Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

ניתוח פתולוגי של גרורות ריאות בעקבות הזרקת וריד זנב לרוחב של תאים סרטניים

Published: May 20, 2020 doi: 10.3791/61270
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center, 2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

ERRATUM NOTICE

Summary

הזרקה תוך ורידי של תאים סרטניים משמשת לעתים קרובות במחקר גרורות, אבל נטל הגידול גרורתי יכול להיות קשה לנתח. כאן, אנו מדגימים מודל הזרקת וריד זנב של גרורות וכוללים גישה חדשנית לניתוח נטל גידול הריאות גרורתי שנוצר.

Abstract

גרורות, הגורם העיקרי לתחלואה ותמותה עבור רוב חולי הסרטן, יכול להיות מאתגר למודל פרה-אקליני בעכברים. מעט מודלים ספונטניים של גרורות זמינים. לכן, מודל גרורות ניסיוני מעורבים הזרקת וריד זנב של קווי תאים מתאימים הוא עמוד התווך של מחקר גרורות. כאשר תאים סרטניים מוזרקים לווריד הזנב לרוחב, הריאה היא האתר המועדף עליהם של קולוניזציה. מגבלה פוטנציאלית של טכניקה זו היא כימות מדויק של נטל גידול הריאות גרורתי. בעוד כמה חוקרים לספור macrometastases של גודל מוגדר מראש ו / או לכלול micrometastases בעקבות חתך של רקמות, אחרים קובעים את האזור של נגעים גרורתיים ביחס לאזור הרקמה הרגיל. שתי שיטות הכימות האלה יכולות להיות קשות מאוד כאשר הנטל גרורתי גבוה. להלן, אנו מדגימים מודל הזרקה תוך ורידי של גרורות ריאות ואחריו שיטה מתקדמת לכימות נטל הגידול גרורתי באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. תהליך זה מאפשר לחקור פרמטרים מרובים של נקודת קצה, כולל גודל גרורות ממוצע, מספר גרורות כולל ואזור גרורות כולל, כדי לספק ניתוח מקיף. יתר על כן, שיטה זו נבדקה על ידי לוח פתולוג וטרינרי מוסמך על ידי המכללה האמריקאית לפתולוגים וטרינריים (SEK) כדי להבטיח דיוק.

Introduction

למרות היותו תהליך מורכב מאוד ולא יעיל1, גרורות הוא תורם משמעותי לתחלואה ותמותה של חולי סרטן2. למעשה, רוב מקרי המוות הקשורים לסרטן מיוחסים להתפשטות גרורתית של מחלות3,4. על מנת שתאי הגידול יצאו גרורות בהצלחה, עליהם להתנתק מהאתר הראשי, לפלוש דרך סטרומה סמוכה, לחדור למחזור הדם או ללימפטיקה, לנסוע למיטה נימית של אתר משני, להזרים לרקמה המשנית, ולהתרבות או לגדול כדי ליצור נגעים גרורתיים5. השימוש במודלים של עכברים היה קריטי לקידום ההבנה של המנגנונים המולקולריים האחראים על זריעה גרורתית וצמיחה6,7. כאן, אנו מתמקדים גרורות סרטן השד, אשר הן מודלים עכבר מהונדסים גנטית, כמו גם שיטות השתלה משמשים לעתים קרובות – כל אחד עם סט משלהם של יתרונות ומגבלות.

מודלים של גידולי החלב מהונדסים גנטית עושים שימוש ביזמים ספציפיים לבלוטת החלב, כולל MMTV-LTR (חוזרים על טרמינל ארוך של וירוס החלב של העכבר) ו- WAP (חלבון חומצי מי גבינה), כדי להניע ביטוי של טרנסג'נים באפיתל החלב8. אונקוגנס כולל אנטיגן T בינוני פוליומה (PyMT), ErbB2 / Neu, c-Myc, Wnt-1, ווירוס simian 40 (SV40) באו לידי ביטוי באופן זה9,10,11,12,13, ובעוד מודלים גנטיים אלה שימושיים לחקר חניכת גידול ראשוני והתקדמות, מעטים בקלות גרורות לאיברים רחוקים. יתר על כן, מודלים אלה של עכבר גנטי הם לעתים קרובות יותר זמן ועלות אוסרת מאשר מודלים גרורות ספונטניות או ניסיוניות. בהתחשב בהגבלתם של רוב המודלים של גידולי האם מהונדסים גנטית לחקר גרורות, טכניקות השתלה הפכו לשיטות אטרקטיביות לחקר תהליך מורכב זה. זה כולל אורתוטופיה, וריד זנב, תוך לב, הזרקה תוך גולגולתית של קווי תאים מתאימים.

למרות מספר שורות תא סרטן השד בקלות גרורות בעקבות הזרקה אורתוטופית לתוך כרית שומן חלב14,15, עקביות ושחזור של נטל הגידול גרורתי יכול להיות אתגר, ואת משך המחקרים האלה יכול להיות בסדר של מספר חודשים. להערכת גרורות ריאות, בפרט, הזרקה תוך ורידי לתוך הווריד הזנב היא לעתים קרובות שיטה לשחזור ויעילה יותר עם התפשטות גרורתית המתרחשת בדרך כלל בתוך טווח של כמה שבועות. עם זאת, מאז מודל הזרקה תוך ורידי עוקף את השלבים הראשוניים של מפל גרורתי, יש לנקוט זהירות בפירוש התוצאות של מחקרים אלה. בהדגמה זו, אנו מראים הזרקת וריד זנב של תאי גידול מאמרי יחד עם שיטת ניתוח מדויקת ומקיפה.

למרות שקהילת המחקר התקדמה משמעותית בהבנת התהליך המורכב של גרורות סרטן השד, ההערכה היא כי מעל 150,000 נשים יש כיום סרטן שד גרורתי16. מתוך אלה עם סרטן השד בשלב IV, >36% מהחולים יש גרורות ריאות17; עם זאת, התבנית הספציפית לאתר והשכיחות של גרורות יכולות להשתנות בהתאם לתת-סוג מולקולרי18,19,20,21. חולים עם גרורות ריאות הקשורות לסרטן השד יש הישרדות חציונית של רק 21 חודשים המדגיש את הצורך לזהות טיפולים יעילים סמנים ביולוגיים חדשניים עבור מחלה זו17. השימוש במודלים גרורתיים ניסיוניים, כולל הזרקה תוך ורידי של תאים סרטניים, ימשיך לקדם את הידע שלנו על אתגר קליני חשוב זה. בשילוב עם פתולוגיה הדמיה דיגיטלית ואת השיטה של ניתוח נטל גידול ריאות גרורתי המתואר בפרוטוקול זה, זריקות וריד זנב הם כלי רב ערך לחקר גרורות סרטן השד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

השימוש בבעלי חיים פעל על פי תקנות משאבי בעלי חיים של המעבדה האוניברסיטאית (ULAR) במסגרת הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים (IACUC)-שאושרה פרוטוקול 2007A0120-R4 (PI: ד"ר ג'ינה סייזמור).

