Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Análisis temporal espacial del flujo de campo en la microvasculatura

5.3K vistas

⸱

DOI:

10.3791/60493

⸱

18 de noviembre de 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biocomplexity Institute, Indiana University, 2Department of Intelligent Systems Engineering, Indiana University, 3Department of Physics, Indiana University, 4Scientific Designs, 5Department of Medicine, Indiana University, 6School of Public Health, Indiana University

En este artículo

Resumen

Para cuantificar el flujo microvascular a partir de secuencias de imágenes de flujo capilar de alta velocidad, desarrollamos el software STAFF (Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow). A lo largo del campo de imagen completo y a lo largo del tiempo, STAFF evalúa las velocidades de flujo y genera una secuencia de mapas espaciales codificados por colores para la visualización y la salida tabular para análisis cuantitativos.

Resumen

Los cambios en la velocidad y distribución del flujo sanguíneo son vitales para mantener la perfusión de tejidos y órganos en respuesta a las diferentes necesidades celulares. Además, la aparición de defectos en la microcirculación puede ser un indicador principal en el desarrollo de múltiples patologías. Los avances en la imagen óptica han hecho de la microscopía intravital (IVM) un enfoque práctico, permitiendo la toma de imágenes a nivel celular y subcelular en animales vivos a alta velocidad en el tiempo. Sin embargo, a pesar de la importancia de mantener una perfusión de tejido adecuada, rara vez se documenta la variabilidad espacial y temporal en el flujo capilar. En el enfoque estándar, se elige un pequeño número de segmentos capilares para la toma de imágenes durante un tiempo limitado. Para cuantificar exhaustivamente el flujo capilar de una manera imparcial, desarrollamos el Análisis Temporal Espacial del Flujo Fieldwise (STAFF), una macro para el software de análisis de imágenes de código abierto fiji. Utilizando secuencias de imágenes de alta velocidad de campos completos de flujo sanguíneo dentro de los capilares, STAFF produce imágenes que representan movimiento a lo largo del tiempo llamados kymographs para cada intervalo de tiempo para cada segmento vascular. A partir de los kymographs, STAFF calcula las velocidades a partir de la distancia a la que se mueven los glóbulos rojos a lo largo del tiempo y genera los datos de velocidad como una secuencia de mapas espaciales codificados por colores para la visualización y la salida tabular para análisis cuantitativos. En los hígados de ratón normales, STAFF analiza las diferencias profundas cuantificadas en la velocidad de flujo entre las regiones pericentrales y periportal dentro de los lóbulos. Aún más inesperadas son las diferencias en la velocidad de flujo que se ven entre los sinusoides que están lado a lado y las fluctuaciones que se ven dentro de segmentos vasculares individuales durante segundos. STAFF es una nueva herramienta poderosa capaz de proporcionar nuevos conocimientos al permitir la medición de la compleja dinámica espaciotemporal del flujo capilar.

Introducción

La microvasculatura desempeña un papel crítico en la fisiología, asegurando la perfusión efectiva de los tejidos en condiciones cambiantes. La disfunción microvascular se asocia con innumerables afecciones, incluyendo la morbilidad cardiovascular y mortalidad a largo plazo, el desarrollo de la demencia y la enfermedad tanto del hígado como del riñón y, por lo tanto, es un factor clave de interés en una amplia gama de investigaciones biomédicas1,2,3,4,5. Mientras que se han utilizado múltiples técnicas para evaluar la perfusión tisular, sólo la microscopía intravital permite la recopilación de datos a la resolución temporal y espacial necesaria para caracterizar el flujo sanguíneo a nivel de capilares individuales.

