Summary
Apresentado aqui é um protocolo para avaliar as propriedades contratuais de myofibrils musculares estriados com resolução nano-Newton. O protocolo emprega uma configuração com uma sonda de força óptica baseada em interferometria. Esta configuração gera dados com uma alta relação sinal-ruído e permite a avaliação da cinética contracttil dos myofibrils.
Abstract
Células musculares estriadas são indispensáveis para a atividade de humanos e animais. As fibras musculares únicas são compostas por miofibrils, que consistem em sarcomeres serialmente ligados, as menores unidades contratuais em músculos. A disfunção sarérica contribui para a fraqueza muscular em pacientes com mutações em genes codificando proteínas sarcomericas. O estudo da mecânica miofibril permite a avaliação das interações actin-myosin sem potenciais efeitos de confusão de miofibrils danificados e adjacentes ao medir a contratilidade de fibras musculares únicas. Danos ultraestruturais e desalinhamento de miofibrils podem contribuir para a falta de comprometimento. Se houver danos estruturais nos miofibrils, eles provavelmente quebram durante o procedimento de isolamento ou durante o experimento. Além disso, estudos em miofibrils fornecem a avaliação das interações actin-myosin na presença das restrições geométricas dos sarcomeres. Por exemplo, medições em miofibrils podem elucidar se a disfunção miofibrilar é o efeito primário de uma mutação em uma proteína sarcomeric. Além disso, a perfusão com soluções ou compostos de cálcio é quase instantânea devido ao pequeno diâmetro do miofibril. Isso torna os myofibrils eminentemente adequados para medir as taxas de ativação e relaxamento durante a produção de força. O protocolo descrito neste artigo emprega uma sonda de força óptica baseada no princípio de um interferômetro Fabry-Pérot capaz de medir forças na faixa nano-Newton, acoplado a um motor de comprimento piezo e um sistema de perfusão de passo rápido. Esta configuração permite o estudo da mecânica miofibril com medições de força de alta resolução.
Introduction
As células musculares estriadas são indispensáveis para as atividades cotidianas. O movimento dos membros, a função respiratória e o movimento de bombeamento do coração dependem da força gerada pelas células musculares. O músculo esquelético consiste em fascicles musculares contendo feixes de fibras musculares únicas(Figura 1A). Estas fibras musculares são compostas por miofibrils, que são formados por sarcomeres serialmente ligados(Figura 1B,D). Os sarcomeres contêm filamentos finos e grossos. Estes consistem principalmente em cadeias de moléculas de actina e miosina, respectivamente(Figura 1B). As interações actina-miosina são responsáveis pela capacidade de geração de força dos músculos. Pacientes com mutações em genes codificados por proteínas sarcomericas, como nebulina, actina e troponina T, sofrem de fraqueza muscular devido à disfunção contratil1.
A qualidade da contratilidade muscular pode ser estudada em vários níveis de organização, desde músculos inteiros in vivo até interações actin-myosin em ensaios de motilidade in vitro. Durante as últimas décadas, vários grupos de pesquisa desenvolveram configurações para determinar a contralidade dos myofibrils individuais2,3,4,5,6,7,8,,9,10. Essas configurações baseiam-se na detecção de alterações na deflexão a laser de um cantilever (ou seja, deflexão óptica do feixe) causada pela contração do myofibril (para detalhes, consulte Labuda et al.11). Embora a determinação da função contratual dos myofibrils tenha algumas limitações (por exemplo, a dinâmica dos processos de acoplamento excitação-contração que estão a montante dos miofibrils são escassas), há múltiplas vantagens nessa abordagem. Estes incluem: 1) a capacidade de avaliar interações actina-miosina na presença das restrições geométricas dos sarcomeres; 2) a capacidade de avaliar as interações actina-miosina sem potenciais efeitos confusos de miofibrils danificados e adjacentes (ao medir a contratilidade de fibras musculares únicas danos ultraestruturais e desalinhamento de miofibrils podem contribuir para a contratilidade prejudicada) (Figura 1D); 3) o pequeno diâmetro dos miofibrils (~1 μm, Figura 2A) e a falta de membranas permitem uma difusão de cálcio quase instantânea nos sarcomeres. Além disso, se os danos estruturais estiverem presentes nos miofibrils, eles provavelmente quebram durante seu isolamento ou durante o experimento. Assim, avaliar a contratude do miofibril é um método elegante para estudar os mecanismos básicos de contração muscular e entender se as interações actina-miosina perturbada são a principal causa de doença muscular causada por mutações em proteínas sarcomericas.
Este protocolo apresenta uma configuração recém-desenvolvida para determinar a contratilidade dos myofibrils incorporando uma sonda de força cantilever com resolução nano-Newton (ou seja, Optiforce). Esta sonda de força é baseada no princípio da interferometria. A interferometria permite o uso de cantilevers relativamente rígidos. Isso torna possível medir a força com pouca deflexão do cantilever, aproximando-se de contrações isométricas do miofibril. A sonda permite a avaliação de forças passivas e ativas baixas que são produzidas por um único myofibril isolado de diferentes biópsias musculares, incluindo as de indivíduos humanos, com uma alta relação sinal-ruído. A sonda óptica cantilever force incorporada nesta configuração é baseada em um interferômetro Fabry-Pérot12. O interferômetro detecta pequenos deslocamentos entre uma fibra óptica e um cantilever revestido de ouro montado em uma ferrule(Figura 3). A distância entre a fibra óptica e o cantilever é chamada de cavidade Fabry-Pérot. Os myofibrils são montados entre a sonda e o motor piezo usando duas fibras de montagem de vidro revestidas de cola. A força produzida pelo myofibril pode ser matematicamente derivada dos dados do interferômetro. A interferometria é baseada na superposição ou interferência de duas ou mais ondas (nesta configuração três ondas de luz). A luz laser com comprimento de onda entre 1.528,77-1.563,85 nm é emitida a partir do interferômetro e é enviada através da fibra óptica. Na sonda, a luz é refletida 1) na interface entre a fibra óptica e o meio(Figura 3A); 2) na interface do meio e do cantilever(Figura 3B); e 3) na interface entre o revestimento metálico e dourado do cantilever(Figura 3C). A reflexão na interface A e B depende do índice de refração (n)do meio em que a sonda está submersa. A luz, composta pelas três reflexões sobrepostas, retorna a um fotodiodo no interferômetro. O fotodiodo mede a intensidade da luz, que é o resultado do padrão de interferência das três reflexões sobrepostas. Quando a força contratil é gerada ativando ou esticando um myofibril, o myofibril puxa o cantilever. Esse movimento altera o tamanho da cavidade (d) e, consequentemente, o número de comprimentos de onda que se encaixam na cavidade. A luz refletida no cantilever terá uma fase diferente, resultando em um padrão de interferência diferente. O fotodiodo registra essa mudança de intensidade de padrão de interferência como uma mudança em Volts. Posteriormente, a geração de força myofibril é calculada a partir desta mudança, levando em conta a rigidez cantilever. A sonda de força é calibrada pelo fabricante empurrando a ponta da agulha de montagem, presa à extremidade de entrega livre do cantilever, contra uma balança de pesagem, mantendo a dobra do cantilever igual a um múltiplo do comprimento de onda do laser de leitura13. Assim, a interferometria é um método altamente sensível para detectar pequenas alterações à distância, permitindo a medição de forças com resolução nano-Newton. Esta resolução permite a avaliação da produção de força miofibrilar com uma alta relação sinal-ruído. Enquanto a interferometria tradicional limita a faixa de medidas à parte linear da curva de interferência, o uso de um amplificador de travamento e modulação do comprimento de onda laser supera essa limitação14. Isso é explicado com mais detalhes na seção de discussão.