1. הזרקת וריד זנב של תאים סרטניים בשד

  1. הכנת תאים ומזרק להזרקה
    1. צלחת מספר מתאים של תאים בהתבסס על מספר העכברים וריכוז התאים שיש להשתמש בהם.
      הערה: מספר התאים המוזרקים והזמן להתפתחות גרורות יהיו תלויים בקו התא המשמש ויהיה צורך למטב אותו. בהדגמה זו, 1 x 106 תאי מד"א-MB-231 מוזרקים תוך ורידי לתוך NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SzJ (NSG) עכברים, ונגעים ריאות מקרוסקופיים נצפים לא יאוחר מ 24 ימים לאחר הזרקה. עבור קו תא הגידול mVT1 מורין mammary17, 3 x 106 תאים מוזרקים לעכברי FVB / N המוכשרים למערכת החיסון עם גרורות ריאות רבות שנצפו על ידי 14 ימים22,23.
    2. שאפו מדיה ושטפו לוחות תאים עם PBS 1x. Trypsinize תאים בנפח מינימלי, הוסף נפח מדיה מתאים וספור תאים באמצעות המטוציטומימטר או שיטה מועדפת אחרת. ניתן להשתמש בכחול טריפן (0.4%) או בצבעים אחרים של תאים חיים/מתים כדי לקבוע ספירת תאים בת קיימא.
    3. כדורי תאים על ידי ספינינג ב 180 x g במשך 5 דקות.
    4. Resuspend מספר מתאים של תאים סטרילי 1x PBS כך נפח של 100 μL מוזרק לכל עכבר. שמור על השעיית תא על קרח כדי לשמור על הכדאיות.
    5. לפני ההזרקה, ביסודיות resuspend תאים עם 200 μL או 1 מ"ל pipette כדי למנוע גושים. צייר 100 μL במזרק אינסולין 28 גרם (ראה טבלה של חומרים).
    6. לחסל את כל בועות האוויר על ידי שמירה על המזרק אנכי, הקשה על המזרק, ולאט לאט להתאים את הבוכנה. הזרקת בועות אוויר לווריד עלולה לגרום לתסחיף אוויר/גז שעלול להיות קטלני.
  2. הזרקת וריד זנב לרוחב
    הערה: לבדיקות גרורות ניסיוניות של סרטן השד, זריקות מבוצעות על > 6 שבועות עכברים נשיים.
    1. טפל בעכבר בזנב והחלק את החיה לתוך צינור מחורץ / התקן ריסון בגודל מתאים (עיין בטבלת החומרים עבור התקן איפוק המשמש).
    2. הכנס את חלק התקע של התקן האיפוק והצב את העכבר על צידו כך שווריד הזנב הצדדי שלו יהיה קל לצפייה. לעכבר עורק גחון בהתאם לאיבר המין, וריד גפי ושני ורידים לרוחב.
    3. נקה את פני השטח של זנב העכבר עם ניגוב אספטי. תפוס את הזנב בין האצבע והאגודל ביד לא דומיננטית והחל מתח קל.
    4. החל בחלק הדיסטלי של הזנב, הכנס את המחט במקביל לווריד עם שיפוע בסופו של דבר.
    5. אם מותר, בזהירות לסכם את המחט ולהתכופף לזווית של 20-30°. מומלץ מאוד לגשת לבד או להתקן סיכום מחטים.
      הערה: אין צורך לשאוף כמו זה עלול לגרום לווריד לקרוס. עם זאת, הבזק קטן של דם ניתן לראות כאשר הוצב לראשונה. המחט תתקדם בצורה חלקה לתוך הווריד עם מיקום נכון.
    6. לאט לאט לחלק את הנפח המלא לתוך הווריד. לא צריכה להיות התנגדות כאשר הבוכנה נדחפת.
    7. אם כל התנגדות מורגשת, מיד להסיר את מחט המזרק. במידת הצורך, הכנס מחדש את המחט (באופן אידיאלי לא יותר מ 3 ניסיונות) נע לכיוון הקצה הפרוקסימלי של הזנב או וריד לרוחב מנוגד.
    8. סביר להניח שנפח קטן של דם ייעקר לאחר ההזרקה. יש למרוח לחץ עדין עם גזה סטרילית ולנגב עם מגבון אספטי.
    9. יש להיפטר מיד ממזרק במיכל חדות מתאים.
    10. החזר את העכבר לכלוב נקי ומאוורר ופקח על סימני מצוקה.
    11. לפקח על עכברים 2-3x/שבועי לסימנים של היווצרות גרורות (נשימה מאומצת, יציבה כפופה, ירידה במשקל) ומצוקה כללית. הזמן להתפתחות גרורות יהיה תלוי קו התא ומתח העכבר.
    12. אם משתמשים במכשיר הדמיה חיה חיה של in vivo, עכברי תמונה מיד לאחר הזרקת וריד הזנב כדי לאשר הזרקה מוצלחת של תאים ולקבל נתוני זמן "אפס" (פרטים ספציפיים על הדמיית ביולומינציה של vivo אינם כלולים כאן, אלא מתוארים על ידי יאנג ואח '24).

