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Immunology and Infection

Isolando Tecidos do Sistema Nervoso Central e Meninges Associadas para Análise a Jusante de Células Imunes

Published: May 19, 2020 doi: 10.3791/61166
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2, 1, 1, 1
1Department of Neurology, Geisel School of Medicine, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 2Program in Experimental and Molecular Medicine, Dartmouth College

Summary

Este artigo apresenta dois protocolos otimizados para examinar células imunes residentes e derivadas periféricas dentro do sistema nervoso central, incluindo cérebro, medula espinhal e meninges. Cada um desses protocolos ajuda a determinar a função e a composição das células que ocupam esses compartimentos em condições de estado estacionário e inflamatório.

Abstract

O sistema nervoso central (SNC) é composto pelo cérebro e pela medula espinhal e é envolto pelas meninges, camadas membranosas que servem de barreira entre a periferia e o SNC. O SNC é um sítio imunologicamente especializado e, em condições de estado estacionário, o privilégio imunológico é mais evidente no parênquima do SNC. Em contraste, as meninges abrigam uma gama diversificada de células residentes, incluindo células imunes inatas e adaptativas. Durante condições inflamatórias desencadeadas por lesão do SNC, autoimunidade, infecção ou mesmo neurodegeneração, células imunes derivadas da periferia podem entrar no parênquima e se instalar dentro das meninges. Acredita-se que essas células realizem ações benéficas e prejudiciais durante a patogênese da doença do SNC. Apesar desse conhecimento, as meninges são frequentemente negligenciadas quando se analisa o compartimento do SNC, pois os métodos convencionais de extração tecidual do SNC omitem as camadas meníngeas. Este protocolo apresenta dois métodos distintos para o isolamento rápido de tecidos murinos do SNC (isto é, cérebro, medula espinhal e meninges) que são adequados para análise a jusante através de técnicas de célula única, imunohistoquímica e métodos de hibridização in situ. Os métodos descritos fornecem uma análise abrangente dos tecidos do SNC, ideal para avaliar o fenótipo, a função e a localização das células que ocupam o compartimento do SNC sob condições homeostáticas e durante a patogênese da doença.

Introduction

O sistema nervoso central (SNC) é um sítio imunologicamente especializado. O parênquima do SNC, excluindo o espaço liquórico, as meninges e a vasculatura, é classicamente visto como um sítio imunoprivilegiado 1,2,3,4,5 e é relativamente desprovido de células imunes durante condições homeostáticas2,6,7. Em contraste, as meninges, compostas pelas camadas dura, aracnoide e pia, são componentes cruciais do compartimento do SNC, participando ativamente da vigilância imunológica homeostática e dos processos inflamatórios durante a patogênese da doença 3,6,7,8. Durante condições de estado estacionário, as meninges suportam numerosas células sentinelas imunes, incluindo células linfoides inatas (ILC), macrófagos, células dendríticas (DC), mastócitos, células T e, em menor grau, células B 9,10,11.

As meninges são estruturas altamente vascularizadas e contêm vasos linfáticos que fornecem uma conexão linfática entre o SNC e sua periferia8,12,13,14. Em condições inflamatórias induzidas por lesão do SNC, infecções, autoimunidade ou mesmo neurodegeneração, células imunes derivadas da periferia infiltram o parênquima e alteram a paisagem imune dentro das meninges. Após a infiltração celular, as meninges podem representar um nicho funcional para células imunes derivadas da periferia, promovendo agregação de células imunes, ativação de células imunes locais e sobrevivência a longo prazo no compartimento do SNC. Inflamação meníngea proeminente é observada em múltiplas doenças que afetam o SNC, incluindo esclerose múltipla (EM)15,16,17,18,19, acidente vascular cerebral 20,21, lesão estéril 22,23 (i.e., lesão medular e traumatismo cranioencefálico), enxaqueca 24 e infecção microbiana 25,26,27,28,29. Assim, a caracterização de células residentes e células imunes derivadas periféricas no compartimento meníngeo é essencial para a compreensão do papel dessas células durante condições de estado estacionário e patogênese da doença.

A extração do cérebro, medula espinhal e meninges do crânio e corpos vertebrais é tecnicamente desafiadora e demorada. Atualmente, não há técnicas disponíveis para a extração rápida do cérebro com as três camadas meníngeas intactas. Embora a laminectomia produza excelente morfologia do tecido medular e preserve as camadas meníngeas, é extremamente demorada e complicada30,31. Por outro lado, métodos de extração mais convencionais, como a remoção do cérebro do crânio e a extrusão hidráulica da medula espinhal, facilitam a rápida extração do tecido do SNC, mas tanto a meninge aracnoide quanto a dural são perdidas com essas técnicas30,31. A omissão das camadas dura-máter e aracnoide durante o isolamento convencional dos tecidos do cérebro e da medula espinhal resulta em uma análise incompleta das células dentro do compartimento do SNC. Assim, a identificação de novas técnicas focadas na extração rápida de tecidos do SNC com meninges intactas é crucial para a análise ótima do compartimento do SNC.

Este manuscrito apresenta dois métodos para a extração rápida do cérebro, medula espinhal e meninges de camundongos, facilitando a análise a jusante de células residentes e células imunes derivadas da periferia no parênquima do SNC e meninges. Esses protocolos otimizados concentram-se em 1) isolar suspensões unicelulares para análise a jusante e 2) preparar o tecido para processamento histológico. A obtenção de suspensões unicelulares do cérebro, tecido medular e meninges durais e aracnoides32 permite a análise simultânea de células residentes nos compartimentos parenquimatoso e meníngeo. Suspensões unicelulares podem ser usadas em diferentes aplicações, incluindo ensaios de cultura celular para realizar estimulação in vitro 33, imunospot ligado à enzima (ELISpot)28,34,35, citometria de fluxo 36,33 e transcriptômica de célula única 37 ou em massa. Além disso, o protocolo otimizado para descalcificação de cérebros inteiros e medula espinhal com crânios ou colunas vertebrais intactos, respectivamente, permite a descalcificação suave do osso circundante, deixando as meninges intactas e preservando a morfologia tecidual. Este método permite a identificação seletiva de proteínas ou RNA usando técnicas de imunohistoquímica (IHQ) ou hibridização in situ (HIS) dentro dos espaços parenquimatoso e meníngeo. A caracterização do fenótipo, estado de ativação e localização de células residentes e células imunes derivadas periféricas dentro do SNC pode fornecer informações essenciais para a compreensão de como tipos celulares individuais no compartimento do SNC contribuem para a homeostase e patogênese da doença.