Para medir a tensão ativa do miofibril, um sistema de perfusão de passo rápido foi incorporado para expor o miofibril às soluções de cálcio(Figura 4A). O sistema de perfusão de passo rápido permite que mudanças de solução ocorram dentro de 10 ms. Devido ao seu pequeno diâmetro, a difusão de cálcio nos miofibrils é quase instantânea. Assim, este sistema é particularmente adequado para medir as taxas de ligação actin-myosin durante a ativação e liberação durante o relaxamento. A taxa de ativação (kACT) e relaxamento (kREL) podem ser determinadas a partir das curvas de ativação-relaxamento. Além disso, expondo os miofibrils a soluções de cálcio de concentração crescente, a relação força-cálcio e a sensibilidade ao cálcio podem ser determinadas.
Além disso, um motor de comprimento piezo permite alongamento rápido e encurtamento do myofibril. Isso oferece a possibilidade de estudar as propriedades viscoelásticas (ou seja, tensão passiva) do myofibril, bem como realizar um rápido encurtamento e ressuado do miofibril para determinar a taxa de reurbanização da tensão (kTR). Os parâmetros recuperados de experimentos de tensão ativa e passiva podem ser alterados por mutações genéticas em uma proteína sarcomeric.
Esta configuração personalizada foi usada para medir as características contratuais ativas e passivas de myofibrils isolados de músculos esqueléticos humanos, pacientes e camundongos saudáveis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
O protocolo de obtenção de biópsias humanas foi aprovado pelo conselho de revisão institucional do Vu University Medical Center (#2014/396) e o consentimento por escrito informado foi obtido dos sujeitos. O protocolo de obtenção de biópsias musculares animais foi aprovado pelo comitê local de ética animal da UNIVERSIDADE VU (AVD114002016501)
1. Preparação e isolamento miofibril
NOTA: Use métodos descritos anteriormente para glicerinar biópsias, preparar as diferentes soluções de concentração de cálcio (pCa)7,16,17e isolar miofibrils2,,18.
- Descongele as soluções relaxantes (pCa 9.0, Rx) e ativação (pCa 4.5, Act), bem como os inibidores (1 M E64, 1 M DTT, 1 M de leupeptina, 1 M PMSF), que são armazenados a -80 °C.
- Pegue uma peça glicerada de biópsia muscular estriada de aproximadamente 1 mm3 e coloque-a em uma pequena placa de Petri com solução de 1:1 Rx/glicerol (v/v) e coloque a placa de Petri em uma placa fria a 4 °C.
- Dissecar o pedaço do músculo usando microscópio de dissecção e fórceps, separando fibras musculares únicas sem isolá-las do pedaço do músculo.
NOTA: Remova o máximo possível de tecido gorduroso e conjuntivo para evitar a contaminação da suspensão do miofibril. - Transfira o pedaço de tecido dissecado para um tubo de 5 mL com 1,5 mL de solução relaxante com inibidores (1 μL/mL E-64, 1 μL/mL leupepína, 1 μL/mL DTT e 125 μL/mL PMSF). Deixe o tecido amenizar aproximadamente 4 °C por 1h.
- Durante a incubação, inicializa os dois PCs, liga os dispositivos e abre o software associado (ver Tabela de Materiais).
- Submergir a sonda de força em água ultrauso em uma placa de Petri e calibrar a sonda.
- Pressione o'Assistente de partida' no interferômetro e siga as instruções na tela. Depois de pressionar Calibrar,toque no estágio do microscópio.
NOTA: Tocar no estágio do microscópio fará com que o cantilever desvie e passe por franjas. Isso permite a calibração da sonda. - Deixe a sonda submersa na água ultrauso na placa de Petri após a calibração.
- Pressione o'Assistente de partida' no interferômetro e siga as instruções na tela. Depois de pressionar Calibrar,toque no estágio do microscópio.
- Inicialize a posição do motor piezo. Para isso, siga um dos passos detalhados abaixo.
- Quando o motor piezo for usado para a tensão kTR, defina o comprimento para 0 μm.
As configurações do gerador de sinal podem ser encontradas na Tabela 1, Figura 5A. - Quando o motor piezo for usado para tensão passiva, defina o comprimento para 50 μm.
As configurações do gerador de sinal podem ser encontradas na Tabela 1.
NOTA: A diferença entre as etapas é a posição inicial do motor de comprimento piezo. Para esticar o miofibril, o motor piezo precisa puxar para aumentar a distância entre as agulhas de montagem e para alongar o miofibril. Para afrouxar o miofibril, o motor piezo precisa empurrar para diminuir a distância entre as agulhas de montagem e encurtar o miofibril.
- Quando o motor piezo for usado para a tensão kTR, defina o comprimento para 0 μm.
- Prepare um slide de microscópio. Pipeta 150 μL de polihidroxietilmetato (poli-HEMA) solução (5% poly-HEMA em 95% etanol, w/v) em um slide de microscópio e espalhá-lo através do slide para que esteja tudo coberto.
NOTA: Se uma suspensão myofibril for esbofícula em um slide de microscópio não revestido, os myofibrils que afundam na parte inferior grudarão no slide do microscópio e não será possível colá-los. - Encha as seringas com soluções pCa (ver Figura 4A) e preencha o sistema de perfusão.
NOTA: Nestas etapas todos os tubos são pré-preenchidos com a solução apropriada para garantir que todas as bolhas de ar sejam removidas da tubulação.- Encha a tubulação de entrada do fluxo de fundo da câmara de fluxo(Figura 3, 4A) entrada com Rx.
- Quando usado, lave o coletor com água ultrauso para remover o ar. Para isso, conecte a seringa com água ultrauso à tomada e lave-a na direção inversa. Bloqueie as portas não usos do coletor.
- Habilite cada seringa pCa para encher seus respectivos tubos com solução pCa. Em seguida, conecte-os ao coletor e ao Ɵ-vidro.
- Abra as válvulas 1 e 6 com o software do painel de aquisição de dados (ver Tabela de Materiais) verificando o botão '1+6'(Figura 6A) para encher o Ɵ-vidro com as soluções relaxantes (pCa 9.0) e ativação (4,5) e válvulas próximas quando o vidro Ɵ é preenchido(Figura 6B).
2. Montagem de um myofibril
- Cubra um slide de microscópio com poly-HEMA para evitar que os miofibrils grudem no vidro.
- Prepare o homogeneizador (ver Tabela de Materiais) para homogeneização tecidual. Limpe a haste do rotor interno com papel de tecido limpo, monte o homogeneizador e gire 1x para 15 s em álcool e três vezes por 15 s cada em água ultrauso. Prerinse o homogeneizador na solução relaxante 1 x para 15 s no gelo.
- Coloque a haste homogeneizadora no tubo contendo o tecido muscular conforme descrito na etapa 1.4 e, mantendo o tubo no gelo, gire o rotor por 15 s na velocidade 5 para rasgar o tecido muscular e obter uma suspensão de myofibril.
- Pipeta ~50 μL da suspensão myofibril e ~250 μL da solução relaxante no slide do microscópio revestido com poly-HEMA no banho de tecido. Isso formará uma queda líquida. Cubra o banho com uma tampa para proteger do pó e espere de 5 a 10 minutos para permitir que os myofibrils afundem até o fundo.
NOTA: A relação entre a suspensão e a solução relaxante depende da qualidade do isolamento, portanto, ajustar-se em conformidade. Por exemplo, se o rendimento do myofibril for baixo e poucos myofibrils adequados estiverem presentes na suspensão, adicione mais suspensão de myofibril e dilua com solução menos relaxante (por exemplo, 75 μL de suspensão myofibril e 225 μL de solução relaxante). O tecido muscular cardíaco e esquelético é fácil de reconhecer devido ao seu padrão de estriação. Usando um objetivo de 10x ou 40x, este padrão também é visível em um único myofibril. Caso outro tecido esteja presente na suspensão, os myofibrils podem ser selecionados visualmente. Pode-se pular a espera de 5 a 10 minutos. No entanto, isso aumenta a dificuldade de colar um miofibril. - Reveste agulhas de montagem com cola (shellac + etanol; 120 mg shellac em 2 mL de 70% de etanol). Para isso, aqueça a cola a 65 °C para 30-60 s e pipeta ~6 μL em um novo slide de vidro não revestido. Mergulhe a ponta de cada agulha de montagem na cola e repita até que uma camada de cola seja visível. Mova a sonda e o piezo verticalmente com os micromanipuladores para abrir espaço para colocar o banho de tecido no estágio do microscópio. Remova a lâmina de vidro que contém a cola.
- Montando os myofibrils
- Coloque o banho de tecido com o slide do microscópio revestido com poli-HEMA contendo a suspensão do myofibril no estágio do microscópio. Use o palco para encontrar um myofibril adequado com o objetivo de 40x. Se necessário, mova-se e gire o banho de tecido para mover o myofibril para uma posição montável.
NOTA: Procure myofibrils com um padrão de estriação visível com aproximadamente 30 μm de comprimento. Como descrito em detalhes nas etapas 3.1 e 3.2.1 é possível verificar o comprimento e o comprimento do sarcomere antes de colar o myofibril. Não cole miofibrils rasgados, porque estes são susceptíveis de quebrar durante a contração. - Deslize a câmara de fluxo para o lugar diretamente acima da gota líquida contendo os miofibrils no banho de tecido (tubos sobre o slide na etapa 2.4) e abaixe-a. Pare antes que atinja a queda de líquido.
- Abaixe a agulha de montagem piezo e pressione-a na ponta inferior do myofibril. Levante-o ligeiramente para verificar se o myofibril está preso à agulha.
- Abaixe a câmara de fluxo o suficiente para que a agulha de montagem da sonda chegue ao fundo sem que a sonda toque na câmara de fluxo.
- Pressione a agulha de montagem da sonda na ponta superior do myofibril. Levante-o ligeiramente para verificar se o myofibril está preso à agulha.
- Levante o myofibril do fundo do banho o mais longe possível sem perder a capacidade de se concentrar sem que o objetivo toque na parte inferior do vidro.
- Coloque o banho de tecido com o slide do microscópio revestido com poli-HEMA contendo a suspensão do myofibril no estágio do microscópio. Use o palco para encontrar um myofibril adequado com o objetivo de 40x. Se necessário, mova-se e gire o banho de tecido para mover o myofibril para uma posição montável.
3. Experimento inicializante
- Use os softwares micromanipuladores, câmera e controlador de sistema(Figura 7A, ver Tabela de Materiais) para medir o comprimento do sarcomere. Mova a sonda piezo e/ou force para definir o comprimento inicial de sarcomere do myofibril para 2,5 μm.
NOTA: Um comprimento de sarcomere de 2,5 μm garante uma sobreposição ideal entre cabeças de miosina e actina. - Utilizando a função do vaso do software do controlador do sistema, meça o comprimento e largura do myofibril(Figura 7B,C).
NOTA: Ao girar a câmera, ela pode inclinar horizontal e/ou verticalmente. Para verificar o alinhamento da câmera, um nível de espírito pode ser usado para verificar se a câmera está girada e não inclinada.- Posicione o myofibril no centro da imagem de vídeo usando o estágio do microscópio.
- Desenhe um quadrado de um lado do myofibril para o outro. Para o comprimento, certifique-se de incluir a borda escura das gotículas de cola(Figura 2A) no quadrado porque o processamento da imagem é baseado no contraste.
- Comece a gravar os dados no software do controlador do sistema (ver Tabela de Materiais) pressionando 'Iniciar' e após 5 s pausar a gravação de dados do software do controlador do sistema pressionando o botão 'Pausa'. O comprimento agora está registrado nos dados.
- Para a largura gire primeiro a câmera 90° (ver Tabela de Materiais) e, em seguida, use o contraste da borda do próprio myofibril.
- Comece a gravar os dados no software do controlador do sistema (ver Tabela de Materiais) pressionando 'Iniciar' e após 5 s pausar a gravação de dados do software do controlador do sistema pressionando o botão'Pausa'. A largura está agora registrada nos dados.
- Se a tensão ativa do myofibril precisa ser determinada, a configuração de perfusão precisa ser usada. Se assim for, continue a passo 3.4. Se apenas a tensão passiva for determinada, pule as etapas 3.4-4.1.3.7 e continue na etapa 4.2.
- Posicione e inicialmente a configuração da perfusão.
NOTA: Isso só é necessário para a geração de força ativa. Continue a etapa 4.2 ao realizar experimentos de tensão passiva.- Ajuste a posição do motor em passo rápido em 4 V (Figura 5B).
- Deslize o suporte de perfusão sobre a mesa para alinhar o canto inferior esquerdo do suporte com a fita sobre a mesa.
NOTA: Tenha cuidado para não acertar a sonda de força ou o motor piezo. - Use o manipulador para posicionar aproximadamente o Ɵ-vidro por olho.
- Olhe através da ocular e mova cuidadosamente o Ɵ-vidro em direção ao myofibril usando o manipulador.
- Alinhe o canal superior do Ɵ-vidro com o myofibril usando o manipulador e verifique a posição realizando um passo rápido (as configurações do gerador de sinal podem ser encontradas na Tabela 1) com o software do controlador do sistema(Figura 2B–C, ver Tabela de Materiais).
NOTA: Certifique-se de que o canal inferior estará alinhado com o myofibril durante a fase de ativação da etapa rápida (Figura 2B–C).
- Ligue o fluxo de fundo de Rx (Figura 4A) para criar um fluxo de fundo laminar na câmara de fluxo.
NOTA: O fluxo de fundo é necessário para evitar o fluxo turbulento como resultado do fluxo de solução pCa do Ɵ-vidro.- Ligue a entrada da câmara de fluxo com uma alavanca de válvula Luer.
- Envie os seguintes parâmetros para a bomba de saída para começar a drenar a câmara de fluxo e evitar o transbordamento da câmara de fluxo (Figura 9): Válvula = Válvula de banho (2); Modo microstep = Micro; Meta de êmbolo = 48.000; Velocidade do êmbolo = 38-40 (arbitrário).
NOTA: Certifique-se de que o nível do fluido está estável o tempo todo. O myofibril não deve secar e nem o cantilever. É melhor ter um pouco de transbordamento do que muito pouco fluxo.
- Envie os seguintes parâmetros para a bomba de saída para começar a drenar a câmara de fluxo e evitar o transbordamento da câmara de fluxo (Figura 9): Válvula = Válvula de banho (2); Modo microstep = Micro; Meta de êmbolo = 48.000; Velocidade do êmbolo = 38-40 (arbitrário).
- Ligue a entrada da câmara de fluxo com uma alavanca de válvula Luer.
- Para definir a temperatura a um valor desejado com o controlador de temperatura termoelétrica(Figura 8, ver Tabela de Materiais),digite a temperatura desejada epressione' Iniciar '. Aguarde até que a temperatura desejada seja atingida verificando o gráfico no software do controlador de temperatura termoelétrica e continue.
NOTA: Ao realizar experimentos à temperatura ambiente, o controlador de temperatura termoelétrica não precisa ser utilizado.
4. Protocolo experimental(s)
- Decida quais protocolos de força ativa precisam ser realizados.
NOTA: Dependendo dos dados necessários para o estudo, vários tipos de experimentos de força ativa podem ser realizados: etapa 4.1.1, medição da força máxima na saturação [Ca2+]; passo 4.1.2, obtendo uma curva Force-pCa para determinar a sensibilidade ao cálcio, além da etapa 4.1.1; passo 4.1.3, determinando a taxa de reurbanização da tensão fazendo um protocolo de encurtamento-ressundo, além da etapa 4.1.1 ou 4.1.2.- Medir a força ativa máxima.
- Comece a gravar os dados no software do controlador do sistema (ver Tabela de Materiais) pressionando 'Iniciar'.
- Abra as válvulas 1 e 6 com o painel de aquisição de dados (ver Tabela de Materiais) verificando o botão '1+6' para iniciar o fluxo de Ɵ-vidro da solução relaxante e ativando a solução através do Ɵ-vidro(Figura 6A).
- Reinicie o intervalo do interferômetro de modo que a força da linha de base seja 0 V selecionando e pressionando 'Reset Range' no interferômetro (ver Tabela de Materiais).