El flujo microvascular se puede visualizar en microscopía de fluorescencia ya sea por el movimiento de microesferas fluorescentes o por el movimiento de glóbulos rojos en el fondo de marcadores fluorescentes impermeant de membrana (por ejemplo, dextran o albúmina con etiqueta fluorescente)6,7. El flujo microvascular se puede fotografiar en capas celulares superficiales utilizando microscopía de campo ancho, o a profundidad mediante microscopía confocal o multifotona. Sin embargo, los caudales capilares son tales que el paso de glóbulos rojos generalmente no se puede capturar a velocidades inferiores a 60 fotogramas/s. Dado que la mayoría de los microscopios confocales y multifotónicos de escaneo láser requieren 1–5 s para escanear un campo de imagen completo, esta velocidad generalmente se puede lograr sólo limitando el campo de visión, a veces a una sola línea de escaneo8. El proceso de limitar las mediciones a segmentos capilares seleccionados (1) tiene el potencial de introducir sesgo de selección y (2) hace imposible capturar la heterogeneidad espacial y temporal en las tasas de flujo sanguíneo capilar. Por el contrario, las imágenes de redes capilares se pueden recoger a velocidades superiores a 100 fps utilizando microscopios digitales de campo ancho equipados con cámaras científicas complementarias complementarias de semiconductores de óxido metálico (sCMOS)9,10. Estos sistemas baratos, comunes en los laboratorios biomédicos típicos, permiten crear imágenes del flujo microvascular a través de redes bidimensionales enteras, esencialmente de forma continua. El problema se convierte entonces en encontrar un enfoque de análisis que sea capaz de extraer datos cuantitativos significativos de los conjuntos de datos de imágenes masivos y complejos generados por la microscopía de vídeo de alta velocidad.

Para permitir el análisis de los datos de flujo de campo completo hemos desarrollado STAFF, un novedoso software de análisis de imágenes que puede medir continuamente el flujo microvascular a través de campos de microscopio completos de series de imágenes recopiladas a alta velocidad11. El enfoque es compatible con una variedad de diferentes sistemas experimentales y modalidades de imagen y el software de análisis de imágenes STAFF se implementa como un conjunto de herramientas macro para la implementación FIJI de ImageJ12. El principio subyacente utilizado aquí para visualizar el flujo microvascular es que, en primer lugar, se debe proporcionar cierto contraste para poder tomar imágenes de los glóbulos rojos dentro de los capilares. En nuestros estudios, el contraste es proporcionado por una sonda fluorescente a granel que es excluida por los glóbulos rojos. La velocidad del flujo se puede cuantificar a partir del desplazamiento de los glóbulos rojos que aparecen como una mancha negativa dentro del plasma etiquetado fluorescentemente en imágenes recogidas a alta velocidad de un animal vivo8. A continuación, utilizamos STAFF para hacer parcelas de distancia a lo largo de cada segmento capilar en múltiples intervalos de tiempo llamados kymographs, luego detectamos las pendientes presentes en loskymographs 13,y a partir de esas pendientes calcular las tasas de flujo microvascular. El enfoque se puede aplicar a las imágenes recogidas desde cualquier lecho capilar al que se pueda acceder para obtener imágenes. Aquí describimos la aplicación de IVM y STAFF a los estudios de flujo sanguíneo en el hígado.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

Todos los experimentos con animales fueron aprobados y llevados a cabo de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Indiana, y se adhirieron a la guía NRC para el cuidado y uso de animales.

1. Preparación quirúrgica para la microscopía intravital

NOTA: Esto no es una cirugía de supervivencia. Una vez iniciada la sección 1 "Preparación quirúrgica para la microscopía intravital", el trabajo no se puede pausar hasta la finalización de la sección 2 "Microscopía intravital".

  1. Aclimatar se 9-10 ratones macho C57BL/6 de una semana de edad, durante al menos 4 días y ayuna durante 16 horas antes de los estudios.
  2. Pesar el animal, sedar con 5% de isoflurano y colocar en una almohadilla de calentamiento para mantener la temperatura corporal. Utilice un caudal de oxígeno de 1–2 L/min y mantenga la sedación con 1-2% de isoflurano. Compruebe los reflejos pellizcando los dedos de los dedos. Controle la temperatura con un termómetro rectal. Controle visualmente la frecuencia cardíaca y la respiración.
  3. Cuando la anestesia es estable, afeitar el área para la colocación de la cánula yugular y el área debajo de la caja torácica para la exposición del hígado.
  4. Para la cánula yugular, haga una incisión ventral izquierda de 1 cm 1-2 cm por debajo de la mandíbula del ratón. Despeja toda la grasa y la fascia que rodea la vena yugular. Ate el extremo anterior de la yugular usando la cuerda de sutura 06 para evitar el sangrado.
    1. Haga un pequeño nick en la vena yugular y deslice la cánula (30 G x 1/2 pulg.), soporte de aguja y tubo de polietileno (0.011 x 0.024 pulgadas2 unido a un adaptador de talón Luer y lleno con 0.9% de salina) en aproximadamente 1 cm, y seguro en el extremo posterior de la yugular usando 0-6 cuerda de sutura.
  5. Utilizando la cánula yugular administrar 70 kDa fluoresceína dextran (a una dosis de 30 mg/kg mediante inyección de 0,1 ml de una solución de 9 mg/ml en solución salina).
  6. Exponga el hígado para obtener imágenes haciendo una incisión de 4-6 cm a través del torso, 1-2 cm por debajo de la mitad de la caja torácica.
  7. Colocar una esponja de gasa húmeda (remojada en 0.9% de salina) 2 x 2 pulgadas2 por debajo del lóbulo hepático lateral izquierdo. Coloque la cinta en la periferia de la ventana de vidrio de un plato con fondo de 40 mm y aplique adhesivo de cianoacrilato en la cinta. Presione la placa de vidrio hacia el hígado y utilizando aplicadores con punta de algodón presione la gasa en el pegamento de la cinta para minimizar el movimiento del tejido para la microscopía.
  8. Mueva al animal a la etapa del microscopio. Agregue una solución estéril del 0,9% en el plato con fondo de cubierta para mantener el hígado húmedo durante toda la sesión de diagnóstico por imágenes. Mantener la temperatura a 36-37 oC a través de almohadillas de calentamiento montadas en el escenario, una almohadilla de calentamiento colocada sobre el animal y un calentador objetivo.

2. Microscopía intravital

  1. Realice una microscopía intravital en un microscopio de epifluorescencia invertido equipado con una cámara de vídeo capaz de capturar imágenes de alta velocidad.
    NOTA: Aquí, se utilizaron una lámpara de arco de xenón, excitación específica de fluoresceína (480–500 nm) y filtros de emisión (507–543 nm), Plan Fluor 20x, objetivo de inmersión en agua N.A. 0.75 y una cámara sCMOS de alta velocidad.
  2. Seleccione el área de interés para el análisis capilar del flujo sanguíneo utilizando una iluminación mínima.
  3. Establezca el tiempo de exposición lo suficientemente corto como para que la cámara pueda adquirir 100 fps. Establezca el nivel de iluminación para visualizar claramente las sombras de los glóbulos rojos y la topología de la vasculatura, evitando al mismo tiempo la fototoxicidad y el fotoblanqueo de la sonda fluorescente.
  4. Recoger imágenes a una velocidad de 100 fps. Establezca la resolución de píxeles de la cámara entre 0,65 y 1,3 m/píxel. Establezca el tamaño de fotograma entre 512 x 512 y 1024 x 1024 píxeles. Establezca la profundidad de bits entre 8 y 16 bits. Utilice la resolución más alta, el tamaño de fotograma y la profundidad de bits que todavía permite la recolección de imágenes de 100 fps en el sistema.
  5. Guarde los archivos de serie temporal como una secuencia de archivos TIF o como formato de cámara/microscopio nativo si Bio-Formats14 en FIJI puede abrir los archivos de formato nativo.
  6. Imagen de varias áreas a lo largo del tiempo. Mantenga el ratón en la etapa del microscopio durante un máximo de 2 h. Euthanize el ratón al final de la toma de imágenes.
    NOTA: La duración de la serie temporal se basará en equilibrar la necesidad de imagen durante un intervalo de tiempo que abarque la variabilidad, sin afectar a la viabilidad del tejido. La duración de la serie temporal también puede estar dictada por consideraciones de tamaño de archivo; una serie temporal de 1 min de imágenes de 1024 x 1024 píxeles de 16 bits recopiladas a 100 fps generará un archivo de 12 GB de tamaño. Las consideraciones de tamaño de archivo también pueden dictar el tamaño de fotograma y la profundidad de bits utilizados. No hay límites de tamaño explícitos dentro de STAFF.

3. Definir la red vascular utilizando TrakEM2 en FIJI

NOTA: El protocolo se puede pausar después de guardar el trabajo en cualquier punto de la sección 3.

  1. Descargue e instale FIJI desde https://imagej.net/Fiji/Downloads.
    NOTA: La versión 1.51n de Fiji se utilizó para este proyecto, y se puede descargar desde https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip. Tenga en cuenta que en Windows, FIJI debe instalarse en el espacio de usuario y no en archivos de programa.
  2. Abra el archivo de película en FIJI utilizando Archivo > Abrir o mediante Archivo > Importar > Secuencia de imágenes. Seleccione una sola imagen de las imágenes estables entre respiraciones donde la topología de la red vascular es fácil de ver. Seleccione Imagen > Duplicar y duplique la imagen única seleccionada (no la pila) y guarde la imagen en una nueva carpeta. No incluya espacios en los nombres de archivo o carpeta.
  3. Configure un nuevo proyecto TrakEM2 en blanco seleccionando Archivo > Nuevo > TrakEM2 (en blanco). Seleccione la nueva carpeta que contiene la imagen única de la película como carpeta del proyecto. Se abrirán las ventanas trakEM2.
  4. Haga clic con el botón derecho en el área de trabajo principal y seleccione Importar > Importar imagen. Navegue a la imagen única guardada en el paso 3.3 y selecciónela.
  5. Vuelva a hacer clic con el botón derecho en el área de trabajo principal y seleccione Visualizar > Cambiar tamaño automático de lienzo/conjunto de capas . Haga clic con el botón izquierdo en la ventana de trabajo principal. La imagen rellenará el área de trabajo.
  6. Para seleccionar las áreas de la imagen que contienen la red vascular, configure la selección de la lista de áreas en TrakEM2. En la ventana más pequeña de TrakEM2 (Plantilla, Objetos de proyecto, Capas) haga clic con el botón derecho en "• cualquier cosa". Seleccione Agregar nuevo hijo > lista de áreas.
  7. En la ventana trakem2 más pequeña, arrastre "Plantilla > cualquier cosa" en "Objetos de proyecto > proyecto". A continuación, arrastre "Plantilla > cualquier cosa > • listade áreas " en "Objetos de proyecto > proyecto > cualquier cosa". En"Objetos de proyecto > proyecto > cualquier cosa", • lista de áreas ahora estará presente.
  8. En la ventana principal de TrakEM2, en la pestaña Espacio Z,se creó una lista de áreas con etiqueta de barra. Haga clic para seleccionarlo. En la ventana principal de TrakEM2 también seleccione la herramienta pincel. Pulse Mayús y enrolle la rueda del ratón para seleccionar un tamaño adecuado para el pincel, por ejemplo, más pequeño que el diámetro de la vasculatura. Para guardar la configuración de TrakEM2 pulse las teclas Control + S.
  9. Pinte la red vascular con la herramienta pincel. Para borrar, mantenga pulsada la tecla Alt mientras utiliza la herramienta pincel. No incluya regiones desenfocadas. Guardar a menudo usando Control + S.
  10. Cuando se complete el etiquetado de la red vascular, haga clic con el botón derecho en la ventana principal de TrakEM2 y seleccione Exportar > Listas de áreas como etiquetas (tif). En la ventana emergente seleccione Escala 100% y Exportar listade áreas . Cierre las ventanas de TrakEM2 y elija yes para Save project.
  11. La imagen de AreaLists se abrirá y puede aparecer como una imagen negra en blanco. En el menú principal de FIJI, seleccione Imagen > Ajustar > Brillo/Contraste. En la ventana B&C pulse el botón automático y AreaList se volverá visible. En el menú principal de FIJI, seleccione Imagen > Tablas de búsqueda > Invertir LUT. Guarde esta imagen de etiquetas negras sobre fondo blanco y cierre la imagen.
  12. Abra el archivo de etiquetas en FIJI. Seleccione Plugins > Esqueleto > Esqueleto. Guarde la imagen esqueletizada como un tif. Utilice el archivo skeleton.tif como uno de los archivos de entrada necesarios para ejecutar el análisis de flujo STAFF. Al guardar el archivo, no utilice espacios en el nombre de archivo.
  13. Edite manualmente el archivo de esqueleto según sea necesario, colocando un hueco (mediante la herramienta de pintura)en el dibujo de línea, por ejemplo, en ubicaciones donde las ramas de la vasculatura no se han capturado porque salen del plano de imagen.

4. Preparar la secuencia de películas para el análisis del personal

  1. Abra el archivo de película en FIJI utilizando Archivo > Abrir o Archivo > Importar > Secuencia de imágenes. Seleccione un período de tiempo de la secuencia de imágenes para el análisis de flujo (puede ser de segundos a minutos, de cientos a decenas de miles de fotogramas) donde la posición del tejido se ha mantenido estable con el tiempo, excepto durante la respiración.
  2. Seleccione Imagen > Duplicar y duplique la parte seleccionada de la secuencia escribiendo los números de los fotogramas inicial y final. Compruebe la calibración espacial y temporal de la imagen en Imagen > Propiedades y corrija si es necesario. Guarde el archivo de imagen como un TIF (o como un AVI sin comprimir). Este archivo movie.tif es necesario como archivo de entrada para ejecutar el análisis STAFF. No incluya espacios en el nombre de archivo.

5. Instale las macros de personal en FIJI

NOTA: (Importante) Varias carpetas dentro de los subdirectorios de carpetas FIJI tienen nombres de archivo similares, algunos en mayúsculas, algunos no. Asegúrese de que las carpetas correctas están seleccionadas al instalar STAFF.

  1. Descargue las macros STAFF desde https://github.com/icbm-iupui/STAFF.
  2. Para instalar, primero abra la carpeta FIJI.
    1. En Windows, busque la carpeta donde FIJI está instalado en el espacio de usuario, más comúnmente en el escritorio. En MacOS busque el icono FIJI en la carpeta Aplicaciones, haga clic con el botón derecho y seleccione Abrir.
  3. En la carpeta FIJI, abra la carpeta plugins. Dentro de la carpeta plugins, abra la carpeta Macros. Copie STAFF.ijm en esta carpeta macros: Fiji, plugins, Macros, STAFF.ijm.
  4. En la carpeta FIJI, abra la carpeta plugins. Copie STAFF_Dir.jar en esta carpeta de plugins: Fiji- plugins STAFF_Dir.jar.
  5. En la carpeta FIJI, abra la carpeta macros. Dentro de esta carpeta de macros, abra la carpeta AutoRun. Copie STAFF_Loader.ijm en esta carpeta de Ejecución automática: Fiji, macros, AutoRun, STAFF_Loader.ijm.
  6. Inicie FIJI y verifique la instalación de macros. Para comprobar la instalación, seleccione Plugins > Macros. Cuando se instala correctamente, el menú desplegable incluirá: Abrir-Crear proyecto, Analizar esqueleto, Editar intervalos de tiempo, Analizar flujo y Producir mapa espacial.
  7. Si estos comandos no están presentes en el menú Macros, seleccione Plugins > Macros > Instalar, abra la carpeta Fiji- plugins -Macros, seleccione el archivo STAFF.ijm y, a continuación, haga clic en el botón Aceptar. Los comandos deberían aparecer ahora en el menú Plugins > Macros.

6. Cuantificación del flujo vascular mediante el personal

  1. Cree un nuevo proyecto.
    1. Seleccione Plugins > Macros > Abrir-Crear proyecto y siga las indicaciones para crear o actualizar un archivo de configuración.
    2. En el menú Abrir-crear proyecto, desplácese hasta el directorio del proyecto, la carpeta de archivos de entrada y los archivos de entrada Movie.tif y Skeleton.tif. Edite los nombres de archivo de salida rellenados automáticamente si es necesario.
    3. Valores de entrada para la longitud del segmento más corto (20 m), la velocidad máxima medida (2.000 m/s) y la velocidad máxima asignada (1.000 m/s).
      NOTA: El producto de la longitud del segmento más corto y los marcos por segundo da la velocidad de flujo máxima que teóricamente se puede medir. Las velocidades de flujo capilar más altas notificadas en la literatura son de alrededor de 2.000 m/s15. En el hígado, observamos que las velocidades de flujo capilar generalmente promediaban alrededor de 300 m/s y rara vez excedían los 1.000 m/s.
    4. Escriba los valores de tamaño de píxel y velocidad de fotogramas de la secuencia de imágenes (a partir de metadatos de imagen o notas experimentales). Estos valores requieren la entrada del usuario. Marque la casilla Corrección de parpadeo si las imágenes tienen parpadeo periódico de intensidad de fondo.
    5. Seleccione los parámetros para la mejor visualización de los datos. Seleccione la velocidad máxima asignada para incluir aproximadamente el 95% de los datos para que los datos se asignen en todo el rango de la escala de color. STAFF asigna valores atípicos de alta velocidad al extremo de alta velocidad de la escala de color.
  2. Analiza el esqueleto.
    1. Seleccione Plugins > Macros > Analizar esqueleto. Se abrirá el archivo skeleton.tif y se abrirá y ejecutará el administrador de regiones de interés (ROI).
      NOTA: Analizar esqueleto clasifica cada píxel por su número de vecinos como en un punto final, en un cruce o dentro de un segmento. Para cada segmento se registra un número de identificación (número de identificación), una longitud de bifurcación calibrada y las coordenadas espaciales de los extremos de la rama.
    2. Espere a que aparezcan los ids de segmento en el esqueleto, la lista de segmentos que aparezca en el gestor de ROI y una ventana emergente que indica que se guarda el archivo roi manager para el esqueleto. Haga clic en Aceptar.
    3. Verifique que entre los movimientos respiratorios, el esqueleto permanece sobre donde los glóbulos rojos pasan a través del capilar (por ejemplo, no el borde y no fuera del capilar). Muestre los segmentos etiquetados como una superposición en la película, abriendo el archivo de película y, a continuación, arrastrando el archivo zip de ROI a la película abierta. Reproduce la película con los segmentos superpuestos.
  3. Seleccione intervalos de tiempo.
    1. Seleccione Plugins > Macros > Seleccionar intervalosde tiempo . Espere mientras la macro genera un kymograph a partir de un único segmento durante el tiempo total de la película. A partir de este kymograph, el usuario selecciona intervalos de tiempo para el análisis. Utilice las teclas Control + + para aumentar el tamaño del kymograph si es necesario.
    2. La herramienta de selección de rectángulos se activa automáticamente. Dibuje un rectángulo alrededor de cada intervalo de tiempo. Un buen punto de partida para la longitud del intervalo de tiempo es el intervalo de 1-2 s entre respiraciones, que son evidentes como regiones borrosas horizontales en el kymograph.
    3. Haga clic en la tecla T o en el botón Agregar del gestor de ROI para registrar las selecciones de intervalos de tiempo. Repita el proceso durante tantos intervalos de tiempo como desee. Realice selecciones secuencialmente de la parte superior (o izquierda) a la inferior (o derecha) del kymograph.
    4. Evalúe las opciones de parámetros (de Open-Create Project) seleccionando un pequeño número de intervalos de tiempo (3 a 4) y completando el análisis solo para esos intervalos, ya que Analizar flujo (el siguiente paso) puede tardar horas para conjuntos de datos grandes.
    5. Haga clic en Aceptar en la ventana Crear un ROI para cada intervalo de tiempo cuando haya terminado. Aparece una ventana emergente cuando se han guardado los intervalos seleccionados en la carpeta del proyecto. Haga clic en Aceptar.
  4. Analizar el flujo.
    1. Seleccione Plugins > Macros > Analizar flujo y se abre el cuadro de diálogo Analizar parámetros de flujo y muestra los valores introducidos en el paso Abrir proyecto. Edite si es necesario y, a continuación, haga clic en Aceptar.
    2. Se abre el cuadro de diálogo Nombres de archivo de salida y muestra los nombres introducidos en el paso Abrir proyecto. Edite si es necesario y, a continuación, haga clic en Aceptar.
    3. Se abre un cuadro de diálogo que pregunta si el usuario está listo para comenzar el análisis. Haga clic en Aceptar y comenzará el análisis. Espere a que se abra un cuadro de diálogo que indique cuándo se ha completado el análisis de flujo.
      NOTA: El tiempo necesario depende de la velocidad del procesador y del tamaño del conjunto de datos.
    4. Confirme que los archivos de resultados se han almacenado como archivos de hoja de cálculo de formato .csv en la carpeta del proyecto.
      NOTA: Los archivos de salida incluyen: segment_velocities.csv contiene valores de velocidad que tienen valores positivos y negativos que indican la dirección del flujo. Las celdas que representan segmentos inferiores a la longitud mínima contienen el texto CORTO. Las celdas con valores de velocidad superiores a la velocidad máxima medida contienen el texto OUT (para valores atípicos). kym_ang.csv contiene ángulos de kymograph medidos por el plugin Directionality en FIJI. good_fit.csv contiene bondad de ajuste de una curva a la distribución de ángulos medidos a partir de cada kymograph. La mala bondad del ajuste (< 0.8) puede indicar puntos de bifurcación ocultos en un segmento, cambio en la velocidad durante el intervalo de tiempo, parpadeo de la lámpara o de la luz de la habitación.
    5. Compruebe que segment_velocities.csv contiene pocos valores OUT. Si hay un gran número de valores OUT, compruebe que la longitud mínima del segmento a analizar no sea inferior a 15–20 m y, a continuación, vuelva a ejecutar Analizar flujo. Si el nuevo segment_velocities.csv todavía contiene una gran proporción de valores OUT, marque la casilla de corrección de parpadeo y, a continuación, vuelva a ejecutar Analizar flujo.
  5. Producir mapas espaciales.
    1. Seleccione Plugins > Macros > Producir mapa espacial y se abrirá la ventana Parámetros de mapa espacial, mostrando los valores introducidos en el paso Abrir proyecto. Edite si es necesario o para continuar seleccione Aceptar.
    2. Observe cómo se genera una secuencia temporal de mapas espaciales de velocidades de flujo con color que indica la velocidad del flujo. La salida tiene la forma de una pila de imágenes .tif con una imagen para cada intervalo de tiempo. Desplácese por la pila .tif para visualizar la variación espacial y temporal del flujo. Guarde la pila como un archivo AVI (sin comprimir para una portabilidad máxima) para compartirla como una película.

7. Análisis cuantitativo utilizando la salida STAFF

  1. Abra el archivo segment_velocities.csv en una hoja de cálculo o un programa de análisis estadístico. Estos valores tienen un signo positivo o negativo que indica la dirección del flujo en relación con los puntos de inicio/parada de ese segmento (registrados en el archivo ROI del segmento).
  2. Haga una nueva página de hoja de cálculo que contenga los valores absolutos de todos los valores de velocidad. Utilice estos valores para calcular la velocidad de flujo promedio general, la velocidad de flujo media para todos los segmentos vasculares a lo largo del tiempo, la velocidad de flujo para cada segmento vascular a lo largo del tiempo y hacer histogramas de distribuciones de velocidad.
  3. Calcule valores alrededor de regiones morfológicas específicas u otras regiones de interés, primero buscando los segmentos relevantes específicos en el esqueleto etiquetado y, a continuación, realizando análisis en estos segmentos seleccionados.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

El análisis de personal genera un censo completo de velocidades microvasculares en campos de microscopio según el período de tiempo que se extiende de segundos a minutos. Los resultados representativos se presentan en la Figura 1, la Figura 2, la Figura 3y la Figura 4. La Figura 1 muestra un ejemplo de una serie temporal de la red microvascular en el hígado de un ratón, la ...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

Hay varios pasos críticos en este protocolo. En primer lugar, la minimización del movimiento durante la toma de imágenes intravitales del hígado es esencial para generar películas que se pueden utilizar para el análisis de flujo capilar utilizando STAFF. Debido a la proximidad del diafragma, se producen períodos cortos de movimiento inducido por la respiración, con el hígado asegurado regresando a su posición inicial después de cada respiración. Asegurar el hígado expuesto quirúrgicamente contra el plato con fondo de cub...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores no reportan intereses en competencia.

Agradecimientos

Los estudios presentados aquí fueron apoyados por fondos de los Institutos Nacionales de Salud (NIH U01 GM111243 y NIH NIDDK P30 DK079312). Se realizaron estudios de microscopía intravital en el Centro de Microscopía Biológica de Indiana. Agradecemos a la Dra. Malgorzata Kamocka por la asistencia técnica con microscopía.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
#5 pinzasFine Science Tools11251-20Dumont #5 Pinzas de acero inoxidable
C57BL/6 ratonesJackson Labsmacho de 9-12 semanas
de edad CánulaInstechBTPE-10Tubo de polietileno 0.011 x 0.024 pulgadas
Cámara CMOSHamamatsuC11440-42U304.0LT Scientific CMOS
Plato de fondo deslizanteMicroscopía electrónica CienciasWillCo Fondo de
tijeras de disecciónFine Science Tools
Fiji ImageJ Softwarehttps://fiji.sc/ ; https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip
Fluoresceína dextranoThermo Fisher, InvitrogenD1822Dextrano, fluoresceína, 70.000 MW, aniónico, lisina fijable
Esponja de gasaFisher22-415-504Esponjas de gasa estériles Dukal de 2x2 pulgadas
Almohadilla térmicaReptithermRH-4entre el ratón y
platina Almohadilla térmicaSunbeam000732-500-000Usobre el ratón
Microscopio de epifluorescencia invertidaNikonNikon Microscopio invertido Nikon TiE
Afeitadora eléctrica Isis RoentBraun AesculapGT420
IsofluoranoAbbott GmbHPZN4831850
Adaptador de talón LuerFisher14-826-19E Adaptador decatéter
Micro tijerasCastro Viejo
Objetivo de microscopioNikonPlan Fluor 20x, NA 0.75 inmersión en agua
AgujaFisher30 G x1/2"
Aguja soporteOlsen-Hegar
Calentador de objetivoBioScience ToolsMTC-HLS-025 Controlador detemperatura con calentador de objetivo
Termómetro rectalBraintree Scientific, INCTH-5ARatón Monitorización de la temperatura corporal
STAFF Macros https://github.com/icbm-iupui/STAFF Cuerda de
suturaHarvard Bioscience723288Sutura de seda negra, 6-0, bobina
vidrio para plato GWST5040 de análisis de imágenes la

Referencias

  1. Shen, J., et al. Subclinical Vascular Dysfunction Associated with Metabolic Syndrome in African Americans and Whites. The Journal of clinical Endocrinology and Metabolism. 100 (11), 4231-4239 (2015).
  2. Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).
  3. Zafrani, L., Ince, C. Microcirculation in Acute and Chronic Kidney Diseases. American Journal of Kidney Diseases. 66 (6), 1083-1094 (2015).
  4. Nielsen, R. B., et al. Capillary dysfunction is associated with symptom severity and neurodegeneration in Alzheimer's disease. Alzheimer's & Dementia. 13 (10), 1143-1153 (2017).
  5. Houben, A. J. H. M., Martens, R. J. H., Stehouwer, C. D. A. Assessing Microvascular Function in Humans from a Chronic Disease Perspective. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (12), 3461-3472 (2017).
  6. Clemens, M., Zhang, J. Regulation of Sinusoidal Perfusion: In Vivo Methodology and Control by Endothelins. Seminars in Liver Disease. 19 (04), 383-396 (1999).
  7. Uhlmann, S., Uhlmann, D., Spiegel, H. U. Evaluation of hepatic microcirculation by in vivo microscopy. Journal of investigative surgery : the official journal of the Academy of Surgical Research. 12 (4), 179-193 (1999).
  8. Dunn, K. W., Sutton, T. A., Sandoval, R. M. Live-animal imaging of renal function by multiphoton microscopy. Current protocols in cytometry. , Chapter 12, Unit12.9 (2012).
  9. von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking. Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).
  10. Huang, Z. -L., et al. Localization-based super-resolution microscopy with an sCMOS camera. Optics Express. 19 (20), 19156(2011).
  11. Clendenon, S. G., et al. A simple automated method for continuous fieldwise measurement of microvascular hemodynamics. Microvascular Research. 123, 7-13 (2019).
  12. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  13. Liu, Z. -Q. Scale space approach to directional analysis of images. Applied Optics. 30 (11), 1369(1991).
  14. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of cell biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  15. Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).
  16. Babbey, C. M., et al. Quantitative intravital microscopy of hepatic transport. IntraVital. 1 (1), 44-53 (2012).
  17. Dunn, K. W., Ryan, J. C. Using quantitative intravital multiphoton microscopy to dissect hepatic transport in rats. Methods. 128, 40-51 (2017).
  18. Ryan, J., et al. Intravital Multiphoton Microscopy with Fluorescent Bile Salts in Rats as an In Vivo Biomarker for Hepatobiliary Transport Inhibition. Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals. 46 (5), 704-718 (2018).
  19. Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats. Journal of Visualized Experiments. (74), e50052(2013).
  20. Chhatbar, P. Y., Kara, P. Improved blood velocity measurements with a hybrid image filtering and iterative Radon transform algorithm. Frontiers in Neuroscience. 7, 106(2013).
  21. Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform. Journal of computational neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).
  22. Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).
  23. Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. -L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. Journal of visualized experiments : JoVE. (101), e52303(2015).
  24. Hoshikawa, R., et al. Dynamic Flow Velocity Mapping from Fluorescent Dye Transit Times in the Brain Surface Microcirculation of Anesthetized Rats and Mice. Microcirculation. 23 (6), New York, N.Y. 416-425 (2016).
  25. Sironi, L., et al. In vivo flow mapping in complex vessel networks by single image correlation. Scientific reports. 4 (1), 7341(2014).
  26. Kamoun, W. S., et al. Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks. Nature Methods. 7 (8), 655-660 (2010).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Flujo microvascularmicroscop a intravitalflujo capilaran lisis de im genes en FIJIproyecto TrakEM2Skeleton Eyesan lisis de quim grafomapeo de velocidad
Análisis temporal espacial del flujo de campo en la microvasculatura
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Condiciones de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.