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Protocol

Todo trabalho com animais utiliza protocolos revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Escola de Medicina Geisel de Dartmouth.

1. Processamento de amostras de cérebro e medula espinhal para descalcificação

  1. Isolamento de amostras de cérebro e medula espinhal
    1. Eutanásia do rato por inalação de CO2 . Certifique-se de que a taxa de fluxo de CO2 desloca de 10% a 30% do volume da gaiola por minuto.
    2. Usando pinças, levante o processo xifoide e corte a parede abdominal lateralmente logo abaixo da caixa torácica com uma tesoura, puxando para cima para evitar cortar vasos sanguíneos ou órgãos subjacentes. Corte o diafragma lateralmente.
    3. Corte a caixa torácica ao longo das bordas laterais paralelas aos pulmões até a clavícula. Usando pinças, levante o esterno e pinça o esterno com um hemostático. Coloque o hemostático sobre a cabeça para levantar a caixa torácica e expor o coração.
    4. Usando pinças, segure o coração perto de seu ápice e faça uma incisão no átrio direito do coração para fornecer uma saída. Insira uma agulha de 25 G com uma seringa de 10 mL conectada para administrar lentamente 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) gelada no ventrículo esquerdo para perfundir transcardialmente o camundongo.
      NOTA: A perfusão deve ocorrer durante 4 a 5 minutos até que o fígado seja limpo de sangue. Um total de 10 mL de 1x PBS geralmente é suficiente para a perfusão, mas mais pode ser utilizado se necessário. Um fígado claro geralmente indica perfusão adequada.
    5. Com tesoura afiada, retirar a cabeça por decapitação (Figura 1; 1). Faça uma incisão na linha média da pele (Figura 1; 2) e vire a pele sobre os olhos para liberar o crânio.
    6. Corte no osso nasal para liberação da mandíbula do crânio (Figura 1; 3). Remova a mandíbula, a língua e os olhos. Corte ao longo das faces laterais do crânio para liberar o tecido ao longo do conduto auditivo externo (Figura 1; 4). Corte para remover todo o excesso de pele, músculo e tecido que cobre o crânio.
    7. Separe a caixa torácica da coluna vertebral cortando paralelamente à coluna vertebral com tesoura afiada (Figura 1; 5 e 6). Realizar um pequeno corte na região lombar inferior para isolar a coluna vertebral (Figura 1; 7). Aparar e remover qualquer músculo remanescente ao longo da coluna vertebral para expor as vértebras (Figura 1; 8).
      NOTA: A remoção do excesso de tecido da coluna vertebral e do crânio é necessária para obter uma penetração adequada do tampão de descalcificação do fixador paraformaldeído (PFA) e do ácido etilenodiaminotetracético (EDTA).
  2. Pós-fixação, descalcificação e criopreservação
    1. Usando pinças, colocar o cérebro com o crânio intacto ou a coluna vertebral em um tubo cônico de 15 mL contendo 10 mL de PFA a 4%. Colocar os tubos a 4 °C durante, pelo menos, 48 h para uma fixação adequada.
      NOTA: Para evitar a sobrefixação do tecido, não exceda 72 h de fixação. Os tempos de fixação dos espécimes ósseos são prolongados antes da descalcificação. A fixação adequada protegerá o tecido dos efeitos da descalcificação e garantirá melhor morfologia tecidual.
    2. Enxaguar o cérebro ou a medula espinhal removendo o tecido do PFA a 4% com pinça e colocando o tecido em um tubo descartável de 14 mL com 10 mL de PBS 1x por 5 min. Transferir o cérebro ou a medula espinhal para um tubo cônico de 50 mL com 10 mL de EDTA a 10% (pH = 7,2–7,4).
      NOTA: O uso de um tubo maior com 10 mL de EDTA proporciona ao EDTA uma maior área de contato com o tecido e acelera o processo de descalcificação.
    3. Verifique diariamente se o osso está macio e maleável: retire o tecido da solução de EDTA com pinças, coloque-o em uma placa de Petri e teste suavemente a maciez óssea com uma agulha de 25 G. Se a agulha penetrar facilmente no osso, o processo de descalcificação está completo.
    4. Retire o tecido da solução de EDTA e transfira o cérebro ou a medula espinhal para um tubo descartável de 14 mL contendo 10 mL de PBS 1x e lave por 10 min. Repita a lavagem.
      NOTA: A descalcificação geralmente leva de 2 a 3 dias. A solução deve ser trocada a cada 2–3 dias se o osso ainda não estiver adequadamente descalcificado. No entanto, a incubação prolongada em EDTA após a descalcificação do osso pode danificar a morfologia tecidual.
    5. Prepare soluções de sacarose a 10%, 20% e 30% adicionando sacarose a 1x PBS. Por exemplo, para 10% de sacarose, adicione 10 g de sacarose e leve o volume para 100 mL usando 1x PBS estéril. Conservar a solução a 4 °C durante um período máximo de 1 mês.
      NOTA: As soluções de sacarose são propensas ao crescimento de microrganismos, pelo que as amostras não devem ser armazenadas durante períodos prolongados de tempo nestas soluções.
    6. Retire o tecido do PBS 1x, coloque-o em 10 mL de solução de sacarose a 10% e armazene-o a 4 °C. Deixe o tecido descansar por 24 h ou até afundar no fundo do tubo.
    7. Repita este processo, movendo o tecido para uma solução de sacarose a 20% primeiro e, finalmente, para uma solução de sacarose a 30%. Deixar o tecido afundar em sacarose a 30% (pelo menos 24 h) e proceder à inclusão do tecido.
  3. Incorporação e congelamento de tecidos
    1. Usando pinças, retire o tecido da sacarose a 30%, coloque-o em uma placa de Petri e incline a placa para se livrar de qualquer excesso de solução de sacarose no tecido. Usando um bisturi, corte o tecido em segmentos desejados.
    2. Crie uma camada fina de composto de temperatura de corte ideal (OCT) na parte inferior do criomold e coloque a(s) peça(s) de tecido no molde. Cubra completamente o tecido com o composto OCT, garantindo que não haja bolhas.
    3. Congelar os blocos pairando sobre nitrogênio líquido38 ou colocando os blocos em uma pasta de gelo seco39 com isopropanol 100% até que o bloco fique opaco. Embrulhe os criomoldes em papel alumínio e armazene os blocos a -80 °C para armazenamento a longo prazo. Mova os blocos para -20 °C antes de seccionar.
      NOTA: Deve-se ter cuidado ao seccionar e realizar protocolos histológicos em cérebros descalcificados, pois as camadas craniana e meníngea podem ser perdidas se os cortes forem manuseados grosseiramente.

2. Preparo das meninges e tecidos do SNC para coloração por citometria de fluxo

  1. Extraindo a calota craniana e o cérebro
    1. Com tesoura afiada, retirar a cabeça por decapitação (Figura 2A; 1). Com tesoura, fazer uma incisão mediana na pele (Figura 2A; 2) e virar a pele sobre os olhos para liberar o crânio.
    2. Coloque a tesoura dentro do forame magno e comece a cortar o crânio lateralmente ao longo dos córtices em direção ao bulbo olfatório, mantendo as incisões acima do conduto auditivo externo e da mandíbula (Figura 2A; 3). Realizar os mesmos cortes no lado oposto, com cortes que se encontram no bulbo olfatório para liberar a calota craniana do cérebro (Figura 2A; 3).
    3. Usando pinças, descasque a calota craniana e coloque a calota craniana em um tubo cônico de 15 mL contendo 5 mL de meio RPMI frio suplementado com HEPES 25 mM. Mantenha o tubo no gelo.
    4. Usando pinças curvas, coloque a pinça abaixo da base do cérebro e levante para libertar o cérebro da calota craniana. Coloque o cérebro em um tubo cônico de 15 mL contendo 5 mL de RPMI frio suplementado com 25 mM HEPES. Mantenha o tubo no gelo até o processamento.
  2. Extração da coluna vertebral e tecido medular
    1. Com pinça e tesoura afiada, separar a caixa torácica da coluna vertebral cortando paralelamente à coluna vertebral (Figura 2A; 4 e 5). Realizar um pequeno corte na região lombar inferior para isolar a coluna vertebral (Figura 2A; 6). Aparar e remover qualquer músculo remanescente ao longo da coluna vertebral para expor as vértebras (Figura 2A; 7).
    2. Coloque a tesoura cirúrgica extrafina dentro da coluna vertebral e corte ao longo da borda lateral da coluna (Figura 2C). Cortar completamente a borda lateral oposta para dividir a coluna vertebral em uma porção anterior e posterior.
      NOTA: A medula espinhal permanecerá presa à coluna vertebral.
    3. Com pinças, descasque lenta e cuidadosamente a medula espinhal da coluna vertebral e coloque o tecido em um tubo cônico de 15 mL contendo 5 mL de RPMI fria com HEPES 25 mM. Transferir as porções anterior e posterior da coluna vertebral para um tubo cônico de 15 mL contendo 5 mL de RPMI fria com HEPES 25 mM.
  3. Remoção das meninges para preparar suspensões unicelulares
    1. Usando pinças, remova a calota craniana da mídia RPMI. Usando pinças afiadas (pinça #7; Tabela de Materiais), escore ao redor da borda externa da calota craniana (Figura 2B) e descasque as meninges para longe da borda da calota craniana, raspando para remover as meninges dural e aracnoide. Coloque as meninges em uma placa de Petri.
      NOTA: A remoção das meninges do cérebro e da medula espinhal requer prática. Se o usuário tiver dificuldade para extrair as meninges, use um microscópio dissecante para ajudar na remoção.
    2. Retire a coluna vertebral do tubo. Usando pinças afiadas, escore ao redor das bordas da coluna vertebral para liberar as meninges e descasque as meninges da borda da vértebra usando pinças curvas. Coloque as meninges em uma placa de Petri.
    3. Coloque um filtro de tela de nylon em um tubo cônico de 50 mL. Mover as meninges para o filtro e adicionar 3 mL de RPMI suplementado com 25 mM HEPES. Usando o êmbolo de uma seringa de 5 mL, triture o tecido e o meio através do filtro.
    4. Usando uma pipeta sorológica de 5 mL, lave o filtro com mais 2 a 3 mL de meio RPMI/HEPES até que todo o tecido visível tenha passado pelo filtro.
      NOTA: Para obter números de células adequados para análise por citometria de fluxo, meninges de vários animais podem precisar ser agrupadas. Neste experimento (Figura 3 e Figura 4), as meninges do cérebro e da medula espinhal de 4 a 5 camundongos foram agrupadas. Se as amostras forem agrupadas, será necessário um meio adicional para triturar o tecido através do filtro de malha de nylon para evitar o superaquecimento do tecido.
    5. Usando uma pipeta sorológica de 10 mL, transferir as células e o meio para um tubo cônico fresco de 15 mL. Com pipeta sorológica de 10 mL, lave o tubo cônico de 50 mL com 5 mL de meio para coletar as células restantes. Centrifugar a 450 x g durante 5 min a 4 °C para pellet das células.
    6. Usando uma pipeta de Pasteur com vácuo, aspirar o sobrenadante tomando cuidado para evitar a pastilha celular e ressuspender as células em um volume e tampão apropriados.
    7. Para contar a suspensão de célula única, diluir um pequeno volume de células (isto é, 5–10 μL) usando corante de exclusão azul de tripano (diluição 1:10) e RPMI. Adicionar 10 μL da diluição ao hemocitômetro.
    8. Conte as células conforme descrito anteriormente40,41, com uma média de pelo menos duas grades de 16 quadrados para precisão.
      NOTA: Na Figura 3, por exemplo, células agrupadas e peletizadas das meninges foram ressuspensas em 250 μL de tampão de classificação celular ativada por fluorescência (FACS) (1x PBS com 1% FBS) para coloração a jusante da superfície. As células foram diluídas 1:10 para contagem (5 μL células, 5 μL de azul de tripano, 40 μL de RPMI). Essa diluição produziu entre 50 e 100 células por 16 grades quadradas, garantindo uma contagem celular mais precisa porque as células não são nem muito densas e sobrepostas, nem muito esparsas. As contagens de células nucleadas de meninges agrupadas do cérebro e da medula espinhal por camundongo foram as seguintes: Para meninges de camundongos de tratamento simulado = 100.000–150.000 células e para meninges de camundongos da doença desmielinizante induzida pelo vírus da encefalomielite murina de Theiler (TMEV-IDD) = 300.000–350.000 células. As contagens de células variam dependendo da precisão da coleta, do processamento e se a inflamação meníngea está presente.
    9. Proceder à técnica unicelular desejada, como superfície FACS (Figura 3)14,36,42,43,44, protocolos de coloração intracelular 33,45, estimulação in vitro, ensaios de cultura celular 33,46,47, ensaio ELISPOT 28,34,35 e massa ou unicelular transcriptômica37,48.
      NOTA: Mantenha todos os tubos no gelo entre as etapas de processamento.
  4. Preparação de suspensões unicelulares de tecido cerebral e medular
    1. Transfira o tecido cerebral ou da medula espinhal com o meio para o topo da placa de Petri de 100 mm, despejando o tecido e o meio do tubo. Usando pinças, mova o tecido para o fundo da placa de Petri. Pique finamente o cérebro ou a medula espinhal com uma lâmina de barbear estéril. Usando a lâmina de barbear, mova o tecido picado para o fundo da placa raspando para coletar o tecido.
      NOTA: Para o protocolo de digestão enzimática abaixo, até duas medulas, podem ser agrupadas para processamento. Os cérebros devem ser processados individualmente.
    2. Usando uma pipeta sorológica de 5 mL, adicionar 3 mL de RPMI suplementado com 10% de soro fetal de bezerro (FCS) à placa de Petri. Com pipeta sorológica de 10 mL, pipetar para cima e para baixo para ressuspender o tecido no meio e transferir para um tubo cônico de 15 mL.
      NOTA: Se a aplicação a jusante for análise de sequenciamento de RNA de célula única ou em massa ou cultura de células, os lotes FCS devem ser testados para garantir que as células não sejam ativadas antes da análise. Alternativamente, as células podem ser processadas usando 1x PBS com 0,04% BSA em vez de RPMI com 10% FCS.