- Quando o traço de força estiver estável, realize o passo rápido de Ɵ-vidro (tamanho da etapa = 100 μm).
As configurações do gerador de sinal podem ser encontradas na Tabela 1 (Figura 5C). Um traço de relaxamento de ativação semelhante à Figura 4D será gravado e visível no software do controlador do sistema. - Pause a gravação de dados do software do controlador do sistema pressionando o botão'Pausa'.
- Se não houver mais ativações, feche as válvulas 1 e 6 para parar Ɵ fluxo de vidro, descontrolando o botão '1+6'(Figura 6B),pare a bomba de seringa(Figura 9, veja Tabela de Materiais) pressionando 'Termine' e pare o fluxo de fundo fechando a válvula Luer.
- Curva Force-pCa
NOTA: Isso é semelhante ao passo 4.1.1 para obter a força ativa máxima, mas com múltiplas ativações usando diferentes soluções pCa.- Comece a gravar os dados no software do controlador do sistema pressionando'Iniciar'.
- Abra as válvulas 1 e 2 com o software do painel de aquisição de dados para iniciar o fluxo de solução relaxante e pCa 6.2 através do Ɵ-vidro.
- Redefinir a faixa do interferômetro de modo que a força da linha de base seja 0 V selecionando e pressionando 'Reset Range' no interferômetro.
- Quando o traço de força estiver estável, realize o passo rápido de Ɵ-vidro (tamanho da etapa = 100 μm).
As configurações do gerador de sinal podem ser encontradas na Tabela 1. - Pause o software do controlador do sistema pressionando o botão'Pausa'.
- Repetição de passos 4.1.2.1-4.1.2.4 para as válvulas 1 e 3 (pCa 5.8), válvulas 1 e 4 (pCa 5.6), válvulas 1 e 5 (pCa 5.4), e válvulas 1 e 6 (pCa 4.5).
- Se não houver mais ativações, feche as válvulas 1 e 6 para parar Ɵ fluxo de vidro, descontrolando o botão '1+6'(Figura 6A),pare a bomba de seringa(Figura 9) pressionando 'Termine' e pare o fluxo de fundo fechando a válvula Luer.
- Medida taxa de reurbanização de tensão (kTR).
NOTA: Isso é semelhante ao passo 4.1.1 para a força ativa máxima, mas com algumas alterações e etapas adicionadas.- Calcule o movimento piezo necessário para afrouxar o myofibril 15% e digite esse valor no gerador de sinal (Figura 5D, Tabela 1).
- Comece a gravar os dados no software do controlador do sistema pressionando 'Iniciar'.
- Abra as válvulas 1 e 6 com o painel de aquisição de dados(Figura 6A)software para iniciar o fluxo da solução relaxante e pCa 4.5 através do Ɵ-vidro.
- Redefinir a faixa do interferômetro de modo que a força da linha de base seja 0 V selecionando e pressionando 'Reset Range' no interferômetro.
- Quando o traço de força estiver estável, realize o passo rápido de Ɵ-vidro (tamanho da etapa = 100 μm).
As configurações do gerador de sinal podem ser encontradas na Tabela 1. - Quando o planalto de força for atingido, realize o encurtamento-ressuante com o piezo.
As configurações do gerador de sinal podem ser encontradas em(Figura 5D, Tabela 1). Um traço de relaxamento de ativação semelhante à Figura 4E será gravado e visível no software do controlador do sistema.
NOTA: Um protocolo personalizado pode ser feito para automatizar os passos acima. - Pause o software do controlador do sistema pressionando o botão'Pausa'.
- Se não houver mais ativações, feche as válvulas 1 e 6 para parar Ɵ fluxo de vidro, descontrolando o botão '1+6'(Figura 6B),pare a bomba de seringa(Figura 9) pressionando 'Termine' e pare o fluxo de fundo fechando a válvula Luer.
- Medir a força ativa máxima.
- Realizar medições de força passiva.
- Realize um estiramento contínuo.
- Calcule o movimento piezo necessário para esticar o miofibril e digite esse valor no gerador de sinal(Tabela 1).
NOTA: São configurações de exemplo. Calcule a quantidade de estiramento e o tempo de estiramento em relação ao comprimento do sarcomere. Estas configurações são necessárias para garantir que a velocidade de estiramento por sarcomere permaneça igual em meus miofibrils. - Comece a gravar os dados no software do controlador do sistema pressionando 'Iniciar'.
- Redefinir a faixa do interferômetro de modo que a força da linha de base seja 0 V selecionando e pressionando 'Reset Range' no interferômetro.
- Realize o alongamento contínuo com o gerador de sinal no software do controlador do sistema para operar o piezo. As configurações do gerador de sinal de exemplo podem ser encontradas na Tabela 1.
- Encurte o myofibril para afrouxar o comprimento com o piezo após o trecho terminar(Tabela 1).
- Calcule o movimento piezo necessário para esticar o miofibril e digite esse valor no gerador de sinal(Tabela 1).
- Faça um alongamento stepwise.
- Comece a gravar os dados no software do controlador do sistema pressionando 'Iniciar'.
- Redefinir a faixa do interferômetro de modo que a força da linha de base seja 0 V selecionando e pressionando 'Reset Range' no interferômetro.
- Realize um trecho stepwise com o gerador de sinal no software do controlador do sistema para operar o piezo. As configurações do gerador de sinal de exemplo podem ser encontradas na Tabela 1 (Figura 5E).
- Encurte o myofibril para afrouxar o comprimento com o piezo depois que o trecho estiver terminado. As configurações do gerador de sinal de exemplo podem ser encontradas na Tabela 1.
- Realize um estiramento contínuo.
- Pause o software do controlador do sistema pressionando o botão'Pausa'.
- Pare a gravação de dados pressionando o botão'Stop' no software do controlador do sistema.
- Salve os dados pressionando 'Arquivo' e 'Salvar dados' no software do controlador do sistema.
5. Limpeza
- Remova o miofibril medido e prepare-se para o próximo myofibril.
- Para isso, rasgue cuidadosamente o myofibril enquanto olha através do ocular com o objetivo de 40x.
- Mova-se para cima da sonda de força e piezo. Suba o Ɵ-vidro todo o caminho para cima, para a direita e para trás. Em seguida, mova-se para cima e deslize para longe da câmara de fluxo. Remova o banho de tecido.
- Para limpar a agulha de montagem, leve-a para o foco usando o 10x e o ocular. Mergulhe a escova no etanol e escove cuidadosamente e retire a cola da agulha.
NOTA: Tenha em mente que pode levar algum tempo até que a cola saia. - Enxágüe a câmara de fluxo e o banho de tecido com água ultrapura.
- Coloque a sonda em uma pequena placa de Petri cheia de água ultrapura. Certifique-se de que a sonda está completamente submersa.
- Quando os experimentos estiverem concluídos, limpe a configuração conforme acima e execute as seguintes etapas adicionais.
- Esvazie a tubulação do banho de fluxo. Envie os parâmetros para a bomba de seringa de saída (ver Tabela de Materiais, Figura 9). Válvula = Válvula de banho (2); Modo microstep = Normal; Alvo do êmbolo = 0; Velocidade do êmbolo = 30.
NOTA: Encerre o comando quando a tubulação estiver vazia. - Inicialize a bomba várias vezes(Figura 9B).
- Escorra as seringas. Para isso, feche todas as válvulas Luer, abra todas as válvulas, remova o tubo da agulha da seringa, segure o tubo de pCa específico sob a agulha e abra a válvula Luer. Use os plugues de pressão para acelerar o processo.
- Recoloque a tubulação na agulha da seringa. Encha as seringas com ~5 mL de água ultrapura. Coloque um copo debaixo do Ɵ de vidro. Abra todas as válvulas e abra a válvula de pressão para lavar o sistema.
- Desligue o sistema. Desligue o pc, o interferômetro e o bloco de alimentação do controlador Piezo.
- Esvazie a tubulação do banho de fluxo. Envie os parâmetros para a bomba de seringa de saída (ver Tabela de Materiais, Figura 9). Válvula = Válvula de banho (2); Modo microstep = Normal; Alvo do êmbolo = 0; Velocidade do êmbolo = 30.
6. Análise de dados
- Exportar traços de dados do software do controlador do sistema (ver Tabela de Materiais) para um programa de software de planilha ou área de transferência, abrindo o arquivo de dados e selecionando o segmento desejado. Os traços mostrados serão exportados (por exemplo, força bruta, comprimento de sarcomere e posição piezo).
- Realizar análise com o software de escolha (por exemplo, MATLAB).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Os vestígios de dados foram registrados e abertos com o software do controlador do sistema (ver Tabela de Materiais). Traços completos ou segmentos selecionados foram exportados para a área de transferência ou arquivo de texto para análise posterior com um software desejado. As válvulas para controlar o fluxo das diferentes soluções foram trocadas com software personalizado ou manualmente. Um script MATLAB personalizado foi usado para analisar as taxas de ativação, redesenvolvimento de tensão e relaxamento. A força ativa máxima e o pico e a força do planalto dos experimentos de força passiva foram tirados diretamente do rastreador de força de software do controlador do sistema. Após a montagem de um myofibril(Figura 2),o protocolo desejado foi selecionado.
Força ativa máxima e cálcio- sensibilidade da força emmiofibrils isolados de biópsias musculares esqueléticas humanas e camundongos
Na Figura 4A, a configuração experimental usada para os experimentos de força ativa é retratada esquematicamente. Traços de força de um experimento de força ativa com um myofibril isolado de músculos de quadríceps humanos saudáveis são mostrados. O myofibril foi ativado 5 vezes com soluções com pCa variado (pCa 6.2, 5.8, 5.6, 5.4, 4.5; dados mostrados na Figura 4B). A força máxima média de todos os myofibrils neste experimento foi de ~123 mN/mm2. Uma curva force-pCa foi construída a partir das forças do planalto alcançadas durante cada ativação em cada uma das cinco soluções de cálcio. Os resultados são mostrados na Figura 4C. A partir dessa curva foi calculada a pCa a 50% da produção de força máxima (pCa50). Neste myofibril, a pCa50 foi de 5,75.
Além disso, um ou vários compostos poderiam ser adicionados à solução perfusada para medir seu efeito sobre a força produzida pelo miofibril. Na Figura 4D, ilustra-se o efeito do inibidor de N-benzyl-p-toluene sulphonamida (BTS), um músculo de contração rápida (tipo II) inibidor de cadeia pesada de miosina II (MHCII). 19 Um myofibril foi ativado primeiro com uma solução pCa 5.6 e, posteriormente, com uma solução pCa 5.6 + BTS. Durante a segunda ativação foi produzida menos força, indicando que este era um myofibril que continha MHCII. Existem mutações em proteínas que estão presentes exclusivamente em tipos musculares específicos, e, portanto, só afetam miofibrils desse tipo muscular específico. Nesse caso, 'digitar' os miofibrils é importante para discernir o efeito de mutação nos vários tipos musculares. Além disso, este exemplo ilustra a possibilidade de testar a eficácia dos compostos terapêuticos em miofibrils.
A Figura 4E mostra um traço de força ativa de um único myofibril isolado do tecido muscular esquelético do rato. O myofibril foi montado na configuração e perfundido com solução relaxante (pCa 9.0), seguido de perfusão com solução de ativação (pCa 4.5, ~0,032 mM de cálcio). Gravamos simultaneamente a força e o comprimento de sarcomere. Esta foi uma contração quase isométrica, já que a deflexão cantilever era ~0,5 μm, que era aproximadamente 1% do comprimento de folga do myofibril (~50 μm). Na Figura 4E foi realizado um protocolo de encurtamento rápido durante a contração ativa para avaliar a taxa de reenvolvimento da tensão (kTR, linha amarela tracejada). O kTR é uma medida de cinética de ciclismo transversal. Além disso, as curvas de ativação e relaxamento foram montadas para determinar a taxa de ativação (kACT, linha tracejada vermelha) e relaxamento (kREL, linha verde tracejada), respectivamente. A Figura 4 mostra uma visão mais detalhada da fase de relaxamento destacada na Figura 4F. Duas fases tornaram-se aparentes: 1) uma fase lenta inicial de relaxamento (dominada pelo descolamento da ponte transversal) e 2) uma fase rápida de relaxamento (dominada pelo descolamento transfronteiriço e dissociação de cálcio)20.
Força passiva em miofibrils isolados de uma biópsia muscular esquelética humana
A Figura 10 mostra um traço de um experimento de força passiva com um myofibril isolado do tecido muscular de diafragma humano saudável. O primeiro protocolo envolvia um ou múltiplos trechos passivos para determinar as propriedades viscoelásticas dos sarcomeres. A Figura 10 mostra um traço de força de um trecho contínuo de um myofibril (trecho do comprimento de sarcomere 2.2-3.0 μm). Durante o trecho, os myofibrils apresentaram características viscosas e elásticas. Isso é evidente a partir da curva mostrada na Figura 10A. O pico acentuado representa ambas as características, enquanto a força do planalto é uma medida de elasticidade. A viscosidade resiste à tensão linearmente. Assim, a força caiu depois que a tensão foi removida. A Figura 10B destaca o trecho em si e ilustra a alta relação sinal-ruído. Note que os traços de força não são filtrados.
Figura 1: Representação esquemática e imagens de microscopia eletrônica de um músculo esquelético e sua morfologia. (A) Mostra a estrutura do músculo esquelético e (B) mostra a estrutura do sarcomere, a menor unidade contraítil. Estas imagens esquemáticas são adaptadas da Servier Medical Art. (C) Mostra uma imagem de uma única fibra muscular e (D) mostra uma imagem de microscopia eletrônica de uma fibra muscular revelando danos miofibrilares, bem como ultraestrutura miofibrilar preservada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagens que mostram um myofibril montado, alinhamento de vidro Ɵ e agulha de montagem piezo. (A) Um myofibril montado em comprimento de folga entre as agulhas de fibra de vidro revestidas com shellac como visto através de um objetivo de 40x. (B) Imagens da posição do Ɵ-vidro em relação ao miofibril (destacado com os ovais brancos) como visto através de um objetivo de 10x. (Topo) Alinhado ao canal superior (solução relaxante, pCa 9.0); (Inferior) Alinhado ao canal inferior (solução ativante, pCa 4.5) para perfundir o miofibril com cálcio e induzir contração. (C) Representações esquemáticas da posição do Ɵ-vidro em relação ao myofibril. (Topo) Alinhado com o canal superior (solução relaxante, pCa 9.0); (Inferior) Alinhado com o canal inferior (solução ativante, pCa 4.5) para perfundir o miofibril com cálcio e induzir contração. (D) Agulha de montagem presa à haste de carbono do suporte piezo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Representação esquemática da configuração e parte final da câmara de fluxo tecidual. Em azul escuro a câmara de fluxo de tecido feita de alumínio, e em branco a cavidade em que a sonda de força e Ɵ-vidro são mostrados em posição; (Centro) Myofibril preso entre duas agulhas de montagem de fibra de vidro presas à sonda de força e motor de comprimento piezo. O Ɵ-vidro está alinhado com o myofibril. O Ɵ-vidro pode mover-se para cima e para baixo para expor o myofibril à solução de cálcio. (À direita) Close-up da sonda cantilever force. Indicados são o tamanho da cavidade (ou cavidade Fabry-Pérot, d); interfaces de reflexão A, B e C; e um exemplo de uma onda de luz emitida pelo laser (vermelho). O cantilever é montado no ombro da ferrula. A fibra que carrega o laser do interferômetro sai da ferrula na ponta do cantilever. Uma fibra de montagem de vidro é fixada no cantilever usando cera. (Canto superior esquerdo) O interferômetro analisa o sinal interferômetro transmitido ao software do controlador do sistema. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Configuração experimental e dados de experimentos de tensão ativa. (A) Representação esquemática da configuração de perfusão e das soluções utilizadas. Observe que os primeiros e últimos tubos (azul claro) contêm solução sem cálcio (ou seja, solução relaxante). (B) Exemplo de traços de força de um experimento de tensão ativa com um myofibril isolado do tecido muscular esquelético humano mostrando cinco ativações desde solução relaxante (pCa 9.0) até múltiplas soluções de ativação (pCa 6.2 – 4.5). (C) Uma curva de força-cálcio; os níveis de força nos platôs do painel (B) foram normalizados e traçados contra seus respectivos níveis de cálcio. (D) Exemplo de traço de força de um myofibril tipo II (contração rápida) isolado do músculo esquelético humano ativado com solução pCa 5.6 (azul) e posteriormente com pCa 5.6 + BTS (um inibidor de ponte transversal específica tipo II, vermelho). (E) Exemplo de traço de dados de um experimento de tensão ativa com myofibrils isolados do tecido muscular esquelético soleus do rato com um protocolo de encurtamento rápido durante a ativação para determinar a taxa de redesenvolvimento da tensão (kTR, linha amarela tracejada). Além disso, a curva de ativação e relaxamento foi montada para determinar a taxa de ativação (kACT, linha tracejada vermelha) e relaxamento (kREL, linha verde tracejada), respectivamente. (F) Um zoom da fase de relaxamento (Superior esquerdo), destacado em (E). O sinal do motor de passo rápido (Inferior esquerdo) indicou o ponto de tempo em que a solução mudou de uma solução de ativação (pCa 4.5) para uma solução relaxante (pCa 9.0). A fase de relaxamento consistiu em uma fase linear, lenta (Superior direita) e uma fase exponencial e rápida (Inferior direito). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Configuração de exemplo para o gerador de sinal no software de controle do sistema. (ver Tabela de Materiais). 1) Indica o botão para executar comandos inseridos no gerador de sinal. (A) Configuração do motor de comprimento piezo. (B) Configuração do motor de passo rápido. (C) Realizar um passo rápido para ativar um myofibril por uma duração de 5 s. (D) Realizando um rápido encurtamento-reestria de um myofibril para determinar o kTR. (E) Realizar um trecho stepwise de um myofibril para determinar as propriedades viscoelásticas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Software do controlador da válvula usado no PC. (A) O botão usado para abrir válvulas 1 (Rx) e 6 (Act). (B) O estado dos botões quando todas as válvulas estão fechadas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: Medindo o comprimento do sarcomere, o comprimento do myofibril e a largura do myofibril com o software do controlador do sistema. Uma régua é usada como exemplo. (A) Medindo o comprimento do sarcomere: a caixa roxa é colocada ao redor do myofibril e o comprimento do sarcomere é mostrado em (1). (B) Medindo o comprimento: A caixa de ciano é colocada do início ao fim do miofibril. (C) Largura de medição: Depois de girar a câmera 90°, a caixa de ciano é colocada de um lado do myofibril para o outro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Software de controlador de temperatura termoelétrica. (A) Estabelecer conexão com o controlador de temperatura termoelétrica. (B) Expanda as configurações de temperatura. (C) Definir a temperatura desejada, neste caso: 15 °C. (D) Ligue o controlador de temperatura termoelétrica e envie tensão para o módulo de refrigerador termoelétrico Peltier. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Configurações para a bomba de saída da seringa. (A) Abra a conexão com a bomba pressionando (1). (B) Inicie a bomba com configurações predefinidas pressionando (2). (C) Inicie o bombeamento de fluxo de saída definindo os 'Comandos da válvula' para ' Válvulade banho' (2) e inserindo os 'Parâmetros de Conjunto de Comando' como mostrado. Execute o comando pressionando (3). Os comandos podem ser rescindidos pressionando (4). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10: Exemplo de dados de um experimento de tensão passiva com myofibrils isolados do tecido muscular esquelético humano. (A) Gravação do comprimento da força (Superior) e sarcomere (Inferior) durante um protocolo de estiramento e liberação. (B) Zoom de (A) mostrando a força (Superior) e o comprimento de sarcomere durante a fase de estiramento do myofibril. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 11: Configuração experimental e dados de experimentos de pré-ativação de cálcio cardiomiócito. (A) Representação esquemática da configuração de perfusão. Observe que o último tubo (azul claro) contém solução livre de cálcio (solução relaxante). (B) Curvas sobrepostas de ativação de um cardiomiócito sem (azul claro) e com pré-ativação de cálcio (azul escuro), com concentrações de cálcio de 1 nM e 80 nM, respectivamente. (C) Comparação da pré-ativação do cálcio em tipo selvagem (WT) e cardiomiócitos heterozigosos RBM20 (HET) isolados do ventrículo esquerdo do rato. Este número foi modificado a partir de Najafi et al.21. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Passo | Dispositivo | Descrição | Forma | Inicial | ||||||||
| 1.7.1. | Piezo | Tensão passiva de inicialização | Fixo | 51,6 μm | ||||||||
| 1.7.2. | Piezo | Tensão ativa de inicialização | Fixo | 0 μm | ||||||||
| Passo | Dispositivo | Descrição | Forma | Inicial | Atraso | Reps | Nível | Atraso | Nível | Atraso | ||
| 3.4.4. / 4.1.1.4. / 4.1.2.4. | Passo rápido | Teste ɵ posição de vidro / Ativação do myofibril | Pulso | 4 V | 1 s | 1 x | 3 V | 5 s | 4 V | 1 s | ||
| 4.1.3.4. | Passo rápido | Ativação do myofibril (incluindo kTR) | Pulso | 4 V | 1 s | 1 x | 3 V | 10s | 4 V | 1 s | ||
| Passo | Dispositivo | Descrição | Forma | Inicial | Atraso | Reps | Nível de rampa | Duração da rampa | Atraso | Nível de rampa | Duração da rampa | Atraso |
| 4.1.3.1. / 4.1.3.6. | Piezo | Encurtamento-Restretch para kTR | Trapézio | 0 μm | 0,5 s | 1 x | 0 + 0,15 * L0 = __ μm | 0.01 s | 0.01 s | 0 μm | 0.01 s | 1 s |
| 4.2.1.1. / 4.2.1.4. | Piezo | Continua trecho | Trapézio | 51,6 μm | 2 s | 1 x | 51.6 - 0,30 * L0 = __ μm | 2 s | 0 s | 51.6 - 0,30 * L0 = __ μm | 0 s | 1 s |
| 4.2.1.4. | Piezo | Devolva myofibril ao comprimento de folga | Trapézio | 1,6 μm | 2 s | 1 x | 51,6 μm | 5 s | 0 s | 51,6 μm | 0 s | 1 s |
| 4.2.2.3. | Piezo | Estiramento stepwise | Trapézio | 51,6 μm | 2 s | 10 x | 51,6 - 5 μm | 0,5 s | 10 s | 51,6 - 5 μm | 0 s | 0 s |
| 4.2.3. | Piezo | Devolva myofibril ao comprimento de folga | Trapézio | 1,6 μm | 2 s | 1 x | 51,6 μm | 5 s | 0 s | 51,6 μm | 0 s | 0 s |
Tabela 1: Tabela descrevendo as várias configurações do gerador de sinal utilizadas no software do controlador do sistema para operar o motor de comprimento piezo e o motor de passo rápido.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Descrito é um protocolo para avaliar a função conctítil de miofibrils isolados dos tecidos musculares esqueléticos humanos ou animais. A resolução de força desta configuração foi descrita anteriormente por Chavan et al.12. Em suma, é determinado pelas flutuações aleatórias do comprimento da cavidade Fabry-Pérot formada entre a fibra de detecção e o cantilever, que produzem a parte dominante do ruído na saída da leitura (expressa em V) que, multiplicada pela sensibilidade de deflexão (expressa em m/V) e pela constante de mola do cantilever (expressa em N/m), fornece o ruído de força. Para nossa configuração, o ruído quadrado médio raiz (rms) no ar na saída da leitura, amostrado em 1.000 pontos de dados/s (amostra/s), é de aproximadamente 2 mV. Para uma medição típica de myofibril, uma sonda ferrule-top é usada com uma constante de mola de ~0,7 N/m (sensibilidade de deflexão ∼300 nm/V). Este valor rms corresponde a uma resolução de deflexão cantilever de 0,6 nm, que se traduz em uma sensibilidade de força de ~0,37 nN. A sonda de força é calibrada empurrando a ponta da agulha de montagem contra uma balança de pesagem, mantendo a dobra do cantilever igual a um múltiplo do comprimento de onda do laser de leitura13. Este método de calibração implica tanto a rigidez cantilever quanto a agulha de montagem, bem como possíveis variações no torque do cantilever e agulha de montagem devido à velocidade e magnitude da contração do miofibril. Atualmente, está disponível uma configuração para avaliar a contrailidade do miofibril, que se baseia na detecção de um laser desviado do cantilever, ou seja, deflexão óptica do feixe (1.700 A; ~1 nN de resolução de força). Este sistema foi desenvolvido por Labuda et al. usando um periscópio óptico para guiar uma luz laser em direção e longe do cantilever em configurações de restrição11. Neste sistema, um myofibril é montado entre o cantilever da força atômica e uma agulha de vidro rígida. Uma vantagem do sistema descrito aqui é a maior sensibilidade de força e relação sinal-ruído. Além disso, nesta configuração, podem ser usadas cantilevers relativamente rígidos, o que resulta em pequena deflexão cantilever quando a força miofibrilar é aplicada. Isso é importante, pois permite medições de força em comprimento sarcomere quase constante. Finalmente, em comparação com o sistema descrito por Labuda et al., o sistema aqui utiliza métodos semelhantes ou idênticos para controlar a temperatura, induzir mudanças de comprimento no miofibril e alterar as soluções de perfusão usando um motor de vidro Ɵ e de passo rápido. A vantagem do sistema descrito por Labuda et al. é que uma mudança na composição da solução (entre cantilever e periscópio óptico) não afeta a saída do sinal. No sistema aqui descrito, a composição da solução entre cantilever e fibra óptica deve permanecer constante. A solução para essa limitação é descrita com mais detalhes abaixo.
Otimização
A sonda de força óptica em combinação com o sistema de perfusão de passo rápido levou a complicações. A diferença nas propriedades ópticas entre soluções ca2+ de baixa e alta concentração interfere nas medições de força. Para evitar o refluxo da solução de alto cálcio, foi projetada uma câmara de fluxo personalizada(Figura 3). Um fluxo de fundo constante de solução livre de cálcio é induzido da direita para a esquerda para manter a solução constante entre o topo da fibra óptica e o cantilever(Figura 3D).
Para controlar a temperatura, um elemento Peltier com resfriamento líquido é montado na câmara de fluxo. Esta câmara de fluxo é termicamente desacoplada do microscópio, montando-a em um adaptador plástico. Com o elemento Peltier, controlado por um sistema TEC, é possível controlar a temperatura da solução ao longo do tempo com precisão de 0,1 °C. A temperatura é monitorada por um sensor de temperatura montado na câmara de fluxo. A estabilidade da temperatura é importante devido à natureza do transdutor de força. O cantilever consiste em uma tira de vidro revestida de ouro, efetivamente tornando-a um termômetro. Assim, o cantilever dobra com mudanças de temperatura.
A configuração utiliza um sistema de perfusão de passo rápido (ver Tabela de Materiais) para controlar o movimento do Ɵ-vidro. Este sistema permite interruptores de perfusão dentro de 10 ms. A combinação do método de controle de temperatura e comutação de soluções torna este sistema particularmente adequado para medir a cinética da contração de sarcomere (ou seja, taxas de desenvolvimento de força, redesenvolvimento de tensão e relaxamento) em myofibrils.
Inicialmente, a desvantagem do uso da interferometria foi a pequena faixa utilizável devido à necessidade de usar a parte linear da curva de interferência (λ/8, sendo λ o comprimento de onda do laser). No entanto, as inovações recentes eliminaram essa necessidade combinando modulação do comprimento de onda com um amplificador lock-in. Portanto, o sistema não se limita a uma única parte linear da curva de interferência. Isso permite a medição da deflexão infinita do cantilever14. Assim, a gama de leitura de deflexão cantilever deste sistema é muito ampliada em comparação com a interferometria tradicional. Além disso, as sondas de força descritas são fáceis de substituir e há muitas cantilevers disponíveis, com rigidezs que variam de 0,5 N/m a >20 N/m. Portanto, é possível mudar rapidamente entre cantilevers e selecionar a rigidez mais adequada para o experimento realizado.
Desafios
O sistema atual é um protótipo baseado em um sistema de medição de cardiomiócitos (ver Tabela de Materiais). Vários componentes podem ser melhorados para proporcionar uma melhor experiência ao usuário e dados de maior qualidade. Primeiro, devido aos complementos ao sistema, a vibração e a ressonância podem ser um problema que adicionará ruído ao sinal. Além disso, o suporte de vidro Ɵ e o método de fixação motora em passo rápido poderiam ser melhorados para torná-lo menos propenso à vibração.
Em segundo lugar, é desejável substituir o motor de passo rápido por um atuador de comprimento piezo para aumentar a velocidade de comutação da solução e obter um movimento mais consistente.
Em terceiro lugar, as soluções de cálcio que usamos anteriormente para ativar fibras musculares estriadas únicas incluíam ácido propiônico, mas essas soluções absorvem luz quase infravermelha, interferindo nas medidas de força. O cloreto de cálcio foi usado para eliminar a necessidade de ácido propiônico, o que reduziu muito esse efeito. Esta questão é inerente a um sistema baseado na interferometria e não está presente ao utilizar a deflexão óptica do feixe.
Em quarto lugar, um banho de fluxo personalizado foi projetado para criar um fluxo laminar, para combinar com o fluxo do Ɵ-vidro. Isso previne o backflow devido à turbulência da solução rica em cálcio. Portanto, a solução entre a ponta da fibra óptica e o cantilever permanece constante. O deslizamento com os miofibrils pode mover-se livremente sob a câmara de fluxo e, portanto, a seleção de myofibrils adequados não se limita à pequena área da câmara de fluxo.
Reprodutibilidade e variabilidade
Existem vários elementos do sistema e do protocolo que são importantes para o grau de reprodutibilidade e variabilidade dos dados obtidos.
Em primeiro lugar, a qualidade das medidas depende fortemente da qualidade do isolamento do myofibril. Protocolos idênticos produzem diferentes qualidades e quantidades de miofibrils de diferentes biópsias. Em alguns casos, biópsias mal produzem myofibrils utilizáveis ou nenhum. O consenso comum é que os myofibrils danificados se romperão durante a contração e, portanto, não são contabilizados nos resultados.
Em segundo lugar, há incerteza na determinação da área transversal do myofibril. Devido a restrições técnicas, é possível medir a largura do myofibril em apenas um plano. Portanto, para calcular a área transversal assumimos que a largura e a profundidade são iguais. Quando a força é normalizada para uma área transversal para calcular a tensão ativa máxima, deve-se estar ciente dessa suposição.
Montagem de myofibrils devido ao ângulo de montagem myofibril, posição, e a integridade da cola.
Embora o ângulo de montagem e a posição possam ser controlados visualmente, pequenas variações entre os miofibrils podem estar presentes. A integridade da cola não foi investigada extensivamente. No entanto, a integridade da cola pode ser verificada monitorando o comprimento do sarcomere no myofibril antes e depois da ativação. Quando mais sarcomeres estão entre a cola após um protocolo, isso sugere que o deslizamento do miofibril na cola ocorreu. Consequentemente, este myofibril deve ser excluído do conjunto de dados.
Outras aplicações da configuração: Pré-ativação de cálcio em cardiomiócitos isolados do ventrículo esquerdo do rato
Além de avaliar a função contratil dos miofibrils, o sistema também pode ser usado para medir a mecânica cardiomiófica. Por exemplo, a Figura 11 ilustra o uso de cardiomiócitos únicos permeabilizados isolados do ventrículo esquerdo do rato21. Ao contrário dos experimentos descritos acima, a solução relaxante foi alterada e a solução de ativação foi mantida constante. Cada cardiomiócito foi submetido a cinco conjuntos de ativações, expondo-o a uma solução de cálcio livre de 2 μM para 1 s. A restrição de tempo 1 é escolhida para imitar a natureza limitada das contrações cardíacas, onde a exposição a soluções de baixa concentração de cálcio imita a fase diastólica e a exposição a soluções de alta concentração de cálcio imita a fase sistólica da contração muscular cardíaca(Figura 11A). Para cada um dos cinco conjuntos o cálcio diastólico foi variado (1, 80, 160, 250 e 400 nM de cálcio), enquanto o cálcio sistólico permaneceu constante(Figura 11A). Um conjunto consistia de dois conjuntos de três ciclos de relaxamento de ativação a 1,8 μm versus 2,0 μm e 2,0 μm versus 2,2 μm para diferentes grupos experimentais. A força máxima foi medida a 1 s do interruptor da pipeta e média para o conjunto de três ciclos de relaxamento de ativação. A alta relação sinal-ruído e o alto alcance dinâmico desse transdutor de força nos permitiram medir tanto as pequenas mudanças na força diastólica quanto as forças sistólicas muito maiores(Figura 11B). O aumento do cálcio diastólico resultou em maior força em 2 μM de cálcio em relação à primeira ativação (Figura 11B). Os cardiomiócitos de rato WT foram comparados com cardiomiócitos de rato heterozigos (HET) RMB20. Devido à emenda alternativa, os ratos HET têm uma proteína de titina mais compatível em comparação com os ratos WT. O efeito foi exagerado nos cardiomiócitos HET a 80 e 160 μM de cálcio(Figura 11C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Michiel Helmes é acionista e coproprietário da IONOptix Inc.
Acknowledgments
Este projeto foi financiado pela AFM-Telethon e uma Fundação Construindo Força para Miopatias Nemaline. Os autores desejam reconhecer o criador dos produtos mencionados neste artigo, IONOptix Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bio Spec Products, Inc. | 985370-XL | To isolate myofibrils | |
| Custom coded | Matlab | ||
| Custom fabricated | Includes Labview program to control over serial connection; To control valves | ||
| Custom fabricated | To cool the Peltier module | ||
| Custom fabricated | |||
| Custom fabricated | Aluminum tissue chamber | ||
| Custom fabricated | To control the valves; Includes PC software to control over USB | ||
| IonOptix | System controller software: data recording software with advanced signal generator for piezo and fast-step | ||
| IonOptix | MCS100 | To record sarcomere length | |
| IonOptix | Includes: Optiforce (interferometer), Micromanipulators, Signal interface, Piezo motor and controller. Based on the MyoStretcher | ||
| IonOptix | Force probe | ||
| Koolance | ADT-EX004S | ||
| Koolance | EX2-755 | To cool the Peltier module | |
| Microsoft | Data registration | ||
| Olympus | IX71 | ||
| Olympus | TH4-200 | ||
| Sigma-Aldrich | 529265 | Poly(2-hydroxyethyl methacrylate); Coating for microscope slides to prevent sticking of tissue | |
| Sigma-Aldrich | 78471 | Crystals to dissolve in ethanol resulting in glue | |
| TE Technology, Inc. | TE-63-1.0-1.3 | To cool the tissue flow chamber | |
| TE Technology, Inc. | TC-720 | Includes PC software to control over USB | |
| Tecan Trading AG | 20736652 | ||
| Tecan Trading AG | 20739263 | Syringe pump to induce backgroundflow together with fast-step perfusion system; Outflow from tissue flow chamber | |
| Thermo scientific | 2441081 | ||
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | Discontinued | Alternative: SF-77CST/VCS-77CSP | |
| Warner Instruments (Harvard Bioscience, Inc.) | TG150-4 | To perfuse the tissue | |
| 1 PC for IonWizard and 1 PC for other software |
References
- Winter, J. M., Ottenheijm, C. A. C.
- Colomo, F., Piroddi, N., Poggesi, C., te Kronnie, G., Tesi, C. Active and passive forces of isolated myofibrils from cardiac and fast skeletal muscle of the frog. Journal of Physiology. 500, Pt 2 535-548 (1997).
- Kulke, M., et al. a major source of myofibrillar stiffness in Drosophila indirect flight muscle. Journal of Cell Biology. 154, 1045-1057 (2001).
- Stehle, R., et al. Isometric force kinetics upon rapid activation and relaxation of mouse, guinea pig and human heart muscle studied on the subcellular myofibrillar level. Basic Research in Cardiology. 97, Suppl 1 127-135 (2002).
- Iorga, B., et al. Micromechanical function of myofibrils isolated from skeletal and cardiac muscles of the zebrafish. Journal of General Physiology. 137, 255-270 (2011).
- Ribeiro, P. A. B., et al. Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: Effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase. International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).
- Joureau, B., et al. Dysfunctional sarcomere contractility contributes to muscle weakness in ACTA1-related nemaline myopathy (NEM3). Annals of Neurology. 83, 269-282 (2018).
- de Souza Leite, F., Minozzo, F. C., Altman, D., Rassier, D. E. Microfluidic perfusion shows intersarcomere dynamics within single skeletal muscle myofibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114, 8794-8799 (2017).
- Shalabi, N., Cornachione, A., de Souza Leite, F., Vengallatore, S., Rassier, D. E. Residual force enhancement is regulated by titin in skeletal and cardiac myofibrils. Journal of Physiology. 595, 2085-2098 (2017).
- Cornachione, A. S., Leite, F., Bagni, M. A., Rassier, D. E. The increase in non-cross-bridge forces after stretch of activated striated muscle is related to titin isoforms. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 310, 19-26 (2016).
- Labuda, A., Brastaviceanu, T., Pavlov, I., Paul, W., Rassier, D. E. Optical detection system for probing cantilever deflections parallel to a sample surface. Review of Scientific Instruments. 82, 013701 (2011).
- Chavan, D., et al. Ferrule-top nanoindenter: an optomechanical fiber sensor for nanoindentation. Review of Scientific Instruments. 83, 115110 (2012).
- Beekmans, S. V., Iannuzzi, D. A metrological approach for the calibration of force transducers with interferometric readout. Surface Topography: Metrology and Properties. 3, (2015).
- van Hoorn, H., Kurniawan, N. A., Koenderink, G. H., Iannuzzi, D. Local dynamic mechanical analysis for heterogeneous soft matter using ferrule-top indentation. Soft Matter. 12, 3066-3073 (2016).
- Winter, J. M., et al. KBTBD13 is an actin-binding protein that modulates muscle kinetics. Journal of Clinical Investigation. , (2019).
- Winter, J. M., et al. Mutation-specific effects on thin filament length in thin filament myopathy. Annals of Neurology. 79, 959-969 (2016).
- Ottenheijm, C. A. C., et al. Deleting exon 55 from the nebulin gene induces severe muscle weakness in a mouse model for nemaline myopathy. Brain. 136, 1718-1731 (2013).
- Ribeiro, P. A., et al. Contractility of myofibrils from the heart and diaphragm muscles measured with atomic force cantilevers: effects of heart-specific deletion of arginyl-tRNA-protein transferase. International Journal of Cardiology. 168, 3564-3571 (2013).
- Pinniger, G. J., Bruton, J. D., Westerblad, H., Ranatunga, K. W. Effects of a Myosin-II Inhibitor (N-benzyl-p-toluene Sulphonamide, BTS) on Contractile Characteristics of Intact Fast-twitch Mammalian Muscle Fibres. Journal of Muscle Research and Cell Motililty. 26, 135-141 (2005).
- Stehle, R., Krüger, M., Pfitzer, G. Force kinetics and individual sarcomere dynamics in cardiac myofibrils after rapid Ca(2+) changes. Biophysics Journal. 83, 2152-2161 (2002).
- Najafi, A., et al. End-diastolic force pre-activates cardiomyocytes and determines contractile force: role of titin and calcium. Journal of Physiology. 597, 4521-4531 (2019).
