Presentamos un sistema de exposición in vitro robusto, transferible y predictivo para el cribado y seguimiento de partículas transmitidas por el aire relativas a su citotoxicidad pulmonar aguda mediante la exposición de células pulmonares humanas cultivadas en la interfaz aire-líquido (ALI).
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Artículo de método
Evaluación de la toxicidad aguda por inhalación de partículas transmitidas por el aire mediante la exposición de células pulmonares humanas cultivadas en la interfaz aire-líquido
En este artículo
Resumen
Resumen
Aquí, presentamos un sistema modular de exposición in vitro especialmente diseñado que permite la exposición homogénea de células pulmonares humanas cultivadas en la ALI a gases, partículas o atmósferas complejas (por ejemplo, humo de cigarrillo), proporcionando así exposición de la superficie apical de la región alveolar humana al aire. A diferencia de los modelos de exposición secuencial con guía lineal de aerosoles, el diseño modular del sistema de flujo radial cumple con todos los requisitos para la generación y transporte continuo de la atmósfera de prueba a las células, una distribución y deposición homogénea de las partículas y la eliminación continua de la atmósfera. Este método de exposición está diseñado principalmente para la exposición de células a partículas en el aire, pero puede adaptarse a la exposición de aerosoles líquidos y gases altamente tóxicos y agresivos dependiendo del método de generación de aerosoles y el material de los módulos de exposición .
En el marco de un estudio de validación recientemente completado, este sistema de exposición se demostró como un método de cribado transferible, reproducible y predictivo para la evaluación cualitativa de la citotoxicidad pulmonar aguda de partículas en el aire, potencialmente reducir o reemplazar experimentos con animales que normalmente proporcionarían esta evaluación toxicológica.
Introducción
La inhalación de partículas tóxicas en el aire es un problema de salud pública, lo que lleva a una multitud de riesgos para la salud en todo el mundo y muchos millones de muertes al año1,2. El cambio climático, el desarrollo industrial en curso y la creciente demanda de productos energéticos, agrícolas y de consumo han contribuido al aumento de las enfermedades pulmonares en los últimos años3,4,5,6. El conocimiento y la evaluación de sustancias inhalables en relación con su toxicidad....
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Protocolo
NOTA: El protocolo de un experimento de exposición abarca un período de tres días.
Día 1
1. Preparaciones generales y cultivo de células
NOTA: La línea celular epitelial del adenocarcinoma pulmonar humano A549 se utilizó para experimentos de exposición. Las células deben manipularse en condiciones estériles. Se pueden utilizar otras líneas celulares aptas para el cultivo en la ALI.
- Preparar el medio de crecimiento (Medio Esencial Mínimo (DMEM) de Dulbecco, complementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 5 g/mL de gentamicina) y el medio de exposición (DMEM, complementado ....
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Resultados
El CULTEX RFS es un sistema modular de exposición in vitro especialmente diseñado que permite la exposición directa y homogénea de las células en la ALI. En un estudio previo a la validación anterior, se demostró con éxito la aplicabilidad general de este sistema de exposición y su transferibilidad, estabilidad y reproducibilidad. En un proyecto de investigación reciente financiado por el Ministerio Federal de Educación e Investigación de Alemania, el sistema de exposición fue validado y .......
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Discusión
En los últimos años se han desarrollado muchos modelos de pruebas de toxicidad por inhalación no animal con el fin de obtener información sobre el riesgo agudo de inhalación de partículas inhalables y para reducir y sustituir los experimentos con animales de acuerdo con el principio 3R25.
En términos de modelos de cultivo celular, la exposición de células se puede hacer en condiciones sumergidas o en la ALI. La exposición de células en condiciones sumergidas puede afect.......
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Divulgaciones
Los autores AT, KG, AB, SH, HM, TG, HT y DS no tienen nada que revelar. La empresa Cultex Technology GmbH (anteriormente Cultex Laboratories GmbH) produce instrumentos (por ejemplo, CULTEX RFS, CULTEX DG) utilizados en este artículo. NM fue empleado de Cultex Laboratories GmbH durante este estudio. OK es un empleado de Cultex Technology GmbH (anteriormente Cultex Laboratories GmbH). La patente PCT/EP2009/007054 para el dispositivo está en poder del fundador de Cultex Technology GmbH Prof. Dr. Ulrich Mohr (anteriormente Cultex Laboratories GmbH).
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Ministerio Federal Alemán de Educación e Investigación (Bundesministerium f'r Bildung und Forschung, BMBF, Alemania (Grant 031A581, subproyecto A-D)) y por la Fundación Alemana de Investigación (Deutsche Forschungsgesellschaft, DFG, Grupo de Formación en Investigación GRK 2338).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cells | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | |
| Cell culture medium and supplies | |||
| DMEM | Biochrom, Berlín, Alemania | FG 0415 | utilizado como medio de crecimiento |
| DMEM | Gibco-Invitrogen, Darmstadt, Alemania | 22320 | utilizado como medio de exposición |
| FBS superior | Biochrom, Berlín, Alemania | S 0615 | |
| Gentamicina (10 mg/mL) | Biochrom, Berlín, Alemania | A 2710 | |
| HEPES 1M | Th. Geyer, Renningen, Alemania | L 0180 | |
| PBS | Biochrom, Berlín, Alemania | L 1825 | |
| Tripsina/EDTA (0,05%/0,02%) | Biochrom, Berlín, Alemania | L 2143 | |
| Material de cultivo celular | |||
| tazas CASY | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Alemania | REF 05651794 | |
| Placas de cultivo celular | Corning, Wiesbaden, Alemania | 3516 | placas de 6 pocillos |
| Corning Transwell insertos de cultivo celular | Corning, Wiesbaden, Alemania | 3450 | insertos de 24 mm; 6- placas de pozos; 0,4 y micro; m |
| Chemicals | |||
| CASYton | Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Alemania | REF 05651808001 | |
| Aire comprimido (DIN EN 12021) | Linde Gas Therapeutics GmbH, Oberschleiß heim, Alemania | 2290152 | |
| WST-1 | Abcam, Cambridge, Reino Unido | ab155902 | |
| Instruments + equipment | |||
| CASY Cell Counter | Schä rfe System GmbH, Reutlingen, Alemania | ||
| Termostato de circulación | LAUDA, Lauda-Kö nigshofen, Alemania | Ecoline RE 100 | |
| CULTEX HyP - Prensa hidráulica | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| Manguito de inserción CULTEX | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX RFS - Sistema de flujo radial Tipo 2 (módulo para la exposición a partículas) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| CULTEX RFS - Sistema de flujo radial Tipo 2 (módulo para exposición a aire limpio) | Cultex® Technology GmbH, Hannover, Gemany | ||
| de CULTEX | |||
| Regulador de caudal 0-30 ml/min (IQ-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
| Regulador de caudal 0-1,5 l/min (EL-Flow) | Bronkhorst Deutschland Nord GmbH | ||
| Filtros (grandes) | Munktell & Filtrak GmbH, Sajonia, Alemania | LP-050 | Filtro estéril Munktell; Eficiencia de retención de partículas > 99,999% |
| Filtros (pequeños) | Parker Hannifin Corporation, Mainz, Alemania | 9933-05-DQ | Filtro desechable Balston |
| Bomba mediana | Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Alemania | Ismatec IPC Dispensador multicanal de alta precisión | peristáltica digital |
| Lector de microplacas Infinite M200 Pro | Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim, Alemania | ||
| Bomba de vacío | KNF, Friburgo, Alemania | N86 KT.18 | |
| Vö gtlin regulador de caudal másico 0,2-10 l/min | TrigasFI GmbH | Vö gtlin regulador compacto red-y, Nº de tipo: GCR-C3SA-BA20 | |
| Baño de agua | LAUDA, Lauda-Kö nigshofen, Alemania | Ecoline Staredition RE 104 |
Referencias
- Faber, S. C., McCullough, S. D. Through the Looking Glass: In vitro Models for Inhalation Toxicology and Interindividual Variability in the Airway. Applied In vitro Toxicology. 4 (2), 115-128 (2018).
- Ambient air pollution: a global assessment of exposure and burden of disease. , World Health Organization. http://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/250141/9789241511353-eng.pdf?sequence=1 ....
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Reimpresiones y permisos