    3. Usando uma pipeta sorológica de 10 mL, lave a placa de Petri com mais 2 mL de meio para coletar qualquer tecido residual e transferir para um tubo cônico para um volume total de 5 mL. Mantenha os tubos no gelo entre as etapas de processamento.
    4. Com uma pipeta, ressuspenda o pó de colagenase I em meio Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) para obter a concentração desejada (i.e., 100 mg/mL). Adicionar colagenase tipo I ao tubo cônico contendo a amostra de tecido picado para obter a concentração final desejada (isto é, 50 μL por 1 mg/mL).
      NOTA: Concentrações mais elevadas de colagenase aumentarão o rendimento celular, mas podem clivar marcadores de superfície celular. Portanto, os lotes de colagenase I devem ser titulados para determinar a concentração ideal necessária para obter o maior número de células viáveis com todos os marcadores de superfície celular necessários intactos. Por exemplo, a colagenase I foi testada nas concentrações finais de 0,5 mg/mL, 1 mg/mL e 2 mg/mL em amostras de cérebro único ou medula espinhal. A viabilidade celular foi determinada pelo método de exclusão do azul de tripano e os marcadores de superfície celular CD45, CD19 e CD4 foram avaliados por citometria de fluxo. Uma concentração de 1 mg/mL de colagenase I produziu a maior contagem de células vivas, mantendo todos os marcadores de superfície celular de interesse. Assim, essa concentração foi utilizada para novos experimentos examinando esses tipos celulares.
    5. Ressuspenda suavemente o pó de DNase I usando cloreto de sódio 0,15 M até a concentração de estoque desejada. Adicionar a DNase I ressuspensa ao tubo cónico contendo a amostra de tecido picado para obter uma concentração final de 20 U/ml.
      NOTA: Os lotes da DNase I variam de acordo com as unidades de atividade por mL. A concentração a ser adicionada à amostra de tecido mudará com base nas unidades de atividade do frasco para injetáveis por mililitro. A concentração final desejada por amostra é de 20 U/mL.
    6. Coloque os tubos num suporte de tubo em banho-maria a 37 °C e incube durante 40 minutos. Inverta os tubos a cada 15 min para misturar completamente o tecido com as enzimas. Após a incubação, adicionar 500 μL de EDTA 0,1 M (pH = 7,2) a cada tubo para uma concentração final de EDTA 0,01 M e incubar por mais 5 min para inativar a colagenase.
    7. Usando uma pipeta sorológica de 10 mL, adicione 9 mL de RPMI suplementado com 10% de SFB a cada tubo para trazer o volume de cada tubo para ~14,5 mL. Centrifugar a 450 x g durante 5 min a 4 °C. Usando uma pipeta de Pasteur com vácuo, aspirar o sobrenadante tomando cuidado para não tocar no pellet celular.
    8. Usando uma pipeta sorológica de 5 mL, adicionar 3 mL de solução de gradiente de densidade isotônica estoque a 100% ao tubo contendo o pellet de células. Usando uma pipeta sorológica de 10 mL, adicione um meio RPMI 10% FCS adicional para trazer o volume final para 10 mL e ressuspenda o pellet de células para criar uma camada de solução de gradiente de densidade isotônica de 30%.
      NOTA: Prepare o meio de gradiente de densidade isotônico de estoque de 100% com antecedência, alíquota e armazene a 4 °C por até 3 meses. Para preparar a solução de gradiente de densidade isotônica de estoque de 100%, dilua o meio de gradiente de densidade (Tabela de Materiais) com tampão de diluição do meio de gradiente de densidade. Preparar o tampão de diluição do meio com gradiente de densidade (80,0 g/L NaCl, 3,0 g/L KCl; 0,73 g/L Na2 HP0 4, 0,20 g/L KH2HP04; 20,0 g/L glicose) e esterilizar o filtro usando um sistema de filtro a vácuo. Faça a solução de gradiente de densidade isotônica de estoque de 100% misturando 1 parte do tampão de diluição de gradiente de densidade e 9 partes de mídia de gradiente de densidade. Misture bem.
    9. Inverta e misture bem cada tubo antes de adicionar a solução de gradiente de densidade isotônica de 70% subjacente. Introduzir uma pipeta serológica de 1 ml contendo 1 ml de solução de gradiente de densidade isotónica de 70% no fundo do tubo. Subpor lentamente 1 mL da solução, tomando cuidado para não formar bolhas. Remover lentamente a pipeta sorológica do tubo, tomando cuidado para não perturbar o gradiente.
      NOTA: Para o underlay de 70%, a solução de gradiente de densidade isotônica de estoque de 100% deve ser diluída a 70% usando meio RPMI (ou seja, 7 mL de solução de gradiente de densidade isotônica de estoque a 100% e 3 mL de meio RPMI bem misturado). Além disso, a criação de uma camada limpa e não perturbada de 70% é essencial para a remoção de detritos de mielina e para a obtenção de suspensões unicelulares puras na interface gradiente após centrifugação.
    10. Centrifugar a 800 x g por 30 min a 4 °C sem freio. Aspirar o sobrenadante, incluindo a camada de debris de mielina até que 2–3 mL permaneçam no tubo, tomando cuidado para não perturbar a camada celular. Colher a camada celular entre o gradiente de densidade de 30/70% usando uma pipeta de 1 mL e transferir para um novo tubo cônico de 15 mL.
    11. Usando uma pipeta sorológica de 10 mL, adicione o meio RPMI 10% FCS para trazer o volume final para 15 mL. Centrifugar 450 x g durante 5 min a 4 °C.
      Observação : durante esta etapa, camadas de célula de dois tubos podem ser agrupadas, se necessário. Não junte mais de dois tubos ou as células não serão granuladas devido a uma concentração de meio de gradiente de alta densidade.
    12. Aspirar o sobrenadante cuidadosamente para não perturbar o pellet celular. Ressuspender as células em um volume/tampão apropriado para contar as células usando um hemocitômetro (por exemplo, ressuspender uma única medula espinhal em 250 μL de tampão FACS para coloração da superfície a jusante) (Figura 3).
    13. Usando uma pipeta de 1 mL, transfira as suspensões celulares para a parte superior de um tubo superior do filtro (Tabela de Materiais) e permita que as células filtrem para o fundo do tubo para remover quaisquer detritos de mielina restantes.
    14. Usando o corante de exclusão azul de tripano, diluir e contar as células em um hemocitômetro com uma média de pelo menos duas grades de 16 quadrados para precisão40,41.
    15. Prossiga com a técnica de análise de célula única desejada.
      NOTA: Usando várias formas de colagenase (i.e., D, tipo I, tipo II, tipo IV), células imunes, micróglia (Figura 3), astrócitos, pericitos, células endoteliais49 e neurônios50 podem ser eficientemente isolados. As contagens de células nucleadas obtidas para os resultados foram as seguintes usando a enzima colagenase I titulada: Cérebro inteiro tratado com simulação = 500.000–600.000 células; Cérebro inteiro de DTI-TMEV = 800.000–1.000.000 células; Medula espinhal toda tratada com simulação = 150.000–200.000 células; Medula espinhal total de DTI-TMEV = 300.000–400.000. As contagens de células variam dependendo da precisão da coleta, do processamento e da presença de inflamação do SNC.

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Representative Results

Este experimento representativo teve como objetivo quantificar as células B e T e descrever a localização das células B e T nos compartimentos meníngeo e parenquimatoso do SNC em condições homeostáticas, bem como em um modelo murino de EM progressiva (i.e., IDD-TMEV). O DDI-TMEV foi induzido em camundongos SJL fêmeas com 5 semanas de idade por infecção intracraniana com 5 x 106 unidades formadoras de placa (UFP) de TMEV BeAn, conforme descrito anteriormente29.

O presente estudo avaliou células B e T nas meninges, cérebro e medula espinhal durante a DTI crônica de VTM no 120º dia pós-infecção. Camundongos sham-treated tratados pareados por idade foram usados como controle. O estudo foi composto por dois experimentos. O primeiro concentrou-se na obtenção de suspensões unicelulares para avaliação por citometria de fluxo, uma técnica bem estabelecida para analisar e quantificar a composição celular por meio da avaliação de antígenos de superfície celular e/ou intracelulares (n = 4 sham-tratados; n = 5 TMEV-IDD). O segundo experimento concentrou-se em descrever a localização de células B e T no compartimento do SNC utilizando imunohistoquímica em tecidos cerebrais e medulares descalcificados (n = 3 sham-tratados; n = 8 TMEV-IDD).

Após o isolamento de suspensões unicelulares do cérebro, medula espinhal e meninges agrupadas (cérebro e medula espinhal) de camundongos TMEV-IDD e sham-tratados, um protocolo de coloração de superfície foi aplicado a todas as amostras. Resumidamente, as suspensões unicelulares foram incubadas com uma coloração de exclusão de viabilidade fixável (780) por 15 min, lavadas, bloqueadas com bloqueio Fc na presença de soro de camundongo por 15 min e coradas com anticorpos conjugados para marcadores de superfície celular, incluindo CD45 (30-F11; PerCP-Cy5.5), CD19 (1D3; PE-CF594) e CD4 (GK1,5; EP) por 30 min, conforme previamente descrito28,29. As células foram então lavadas e analisadas por citômetro de fluxo28,29. O gating de viabilidade foi conduzido conforme descrito anteriormente28. A expressão de CD45 foi avaliada para distinguir células imunes infiltrantes (P1) derivadas periféricas de CD45 hi de CD45lo microglia (P2) e neurônios CD45-, astrócitos e oligodendrócitos no cérebro e na medula espinhal (P3; Figura 3A). Em camundongos sham-tratados, poucas célulashi CD45 estavam presentes na medula espinhal e no tecido cerebral. Nas meninges, o mesmo ponto de corte para a expressãode CD45 hi utilizado para os dados do cérebro e da medula espinhal foi aplicado para identificar as células imunes CD45hi (P1; Figura 3C) e excluir células não imunes presentes nas meninges (isto é, fibroblastos, células endoteliais). Em camundongos sham-tratados, poucas célulashi CD45 (<0,1%) estavam presentes nas meninges. Entre as células imunes CD45hi nos tecidos do SNC do TMEV-IDD, as células B e as células T CD4 foram identificadas pela expressão superficial de CD19 e CD4, respectivamente (Figura 3B–D). Em todos os tecidos do TNSC TMEV-IDD, foram observadas porcentagens aumentadas de células imunes CD45hi em comparação com camundongos tratados com simulação (Figura 4A). Durante a DTI crônica do TMEV, a porcentagem de células B entre as células imunes CD45hi no cérebro e na medula espinhal foi maior em comparação com o compartimento meníngeo (Figura 4B).

Para identificar a localização de células B e células T dentro do compartimento do SNC durante a DDI crônica de VDI, cérebros e medula espinhais descalcificados foram avaliados por imunohistoquímica usando o protocolo de coloração descritoanteriormente29. As meninges e vasculatura foram demarcadas utilizando-se laminina, componente da membrana basal29,51 e ER-TR7, marcador de células reticulares de fibroblastos52,53. Durante a extração convencional do encéfalo da calota craniana, a camada pia estava intacta, mas as camadas meníngeas restantes foram excluídas (Figura 5A). Na medula espinhal, a extrusão hidráulica resultou na ausência de todas as camadas meníngeas (dados não mostrados). Tanto no encéfalo descalcificado quanto na medula espinhal, todas as camadas meníngeas estavam íntegras (Figura 5B). Para examinar a localização de células B e T em DTI-TMEV crônica, a expressão de IgG foi usada para determinar a localização de células B comutadas porisótipos29, e CD3 foi usado para visualizar todas as células T29. A dosagem de IgG por Costa com ER-TR7 revelou a presença de células B IgG+ isotipadas no parênquima do SNC e nas meninges (Figura 6A). Os agregados celulares dentro das meninges ER-TR7+ continham múltiplas células B IgG+ e células T CD3+ (Figura 6B).

Os resultados representativos mostram altas porcentagens de células B e células T nos compartimentos parenquimatoso e meníngeo em camundongos IDD-TMEV crônicos em contraste com camundongos sham-tratados pareados por idade. A análise IHQ demonstrou ainda que, no tecido de DDI-TMEV, as células B e as células T estavam dispersas no parênquima, mas estavam intimamente associadas nas meninges, formando agregados inflamatórios. Em pacientes com EM progressiva, agregados inflamatórios meníngeos estão associados com lesão tecidual adjacente e piores desfechos da doença. Na DTI crônica do VDI, a presença persistente de células B e T no compartimento do SNC e agregação nas meninges pode estar associada à lesão tecidual e progressão da doença. Mais estudos são necessários para entender como a inflamação meníngea versus parenquimatosa afeta a desmielinização, a neurodegeneração e a incapacidade clínica.

Figure 1
Figura 1: Isolamento do cérebro e da medula espinhal para descalcificação. Linhas pontilhadas azuis indicam cortes feitos para isolar o cérebro com crânio intacto (cortes 1-4) e coluna vertebral (cortes 5-8). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Isolamento de cérebros, medula espinhal e meninges para técnicas unicelulares. (A) Linhas pontilhadas azuis indicam cortes feitos para isolar a calota craniana com meninges intactas e cérebro (cortes 1-3) e coluna vertebral (cortes 5-7). O corte lateral 3 é feito em ambos os lados do crânio. (B) Linha azul indica incisão feita para marcar e remover as meninges da calota craniana e os cortes feitos na coluna vertebral (ambos os lados) para isolar a medula espinhal e as meninges. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Identificação de células imunes CD45hi infiltrantes nos tecidos do SNC. (A) Estratégia de gating para a identificação de células imunes infiltrantes de CD45hi (P1), CD45lo microglia (P2) e oligodendrócitos, astrócitos e neurônios CD45- entre células vivas totais na medula espinhal de camundongos sham-treated (vermelho) ou TMEV-IDD (azul). Células CD45hi mínimas foram detectadas em cérebros e medula espinhal tratados com simulação. (B) Estratégia de Gating para identificar células B CD19+ e células T CD4+ entre células imunes infiltrantes (P1) de CD45hi em camundongos ID-TMEV. As estratégias de gating foram semelhantes para o tecido cerebral e medular. (C) Estratégia de gating para identificaçãode células hi CD45 (P1) nas meninges de camundongos sham-treated (vermelho) e crônicos TMEV-IDD (azul). (D) Estratégia de gating para identificação de células B CD19+ e células T CD4+ entre células imunes infiltrantes CD45hi (P1) nas meninges de camundongos IDD-TMEV crônicos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Células imunesCD45 hi e células B CD19+ aumentaram nos tecidos do SNC na DTI-TMEV crônica. Resumos de gráficos de barras de dados de citometria de fluxo obtidos de meninges, cérebro e medula espinhal tratados com simulação ou DTI-TMEV mostram porcentagens de células imunes infiltrantes de CD45hi (A) ou porcentagens de células B CD19+ (B). Para os tecidos de DTI-TMEV, os dados de citometria de fluxo foram obtidos de cinco camundongos, com medula espinhal e cérebros processados individualmente, enquanto as meninges foram agrupadas para análise. Para camundongos tratados com simulação, os dados de citometria de fluxo foram obtidos de quatro camundongos, com medula espinhal e cérebros processados individualmente, enquanto as meninges foram agrupadas para análise. Os dados para medula espinhal e cérebros são mostrados como média ± MEV. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Camadas meníngeas íntegras em cérebros e medula espinhais descalcificados. (A) Cérebros extraídos da calota craniana ou (B) cérebros descalcificados com crânios e colunas vertebrais intactos de camundongos com DDI crônica foram avaliados para DAPI (azul), marcadores meníngeos laminina (verde) e ER-TR7 (vermelho). Barra de escala = 50 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: A agregação de células imunes foi evidente nas meninges durante a DTI-TMEV crônica. (A) Colunas vertebrais descalcificadas de camundongos IDD-TMEV crônicos foram examinadas para a presença de IgG (verde) para identificar células imunes com comutação de isótipo no parênquima e nas meninges ER-TR7+ (vermelho). (B) Células T CD3+ (verde) e células B com comutação de isótipo IgG+ (vermelho) foram coalhadas com meninges ER-TR7+ para avaliar a localização no tecido medular. As setas brancas destacam as células B e T dentro das meninges. Barra de escala = 50 μm. As caixas brancas delineiam as áreas selecionadas para imagens cortadas (direita; barra de escala = 10 μm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Métodos para avaliar a composição celular no compartimento do SNC durante a homeostase e a doença são essenciais para a compreensão dos estados fisiológicos e patológicos do SNC. No entanto, apesar de servir como uma barreira importante no SNC e abrigar uma gama diversificada de células imunes, as meninges são frequentemente omitidas da análise porque muitos métodos convencionais de extração de tecidos para o cérebro e a medula espinhal não permitem a coleta dessas membranas. Essa omissão é uma limitação crítica no avanço do entendimento da composição e função celular das meninges e seu papel em condições de estado estacionário e inflamatórias. Estudos recentes revelaram que tanto as células imunes residentes quanto as derivadas periféricas que residem no compartimento meníngeo desempenham um papel essencial na manutenção da homeostase no SNC, bem como na condução da patogênese da doença do SNC. Esses estudos enfatizam a necessidade de analisar não apenas o compartimento parenquimatoso, mas também as camadas meníngeas circundantes. Os protocolos aqui descritos permitem o rápido isolamento do cérebro e da medula espinhal, preservando as meninges, permitindo, em última análise, uma análise abrangente a jusante do compartimento do SNC utilizando estudos histológicos e unicelulares. Os resultados representativos concentram-se na avaliação de células imunes no compartimento do SNC; no entanto, os protocolos podem ser adaptados para analisar micróglia, astrócitos, neurônios, pericitos, células endoteliais ou outras células residentes no SNC.

Uma etapa crítica nos métodos descritos é a extração cuidadosa do tecido, essencial tanto para isolar suspensões unicelulares puras do cérebro, medula espinhal e meninges quanto para obter tecidos do SNC com crânios ou colunas vertebrais intactos, permitindo morfologia tecidual de alta qualidade. Praticar a técnica para obter suspensões de célula única é a chave para uma extração de tecido bem-sucedida, porque não só aumentará a pureza da amostra, mas também melhorará o rendimento celular para aplicações a jusante. Da mesma forma, a prática no isolamento de tecidos do SNC com crânios ou colunas vertebrais intactos para remover adequadamente o excesso de tecido ao redor do osso é uma etapa essencial que garante melhor fixação, descalcificação e criopreservação do tecido, todos componentes cruciais para a obtenção de cortes teciduais com morfologia de alta qualidade e alvos antigênicos intactos.

Uma limitação do nosso protocolo para isolar suspensões unicelulares das meninges é que ele se concentra na obtenção de meninges durais e aracnoides32,54 enquanto omite o isolamento do pia, que permanece ligado ao cérebro ou à medula espinhal através de processos astrocitários. Embora as células residentes na pia-máter sejam um componente essencial do compartimento meníngeo, optou-se por excluir a pia-máter durante o preparo da suspensão unicelular devido ao extenso tempo necessário para isolá-la adequadamente55. Da mesma forma, o protocolo foca apenas na obtenção de meninges na porção superior do crânio e exclui o isolamento das meninges invaginantes no cérebro e plexo coroide. A coleta das meninges invaginantes e do plexo coroide pode ser realizada de acordo com protocolos previamentepublicados55, embora seja um procedimento demorado. Em ambos os casos, a opção por omitir parte das camadas meníngeas deveu-se ao tempo necessário para isolá-las. O momento do protocolo usado para preparar suspensões de célula única necessárias para aplicações a jusante, como citometria de fluxo, ensaios de cultura de células e sequenciamento de RNA (RNAseq) é crítico para melhorar a viabilidade celular e a qualidade dos dados. Portanto, dependendo da questão específica de pesquisa, deve-se encontrar um equilíbrio entre o tempo de isolamento da amostra e o rigor na extração das meninges. No protocolo atual, apenas preparações de suspensão unicelular das meninges da dura-máter e aracnoide são obtidas, o que limita a capacidade de extrapolar os resultados para a totalidade das meninges do SNC. No entanto, se esses métodos forem usados em combinação com a análise de IHQ ou ISH de cortes inteiros de tecido com as três camadas de meninges, uma compreensão mais completa da dinâmica celular e molecular nos compartimentos parenquimatoso e meníngeo pode ser obtida.

Outra limitação do protocolo é o baixo número de células obtidas das meninges dural e aracnoide, especialmente durante condições homeostáticas. No entanto, se o número de células na medula espinhal, no cérebro ou nas meninges for considerado muito baixo para a análise de uma população celular alvo específica, o número mínimo de células necessário para essa análise pode ser determinado estimando o número total de eventos necessários para uma dada precisão (por exemplo, coeficiente de variação de 5%), conforme descrito na literatura anterior especializada em análise de eventos raros56. Esses cálculos podem então ser usados para determinar se amostras de vários animais devem ser agrupadas para adquirir números de células suficientes para analisar a população celular de interesse.

Os métodos descritos fornecem um avanço essencial na investigação da dinâmica celular dentro do compartimento do SNC, estendendo as análises para incluir o compartimento meníngeo comumente negligenciado. Esses protocolos permitem a extração individual do cérebro, da medula espinhal e das meninges durais e aracnoides para gerar suspensões unicelulares. Além disso, o protocolo de descalcificação permite a análise histológica de cortes teciduais que compreendem tecido cerebral ou medular, incluindo as três camadas meníngeas. A utilização do EDTA proporciona um processo de descalcificação lento, mas suave, que é mais apropriado para espécimes onde a morfologia tecidual de alta qualidade é necessária (por exemplo, IHQ e ISH). O protocolo usa um pH de 7,2–7,4 para diminuir a taxa de descalcificação e garantir a manutenção da morfologia do tecido intacto, uma clara vantagem sobre os ácidos fortes e fracos (por exemplo, ácido clorídrico e ácido tricloroacético), que têm um tempo de descalcificação mais curto, mas afetam a qualidade da morfologia do tecido.

Métodos futuros que buscam isolar suspensões unicelulares das meninges devem se concentrar no desenvolvimento de protocolos para encurtar o tempo necessário para isolar completamente a camada pial dos tecidos do SNC e das meninges invaginantes no cérebro. A obtenção do complexo completo das três camadas meníngeas não só aumentará o número de células para qualquer análise, mas também fornecerá uma avaliação mais abrangente das células imunes residentes e infiltrantes que ocupam as meninges, que encerram o SNC. Ao mesmo tempo, futuros protocolos focados no preparo de cérebros e medula espinhais descalcificados devem buscar identificar novos agentes com o objetivo de acelerar a descalcificação tecidual, preservando a qualidade da morfologia tecidual. No entanto, em conjunto, as aplicações a jusante que analisam suspensões unicelulares do SNC, incluindo meninges duplas e aracnoides, realizadas em combinação com uma análise abrangente de cortes teciduais, podem fornecer uma compreensão detalhada do fenótipo, função e localização celular dentro do compartimento do SNC.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Os autores agradecem à equipe do Centro de Medicina Comparada e Pesquisa (CCMR) em Dartmouth por seu cuidado especializado com os camundongos usados para esses estudos. O Bornstein Research Fund financiou esta pesquisa.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum foil any N/A
Bovine Serum Albumin ThermoFisher Scientific 37002D
Centrifuge Beckman Coulter Allegra X-12R centrifuge
Collagenase I Worthington LS004196
Conical tube, 15 mL VWR 525-1069
Conical tube, 50 mL VWR 89039-658
Cover glass Hauser Scientific 5000
Cryomold VWR 18000-128
Curved forceps Fine Science Tools 11003-14
Disposable polystyrene tube, 14 mL Fisher Scientific 14-959-1B
Disposable Scalpel Fisher Scientific NC0595256
DNAse I Worthington LS002139
Dry ice Airgas N/A
Durmont #7Forceps Fine Science Tools 11271-30
EDTA disodium salt dihydrate Amresco 0105-500g
Ethanol, 100% any N/A
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30910.03
Filter top tube, 5 mL VWR 352235
Fixable viability stain 780 Becton Dickinson 565388
Flow cytometer Beckman Coulter Gallios
Glucose Fisher Chemical D16-500
Goat anti-mouse IgG (488 conjugate) Jackson immunoresearch 115-546-146
Goat anti-mouse IgG (594 conjugate) Jackson immunoresearch 115-586-146
Goat anti-rabbit 488 Jackson immunoresearch 111-545-144
Goat anti-rat 594 Jackson immunoresearch 112-585-167
Goat anti-rat 650 Jackson immunoresearch 112-605-167
Hank's Balnced Salt Solution (HBSS) Corning 21-020-CV
Hemacytometer Andwin Scientific 02-671-51B
Hemostat Fine Science Tools 13004-14
HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid) ThermoFisher Scientific 15630080
KCl Fisher chemical BP366-500
KH2PO4 (anhydrous) Sigma Aldrich P5655-100G
Liquid Nitrogen Airgas N/A
Mouse FC block (CD16/32) Becton Dickinson 553141
Na2HP04 (anhydrous) Fisher Chemical S374-500
NaCl Fisher chemical S671-500
Needle, 25 gauge Becton Dickinson 305122
Normal mouse serum ThermoFisher Scientific 31881
Nylon mesh strainer VWR 352350
OCT Sakura 4583
Paraformaldehyde, 20% Electron Microscopy Sciences 15713-S Diluted to 4% using 1 x PBS
Pasteur pipette, 9 inch, unplugged Fisher Scientific 13-678-20C
PBS (1x) Corning 21-040-CV
PE Rat Anti-Mouse CD4 Becton Dickinson 553730
PE-CF594 Rat Anti-Mouse CD19 Becton Dickinson 562329
Percoll density gradient media GE healthcare 17-0891-01
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45 Becton Dickinson 550994
Petri dish, 100 mm VWR 353003
pH meter Fisher Scientific 13-636-AB150
Pipet-Aid Drummond Scientific Corporation 4-000-101
Pipette 200 µl Gilson FA10005M
Pipette tips, 1 mL USA Scientific 1111-2831
Pipette tips, 200 µl USA Scientific 1111-1816
Pipette, 1 mL Gilson FA10006M
Prolong Diamond mountant with DAPI ThermoFisher Scientific P36962
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 Becton Dickinson 553141
Rabbit anti-mouse CD3 (SP7 clone) Abcam ab16669
Rabbit anti-mouse laminin Abcam ab11575
Rat anti-mouse ERT-R7 Abcam ab51824
RPMI 1640 Corning 10-040-CV
Serological pipet, 1 mL VWR 357521
Serological pipet, 10 mL VWR 357551
Serological pipet, 5 mL VWR 357543
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-100
Sucrose Fisher chemical S5-500
Surgical scissors Fine Science Tools 14001-16
Surgical scissors, extra fine Roboz RS-5882
Syringe, 10 mL Becton Dickinson 302995
Syringe, 5 mL Becton Dickinson 309646
Trypan blue Gibco 15250-061
Vacuum filter system Millipore 20207749
Vacuum flask Thomas Scientific 5340-2L
Vacuum in-line filter Pall Corporation 4402
Vacuum line Cole Palmer EW-06414-20
Water bath ThermoFisher Scientific Versa bath

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Imunologia e Infecção Edição 159 meninges sistema nervoso central descalcificação imunohistoquímica suspensão unicelular células imunes camundongos
Isolando Tecidos do Sistema Nervoso Central e Meninges Associadas para Análise a Jusante de Células Imunes
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DiSano, K. D., Linzey, M. R., Welsh, N. C., Meier, J. S., Pachner, A. R., Gilli, F. Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells. J. Vis. Exp. (159), e61166, doi:10.3791/61166 (2020).

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