2. קיבוע רקמת ריאה וניתוח נטל גידול ריאות גרורתי

  1. אינפלציית רקמת ריאה כדי לשמור על הפורמט המבני של הריאות עבור היסטופתולוגיה
    1. לאחר נהלי המתת חסד מאושרים (למשל פחמן דו חמצני ב 30 - 70% תזוזה של נפח התא / דקה) הם אחריו, לאבטח את פגר העכבר ללוח ניתוח עם סיכות. או לרסס או להחיל 70% אתנול כדי לשמור על פרוות העכבר מהדרך במהלך הניתוח.
      הערה: חנק דו תחמוצת הפחמן יכול לגרום לדימום ריאתי כמו נגע רקע צפוי, במיוחד בקצבי זרימה איטיים יותר.
    2. פתחו את בית החזה עם חתך בקו האמצע, הרחיבו את החתך באופן קרני/קאודלי דרך הציפק, וחתכו את הסרעפת על ידי אחיזת תהליך הקסיפיד.
    3. באמצעות קבוצה נפרדת של מספריים כדי לא לעמעם את הלהבים, לחתוך את הצלעות לאורך כל צד של בעצם החזה ולהסיר בזהירות כלוב צלעות משאיר מקום לריאות להתרחב.
    4. לבודד את קנה הנשימה על ידי הסרת בלוטות רוק תת-קרקעיות ושרירים אינפרהיואידים. הצבת סיכות משני צדי קנה הנשימה יכולה למנוע תנועה לא רצויה במהלך החדרת מחט.
    5. מלא מזרק 26 G עם 2-3 מ"ל של 10% פורמלין חוצץ נייטרלי ולהכניס לתוך קנה הנשימה.
    6. לאט להזריק פורמלין ולצפות הריאות להתרחב (בדרך כלל דורש ~ 1.5 מ"ל של פורמלין).
    7. ברגע שפורמלין מתחיל לדלוף מהריאות (הימנעו מאינפלציה יתר), צבוטו את קנה הנשימה עם זוג מלקחיים, הסירו מחט מזרק וניתקו את כל מערכת הנשימה. מניחים ריאות, לב וכו 'ישירות לתוך פורמלין כמו גיזום נוסף של רקמות יכול להיעשות לאחר קיבעון.
    8. עיבוד מלא, הטבעה, חתך של רקמות, המטוקסילין ו- eosin (H&E) מכתימים בשיטות סטנדרטיות.
  2. ניתוח נטל גידול ריאות גרורתי
    1. סרוק מקטעי ריאות מוכתמים H&E בסורק שקופיות ברזולוציה גבוהה בהגדלה של פי 40 (איור 3).
    2. יבא תמונות לתוכנת ניתוח תמונה (לדוגמה, Visiopharm Image Analysis) לכימות גרורות ריאות.
      הערה: אנו ממליצים למשתמשים חדשים לקבל הדרכה באתר או באינטרנט כדי להשתמש בתוכנת ניתוח התמונות. סמינרים מקוונים רבים זמינים גם דרך דף האינטרנט המסחרי.
    3. בחר את אפליקציית גרורות הריאות של Visiopharm 10118 מתוך ספריית היישומים של התוכנה.
      הערה: מטרת אפליקציה זו היא לתייג ולכומת גרורות ריאות בשקופיות מוכתמות ב- H&E. כחלק מאפליקציית גרורות הריאות H&E 10118, שלב עיבוד התמונה הראשון מפלח את רקמת הריאה באמצעות אפליקציית זיהוי הרקמות. שלב עיבוד התמונה השני משתמש ביישום זיהוי גרורות המזהה את גרורות בתוך רקמת הריאה. גרורות מזוהות באמצעות צורה יחד עם אזורים שהם מעוותים מדי, אדומים מדי או דלילים מדי לזיהוי כגרורות.
    4. התאם את הפרמטרים המגדירים צורה ודלילות כך שיתאימו בצורה הטובה ביותר לתמונות מייצגות. אזורים מקוטעים של גרורות גידול ורקמת ריאה רגילה ניתן להציג באמצעות תוויות צבע שונות עבור כל סוג רקמה.
      הערה: במקרה שהאפליקציה אינה יכולה להפריד במדויק גרורות מרקמת ריאה רגילה, ייתכן שיהיה צורך לכתוב אפליקציה מותאמת אישית המשתמשת בתוכנית Visiopharm Decision Forest כפי שנעשה עבור הניסויים (ראה איור 2 ואיור 3). להלן פרטים לכתיבת אלגוריתם מותאם אישית. אחרת, המשך לשלב 2.2.9.
    5. פתח את תוכנית יער ההחלטות, הפועלת על ידי אימון שיעורים מרובים [כלומר, רקמת ריאה (לא ניאופלאסטית), גרורות, תאי דם אדומים, אפיתל ו/או חלל לבן] על תמונה רצויה. באיור 2, גרורות הגידול הן כחולות, רקמה רגילה ירוקה ואפיתל הסימפונות צהוב. כמו כן, תאי דם אדומים נמצאים בחללים אדומים ואוויר בוורוד.
    6. בצע את הסדרה המתבקשת של שאלות כן או לא כדי לאמן כראוי כל כיתה לתמונה. הדיוק של האלגוריתם יקבע את מספר שאלות כן/לא. לצורך הניתוח, האלגוריתם/האפליקציה המותאמים אישית נכתבו בדיוק מוגדר ל- 50 (טווח 0-100).
    7. התאם תכונות עבור כל מחלקה על-ידי החלת מסננים כדי לחדד, לטשטש, למיין לפי צורה וכו' כדי לשפר את הדיוק של האלגוריתם/אפליקציה. Visiopharm מציג כל מחלקה דרך עדשות אחת או מרובות המכונות תכונות. התכונות משנות את האופן שבו הכיתה רואה את התמונה כדי להוציא צבעים או עוצמות מסוימים.
      הערה: עבור האלגוריתם המותאם אישית, גרורות מדידה 8500 μm2 ומעלה מסומנות ונמדדות כגרורות. זה מסביר את סטיית הגודל והגרורות קטנות מכדי לזהות. אזורים קטנים מעוותים ואזורים גרורתיים קטנים מתחת 8500 מיקרומטר 2 נכללו כימות הרקמה הרגיל.
    8. שמור את ההגדרות שהשתנו מהאפליקציה או מהאלגוריתם המותאם אישית ולאחר מכן, החל את האלגוריתם/אפליקציה על ערכה שלמה או סדרה של רקמות מוכתמות ב- H&E.
    9. לבסוף, יצא את כל משתני הפלט, הכוללים את משתני הפלט המפורטים בטבלה 1. שטח במיקרונים בריבוע (μm2) ניתן לכמת עבור כל סוג רקמה ואחוזים נגזרים מדגם שטח רקמה נטו הכולל (כלומר, רקמה כוללת פחות שטח אוויר).
    10. בעת יצירת אלגוריתם מותאם אישית, סקור סימוני רקמות בהתייעצות עם לוח פתולוגים וטרינריים המאושר על ידי המכללה האמריקאית לפתולוגים וטרינריים כדי להבטיח מדידות מדויקות ולהבדיל בין סוגי רקמות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אם משתמשים בתאים לא מתובלים להזרקת ורידים בזנב, ייתכן שיהיה קשה לאשר קולוניזציה של ריאות עד (1) זמן הנמק אם ניתן לצפות במקרומטסטאזים או (2) בעקבות ניתוח היסטולוגי אם קיימים גרורות מיקרוסקופיות. עם נטל גידול גרורתי נרחב בריאות, לעכברים תהיה נשימה מאומצת. כמו בכל מחקר גידול, עכברים צריכים להיות במעקב קפדני לאורך כל המחקר. השימוש בתאים מסומנים הוא דרך קלה לאשר הזרקת וריד זנב מוצלחת; מכאן השימוש בתאי מד"א-MB-231 מתויגים לוציפראז בהדגמה. עם זאת, בהדמיית vivo לא תמיד אפשרי או הכרחי בהתאם לעיצוב הניסיוני וגורמים אחרים. איור 1A מראה אות ביו-לומינציה בחלל בית החזה פחות משעתיים לאחר הזרקת וריד הזנב של תאי מד"א-MB-231 מתויגים לוציפראז כאישור להזרקה מדויקת. בניסוי זה, ספירת הפוטון באזור בית החזה גדלה עם הזמן ואות ביו-לומינציה חזק קיים ביום 24 לאחר ההזרקה (איור 1B ו- C; שימו לב לשינוי בסרגל קנה המידה). בזמן הנמק נצפו בעכברים אלה נגעים רבים בריאות מקרוסקופיות (איור 1D).

לאחר עיבוד והכתמה נאותים של רקמות, ניתן לסרוק או לדמות מקטעי ריאות מוכתמים ב-H&E. כימות נטל גידול ריאות גרורתי ניתן להשיג ביעילות באמצעות תוכנת ניתוח תמונה ואלגוריתם מותאם אישית. באמצעות האלגוריתם המותאם אישית, רקמת ריאה שלמה מחולקת לפי תכונות רקמות שונות (איור 2A ו- B). על ידי פילוח רקמת הריאה באופן זה, התוכנה יכולה לכמת את הפרמטרים השונים המפורטים בטבלה 1. ניתוח זה בוצע על רקמת ריאה מעכברים שהוזרקו לתאי מד"א-MB-231 ולאחריהם טיפול בתרופה שנועדה לחסום קולוניזציה גרורתית או בקרת רכב (DMSO). הנתונים הגולמיים מניתוח זה מוצגים בטבלה 2. יתר על כן, איור 3A מציג תמונות H&E מייצגות של גרורות ריאות של מד"א-MB-231 מ-DMSO או מעכברים שטופלו בסמים. בעוד שהבדל בנטל הגידול גרורתי בין קבוצות טיפול אלה אולי התעלם בקלות מכיוון שהמספר הכולל של גושי הריאות אינו שונה, ניתוח מקיף של כל הפרמטרים מצביע על הבדל משמעותי באזור גרורות הריאות נטו באחוזים (איור 3B,C). זה מדגיש את הצורך בגישה מקיפה ויסודית לניתוח נטל גידול ריאות גרורתי כגון השיטה המתוארת כאן.

עבור הנתונים המוצגים באיור 3, כל הניתוחים הסטטיסטיים נערכו באמצעות מנסרה GraphPad 7. הנתונים נחשבו מופצים בדרך כלל עם מעבר לכל אחד מבדיקות הנורמליות הסטנדרטיות הבאות: ד'אגוסטינו-פירסון אומניבוס, שפירו-וילק וקולמוגורוב-סמירנוב. ההשוואה בין הרכב לקבוצות שטופלו בסמים (איור 3) נעשתה על ידי מבחן T-t של סטודנט דו-זנבי לא מנוקד. משמעות סטטיסטית נקבעה ב P ≤ 0.05.

Figure 1
איור 1: אישור ביו-לומינציה של ויוו להזרקה מוצלחת של וריד זנב.
(א) אות ביו-לומינציה מייצג בעכברים שעה לאחר הזרקת וריד הזנב של תאי מד"א-MB-231 מתויגים לוציפראז. (B) אות ביו-לומינציה מייצג באותה קבוצה של עכברים כמו (A) 24 ימים לאחר הזרקת וריד הזנב של תאי מד"א-MB-231 מתויגים לוציפראז. [שים לב לשינוי בסרגל קנה המידה בין (A) ל- (B)]. (ג) כימות ספירת פוטון לאורך זמן בעכברים מוזרקים של מד"א-MB-231. סרגלי שגיאה מייצגים ממוצע ± SEM. (n = 8 עכברים) (D) נציג שאינו נושא רקמת ריאה נושאת גידול (מימין) ו- macrometastases של מד"א-MB-231 בריאות (משמאל) בזמן נמק. מוטות קנה מידה = 50 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: פילוח רקמות באמצעות תוכנת Visiopharm.
(א) צליפים מייצגים של סימוני רקמות לא מוזכרים ומפולחים באמצעות אלגוריתם התוכנה המותאם אישית. (ב) מקרא עבור כל קטגוריות הרקמות המפולח באמצעות תוכנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: ניתוח נטל גידול ריאות גרורתי מייצג של רקמות מוכתמות H&E.
(א) הכתמת H&E מייצגת של רקמת ריאה מעכברים ובקרה (DMSO) ועכברים שטופלו בסמים בעקבות הזרקת וריד הזנב של תאי מד"א-MB-231. גרורות גידול מייצגות מסומנות עם חצים. סרגלי קנה מידה = 500 מיקרומטר להגדלה של פי 4 ו- 200 מיקרומטר להגדלה של פי 10. (B) גרף של אחוז אזור גרורות ריאות נטו של שליטה ועכברים שטופלו בסמים. קווי שגיאה מייצגים ממוצע ± SD. (*) P = 0.022 לפי מבחן t של סטודנט. (C) טבלה המסכמת את ניתוח נטל גידול הריאות גרורתי (n = 9 DMSO; n = 9 מטופלים בתרופות). לאחר בדיקת התפלגות נורמלית של נתונים, כל ערכי ה- P בטבלה נקבעו על-ידי t-test דו-זנבי שלא שולמו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

פרמטר תיאור
סה"כ שטח רקמה (μm2) שטח במיקרונים מרובעים כולל כל גרורות הגידול, ריאות רגילות ואזורים של תאי דם אדומים.
ספירת גרורות המספר הכולל של גרורות בתוך רקמת הריאה.
אחוז אזור גרורות (μm2) אזור גרורות כולל חלקי שטח רקמה נטו x 100.
סה"כ רקמה + שטח לבן (μm2) שטח במיקרונים מרובעים כולל כל הרקמה והחלל הלבן.
אזור רקמה נטו (μm2) אזור רקמות במיקרונים מרובעים (מטס וריאה רגילה) ללא שטח לבן ותאי דם אדומים.
סה"כ אזור גרורות (μm2) שטח גרורות כולל במיקרונים מרובעים כפי שמפולח על ידי אלגוריטים יער ההחלטה.
אזור גרורות ממוצע (μm2) אזור ממוצע (ממוצע) במיקרונים מרובעים של גרורות בתוך כל תמונה.
אזור גרורות חציוני (μm2) אזור גרורות חציוני במיקרונים מרובעים. מספר שווה של גרורות נופל מתחת לערך זה ומספר שווה של גרורות גדול מהערך החציוני.

טבלה 1: פרמטרים הנמדדים באמצעות תוכנה. רשימת פרמטרים יחד עם תיאור של כל מדידה שחושבת באמצעות האלגוריתם המותאם אישית.

שקופית ספירת גרורות אחוז אזור גרורות (μm2) סה"כ רקמה + שטח לבן (μm2) סה"כ שטח לבן (μm2) אזור רקמה נטו (μm2) סה"כ אזור גרורות (μm2) אזור תאי הדם האדומים (μm2) אזור גרורות ממוצע (μm2) אזור גרורות חציוני (μm2)
171 שקופית ריאות 1 435 8.90 185698000 83201800 92031400 8189250 10464800 18825.86 14748.73
171 שקופית ריאות 2 323 8.37 185698000 83201800 92054740 7708990 10441460 23866.84 14748.73
172 שקופית ריאות 1 151 2.73 181546000 89509904 81571296 2225220 10464800 14736.56 12486.37
172 שקופית ריאות 2 142 2.60 170708000 81735504 80558196 2093040 8414300 14739.72 12119.62
173 שקופית ריאות 1 634 11.60 234104992 102153000 115606692 13406800 16345300 21146.37 15472.22
173 שקופית ריאות 2 667 12.70 223180992 86778600 122374592 15542700 14027800 23302.40 16531.00
174 שקופית ריאות 1 40 0.55 192452992 80340896 87591096 485121 24521000 12128.03 10484.05
174 שקופית ריאות 2 34 0.51 183918000 71287904 91242796 464830 21387300 13671.47 11181.81
175 שקופית ריאות 1 780 23.93 179544992 44799200 126995782 30388600 7750010 38959.74 19307.76
175 שקופית ריאות 2 1001 12.58 169191536 43425608 120610754 15169100 5155174 15153.95 19703.08
188 שקופית ריאות 1 569 13.20 162290000 54210000 98486310 12997300 9593690 22842.36 14463.91
188 שקופית ריאות 2 271 5.15 157146000 54250800 91996500 4738100 10898700 17483.76 12657.83
189 שקופית ריאות 1 74 1.70 185292992 95700800 77779392 1318820 11812800 17821.89 14551.08
189 שקופית ריאות 2 74 1.76 182272992 95700800 74759392 1318820 11812800 17821.89 14551.08
816 שקופית ריאות 1 246 5.65 185876000 87568896 81916204 4631050 16390900 18825.41 14371.99
816 שקופית ריאות 2 565 6.05 183220000 76954304 90305396 5462670 15960300 9668.44 14244.82
876 שקופית ריאות 1 468 10.36 208308000 99300096 100947064 10454500 8060840 22338.68 16011.37
876 שקופית ריאות 2 528 11.74 199750896 81642568 110450391 12963400 7657937 24551.89 16699.13
877 שקופית ריאות 1 732 17.98 219340992 99918600 107869992 19397100 11552400 26498.77 18137.52
877 שקופית ריאות 2 605 14.64 207925504 88539712 108168329 15839700 11217463 26181.32 18014.64
878 שקופית ריאות 1 377 10.05 178534000 85610896 81931104 8232340 10992000 21836.45 16671.03
878 שקופית ריאות 2 376 9.88 170544000 75337904 86108406 8511710 9097690 22637.53 16754.38
879 שקופית ריאות 1 205 5.22 167556000 89999000 68123630 3553860 9433370 17335.90 13845.69
879 שקופית ריאות 2 213 4.64 167931008 80789400 78489588 3638720 8652020 17083.19 14058.12
881 שקופית ריאות 1 1122 38.81 218880000 79713504 130893816 50802300 8272680 45278.34 22044.99
881 שקופית ריאות 2 628 21.67 184200992 74502600 99122692 21475200 10575700 34196.18 19857.40
882 שקופית ריאות 1 678 24.05 194476992 83941904 98484788 23684500 12050300 34932.89 20748.06
882 שקופית ריאות 2 645 21.93 185537040 75790040 101412430 22241700 8334570 34483.26 20325.11
883 שקופית ריאות 1 429 10.79 179400992 84955696 84699866 9138800 9745430 21302.56 15080.23
883 שקופית ריאות 2 342 85.30 175220992 76210896 90472386 77170200 8537710 225643.86 17078.26
884 שקופית ריאות 1 359 6.42 206751008 87752600 103825008 6669710 15173400 18578.58 14333.41
884 שקופית ריאות 2 480 9.12 200990000 77052496 111060804 10125700 12876700 21095.21 15679.88
885 שקופית ריאות 1 332 7.79 191398000 92896304 84752596 6605490 13749100 19896.05 14500.11
885 שקופית ריאות 2 537 81.02 187475008 85938000 89378408 72411104 12158600 134843.77 15360.29
886 שקופית ריאות 1 305 7.93 158435008 80433296 76541662 6068720 1460050 19897.44 14500.11
886 שקופית ריאות 2 898 8.84 155460000 70808600 83457470 7380490 1193930 8218.81 14744.92

טבלה 2: רשימת תוצאות מייצגת. טבלת תוצאות עבור כל פרמטר של האלגוריתם מתוך קבוצה של עכברים וריד זנב מוזרק עם תאי מד"א-MB-231.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ככל שהחוקרים ממשיכים להשתמש בהזרקה תוך ורידי של תאים סרטניים כמודל ניסיוני לגרורות, חסרים פרקטיקות סטנדרטיות לניתוח נטל הגידול גרורתי שנוצר. במקרים מסוימים, הבדלים משמעותיים בנטל הגידול גרורתי על מניפולציה של קווי תאים מסוימים ו /או שימוש בתרכובות כימיות ניתן לראות מקרוסקופית. עם זאת, במקרים אחרים, הבדלים עדינים זריעה גרורתית וצמיחה ניתן להתעלם או לפרש לא נכון ללא ניתוח פתולוגי יסודי. מחקר זה מקדם פרוטוקולי הזרקת ורידים זנב שפורסמו בעבר על ידי הכללת שיטה מקיפה של ניתוח נטל גידול ריאות גרורתי. חשוב לציין, שיטה זו של ניתוח פתולוגיה דיגיטלית יכולה להיות מיושמת גם לכימות של נטל גידול גרורתי ריאות בעקבות הזרקה אורתוטופית של תאים סרטניים המסוגלים גרורות ספונטניות, כמו גם מודלים גרורות ניסיוניות אחרים (כלומר תוך לב, וכו ') ומודלים קסנוגרפט (PDX) שמקורם בחולה. השימוש בהדמיה דיגיטלית ופיתוח אלגוריתמים של תוכנה על ידי פתולוגים וטרינריים מבטיח את הרבייה, הדיוק והיסודיות של גישה זו לניתוח נטל גידול הריאות גרורתי25.

החלטה מתחשבת של קווי תאים, ריכוז תאים ונקודות קצה המבוססות על מחקרים שפורסמו בעבר או אופטימיזציה ניסיונית זהירה היא הכרחית לחלוטין. בהתחשב בכך זריעה גרורתית קולוניזציה תלויים מאוד אינטראקציות עם אוכלוסיות תאי מערכת החיסון שונים26,27, השימוש בעכברים המוכשרים למערכת החיסון הוא אידיאלי, אם כי לא תמיד ריאלי. מאותה סיבה, יש לנקוט בזהירות בפרשנות של מחקרי גרורות ניסיוניים באמצעות עכברים אתימיים או NSG, שאין בהם מרכיבי תאי חיסון מרכזיים. ישנם מספר קווי תאי גידול ממארי עכבר, כולל תאי MVT1 המשמשים במחקר זה, שנגזרו מזן העכבר FVB / N22,28,29. מודלים סינגניים אחרים קיימים גם כן. לגבי ריכוז התאים, הזרקה של מספר רב של תאים עשויה להאיץ מאוד ולשפר את נטל גידול הריאות גרורתי. עם זאת, אם הריאות מוצפות, ייתכן שיהיה קשה להבחין בין מוקדים מ גרורתיים בודדים ותסחיפים נוטים יותר להתרחש. כמו כן, הליך הזרקת וריד הזנב דורש תרגול ואימונים בשפע לפני בבטחה ו /או ביצוע שגרתי זריקות. מוסדות רבים יציעו הכשרה טכנית ועשויים לספק עכברים למטרות תרגול. מיקום נכון של המחט והזרקה חלקה אמורים להצביע על הצלחה; עם זאת, למטרות אימון / תרגול, אוונס צבע כחול יכול לשמש כדי לעזור לקבוע הזרקה מוצלחת (1% PBS סטרילי). הגפיים של העכבר יהפכו כחולות זמן קצר לאחר ההזרקה, אבל החיה צריכה להיות מורדמת לאחר מכן.

בנוסף, לא ניתן להדגיש מספיק את החשיבות של טכניקות סטנדרטיות של נמק ודגימה של רקמות כדי לשלוט ולמנוע ממצאי שקופיות שעלולים לפגוע בסריקת שקופיות וניתוח על ידי תוכנת ניתוח התמונה. אינפלציית הריאות בזמן הנמק היא צעד קריטי בשמירה על שלמות הרקמות ומשפרת את הכתמת ה- H&E לאחר מכן, כמו גם ניתוח סופי. עבור עקביות עם רזולוציה ושחזור, מומלץ שכל השקופיות בערכת מחקר יסרקו באותה מטרה. במחקר זה, כל השקופיות נסרקו ב 40x כדי להבטיח דיוק של הגדרות אלגוריתם וזיהוי נכון של גרורות גידול כאשר מוחל על שדות מנותחים. עבור כל שקופית, אותן אונות ריאה נסרקו ונותחו בעקביות עבור כל עכבר. כמו כן, מומלץ בחום כי פתולוג לסקור סימוני רקמות לדיוק של האלגוריתם המיושם וכי אותו אלגוריתם מוחל על כל שקופית במחקר.

ניתן לשנות את הפרוטוקול המוצג בהתאם לתכנון ניסיוני, העדפות משתמש ומדידות תוצאות רצויות. שינוי אחד כזה כולל שימוש בתא אינדוקציה הרדמה ולא מכשיר מרסן קונבנציונאלי עבור חיה מודעת. במונחים של בריאות בעלי חיים ובריאות, אף גישה אינה עדיפה על השנייה ולכל אחד יש סט יתרונות משלו, כמו גם מגבלות30. כמו כן, עבור עכברים שחורים או חומים, מקור אור או מכשיר חימום עשוי להיות נחוץ על מנת לדמיין את ורידי הזנב. מנורות אינפרא אדום או אמבט מים חמים ניתן להשתמש כדי להרחיב את הוורידים. עם זאת, יש לפקח בקפידה על הטמפרטורה. יתר על כן, ישנם התקני ריסון מוארים זמינים, כמו גם גרסאות מסחריות אחרות של מכשירי ריסון מכרסמים. חלק מהחוקרים מעדיפים מזרקי לוהר-לוק על זריקות. אנחנו מוצאים את זה יותר קשה לחסל בועות אוויר עם מזרקי Luer-Lok, אבל זה עניין של העדפה. הכדאיות של תאים היא שיקול חשוב עבור הליך הזרקת וריד הזנב, ולכן, ספירת תאים מדויקת, כמו גם שמירה על תאים על קרח לפני ההזרקה הם צעדים הכרחיים. אם משווים זריעת ריאות קולוניזציה של קווי תאים מניפולציה, זה קריטי כדי לקבוע את כל ההבדלים בגודל התא ואת הכדאיות לפני הזרקה כמו אלה עלולים לסבך את הפרשנות של תוצאות. מוות תא ו/או נזק עלול להתרחש בעת שימוש במחט מד צר; עם זאת, לא מומלץ כי מחט גדולה מ 25 G לשמש כפי שהוא עלול לגרום לכאב ואי נוחות לחיה.

כדרך לאמת כי נגעים ריאות נוצרים על ידי תאים סרטניים מוזרקים, חיסונים יכולים להיעשות על קטעי רקמות. אם משתמשים בקווי תאים אנושיים, נוגדנים ספציפיים לאדם יכולים לשמש להבחין נגעים גרורתיים. לחלופין, אם משתמשים בקווי תאים מתויגים (למשל, GFP), ניתן להשתמש בנוגדנים המתאימים. כמו כן, קווי תאים רבים של סרטן השד חיוביים עבור סמני אפיתל (כלומר, ציטו-קדרטין, E-cadherin, ו- EpCAM), אבל ידע מוקדם של ביטוי הוא חיוני. עם זאת, אפיתל הריאות רירית דרכי הנשימה יהיה גם חיובי עבור סמנים אלה ולכן, מבנה חייב להיחשב גם. ייתכנו מקרים שבהם יש לשלול התפתחות ראשונית של גידול ריאות. כדי לעשות זאת, כתמים אימונוהיסטוכימיים עבור פקטור שעתוק בלוטת התריס-1 (TTF1) יכול לשמש כסמן של אדנוקרצינומה ריאות ראשונית. כתמי TTF1 צריכים להיות מוערכים על ידי פתולוג מוסמך.

להלן, אלגוריתם מותאם אישית נכתב באמצעות אלגוריתם סיווג יער החלטות כי אלגוריתם גרורות ריאות הוקמה לא יכול להיות מכוון היטב לגילוי מדויק של גרורות מגוונות בגודל. אלגוריתם מותאם אישית זה מאפשר מדידות מורכבות, מאפשר פילוח מדויק של גרורות לפי גודל, ותומך בקיצוץ גודל כך שאזורים קטנים שגויים ומבנים רגילים אינם מתפרשים שלא כהלכה ולכן ניתן לכלול אותם בערכת הנתונים הסופית. אנו צופים כי אלגוריתם זה יהיה ישים על רוב מחקרי גרורות ריאות vivo, אבל משתמשים ייתכן שיהיה צורך להתאים את ההגדרות בתוך התוכנה כדי להתאים את צרכי המחקר האישי שלהם. עם זאת, אלגוריתם זה משמש פלטפורמה לחוקרים המעוניינים לנתח את הנטל גרורתי של הריאות באופן דומה. ישנן אפשרויות רבות ושונות עבור פלטפורמות ניתוח תמונה לפיהן גישה או זמינות, עלות והדרכה, כמו גם רמת ניסיון עשוי להכתיב את הפלטפורמה הטובה ביותר לנצל36. מגוון האפשרויות כולל פלטפורמות חינמיות כגון QuPath ופלטפורמות יקרות יותר אך מתוחכמות יותר, כגון Visiopharm. מומלץ להתייעץ עם ליבת פתולוגיה ניתוח תמונה ופתולוג כאשר מחליטים איזו פלטפורמה עשויה להיות זמינה ומנוצלת בצורה הטובה ביותר לפרויקט מחקר מסוים.

מודלים ספונטניים של גידולים בחלב עכבר (למשל, MMTV-PyMT) או שיטות הזרקת כרית שומן ממארי אורתוטופית מייצגים את המודל הרלוונטי ביותר מבחינה פיזיולוגית לחקר גרורות ריאות. חיסרון רציני במודל הזרקת וריד הזנב הוא שהוא אינו מסכם את מפל גרורתי מלא ולכן מוגבל לחקר ההגזמה של תאי הגידול והתיישבות איברים משנית. עם זאת, מודל גרורות ניסיוני זה רלוונטי לחקר סרטן השד כמו גרורות ריאות שנוצרו בעקבות הזרקת וריד זנב יש פרופילים גנומיים דומים נגעים גרורתיים המתפתחים לאחר השתלה אורתוטופית של אותם תאים31. על מנת ליצור מודל גרורות ריאות, מספר רב של תאים מוזרקים לעתים קרובות תוך ורידי אשר לא יכול לייצג במדויק את תהליך גרורות כפי שהוא נוגע זריעה, תגובה חיסונית, רדום. כמו כן, בהתבסס על מסלול הדם, גרורות ריאות שכיחות ביותר עם הזרקת וריד זנב32. עם רוב קווי התאים של סרטן השד, דוחות שפורסמו מצביעים על שכיחות נמוכה יחסית של גרורות עצם, כבד או מוח לאחר הזרקת וריד הזנב7. שיטות גרורות ניסיוניות חלופיות כגון תוך-לב, תוך-אינטימי, וריד פורטל וזריקות תוך-קרוטידים מתאימות יותר לבחינת גרורות לאתרים אחרים33,34,35,36,37. שוב, מודלים של גידולים מאמרי ספונטניים או שיטות הזרקת כרית שומן אורתוטופית המשיבות את כל שלבי המפל גרורתי עדיפים. בעיות עם נטל גידול גרורתי עקבי, משך המחקר ומספר בעלי החיים הנדרשים למחקרים כאלה הם חיסרון. עם זאת, השיטה של ניתוח פתולוגיה דיגיטלית המוצגת כאן ב יכול להיות מיושם גרורות ריאות שנוצרו באמצעות כל מודל גרורות ספונטני או ניסיוני.

שיטת הניתוח גם מניבה מגבלות מסוימות כגון סובייקטיביות ביצירת אלגוריתמים. למרות הדמיית שקופית שלמה מאפשרת ניתוח דיגיטלי על קטע רקמות שלם ועל כל אונות הריאות של עכבר אחד, זה מוגבל לניתוח דו ממדי של רקמה 3D. סטריאוטולוגיה הופכת למנהג נפוץ המקבל מידע תלת-ממדי לניתוח תמונה ויכול להסביר גורמים כגון התכווצות רקמות המתרחשת במהלך עיבוד רקמות38. סטריאוטולוגיה, לעומת זאת, יש מגבלות משלה כגון רקמה, משאב, ואילוצי זמן.

בהתחשב במספר חולי הסרטן המושפעים מהתפשטות גרורתית של מחלתם, שיטת הזרקת הוורידים האחוריים לחקר גרורות תמשיך להיות כלי שימושי מבחינת הבנת הביולוגיה המורכבת של התפשטות גרורתית וקביעת היעילות הקדם קלינית של טיפולים חדשניים. מודלים של עכברי Vivo של גרורות, במיוחד אלה המשתמשים בבעלי חיים מוסמכים במערכת החיסון, הופכים חשובים עוד יותר לחקר הסרטן בהתחשב בהתעניינות הנרחבת באימונותרפיה29. כמו כן, מודלים גרורתיים ניסיוניים הם קריטיים מבחינת חקירת גנים מדכא גרורות (כלומר, אלה המדכאים את הפוטנציאל גרורתי של תאים סרטניים מבלי להשפיע על צמיחת הגידול העיקרי), ולכן, ממשיכים להיות כלי מחקרי בעל ערך.

הדמיה דיגיטלית וניתוח שקופיות הפכו במהירות לעמוד התווך במודלים של עכברים אבחנתיים וניסיוניים39. שימוש בסוג הגישה המתוארת להלן לניתוח נטל הגידול גרורתי של הריאות יאפשר ניתוחי תפוקה גבוהים באופן מקיף ומדויק יותר. יתר על כן, פתולוגיית הדמיה דיגיטלית מספקת שדרה לפרויקטי מחקר שיתופיים יותר הכוללים פתולוגים המתמחים בתחומים כגון מודלים של עכברים של גרורות סרטן השד. ככל ששיטות הדמיית רקמות מולטיפלקס וטכנולוגיות הדמיה תלת-ממדיות (כאמור) ממשיכות להתפתח, פתולוגיית הדמיה דיגיטלית, תוכנות מתוחכמות לניתוח תמונה, ומומחיותם של פתולוגים בהחלט תהיה נחוצה לקידום מחקר גרורות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgments

הנתונים הייצוגית מומנו באמצעות המכון הלאומי לסרטן (K22CA218549 ל- S.T.S). בנוסף לסיועם בפיתוח שיטת הניתוח המקיפה המדווחת כאן, אנו מודים למרכז הסרטן המקיף של אוניברסיטת אוהיו ולמשאב המשותף של פנוטיפינג עכבר (מנהל – קריסטה לה פרל, DVM, PhD) על שירותי היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה ולליבת ההדמיה הפתולוגית לפיתוח וניתוח אלגוריתמים.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
alcohol prep pads Fisher Scientific 22-363-750 for cleaning tail prior to injection
dissection scissors Fisher Scientific 08-951-5 for mouse dissection and lung tissue inflation
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate Fisher Scientific MT10013CV cell culture media base for MDA-MB-231 and MVT1 cell lines
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x Fisher Scientific MT21030CV used for resuspending tumor cells for injection
ethanol (70 % solution) OSU used to minimize mouse's fur during dissection; use caution - flammable
Evan's blue dye Millipore Sigma E2129 used at 1 % in sterile PBS for practice with tail-vein injection method; use caution - dangerous reagent
Fetal Bovine Serum Millipore Sigma F4135 cell culture media additive; used at 10% in DMEM
forceps Fisher Scientific 10-270 for dissection and lung tissue inflation
FVB/NJ mice The Jackson Laboratory 001800 syngeneic mouse strain for MVT1 cells
hemacytometer (Bright-Line) Millipore Sigma Z359629 for use in cell culture to obtain cell counts
insulin syringe (28 G) Fisher Scientific 14-829-1B for tail-vein injections (BD 329424)
MDA-MB-231 cells ATCC human breast cancer cell line
MVT1 cells mouse mammary tumor cells
needles (26 G) Fisher Scientific 14-826-15 used to inflate the mouse's lungs
neutral buffered formalin (10%) Fisher Scientific 245685 used as a tissue fixative and to inflate lung tissue; use caution - dangerous reagent
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice The Jackson Laboratory 005557 maintained by OSUCCC Target Validation Shared Resource
Penicillin Streptomycin 100x ThermoFisher 15140163 cell culture media additive
sterile gauze Fisher Scientific NC9379092 for applying pressue to mouse's tail if bleeding occurs
syringe (5 mL) Fisher Scientific 14-955-458 used to inflate mouse lung tissue
tail-vein restrainer Braintree Scientific, Inc. TV-150 STD used to restrain mouse for tail-vein injections
Trypan blue (0.4 %) ThermoFisher 15250061 used in cell culture to assess viability
Trypsin-EDTA 0.25 % ThermoFisher 25200-114 used in cell culture to detach tumor cells from plate

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nature Reviews: Cancer. 2 (8), 563-572 (2002).
  2. Steeg, P. S. Targeting metastasis. Nature Reviews: Cancer. 16 (4), 201-218 (2016).
  3. Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
  4. Steeg, P. S. Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges. Nature Medicine. 12 (8), 895-904 (2006).
  5. Chaffer, C. L., Weinberg, R. A. A perspective on cancer cell metastasis. Science. 331 (6024), 1559-1564 (2011).
  6. Eckhardt, B. L., Francis, P. A., Parker, B. S., Anderson, R. L. Strategies for the discovery and development of therapies for metastatic breast cancer. Nature Reviews Drug Discovery. 11 (6), 479-497 (2012).
  7. Gomez-Cuadrado, L., Tracey, N., Ma, R., Qian, B., Brunton, V. G. Mouse models of metastasis: progress and prospects. Disease Models & Mechanisms. 10 (9), 1061-1074 (2017).
  8. Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Research. 8 (4), 212 (2006).
  9. Schoenenberger, C. A., et al. Targeted c-myc gene expression in mammary glands of transgenic mice induces mammary tumours with constitutive milk protein gene transcription. EMBO Journal. 7 (1), 169-175 (1988).
  10. Nusse, R., Varmus, H. E. Many tumors induced by the mouse mammary tumor virus contain a provirus integrated in the same region of the host genome. Cell. 31 (1), 99-109 (1982).
  11. Muller, W. J., Sinn, E., Pattengale, P. K., Wallace, R., Leder, P. Single-step induction of mammary adenocarcinoma in transgenic mice bearing the activated c-neu oncogene. Cell. 54 (1), 105-115 (1988).
  12. Lin, E. Y., et al. Progression to malignancy in the polyoma middle T oncoprotein mouse breast cancer model provides a reliable model for human diseases. American Journal of Pathology. 163 (5), 2113-2126 (2003).
  13. Green, J. E., et al. The C3(1)/SV40 T-antigen transgenic mouse model of mammary cancer: ductal epithelial cell targeting with multistage progression to carcinoma. Oncogene. 19 (1), 1020-1027 (2000).
  14. Iorns, E., et al. A new mouse model for the study of human breast cancer metastasis. PloS One. 7 (10), 47995 (2012).
  15. Kim, I. S., Baek, S. H. Mouse models for breast cancer metastasis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 394 (3), 443-447 (2010).
  16. Mariotto, A. B., Etzioni, R., Hurlbert, M., Penberthy, L., Mayer, M. Estimation of the Number of Women Living with Metastatic Breast Cancer in the United States. Cancer Epidemiology, Biomarkers and Prevention. 26 (6), 809-815 (2017).
  17. Xiao, W., et al. Risk factors and survival outcomes in patients with breast cancer and lung metastasis: a population-based study. Cancer Medicine. 7 (3), 922-930 (2018).
  18. Smid, M., et al. Subtypes of breast cancer show preferential site of relapse. Cancer Research. 68 (9), 3108-3114 (2008).
  19. Kennecke, H., et al. Metastatic behavior of breast cancer subtypes. Journal of Clinical Oncology. 28 (20), 3271-3277 (2010).
  20. Soni, A., et al. Breast cancer subtypes predispose the site of distant metastases. American Journal of Clinical Pathology. 143 (4), 471-478 (2015).
  21. Leone, B. A., et al. Prognostic impact of metastatic pattern in stage IV breast cancer at initial diagnosis. Breast Cancer Research and Treatment. 161 (3), 537-548 (2017).
  22. Pei, X. F., et al. Explant-cell culture of primary mammary tumors from MMTV-c-Myc transgenic mice. In Vitro Cellular and Developmental Biology: Animal. 40 (1-2), 14-21 (2004).
  23. Mathsyaraja, H., et al. CSF1-ETS2-induced microRNA in myeloid cells promote metastatic tumor growth. Oncogene. 34 (28), 3651-3661 (2015).
  24. Yang, S., Zhang, J. J., Huang, X. Y. Mouse models for tumor metastasis. Methods in Molecular Biology. 928, 221-228 (2012).
  25. La Perle, K. M. D. Comparative Pathologists: Ultimate Control Freaks Seeking Validation. Veterinary Pathology. 56 (1), 19-23 (2019).
  26. Blomberg, O. S., Spagnuolo, L., de Visser, K. E. Immune regulation of metastasis: mechanistic insights and therapeutic opportunities. Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).
  27. Gonzalez, H., Hagerling, C., Werb, Z. Roles of the immune system in cancer: from tumor initiation to metastatic progression. Genes and Development. 32 (19-20), 1267-1284 (2018).
  28. Borowsky, A. D., et al. Syngeneic mouse mammary carcinoma cell lines: two closely related cell lines with divergent metastatic behavior. Clinical and Experimental Metastasis. 22 (1), 47-59 (2005).
  29. Yang, Y., et al. Immunocompetent mouse allograft models for development of therapies to target breast cancer metastasis. Oncotarget. 8 (19), 30621-30643 (2017).
  30. Resch, M., Neels, T., Tichy, A., Palme, R., Rulicke, T. Impact assessment of tail-vein injection in mice using a modified anaesthesia induction chamber versus a common restrainer without anaesthesia. Laboratory Animals. 53 (2), 190-201 (2019).
  31. Rashid, O. M., et al. Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model. Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).
  32. Goodale, D., Phay, C., Postenka, C. O., Keeney, M., Allan, A. L. Characterization of tumor cell dissemination patterns in preclinical models of cancer metastasis using flow cytometry and laser scanning cytometry. Cytometry Part A. 75 (4), 344-355 (2009).
  33. Goddard, E. T., Fischer, J., Schedin, P. A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer. Journal of Visualized Experiments. (118), (2016).
  34. Wright, L. E., et al. Murine models of breast cancer bone metastasis. BoneKEy Reports. 5, 804 (2016).
  35. Simmons, J. K., et al. Animal Models of Bone Metastasis. Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).
  36. Liu, Z., et al. Improving orthotopic mouse models of patient-derived breast cancer brain metastases by a modified intracarotid injection method. Scientific Reports. 9 (1), 622 (2019).
  37. Kodack, D. P., Askoxylakis, V., Ferraro, G. B., Fukumura, D., Jain, R. K. Emerging strategies for treating brain metastases from breast cancer. Cancer Cell. 27 (2), 163-175 (2015).
  38. Brown, D. L. Practical Stereology Applications for the Pathologist. Veterinary Pathology. 54 (3), 358-368 (2017).
  39. Aeffner, F., et al. Digital Microscopy, Image Analysis, and Virtual Slide Repository. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 59 (1), 66-79 (2018).

Tags

חקר הסרטן גיליון 159 הזרקת ורידים זנב סרטן השד גרורות ריאות מקטעים מוכתמים ב- H&E פתולוגיה דיגיטלית כמותית ניתוח תמונה

Erratum

Formal Correction: Erratum: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells
Posted by JoVE Editors on 12/02/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells. The author list was updated.

The author list was updated from:

Katie A. Thies1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

to:

Katie A. Thies1, Sarah Steck1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

ניתוח פתולוגי של גרורות ריאות בעקבות הזרקת וריד זנב לרוחב של תאים סרטניים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Thies, K. A., Steck, S., Knoblaugh,… More

Thies, K. A., Steck, S., Knoblaugh, S. E., Sizemore, S. T. Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells. J. Vis. Exp. (159), e61270, doi:10.3791/61270 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter