | |
| Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEK-293 | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1573 | |
| Hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | 1051750500 | |
| Human primary glioma stem-like cells (GBM62) | Provided by Dr. E. A. Chiocca (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA) | ||
| Human primary glioma stem-like cells (MGG4) | Provided by Dr. Hiroaki Wakimoto (Massachusetts General Hospital, Boston, MA) | ||
| Lentiviral vector pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP | System Biosciences | CD511B-1 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| Microcentrifuge refrigerated | Eppendorf | model no. 5424 R, cat. no.5404000138 | |
| Mounting medium | Thermo Fisher Scientific | 4112APG | |
| Nalgene High-Speed Polycarbonate Round Bottom Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 3117-0380PK | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | 2000c | |
| Neural Progenitor cells (NPC) | Provided by Dr. Jakub Godlewski (Brigham and Women’s Hospital, Boston, MA) | ||
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Nikon eclipse Ti motorized fluorescent microscope system | Nikon, Japan | 14314 | |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | 31985088 | |
| PCR tubes | Sigma-Aldrich | CLS6571-960EA | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri-Dishes 94/16 | Greiner Bio-One | 632180 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma- Aldrich | P4707 | |
| Recombinant Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| Recombinant Human FGF-basic | PeproTech | AF-100-18B | |
| Retinoic acid | Gibco | 12587-010 | |
| RNA Miniprep Kit | Direct-zol | R2050 | |
| S1000 Thermal Cycler | Bio-Rad | 1852196 | |
| Small Animal Image-Guided Micro Irradiator | Xstrahal Life Sciences, UK | Core facility (Dana-Farber Cancer Institute, Boston, MA) | |
| Sorvall WX+ Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75000100 | |
| StemPro Accutase | Thermo Fisher Scientific | A1110501 | |
| StepOne Real-Time PCR System | Applied Biosystems | 4376357 | |
| SterilGARD biosafety cabinet | The Baker Company | SG403A-HE | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| T98-G | American Type Culture Collecti | ATCC CRL-1690 | |
| TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4366596 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4324018 | |
| Temozolomide | Tocris Bioscience | 2706 | |
| Tissue-Tek optimum cutting temperature | Fisher Scientific | NC9636948 | |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | Lysis reagent |
| U251-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-17 | |
| U87-MG | American Type Culture Collecti | ATCC HTB-14 | |
| ViraPower Lentivector Expression system | Thermo Fisher Scientific | K4970-00 | |
| Water, HPLC grade | Fisher | W54 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 |
References
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