Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Isolering af centralnervesystemvæv og tilhørende meninges til downstream-analyse af immunceller

Published: May 19, 2020 doi: 10.3791/61166
Automatic Translation
1, 1,2, 1,2, 1, 1, 1
1Department of Neurology, Geisel School of Medicine, Dartmouth-Hitchcock Medical Center, 2Program in Experimental and Molecular Medicine, Dartmouth College

Summary

Dette papir præsenterer to optimerede protokoller til undersøgelse af residente og perifert afledte immunceller i centralnervesystemet, herunder hjernen, rygmarven og meninges. Hver af disse protokoller hjælper med at fastslå funktionen og sammensætningen af cellerne, der optager disse rum under steady state og inflammatoriske tilstande.

Abstract

Centralnervesystemet (CNS) består af hjernen og rygmarven og er omsluttet af meninges, membranøse lag, der tjener som en barriere mellem periferien og CNS. CNS er et immunologisk specialiseret sted, og i steady state-forhold er immunprivilegium mest tydeligt i CNS parenchyma. I modsætning hertil har meninges en bred vifte af residente celler, herunder medfødte og adaptive immunceller. Under inflammatoriske tilstande udløst af CNS-skade, autoimmunitet, infektion eller endda neurodegeneration kan perifert afledte immunceller komme ind i parenchymen og tage ophold i meninges. Disse celler menes at udføre både gavnlige og skadelige handlinger under CNS sygdomspatogenese. På trods af denne viden overses hjernehinderne ofte, når man analyserer CNS-rummet, fordi konventionelle CNS-vævsekstraktionsmetoder udelader meningeallagene. Denne protokol præsenterer to forskellige metoder til hurtig isolering af murine CNS-væv (dvs. hjerne, rygmarv og meninges), der er egnede til nedstrømsanalyse via enkeltcelleteknikker, immunhistokemi og in situ-hybridiseringsmetoder. De beskrevne metoder giver en omfattende analyse af CNS-væv, ideel til vurdering af fænotype, funktion og lokalisering af celler, der optager CNS-rummet under homeostatiske forhold og under sygdomspatogenese.

Introduction

Centralnervesystemet (CNS) er et immunologisk specialiseret sted. CNS-parenchymen, eksklusive CSF-rummet, meninges og vaskulaturen, betragtes klassisk som et immunprivilegeret sted 1,2,3,4,5 og er relativt blottet for immunceller under homeostatiske tilstande 2,6,7. I modsætning hertil er meninges, der består af dura-, arachnoid- og pia-lagene, afgørende komponenter i CNS-rummet, der aktivt deltager i homeostatisk immunovervågning og inflammatoriske processer under sygdomspatogenese 3,6,7,8. Under steady state-forhold understøtter hjernehinderne adskillige immunsentinelceller, herunder medfødte lymfoide celler (ILC), makrofager, dendritiske celler (DC), mastceller, T-celler og i mindre grad B-celler 9,10,11.

Meninges er stærkt vaskulariserede strukturer og indeholder lymfekar, der giver en lymfeforbindelse mellem CNS og dens periferi 8,12,13,14. Ved inflammatoriske tilstande induceret af CNS-skade, infektioner, autoimmunitet eller endda neurodegeneration infiltrerer perifert afledte immunceller parenchymen og ændrer immunlandskabet i meninges. Efter celleinfiltration kan meninges repræsentere en funktionel niche for perifert afledte immunceller, der fremmer immuncelleaggregering, lokal immuncelleaktivering og langsigtet overlevelse i CNS-rummet. Fremtrædende meningeal inflammation observeres i flere sygdomme, der påvirker CNS, herunder multipel sklerose (MS) 15,16,17,18,19, slagtilfælde 20,21, steril skade 22,23 (dvs. rygmarvsskade og traumatisk hjerneskade), migræne 24 og mikrobiel infektion 25,26,27,28,29. Således er karakteriseringen af residente celler og perifert afledte immunceller i meningealrummet afgørende for at forstå disse cellers rolle under steady state-tilstande og sygdomspatogenese.

Udvindingen af hjerne, rygmarv og hjernehinder fra kraniet og hvirvellegemerne er teknisk udfordrende og tidskrævende. Der er i øjeblikket ingen teknikker til rådighed til hurtig ekstraktion af hjernen med alle tre meningeal lag intakte. Mens laminektomi giver fremragende rygmarvsvævsmorfologi og bevarer meningeallagene, er det både ekstremt tidskrævende og kompliceret30,31. Omvendt letter mere konventionelle ekstraktionsmetoder såsom fjernelse af hjernen fra kraniet og hydraulisk ekstrudering af rygmarven hurtig ekstraktion af CNS-vævet, men både arachnoide og durale meninges går tabt med disse teknikker30,31. Udeladelsen af dura og arachnoide lag under konventionel isolering af hjerne- og rygmarvsvæv resulterer i en ufuldstændig analyse af cellerne i CNS-rummet. Således er identifikation af nye teknikker med fokus på hurtig ekstraktion af CNS-væv med intakte meninges afgørende for den optimale analyse af CNS-rummet.

Dette manuskript præsenterer to metoder til hurtig ekstraktion af hjernen, rygmarven og hjernehinderne fra mus, hvilket letter nedstrømsanalysen af residente celler og perifert afledte immunceller i CNS-parenkym og meninges. Disse optimerede protokoller fokuserer på 1) isolering af enkeltcellesuspensioner til downstream-analyse og 2) klargøring af væv til histologisk behandling. Opnåelse af enkeltcellesuspensioner fra hjernen, rygmarvsvævet og dural og arachnoid meninges32 muliggør samtidig analyse af celler, der er bosiddende i både parenkymale og meningeale rum. Enkeltcellesuspensioner kan anvendes i forskellige applikationer, herunder cellekulturassays til udførelse af in vitro-stimulering 33, enzymbundet immunspot (ELISpot)28,34,35, flowcytometri 36,33 og enkeltcelle 37 eller bulktranskriptomik. Derudover giver den optimerede protokol til afkalkning af hele hjerner og rygmarv med henholdsvis intakte kranier eller rygsøjler mulighed for blid afkalkning af den omgivende knogle, hvilket efterlader meningerne intakte og bevarer vævsmorfologien. Denne metode muliggør selektiv identifikation af proteiner eller RNA ved hjælp af immunohistokemi (IHC) eller in situ hybridiseringsteknikker (ISH) inden for både parenkymale og meningeale rum. Karakteriseringen af fænotypen, aktiveringstilstanden og lokaliseringen af residente celler og perifert afledte immunceller i CNS kan give oplysninger, der er afgørende for at forstå, hvordan individuelle celletyper i CNS-rummet bidrager til homeostase og sygdomspatogenese.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alt dyrearbejde anvender protokoller, der er gennemgået og godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Geisel School of Medicine i Dartmouth.

1. Behandling af hjerne- og rygmarvsprøver til afkalkning

  1. Isolering af hjerne- og rygmarvsprøver
    1. Aflive musen via CO2 indånding. Sørg for, at CO2 -strømningshastigheden fortrænger 10% -30% af burets volumen pr. Minut.
    2. Brug tang, løft xiphoid-processen og skær abdominalvæggen sideværts lige under ribbenburet med en saks, træk op for at undgå at skære underliggende blodkar eller organer. Skær gennem membranen sideværts.
    3. Skær ribbenburet langs sidekanterne parallelt med lungerne op til kravebenet. Brug tang til at løfte brystbenet og klemme brystbenet med en hæmostat. Placer hemostat over hovedet for at løfte brystkassen væk og udsætte hjertet.
    4. Brug tang, tag fat i hjertet nær dets spids og lav et snit i hjertets højre atrium for at give et udløb. Indsæt en 25 G kanyle med en 10 ml sprøjte fastgjort for langsomt at administrere 10 ml iskold 1x fosfatbufret saltvand (PBS) i venstre ventrikel for transkardialt at perfusere musen.
      BEMÆRK: Perfusion bør forekomme over 4-5 minutter, indtil leveren er renset for blod. I alt 10 ml 1x PBS er normalt nok til perfusion, men mere kan udnyttes, hvis det er nødvendigt. En klar lever indikerer normalt tilstrækkelig perfusion.
    5. Brug en skarp saks til at fjerne hovedet ved halshugning (figur 1; 1). Lav et midterlinjesnit i huden (figur 1; 2) og vend huden over øjnene for at frigøre kraniet.
    6. Skær ved næsebenet for at frigøre underkæben fra kraniet (figur 1; 3). Fjern underkæben, tungen og øjnene. Skær langs de laterale aspekter af kraniet for at frigive vævet langs den eksterne auditive meatus (figur 1; 4). Trim for at fjerne al overskydende hud, muskler og væv, der ligger over kraniet.
    7. Adskil brystkassen fra rygsøjlen ved at skære parallelt med rygsøjlen med en skarp saks (figur 1; 5 og 6). Lav et lille snit i den nedre lændehvirvelregion for at isolere rygsøjlen (figur 1; 7). Trim og fjern eventuelle resterende muskler langs rygsøjlen for at udsætte ryghvirvlerne (figur 1; 8).
      BEMÆRK: Det er nødvendigt at fjerne overskydende væv fra rygsøjlen og kraniet for at opnå tilstrækkelig penetration af fiksativ paraformaldehyd (PFA) og ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) afkalkningsbuffer.
  2. Efterfiksering, afkalkning og kryopræservering
    1. Brug tang til at placere hjernen med det intakte kranium eller rygsøjlen i et 15 ml konisk rør indeholdende 10 ml 4% PFA. Glassene anbringes ved 4 °C i mindst 48 timer for tilstrækkelig fiksering.
      BEMÆRK: For at undgå overfiksering af vævet må du ikke overstige 72 timers fiksering. Fikseringstider forlænges for knogleprøver før afkalkning. Tilstrækkelig fiksering vil beskytte væv mod virkningerne af afkalkningen og sikre bedre vævsmorfologi.
    2. Skyl hjernen eller rygmarven ved at fjerne vævet fra 4% PFA med pincet og placere vævet i et engangsrør på 14 ml med 10 ml 1x PBS i 5 min. Overfør hjernen eller rygmarven til et 50 ml konisk rør med 10 ml 10% EDTA (pH = 7,2-7,4).
      BEMÆRK: Brug af et større rør med 10 ml EDTA giver EDTA et større kontaktområde med vævet og fremskynder afkalkningsprocessen.
    3. Kontroller dagligt, om knoglen er blød og bøjelig: Fjern vævet fra EDTA-opløsningen med tang, læg det på en petriskål, og test forsigtigt knoglens blødhed med en 25 G nål. Hvis nålen let trænger ind i knoglen, er afkalkningsprocessen afsluttet.
    4. Fjern vævet fra EDTA-opløsningen og overfør hjernen eller rygmarven til et 14 ml engangsrør indeholdende 10 ml 1x PBS og vask i 10 minutter. Gentag vasken.
      BEMÆRK: Afkalkning tager normalt 2-3 dage. Opløsningen skal ændres hver 2-3 dage, hvis knoglen endnu ikke er tilstrækkeligt afkalket. Imidlertid kan langvarig inkubation i EDTA, efter at knoglen er blevet afkalket, beskadige vævsmorfologien.
    5. Forbered 10%, 20% og 30% saccharoseopløsninger ved at tilføje saccharose til 1x PBS. For eksempel tilsættes 10 g saccharose til 10% saccharose og bringes volumenet til 100 ml ved hjælp af steril 1x PBS. Opbevar opløsningen ved 4 °C i op til 1 måned.
      BEMÆRK: Saccharoseopløsninger er tilbøjelige til vækst af mikroorganismer, så prøver bør ikke opbevares i længere tid i disse opløsninger.
    6. Vævet fjernes fra 1x PBS, anbringes i 10 ml 10% saccharoseopløsning og opbevares ved 4 °C. Lad vævet sidde i 24 timer, eller indtil det synker til bunden af røret.
    7. Gentag denne proces, flyt vævet til en 20% saccharoseopløsning først og til sidst til en 30% saccharoseopløsning. Lad vævet synke i 30% saccharose (mindst 24 timer) og fortsæt til vævsindlejring.
  3. Indlejring og frysning af væv
    1. Brug tang til at fjerne vævet fra 30% saccharose, læg det på en petriskål og vip skålen for at slippe af med overskydende saccharoseopløsning på vævet. Brug en skalpel til at skære vævet i ønskede segmenter.
    2. Opret et tyndt lag med optimal skæretemperatur (OCT) forbindelse i bunden af cryomold og læg vævsstykket (e) i formen. Dæk vævet helt med OCT-forbindelsen, og sørg for, at der ikke er bobler til stede.
    3. Flashfryse blokkene ved at svæve over flydende nitrogen38 eller sætte blokkene på en 100% isopropanol/tørisopslæmning39 , indtil blokken er uigennemsigtig. Pak cryomolderne ind i aluminiumsfolie og opbevar blokkene ved -80 °C til langtidsopbevaring. Flyt blokke til -20 °C før sektionering.
      BEMÆRK: Der skal udvises forsigtighed ved sektionering og udførelse af histologiprotokoller på afkalkede hjerner, da kraniet og meningeallagene kan gå tabt, hvis sektionerne håndteres groft.

2. Forberedelse af meninges og CNS-væv til flowcytometrifarvning

  1. Udtrækning af kraniehætten og hjernen
    1. Brug en skarp saks til at fjerne hovedet ved halshugning (figur 2A; 1). Brug en saks til at lave et midterlinjesnit i huden (figur 2A; 2) og vend huden over øjnene for at frigøre kraniet.
    2. Placer saksen i foramen magna og begynd at skære kraniet sideværts langs cortices mod den olfaktoriske pære, og hold snittene over den ydre auditive meatus og underkæbe (figur 2A; 3). Udfør de samme snit på den modsatte side, med snit, der mødes ved den olfaktoriske pære for at frigøre kraniehætten fra hjernen (figur 2A; 3).
    3. Brug tang til at trække kraniehætten tilbage og placere kraniehætten i et 15 ml konisk rør indeholdende 5 ml koldt RPMI-medium suppleret med 25 mM HEPES. Hold røret på is.
    4. Brug buede tang til at placere tangen under bunden af hjernen og løfte for at frigøre hjernen fra kraniehætten. Placer hjernen i et 15 ml konisk rør indeholdende 5 ml koldt RPMI suppleret med 25 mM HEPES. Hold røret på is indtil forarbejdning.
  2. Ekstraktion af rygsøjlen og rygmarvsvævet
    1. Brug tang og skarp saks til at adskille brystkassen fra rygsøjlen ved at skære parallelt med rygsøjlen (figur 2A; 4 og 5). Lav et lille snit i det nedre lændeområde for at isolere rygsøjlen (figur 2A; 6). Trim og fjern eventuelle resterende muskler langs rygsøjlen for at udsætte ryghvirvlerne (figur 2A; 7).
    2. Placer den ekstra fine kirurgiske saks i rygsøjlen og skær langs søjlens sidekant (figur 2C). Skær den modsatte sidekant helt for at opdele rygsøjlen i en forreste og bageste del.
      BEMÆRK: Rygmarven forbliver fastgjort til rygsøjlen.
    3. Brug tang til langsomt og forsigtigt at fjerne rygmarven fra rygsøjlen og placere vævet i et 15 ml konisk rør indeholdende 5 ml koldt RPMI med 25 mM HEPES. Overfør de forreste og bageste dele af rygsøjlen til et 15 ml konisk rør indeholdende 5 ml koldt RPMI med 25 mM HEPES.
  3. Fjernelse af meninges for at forberede enkeltcellesuspensioner
    1. Brug tang til at fjerne kraniehætten fra RPMI-mediet. Brug af skarpe tang (#7 tang; Materialetabel), score omkring yderkanten af kraniehætten (figur 2B) og skræl hjernehinderne væk fra kanten af kraniehætten, skrab for at fjerne dural og arachnoid meninges. Placer meninges på en petriskål.
      BEMÆRK: Fjernelse af hjernehinderne fra både hjernen og rygmarven kræver øvelse. Hvis brugeren oplever problemer med at udtrække meninges, skal du bruge et dissekerende mikroskop til at hjælpe med fjernelsen.
    2. Fjern rygsøjlen fra røret. Brug skarpe tang, score rundt om kanterne af rygsøjlen for at frigøre meninges og skræl væk meninges fra kanten af hvirvlen ved hjælp af buede tang. Placer meninges på en petriskål.
    3. Anbring en nylonnetsil i et 50 ml konisk rør. Flyt hjernehinderne ind i silen og tilsæt 3 ml RPMI suppleret med 25 mM HEPES. Brug stemplet fra en 5 ml sprøjte til at slibe væv og medier gennem sien.
    4. Brug en 5 ml serologisk pipette til at vaske sien med yderligere 2 til 3 ml RPMI/HEPES-medier, indtil alt synligt væv er passeret gennem silen.
      BEMÆRK: For at opnå tilstrækkelige celletal til flowcytometrisk analyse kan det være nødvendigt at samle meninges fra flere dyr. I dette eksperiment (figur 3 og figur 4) blev hjerne- og rygmarvshjernehinderne fra 4-5 mus samlet sammen. Hvis prøverne samles, kræves der yderligere medier til at male vævet gennem nylonnetsilen for at forhindre overophedning af vævet.
    5. Brug en 10 ml serologisk pipette til at overføre cellerne og mediet til et frisk 15 ml konisk rør. Brug en 10 ml serologisk pipette til at vaske det 50 ml koniske rør med 5 ml medier for at opsamle eventuelle resterende celler. Der centrifugeres ved 450 x g i 5 minutter ved 4 °C for at pelletere cellerne.
    6. Ved hjælp af en Pasteur-pipette med vakuum aspireres supernatanten, idet man er omhyggelig med at undgå cellepellet og resuspenderer cellerne i et passende volumen og buffer.
    7. For at tælle enkeltcellesuspensionen fortyndes et lille volumen af cellerne (dvs. 5-10 μL) ved hjælp af trypanblåt udelukkelsesfarvestof (1:10 fortynding) og RPMI. Der tilsættes 10 μL af fortyndingen til hæmocytometeret.
    8. Tæl cellerne som tidligere beskrevet40,41, i gennemsnit mindst to 16 kvadratiske gitre for nøjagtighed.
      BEMÆRK: I figur 3 blev f.eks. samlede, pelleterede celler fra hjernehinderne resuspenderet i 250 μL fluorescensaktiveret cellesorteringsbuffer (FACS) (1x PBS med 1% FBS) til nedstrøms overfladefarvning. Cellerne blev fortyndet 1:10 til tælling (5 μL celler, 5 μL trypanblåt, 40 μL RPMI). Denne fortynding gav mellem 50-100 celler pr. 16 kvadratgitter, hvilket sikrer mere nøjagtig celletælling, fordi cellerne hverken er for tætte og overlappende eller for sparsomme. Nukleerede celletal fra poolede hjerne- og rygmarvshjerne- og rygmarvshjerner pr. mus var som følger: For meninges fra sham-behandlingsmus = 100.000-150.000 celler og for meninges fra Theilers murine encephalomyelitis virus-induceret demyeliniserende sygdom (TMEV-IDD) mus = 300.000-350.000 celler. Celletal vil variere afhængigt af præcisionen af indsamling, behandling, og hvis meningeal inflammation er til stede.
    9. Fortsæt til den ønskede enkeltcelleteknik, såsom en FACS-overflade (figur 3) 14,36,42,43,44, intracellulære farvningsprotokoller 33,45, in vitro-stimulering, cellekulturassays 33,46,47, ELISPOT-assay 28,34,35 og bulk- eller enkeltcelle transkriptomik37,48.
      BEMÆRK: Hold alle rør på is mellem behandlingstrinnene.
  4. Forberedelse af enkeltcellesuspensioner af hjerne- og rygmarvsvæv
    1. Overfør hjernen eller rygmarvsvævet med medier til toppen af 100 mm petriskålen ved at hælde væv og medier fra røret. Brug tang til at flytte vævet til bunden af petriskålen. Finhak hjernen eller rygmarven med et sterilt barberblad. Brug barberbladet til at flytte hakket væv til bunden af pladen ved at skrabe for at samle vævet.
      BEMÆRK: For nedenstående enzymatiske fordøjelsesprotokol kan op til to rygmarv samles til behandling. Hjerner bør behandles individuelt.
    2. Brug en 5 ml serologisk pipette til at tilsætte 3 ml RPMI suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS) til petriskålen. Brug en 10 ml serologisk pipette til at pipette op og ned for at resuspendere vævet i mediet og overføre til et 15 ml konisk rør.
      BEMÆRK: Hvis downstream-applikationen er enkeltcelle- eller bulk-RNA-sekventeringsanalyse eller cellekultur, skal FCS-partier testes for at sikre, at celler ikke aktiveres før analyse. Alternativt kan celler behandles ved hjælp af 1x PBS med 0,04% BSA i stedet for RPMI med 10% FCS.
    3. Brug en 10 ml serologisk pipette til at vaske petriskålen med yderligere 2 ml medier for at opsamle eventuelt resterende væv og overføre til et konisk rør for et samlet volumen på 5 ml. Hold rørene på is mellem behandlingstrinnene.
    4. Brug en pipette til at resuspendere collagenase I-pulveret i Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) medier for at opnå den ønskede koncentration (dvs. 100 mg/ml). Der tilsættes kollagenase type I til det koniske rør, der indeholder den hakkede vævsprøve, for at opnå den ønskede slutkoncentration (dvs. 50 μL for 1 mg/ml).
      BEMÆRK: Højere koncentrationer af kollagenase vil øge celleudbyttet, men kan spalte celleoverflademarkører. Derfor bør collagenase I-partier titreres for at bestemme den optimale koncentration, der er nødvendig for at opnå det højeste antal levedygtige celler med alle nødvendige celleoverflademarkører intakte. For eksempel blev collagenase I testet i endelige koncentrationer på 0,5 mg / ml, 1 mg / ml og 2 mg / ml på enkelthjerne- eller rygmarvsprøver. Cellelevedygtighed blev bestemt ved hjælp af trypanblå eksklusionsmetoden, og celleoverflademarkørerne CD45, CD19 og CD4 blev vurderet ved flowcytometri. En koncentration på 1 mg/ml kollagenase I gav det højeste antal levende celler, samtidig med at alle celleoverflademarkører af interesse blev bevaret. Således blev denne koncentration anvendt til yderligere eksperimenter, der undersøgte disse celletyper.
    5. DNase I pulver resuspenderes forsigtigt med 0,15 M natriumchlorid til den ønskede stamkoncentration. Den resuspenderede DNase I tilsættes til det koniske rør indeholdende den hakkede vævsprøve for at opnå en slutkoncentration på 20 E/ml.
      BEMÆRK: DNase I-partier varierer efter aktivitetsenheder pr. ml. Den koncentration, der skal tilsættes vævsprøven, ændres baseret på hætteglassets aktivitetsenheder pr. milliliter. Den endelige ønskede koncentration pr. prøve er 20 E/ml.
    6. Rørene anbringes i en rørrist i et 37 °C vandbad og inkuberes i 40 min. Vend rørene hvert 15. minut for at blande vævet grundigt med enzymerne. Efter inkubation tilsættes 500 μL 0,1 M EDTA (pH = 7,2) til hvert glas i en slutkoncentration på 0,01 M EDTA og inkuberes i yderligere 5 minutter for at inaktivere collagenasen.
    7. Brug en 10 ml serologisk pipette til at tilføje 9 ml RPMI suppleret med 10% FCS til hvert rør for at bringe volumenet af hvert rør til ~ 14,5 ml. Der centrifugeres ved 450 x g i 5 minutter ved 4 °C. Brug en Pasteur-pipette med vakuum, og sug supernatanten og pas på ikke at røre cellepelleten.
    8. Brug en 5 ml serologisk pipette til at tilsætte 3 ml 100% isotonisk densitetsgradientopløsning til røret, der indeholder cellepelleten. Brug en 10 ml serologisk pipette til at tilføje yderligere RPMI 10% FCS-medier for at bringe det endelige volumen til 10 ml og resuspendere cellepelleten for at skabe et 30% isotonisk densitetsgradientopløsningslag.
      BEMÆRK: Forbered det isotoniske gradientmedium på lager på forhånd, alikvote, og opbevar det ved 4 °C i op til 3 måneder. For at fremstille den isotoniske stamdensitetsgradientopløsning fortyndes densitetsgradientmediet (materialetabel) med densitetsgradientmediefortyndingsbuffer. Massefyldegradientmediefortyndingsbufferen (80,0 g/l NaCl, 3,0 g/l KCl; 0,73 g/lNa2HP0 4, 0,20 g/l KH2HP04; 20,0 g/l glucose) fremstilles og filtreres steriliseres ved hjælp af et vakuumfiltersystem. Der fremstilles en 100 % lagerisotonisk densitetsgradientopløsning ved at blande 1 del densitetsgradientfortyndingsbuffer og 9 dele densitetsgradientmedier. Bland godt.
    9. Vend og bland hvert rør godt, inden der tilsættes 70% lager isotonisk densitetsgradient opløsning underlag. En 1 ml serologisk pipette indeholdende 1 ml 70 % stamopløsning med isotonisk densitetsgradient indsættes i bunden af reagensglasset. Underlæg langsomt 1 ml af opløsningen, pas på ikke at lave bobler. Fjern langsomt den serologiske pipet fra røret, og pas på ikke at forstyrre gradienten.
      BEMÆRK: For 70% underlaget skal 100% isotonisk densitetsgradientopløsning fortyndes til 70% ved hjælp af RPMI-medier (dvs. 7 ml 100% isotonisk densitetsgradientopløsning og 3 ml RPMI-medier blandet godt). Derudover er det vigtigt at skabe et rent, uforstyrret 70% underlag for at fjerne myelinrester og for at opnå rene encellede suspensioner ved gradientgrænsefladen efter centrifugering.
    10. Der centrifugeres ved 800 x g i 30 minutter ved 4 °C uden bremse. Opsug supernatanten, inklusive myelinaffaldslaget, indtil der er 2-3 ml tilbage i røret, og pas på ikke at forstyrre cellelaget. Høst cellelaget mellem 30/70% densitetsgradienten ved hjælp af en 1 ml pipette og overfør til et nyt 15 ml konisk rør.
    11. Brug en 10 ml serologisk pipette til at tilføje RPMI 10% FCS-medier for at bringe den endelige lydstyrke til 15 ml. Der centrifugeres 450 x g i 5 minutter ved 4 °C.
      BEMÆRK: I løbet af dette trin kan cellelag fra to rør samles, hvis det er nødvendigt. Saml ikke mere end to rør, ellers pelleterer cellerne ikke på grund af en gradientmediekoncentration med høj densitet.
    12. Supernatanten suges forsigtigt til sig, så cellepillen ikke forstyrres. Resuspender cellerne i et passende volumen / buffer for at tælle cellerne ved hjælp af et hæmocytometer (f.eks. Resuspender en enkelt rygmarv i 250 μL FACS-buffer til nedstrøms overfladefarvning) (figur 3).
    13. Brug en 1 ml pipette til at overføre cellesuspensionerne til toppen af et filterrør (materialetabel) og lad cellerne filtrere til bunden af røret for at fjerne eventuelle resterende myelinrester.
    14. Brug trypanblå udelukkelsesfarvestof, fortynd og tæl cellerne på et hæmocytometer ved at beregne gennemsnittet af mindst to 16 kvadratiske gitter for nøjagtighed40,41.
    15. Fortsæt med den ønskede enkeltcelleanalyseteknik.
      BEMÆRK: Brug af forskellige former for kollagenase (dvs. D, type I, type II, type IV), immunceller, mikroglia (figur 3), astrocytter, pericytter, endotelceller49 og neuroner50 kan alle isoleres effektivt. Nukleerede celletal opnået for resultaterne var som følger ved anvendelse af det titrerede collagenase I-enzym: Hele skambehandlet hjerne = 500.000-600.000 celler; Hele TMEV-IDD-hjernen = 800.000-1.000.000 celler; Hele skambehandlet rygmarv = 150.000-200.000 celler; Hele TMEV-IDD rygmarv = 300.000-400.000. Celletal vil variere afhængigt af præcisionen af indsamling, behandling, og om CNS-betændelse er til stede.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Dette repræsentative eksperiment havde til formål at kvantificere B- og T-celler og beskrive B- og T-cellelokalisering i meningeal og parenkymale CNS-rum under homeostatiske forhold såvel som i en murine progressiv MS-model (dvs. TMEV-IDD). TMEV-IDD blev induceret i 5 uger gamle kvindelige SJL-mus ved intrakraniel infektion med 5 x 106 plakdannende enheder (PFU) af TMEV BeAn som tidligere beskrevet29.

Den foreliggende undersøgelse vurderede B- og T-celler i hjernehinder, hjerne og rygmarv under kronisk TMEV-IDD på dag 120 efter infektion. Aldersmatchede skambehandlede mus blev brugt som kontrol. Undersøgelsen bestod af to eksperimenter. Den første fokuserede på at opnå enkeltcellesuspensioner til flowcytometrisk vurdering, en veletableret teknik til analyse og kvantificering af cellesammensætning ved evaluering af celleoverflade og / eller intracellulære antigener (n = 4 skambehandlet; n = 5 TMEV-IDD). Det andet eksperiment fokuserede på at beskrive B- og T-cellelokalisering i CNS-rummet ved at udnytte immunhistokemi på afkalket hjerne- og rygmarvsvæv (n = 3 skambehandlet; n = 8 TMEV-IDD).

Efter isolering af enkeltcellesuspensioner fra hjernen, rygmarven og poolede meninges (hjerne og rygmarv) fra TMEV-IDD og skambehandlede mus blev der anvendt en overfladefarvningsprotokol på alle prøver. Kort fortalt blev enkeltcellesuspensioner inkuberet med en fikserbar levedygtighedsudelukkelsesplet (780) i 15 minutter, vasket, blokeret med Fc-blok i nærværelse af museserum i 15 minutter og farvet med konjugerede antistoffer til celleoverflademarkører, herunder CD45 (30-F11; PerCP-Cy5.5), CD19 (1D3; PE-CF594) og CD4 (GK1.5; PE) i 30 min som tidligere beskrevet28,29. Celler blev derefter vasket og analyseret ved hjælp af et flowcytometer28,29. Levedygtighed gating blev udført som tidligere beskrevet28. CD45-ekspression blev vurderet til at skelne CD45hi perifert afledte infiltrerende immunceller (P1) fra CD45til mikroglia (P2) og CD45- neuroner, astrocytter og oligodendrocytter i hjernen og rygmarven (P3; Figur 3A). I skambehandlede mus var få CD45hi-celler til stede i rygmarven og hjernevævet. I meninges blev den samme gating-afskæring for CD45 hi-ekspression, der blev brugt til hjerne- og rygmarvsdata, anvendt til at identificere CD45hi-immunceller (P1; Figur 3C) og udelukker ikke-immune celler, der er til stede i meninges (dvs. fibroblaster, endotelceller). I sham-behandlede mus var få CD45hi-celler (<0,1%) til stede i meninges. Blandt CD45hi-immunceller i TMEV-IDD CNS-væv blev B-celler og CD4 T-celler identificeret ved overfladeekspression af henholdsvis CD19 og CD4 (figur 3B-D). I alle TMEV-IDD CNS-væv blev der observeret øgede procentdele af CD45hi-immunceller sammenlignet med skambehandlede mus (figur 4A). Under kronisk TMEV-IDD var procentdelen af B-celler blandt CD45hi immunceller i hjernen og rygmarven højere sammenlignet med meningealrummet (figur 4B).

For at identificere lokaliseringen af B-celler og T-celler i CNS-rummet under kronisk TMEV-IDD blev afkalkede hjerner og rygmarv evalueret ved hjælp af immunhistokemi ved hjælp af den tidligere beskrevne farvningsprotokol29. Hjernehinderne og vaskulaturen blev afgrænset ved hjælp af laminin, en kældermembrankomponent29,51 og ER-TR7, en fibroblast retikulær cellemarkør52,53. Under konventionel ekstraktion af hjerne fra kraniehætten var pialaget intakt, men de resterende meningeallag blev udelukket (figur 5A). I rygmarven resulterede hydraulisk ekstrudering i fraværet af alle meningeallag (data ikke vist). I både afkalkede hjerner og rygmarv var alle meningeallag intakte (figur 5B). For at undersøge B- og T-cellelokalisering i kronisk TMEV-IDD blev IgG-ekspression brugt til at bestemme lokaliseringen af isotype-switchede B-celler 29, og CD3 blev brugt til at visualisere alle T-celler29. Farvning af IgG med ER-TR7 afslørede, at isotypeskiftede IgG + B-celler var til stede i CNS-parenchymen og meninges (figur 6A). Cellulære aggregater inden for ER-TR7+ meninges indeholdt flere IgG + B-celler og CD3 + T-celler (figur 6B).

De repræsentative resultater viser høje procentdele af både B-celler og T-celler i parenkym- og meningealrummet hos kroniske TMEV-IDD-mus i modsætning til aldersmatchede skambehandlede mus. IHC-analyse viste yderligere, at i TMEV-IDD-væv blev B-celler og T-celler dispergeret i parenchymen, men var tæt forbundet i meninges og dannede inflammatoriske aggregater. Hos progressive MS-patienter er meningeal inflammatoriske aggregater forbundet med tilstødende vævsskade og værre sygdomsresultater. Ved kronisk TMEV-IDD kan vedvarende B-celle- og T-celletilstedeværelse i CNS-rummet og aggregering i hjernehinderne være forbundet med vævsskade og sygdomsprogression. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at forstå, hvordan meningeal versus parenkymal inflammation påvirker demyelinisering, neurodegeneration og klinisk handicap.

Figure 1
Figur 1: Isolering af hjerner og rygmarv til afkalkning. Blå stiplede linjer angiver nedskæringer foretaget for at isolere hjernen med intakt kranium (snit 1-4) og rygsøjle (snit 5-8). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Isolering af hjerner, rygmarv og meninges til enkeltcelleteknikker. (A) Blå stiplede linjer angiver snit foretaget for at isolere kraniehætten med intakte meninges og hjerne (snit 1-3) og rygsøjle (snit 5-7). Sideskæring 3 er lavet på begge sider af kraniet. (B) Blå linje angiver snit foretaget for at score og fjerne hjernehinderne i kraniehætten og snittene i rygsøjlen (begge laterale sider) for at isolere rygmarven og meninges. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Identifikation af CD45hi infiltrerende immunceller i CNS-væv. (A) Gating strategi til identifikation af CD45hi infiltrerende immunceller (P1), CD45til microglia (P2) og CD45- oligodendrocytter, astrocytter og neuroner blandt samlede levende celler i rygmarv fra skambehandlede (røde) eller TMEV-IDD (blå) mus. Minimale CD45hi-celler blev påvist i skambehandlede hjerner og rygmarv. (B) Gating strategi til identifikation af CD19 + B-celler og CD4 + T-celler blandt CD45hi infiltrerende immunceller (P1) i TMEV-IDD-mus. Gating strategier var ens for hjerne og rygmarv væv. (C) Gating strategi til identifikation af CD45hi-celler (P1) i hjernehinderne hos skambehandlede (røde) og kroniske TMEV-IDD-mus (blå). (D) Gating strategi til identifikation af CD19 + B-celler og CD4 + T-celler blandt CD45hi infiltrerende immunceller (P1) i meninges af kroniske TMEV-IDD mus. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: CD45hi immunceller og CD19+ B-celler steg i CNS-væv i kronisk TMEV-IDD. Søjlediagrammer resuméer af flowcytometridata opnået fra skambehandlede eller TMEV-IDD-meninges, hjerne og rygmarv viser procentdele af CD45hi , der infiltrerer immunceller (A) eller procentdele af CD19 + B-celler (B). For TMEV-IDD-væv blev flowcytometridata opnået fra fem mus, hvor rygmarv og hjerner blev behandlet individuelt, mens meninges blev samlet til analyse. For sham-behandlede mus blev flowcytometridata opnået fra fire mus, hvor rygmarv og hjerner blev behandlet individuelt, mens meninges blev samlet til analyse. Data for rygmarv og hjerner vises som middel ± SEM. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Intakte meningeallag i afkalkede hjerner og rygmarv. (A) Hjerner ekstraheret fra kraniehætten eller (B) afkalkede hjerner med intakte kranier og rygsøjler fra kronisk-TMEV-IDD-mus blev vurderet for DAPI (blå), meningeal markører laminin (grøn) og ER-TR7 (rød). Skalabjælke = 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Immuncelleaggregering var tydelig i hjernehinderne under kronisk TMEV-IDD. (A) Afkalkede rygsøjler fra kronisk-TMEV-IDD-mus blev undersøgt for tilstedeværelse af IgG (grøn) for at identificere isotype-skiftede immunceller i parenchymen og i ER-TR7+ meninges (rød). (B) CD3 + T-celler (grønne) og IgG + isotype-switchede B-celler (rød) blev kostet med ER-TR7 + meninges for at vurdere lokalisering i rygmarvsvævet. Hvide pile fremhæver B- og T-celler i hjernehinderne. Skalabjælke = 50 μm. Hvide felter afgrænser områder, der er valgt til beskårne billeder (højre; skalalinje = 10 μm). Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Metoder til evaluering af den cellulære sammensætning i CNS-rummet under homeostase og sygdom er afgørende for at forstå de fysiologiske og patologiske tilstande i CNS. På trods af at de tjener som en vigtig barriere i CNS og huser en bred vifte af immunceller, udelades meninges ofte fra analyse, fordi mange konventionelle vævsekstraktionsmetoder til hjernen og rygmarven ikke tillader indsamling af disse membraner. Denne udeladelse er en kritisk begrænsning i udviklingen af vores forståelse af meninges cellulære sammensætning og funktion og dens rolle i steady state og inflammatoriske tilstande. Nylige undersøgelser viste, at både residente og perifert afledte immunceller, der bor i meningealrummet, spiller en væsentlig rolle i at opretholde homeostase i CNS samt i at drive CNS-sygdomspatogenese. Disse undersøgelser understreger behovet for at analysere ikke kun parenkymrummet, men også de omgivende meningeallag. De her beskrevne protokoller giver mulighed for hurtig isolering af hjerne og rygmarv, samtidig med at hjernehinderne bevares, hvilket i sidste ende muliggør en omfattende nedstrømsanalyse af CNS-rummet ved hjælp af både histologiske og enkeltcelleundersøgelser. De repræsentative resultater fokuserer på vurdering af immunceller i CNS-rummet; protokollerne kan dog tilpasses til at analysere mikroglia, astrocytter, neuroner, pericytter, endotelceller eller andre CNS-residente celler.

Et kritisk trin i de beskrevne metoder er omhyggelig ekstraktion af vævet, der er afgørende for både isolering af rene enkeltcellesuspensioner fra hjerne, rygmarv og meninges og for at opnå CNS-væv med enten intakte kranier eller rygsøjler, hvilket muliggør vævsmorfologi af høj kvalitet. Øvelse af teknikken til opnåelse af enkeltcellesuspensioner er nøglen til en vellykket vævsekstraktion, fordi det ikke kun vil forbedre prøvens renhed, men også forbedre celleudbyttet til downstream-applikationer. På samme måde er praksis i isolering af CNS-væv med intakte kranier eller rygsøjler for tilstrækkeligt at fjerne overskydende væv omkring knoglen et vigtigt skridt, der sikrer bedre fiksering, afkalkning og kryopræservering af vævet, alle afgørende komponenter til opnåelse af vævssektioner med morfologi af høj kvalitet og intakte antigenmål.

En begrænsning af vores protokol til isolering af enkeltcellesuspensioner fra meninges er, at den fokuserer på at opnå dural og arachnoid meninges32,54, mens den udelader isoleringen af pia, som forbliver fastgjort til hjernen eller rygmarven via astrocytprocesser. Selvom cellerne, der er bosiddende i pia mater, er en væsentlig bestanddel af meningealrummet, blev det besluttet at udelukke pia mater under enkeltcellesuspensionspræparatet på grund af den omfattende tid, der kræves for at isolere det tilstrækkeligt55. På samme måde fokuserer protokollen kun på at opnå meninges i den overordnede del af kraniet og udelukker isolering af de invaginaterende meninges i hjernen og choroid plexus. Indsamling af invaginating meninges og choroid plexus kan udføres i henhold til tidligere offentliggjorte protokoller55, selvom det er en tidskrævende procedure. I begge tilfælde skyldtes valget om at udelade en del af meningeallagene den tid, det tager at isolere dem. Timingen af protokollen, der anvendes til fremstilling af enkeltcellesuspensioner, der kræves til downstream-applikationer, såsom flowcytometri, cellekulturassays og RNA-sekventering (RNAseq), er afgørende for at forbedre cellelevedygtigheden og datakvaliteten. Afhængigt af det specifikke forskningsspørgsmål bør der derfor findes en balance mellem prøveisoleringstid og grundigheden i ekstraktion af meninges. I den nuværende protokol opnås kun enkeltcellesuspensionspræparater fra dura og arachnoid meninges, hvilket begrænser evnen til at ekstrapolere resultater til hele CNS-meninges. Men hvis disse metoder anvendes i kombination med IHC- eller ISH-analyse af hele vævssektioner med de tre lag meninges, kan der opnås en mere grundig forståelse af den cellulære og molekylære dynamik i parenkymale og meningeale rum.

En anden begrænsning af protokollen er de lave celletal opnået fra dural og arachnoid meninges, især under homeostatiske forhold. Hvis celleantallet i rygmarven, hjernen eller hjernehinderne imidlertid anses for at være for lavt til analyse af en bestemt målcellepopulation, kan det minimale celleantal, der kræves til denne analyse, bestemmes ved at estimere det samlede antal hændelser, der kræves for en given præcision (f.eks. 5% variationskoefficient) som beskrevet i tidligere litteratur med speciale i analyse af sjældne begivenheder56. Disse beregninger kan derefter bruges til at bestemme, om prøver fra flere dyr skal samles for at erhverve tilstrækkelige cellenumre til at analysere cellepopulationen af interesse.

De beskrevne metoder giver et væsentligt fremskridt i undersøgelsen af den cellulære dynamik i CNS-rummet ved at udvide analyserne til at omfatte det almindeligt oversete meningealrum. Disse protokoller giver mulighed for individuel ekstraktion af hjernen, rygmarven og dural og arachnoid meninges til at generere enkeltcellesuspensioner. Derudover tillader afkalkningsprotokollen histologiske analyser af vævssektioner, der omfatter hjerne- eller rygmarvsvæv inklusive de tre meningeallag. Brug af EDTA giver en langsom, men skånsom afkalkningsproces, som er mest velegnet til prøver, hvor vævsmorfologi af høj kvalitet er påkrævet (f.eks. IHC og ISH). Protokollen bruger en pH-værdi på 7,2-7,4 til at bremse afkalkningshastigheden og sikre vedligeholdelsen af intakt vævsmorfologi, en klar fordel i forhold til stærke og svage syrer (f.eks. saltsyre og trichloreddikesyre), som har en kortere afkalkningstid, men påvirker kvaliteten af vævsmorfologien.

Fremtidige metoder, der søger at isolere enkeltcellesuspensioner fra hjernehinderne, bør fokusere på at udvikle protokoller for at forkorte den tid, der kræves for grundigt at isolere piallaget fra CNS-væv og de invaginaterende meninges i hjernen. Opnåelse af det komplette kompleks af de tre meningeallag vil ikke kun øge celleantallet til enhver analyse, men vil også give en mere omfattende vurdering af de residente og infiltrerende immunceller, der optager meninges, som omslutter CNS. Samtidig bør fremtidige protokoller med fokus på forberedelse af afkalkede hjerner og rygmarv søge at identificere nye midler, der sigter mod at fremskynde vævsafkalkning og samtidig bevare kvaliteten af vævsmorfologi. Alt i alt kan downstream-applikationer, der analyserer CNS-enkeltcellesuspensioner inklusive dobbelt- og arachnoide meninges, udført i kombination med omfattende vævssektionsanalyse, give en detaljeret forståelse af cellefænotype, funktion og lokalisering inden for CNS-rummet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker personalet på Center for Comparative Medicine and Research (CCMR) i Dartmouth for deres ekspertpleje af de mus, der bruges til disse undersøgelser. Bornstein Research Fund finansierede denne forskning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum foil any N/A
Bovine Serum Albumin ThermoFisher Scientific 37002D
Centrifuge Beckman Coulter Allegra X-12R centrifuge
Collagenase I Worthington LS004196
Conical tube, 15 mL VWR 525-1069
Conical tube, 50 mL VWR 89039-658
Cover glass Hauser Scientific 5000
Cryomold VWR 18000-128
Curved forceps Fine Science Tools 11003-14
Disposable polystyrene tube, 14 mL Fisher Scientific 14-959-1B
Disposable Scalpel Fisher Scientific NC0595256
DNAse I Worthington LS002139
Dry ice Airgas N/A
Durmont #7Forceps Fine Science Tools 11271-30
EDTA disodium salt dihydrate Amresco 0105-500g
Ethanol, 100% any N/A
Fetal Bovine Serum (FBS) Hyclone SH30910.03
Filter top tube, 5 mL VWR 352235
Fixable viability stain 780 Becton Dickinson 565388
Flow cytometer Beckman Coulter Gallios
Glucose Fisher Chemical D16-500
Goat anti-mouse IgG (488 conjugate) Jackson immunoresearch 115-546-146
Goat anti-mouse IgG (594 conjugate) Jackson immunoresearch 115-586-146
Goat anti-rabbit 488 Jackson immunoresearch 111-545-144
Goat anti-rat 594 Jackson immunoresearch 112-585-167
Goat anti-rat 650 Jackson immunoresearch 112-605-167
Hank's Balnced Salt Solution (HBSS) Corning 21-020-CV
Hemacytometer Andwin Scientific 02-671-51B
Hemostat Fine Science Tools 13004-14
HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid) ThermoFisher Scientific 15630080
KCl Fisher chemical BP366-500
KH2PO4 (anhydrous) Sigma Aldrich P5655-100G
Liquid Nitrogen Airgas N/A
Mouse FC block (CD16/32) Becton Dickinson 553141
Na2HP04 (anhydrous) Fisher Chemical S374-500
NaCl Fisher chemical S671-500
Needle, 25 gauge Becton Dickinson 305122
Normal mouse serum ThermoFisher Scientific 31881
Nylon mesh strainer VWR 352350
OCT Sakura 4583
Paraformaldehyde, 20% Electron Microscopy Sciences 15713-S Diluted to 4% using 1 x PBS
Pasteur pipette, 9 inch, unplugged Fisher Scientific 13-678-20C
PBS (1x) Corning 21-040-CV
PE Rat Anti-Mouse CD4 Becton Dickinson 553730
PE-CF594 Rat Anti-Mouse CD19 Becton Dickinson 562329
Percoll density gradient media GE healthcare 17-0891-01
PerCP-Cy5.5 Rat Anti-Mouse CD45 Becton Dickinson 550994
Petri dish, 100 mm VWR 353003
pH meter Fisher Scientific 13-636-AB150
Pipet-Aid Drummond Scientific Corporation 4-000-101
Pipette 200 µl Gilson FA10005M
Pipette tips, 1 mL USA Scientific 1111-2831
Pipette tips, 200 µl USA Scientific 1111-1816
Pipette, 1 mL Gilson FA10006M
Prolong Diamond mountant with DAPI ThermoFisher Scientific P36962
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 Becton Dickinson 553141
Rabbit anti-mouse CD3 (SP7 clone) Abcam ab16669
Rabbit anti-mouse laminin Abcam ab11575
Rat anti-mouse ERT-R7 Abcam ab51824
RPMI 1640 Corning 10-040-CV
Serological pipet, 1 mL VWR 357521
Serological pipet, 10 mL VWR 357551
Serological pipet, 5 mL VWR 357543
Sodium hydroxide Fisher Scientific S318-100
Sucrose Fisher chemical S5-500
Surgical scissors Fine Science Tools 14001-16
Surgical scissors, extra fine Roboz RS-5882
Syringe, 10 mL Becton Dickinson 302995
Syringe, 5 mL Becton Dickinson 309646
Trypan blue Gibco 15250-061
Vacuum filter system Millipore 20207749
Vacuum flask Thomas Scientific 5340-2L
Vacuum in-line filter Pall Corporation 4402
Vacuum line Cole Palmer EW-06414-20
Water bath ThermoFisher Scientific Versa bath

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mastorakos, P., McGavern, D. The anatomy and immunology of vasculature in the central nervous system. Science Immunology. 4 (37), 0492 (2019).
  2. Carson, M. J., Doose, J. M., Melchior, B., Schmid, C. D., Ploix, C. C. CNS immune privilege: hiding in plain sight. Immunological Reviews. 213, 48-65 (2006).
  3. Rua, R., McGavern, D. B. Advances in Meningeal Immunity. Trends in Molecular Medicine. 24 (6), 542-559 (2018).
  4. Greene, H. S. The transplantation of tumors to the brains of heterologous species. Cancer Research. 11 (7), 529-534 (1951).
  5. Murphy, J. B., Sturm, E. Conditions determining the transplantability of tissues in the brain. Journal of Experimental Medicine. 38 (2), 183-197 (1923).
  6. Louveau, A., Harris, T. H., Kipnis, J. Revisiting the Mechanisms of CNS Immune Privilege. Trends in Immunology. 36 (10), 569-577 (2015).
  7. Prinz, M., Priller, J. The role of peripheral immune cells in the CNS in steady state and disease. Nature Neuroscience. 20 (2), 136-144 (2017).
  8. Louveau, A., et al. Structural and functional features of central nervous system lymphatic vessels. Nature. 523 (7560), 337-341 (2015).
  9. Korin, B., et al. High-dimensional, single-cell characterization of the brain's immune compartment. Nature Neuroscience. 20 (9), 1300-1309 (2017).
  10. Walker-Caulfield, M. E., Hatfield, J. K., Brown, M. A. Dynamic changes in meningeal inflammation correspond to clinical exacerbations in a murine model of relapsing-remitting multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology. 278, 112-122 (2015).
  11. Gadani, S. P., Smirnov, I., Smith, A. T., Overall, C. C., Kipnis, J. Characterization of meningeal type 2 innate lymphocytes and their response to CNS injury. Journal of Experimental Medicine. 214 (2), 285-296 (2017).
  12. Aspelund, A., et al. A dural lymphatic vascular system that drains brain interstitial fluid and macromolecules. Journal of Experimental Medicine. 212 (7), 991-999 (2015).
  13. Li, J., Zhou, J., Shi, Y. Scanning electron microscopy of human cerebral meningeal stomata. Annals of Anatomy. 178 (3), 259-261 (1996).
  14. Louveau, A., et al. CNS lymphatic drainage and neuroinflammation are regulated by meningeal lymphatic vasculature. Nature Neuroscience. 21 (10), 1380-1391 (2018).
  15. Choi, S. R., et al. Meningeal inflammation plays a role in the pathology of primary progressive multiple sclerosis. Brain. 135, Pt 10 2925-2937 (2012).
  16. Howell, O. W., et al. Meningeal inflammation is widespread and linked to cortical pathology in multiple sclerosis. Brain. 134, Pt 9 2755-2771 (2011).
  17. Kooi, E. J., Geurts, J. J., van Horssen, J., Bo, L., van der Valk, P. Meningeal inflammation is not associated with cortical demyelination in chronic multiple sclerosis. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 68 (9), 1021-1028 (2009).
  18. Lucchinetti, C. F., et al. Inflammatory cortical demyelination in early multiple sclerosis. New England Journal of Medicine. 365 (23), 2188-2197 (2011).
  19. Magliozzi, R., et al. A Gradient of neuronal loss and meningeal inflammation in multiple sclerosis. Annals of Neurology. 68 (4), 477-493 (2010).
  20. Arac, A., et al. Evidence that meningeal mast cells can worsen stroke pathology in mice. American Journal of Pathology. 184 (9), 2493-2504 (2014).
  21. Benakis, C., et al. Commensal microbiota affects ischemic stroke outcome by regulating intestinal gammadelta T cells. Nature Medicine. 22 (5), 516-523 (2016).
  22. Roth, T. L., et al. Transcranial amelioration of inflammation and cell death after brain injury. Nature. 505 (7482), 223-228 (2014).
  23. Shechter, R., et al. Recruitment of beneficial M2 macrophages to injured spinal cord is orchestrated by remote brain choroid plexus. Immunity. 38 (3), 555-569 (2013).
  24. Schain, A. J., et al. Activation of pial and dural macrophages and dendritic cells by cortical spreading depression. Annals of Neurology. 83 (3), 508-521 (2018).
  25. Azevedo, R. S. S., et al. In situ immune response and mechanisms of cell damage in central nervous system of fatal cases microcephaly by Zika virus. Scientific Reports. 8 (1), 1 (2018).
  26. Coles, J. A., et al. Intravital imaging of a massive lymphocyte response in the cortical dura of mice after peripheral infection by trypanosomes. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (4), 0003714 (2015).
  27. Kang, S. S., McGavern, D. B. Lymphocytic choriomeningitis infection of the central nervous system. Frontiers in Bioscience. 13, 4529-4543 (2008).
  28. DiSano, K. D., Stohlman, S. A., Bergmann, C. C. Activated GL7(+) B cells are maintained within the inflamed CNS in the absence of follicle formation during viral encephalomyelitis. Brain, Behavior, and Immunity. 60, 71-83 (2017).
  29. DiSano, K. D., R, D. B., Gilli, F., Pachner, A. R. Central Nervous System Inflammatory Aggregates in the Theiler's Virus Model of Progressive Multiple Sclerosis. Frontiers in Immunology. 10, (2019).
  30. Kennedy, H. S., Jones, C., Caplazi, P. Comparison of standard laminectomy with an optimized ejection method for the removal of spinal cords from rats and mice. Journal of Histotechnology. 36 (3), 86-91 (2013).
  31. Richner, M., Jager, S. B., Siupka, P., Vaegter, C. B. Hydraulic Extrusion of the Spinal Cord and Isolation of Dorsal Root Ganglia in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (119), e55226 (2017).
  32. Manglani, M., Gossa, S., McGavern, D. B. Leukocyte Isolation from Brain, Spinal Cord, and Meninges for Flow Cytometric Analysis. Current Protocols in Immunology. 121 (1), 44 (2018).
  33. Laroumanie, F., Dale, B. L., Saleh, M. A., Madhur, M. S. Intracellular Staining and Flow Cytometry to Identify Lymphocyte Subsets within Murine Aorta, Kidney and Lymph Nodes in a Model of Hypertension. Journal of Visualized Experiments. (119), e55266 (2017).
  34. Cao, Y., et al. An optimized assay for the enumeration of antigen-specific memory B cells in different compartments of the human body. Journal of Immunological Methods. 358 (1-2), 56-65 (2010).
  35. Wykes, M. N., Renia, L. ELISPOT Assay to Measure Peptide-specific IFN-γ Production. Bio-Protocol. 7 (11), (2017).
  36. Gjurich, B. N., Taghavie-Moghadam, P. L., Galkina, E. V. Flow Cytometric Analysis of Immune Cells Within Murine Aorta. Methods in Molecular Biology. 1339, 161-175 (2015).
  37. Laboissonniere, L. A., Sonoda, T., Lee, S. K., Trimarchi, J. M., Schmidt, T. M. Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells. Journal of Visualized Experiments. (123), e55229 (2017).
  38. Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. Journal of Visualized Experiments. (4), 198 (2007).
  39. McGowan, J. W., Bidwell, G. L. The Use of Ex Vivo Whole-organ Imaging and Quantitative Tissue Histology to Determine the Bio-distribution of Fluorescently Labeled Molecules. Journal of Visualized Experiments. (118), e54987 (2016).
  40. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count cells. Journal of Visualized Experiments. , Available from: https://www.jove.com/science-education/5048/using-a-hemacytometer-to-count-cells (2019).
  41. Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. , e752 (2008).
  42. Hatfield, J. K., Brown, M. A. Group 3 innate lymphoid cells accumulate and exhibit disease-induced activation in the meninges in EAE. Cellular Immunology. 297 (2), 69-79 (2015).
  43. Molina Estevez, F. J., Mathews, T. D., Biffi, A., Peviani, M. Simultaneous Flow Cytometric Characterization of Multiple Cell Types Retrieved from Mouse Brain/Spinal Cord Through Different Homogenization Methods. Journal of Visualized Experiments. (153), e752 (2019).
  44. Herz, J., Louveau, A., Da Mesquita, S., Kipnis, J. Morphological and Functional Analysis of CNS-Associated Lymphatics. Methods in Molecular Biology. 1846, 141-151 (2018).
  45. Kwong, B., et al. T-bet-dependent NKp46(+) innate lymphoid cells regulate the onset of TH17-induced neuroinflammation. Nature Immunology. 18 (10), 1117-1127 (2017).
  46. Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. Journal of Visualized Experiments. (88), e51046 (2014).
  47. Nurkhametova, D., et al. Activation of P2X7 Receptors in Peritoneal and Meningeal Mast Cells Detected by Uptake of Organic Dyes: Possible Purinergic Triggers of Neuroinflammation in Meninges. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 45 (2019).
  48. Van Hove, H., et al. A single-cell atlas of mouse brain macrophages reveals unique transcriptional identities shaped by ontogeny and tissue environment. Nature Neuroscience. 22 (6), 1021-1035 (2019).
  49. Czupalla, C. J., Yousef, H., Wyss-Coray, T., Butcher, E. C. Collagenase-based Single Cell Isolation of Primary Murine Brain Endothelial Cells Using Flow Cytometry. Bio-Protocol. 8 (22), 3092 (2018).
  50. Katzenell, S., Cabrera, J. R., North, B. J., Leib, D. A. Isolation, Purification, and Culture of Primary Murine Sensory Neurons. Methods in Molecular Biology. 1656, 229-251 (2017).
  51. Eriksdotter-Nilsson, M., Björklund, H., Olson, L. Laminin immunohistochemistry: a simple method to visualize and quantitate vascular structures in the mammalian brain. Journal of Neuroscience Methods. 17 (4), 275-286 (1986).
  52. Cha, J. H., et al. Prompt meningeal reconstruction mediated by oxygen-sensitive AKAP12 scaffolding protein after central nervous system injury. Nature Communications. 5, 4952 (2014).
  53. Van Vliet, E., Melis, M., Foidart, J. M., Van Ewijk, W. Reticular fibroblasts in peripheral lymphoid organs identified by a monoclonal antibody. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 34 (7), 883-890 (1986).
  54. Louveau, A., Filiano, A. J., Kipnis, J. Meningeal whole mount preparation and characterization of neural cells by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. 121 (1), (2018).
  55. Derecki, N., J, K. Mouse meninges isolation for FACS. Protocol Exchange. , (2014).
  56. Hedley, B. D., Keeney, M. Technical issues: flow cytometry and rare event analysis. International Journal of Laboratory Hematology. 35 (3), 344-350 (2013).

Tags

Immunologi og infektion udgave 159 hjernehinder centralnervesystemet afkalkning immunhistokemi enkeltcellesuspension immunceller mus
Isolering af centralnervesystemvæv og tilhørende meninges til downstream-analyse af immunceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

DiSano, K. D., Linzey, M. R., Welsh, … More

DiSano, K. D., Linzey, M. R., Welsh, N. C., Meier, J. S., Pachner, A. R., Gilli, F. Isolating Central Nervous System Tissues and Associated Meninges for the Downstream Analysis of Immune cells. J. Vis. Exp. (159), e61166, doi:10.3791/61166 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter