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Cancer Research

Analisi patologica delle metastasi polmonari a seguito di iniezione laterale della vena della coda di cellule tumorali

Published: May 20, 2020 doi: 10.3791/61270
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center, 2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

ERRATUM NOTICE

Summary

L'iniezione endovenosa di cellule tumorali viene spesso utilizzata nella ricerca sulle metastasi, ma il carico tumorale metastatico può essere difficile da analizzare. Qui, dimostriamo un modello di iniezione della vena caudale di metastasi e includiamo un nuovo approccio per analizzare il carico tumorale polmonare metastatico risultante.

Abstract

Le metastasi, la causa principale di morbilità e mortalità per la maggior parte dei malati di cancro, possono essere difficili da modellare preclinicamente nei topi. Sono disponibili pochi modelli di metastasi spontanee. Pertanto, il modello sperimentale di metastasi che coinvolge l'iniezione della vena caudale di linee cellulari adatte è un pilastro della ricerca sulle metastasi. Quando le cellule tumorali vengono iniettate nella vena laterale della coda, il polmone è il loro sito preferito di colonizzazione. Una potenziale limitazione di questa tecnica è la quantificazione accurata del carico tumorale polmonare metastatico. Mentre alcuni ricercatori contano macrometastasi di dimensioni predefinite e/o includono micrometastasi dopo il sezionamento del tessuto, altri determinano l'area delle lesioni metastatiche rispetto all'area tissutale normale. Entrambi questi metodi di quantificazione possono essere estremamente difficili quando il carico metastatico è elevato. Qui, dimostriamo un modello di iniezione endovenosa di metastasi polmonari seguito da un metodo avanzato per quantificare il carico tumorale metastatico utilizzando un software di analisi delle immagini. Questo processo consente di studiare più parametri end-point, tra cui la dimensione media delle metastasi, il numero totale di metastasi e l'area totale delle metastasi, per fornire un'analisi completa. Inoltre, questo metodo è stato esaminato da un patologo veterinario certificato dall'American College of Veterinary Pathologists (SEK) per garantire l'accuratezza.

Introduction

Nonostante sia un processo altamente complesso e inefficiente1, le metastasi contribuiscono in modo significativo alla morbilità e alla mortalità dei pazienti oncologici2. In effetti, la maggior parte dei decessi correlati al cancro sono attribuiti alla diffusione metastatica della malattia3,4. Affinché le cellule tumorali possano metastatizzare con successo, devono staccarsi dal sito primario, invadere attraverso lo stroma adiacente, intravasare la circolazione sanguigna o linfatica, viaggiare verso il letto capillare di un sito secondario, estravasare nel tessuto secondario e proliferare o crescere fino a formare lesioni metastatiche5. L'uso di modelli murini è stato fondamentale per promuovere la comprensione dei meccanismi molecolari responsabili della semina e della crescita metastatica6,7. Qui ci concentriamo sulle metastasi del cancro al seno, per le quali vengono spesso utilizzati sia modelli murini geneticamente modificati che metodi di trapianto, ognuno con la propria serie di vantaggi e limitazioni.

I modelli di tumore mammario geneticamente modificati fanno uso di promotori specifici della ghiandola mammaria, tra cui MMTV-LTR (mouse mammary tumor virus long terminal repeat) e WAP (Whey Acidic Protein), per guidare l'espressione dei transgeni nell'epitelio mammario8. Gli oncogeni tra cui l'antigene T medio del polioma (PyMT), ErbB2/Neu, c-Myc, Wnt-1 e il virus simian 40 (SV40) sono stati espressi in questo modo9,10,11,12,13, e mentre questi modelli genetici sono utili per studiare l'inizio e la progressione del tumore primario, pochi metastatizzano facilmente in organi distanti. Inoltre, questi modelli genetici murini sono spesso più proibitivi in termini di tempo e costi rispetto ai modelli di metastasi spontanee o sperimentali. Data la limitazione della maggior parte dei modelli di tumore mammario geneticamente modificati per studiare le metastasi, le tecniche di trapianto sono diventate metodi interessanti per studiare questo complesso processo. Ciò include l'iniezione ortotopica, della vena della coda, intracardiaca e intracranica di linee cellulari adatte.

Sebbene diverse linee cellulari di cancro al seno metastatizzino prontamente dopo l'iniezione ortotopica nel cuscinetto di grasso mammario14,15, la consistenza e la riproducibilità del carico tumorale metastatico può essere una sfida e la durata di tali studi può essere dell'ordine di diversi mesi. Per valutare le metastasi polmonari, in particolare, l'iniezione endovenosa nella vena della coda è spesso un metodo più riproducibile ed efficace nel tempo con diffusione metastatica che si verifica tipicamente nell'arco di poche settimane. Tuttavia, poiché il modello di iniezione endovenosa bypassa le fasi iniziali della cascata metastatica, è necessario prestare attenzione nell'interpretare i risultati di questi studi. In questa dimostrazione, mostriamo l'iniezione della vena caudale di cellule tumorali mammarie insieme a un metodo di analisi accurato e completo.

Anche se la comunità di ricerca ha compiuto progressi significativi nella comprensione del complesso processo delle metastasi del cancro al seno, si stima che oltre 150.000 donne abbiano attualmente il cancro al seno metastatico16. Di quelli con carcinoma mammario in stadio IV, >36% dei pazienti ha metastasi polmonari17; tuttavia, il modello sito-specifico e l'incidenza delle metastasi possono variare in base al sottotipo molecolare18,19,20,21. Le pazienti con metastasi polmonari associate al cancro al seno hanno una sopravvivenza mediana di soli 21 mesi, evidenziando la necessità di identificare trattamenti efficaci e nuovi biomarcatori per questa malattia17. L'uso di modelli sperimentali di metastasi, compresa l'iniezione endovenosa di cellule tumorali, continuerà a far progredire la nostra conoscenza di questa importante sfida clinica. Quando combinate con la patologia di imaging digitale e il metodo di analisi del carico tumorale polmonare metastatico descritto in questo protocollo, le iniezioni di vena caudale sono uno strumento prezioso per la ricerca sulle metastasi del cancro al seno.

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Protocol

L'uso degli animali ha seguito i regolamenti dell'Università Laboratory Animal Resources (ULAR) nell'ambito del protocollo approvato dall'OSU Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) 2007A0120-R4 (PI: Dr. Gina Sizemore).

1. Iniezione della vena della coda delle cellule del cancro al seno

  1. Preparazione di cellule e siringhe per iniezione
    1. Placcare un numero appropriato di cellule in base al numero di topi e alla concentrazione cellulare da utilizzare.
      NOTA: Il numero di cellule iniettate e il tempo per lo sviluppo delle metastasi dipenderanno dalla linea cellulare utilizzata e dovranno essere ottimizzati. In questa dimostrazione, 1 x 106 cellule MDA-MB-231 vengono iniettate per via endovenosa in topi NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) e le lesioni polmonari macroscopiche vengono osservate entro e non oltre 24 giorni dopo l'iniezione. Per la linea cellulare del tumore mammario murino MVT117, 3 x 106 cellule vengono iniettate in topi FVB/N immunocompatibili con numerose metastasi polmonari osservate da 14 giorni22,23.
    2. Aspirare i mezzi e le piastre delle celle di risciacquo con 1x PBS. Tripsinizzare le cellule in volume minimo, aggiungere il volume appropriato di media e contare le cellule utilizzando un ematocitometro o un altro metodo preferito. Il blu di tripano (0,4%) o altri coloranti a cellule vive / morte possono essere utilizzati per determinare la conta cellulare vitale.
    3. Celle a pellet ruotando a 180 x g per 5 min.
    4. Sospendere il numero appropriato di cellule in PBS sterile 1x in modo tale che venga iniettato un volume di 100 μL per topo. Mantenere la sospensione cellulare sul ghiaccio per mantenere la vitalità.
    5. Prima dell'iniezione, risospendare accuratamente le cellule con una pipetta da 200 μL o 1 mL per evitare l'aggregazione. Aspirare 100 μL in una siringa da insulina da 28 G (vedere Tabella dei materiali).
    6. Eliminare eventuali bolle d'aria mantenendo la siringa verticale, picchiettando la siringa e regolando lentamente lo stantuffo. L'iniezione di bolle d'aria nella vena è probabile che causi un'embolia aria / gas che può essere fatale.
  2. Iniezione laterale della vena della coda
    NOTA: Per i test sperimentali di metastasi del cancro al seno, le iniezioni vengono eseguite su topi femmina di > 6 settimane.
    1. Maneggiare il mouse per la coda e far scivolare l'animale in un tubo/dispositivo di ritenuta a fessura di dimensioni appropriate (vedere la tabella dei materiali per il dispositivo di ritenuta utilizzato).
    2. Inserire la parte della spina del dispositivo di ritenuta e posizionare il mouse su un lato in modo tale che la sua vena laterale della coda sia facile da visualizzare. Il topo ha un'arteria ventrale in linea con i genitali, una vena dorsale e due vene caudali laterali.
    3. Pulire la superficie della coda del mouse con una salvietta asettica. Afferrare la coda tra indice e pollice con la mano non dominante e applicare una leggera tensione.
    4. A partire dalla porzione distale della coda, inserire l'ago parallelo alla vena con la fine smussata.
    5. Se consentito, ricapitolare attentamente l'ago e piegarlo con un angolo di 20-30 °. Un dispositivo di avvicinamento con una sola mano o un dispositivo di ricapitolazione dell'ago è altamente raccomandato.
      NOTA: Non è necessario aspirare in quanto ciò potrebbe causare il collasso della vena. Tuttavia, un piccolo lampo di sangue può essere visto quando viene posizionato per la prima volta. L'ago avanzerà dolcemente nella vena con un posizionamento corretto.
    6. Erogare lentamente il volume completo nella vena. Non ci dovrebbe essere resistenza quando lo stantuffo viene spinto.
    7. Se si avverte resistenza, rimuovere prontamente l'ago della siringa. Se necessario, reinserire l'ago (idealmente non più di 3 tentativi) spostandosi verso l'estremità prossimale della coda o la vena laterale opposta.
    8. Un piccolo volume di sangue sarà probabilmente spostato dopo l'iniezione. Applicare una leggera pressione con una garza sterile e pulire con una salvietta asettica.
    9. Smaltire tempestivamente la siringa in un apposito contenitore per taglienti.
    10. Riportare il mouse in una gabbia pulita e ventilata e monitorare i segni di pericolo.
    11. Monitorare i topi 2-3x / settimana per segni di formazione di metastasi (respirazione affannosa, postura curva, perdita di peso) e disagio generale. Il tempo di sviluppo delle metastasi dipenderà dalla linea cellulare e dal ceppo di topo.
    12. Se si utilizza un dispositivo di imaging animale vivo in vivo, i topi immagine immediatamente dopo l'iniezione della vena della coda per confermare il successo dell'iniezione di cellule e ottenere dati "zero" a tempo (dettagli specifici sull'imaging a bioluminescenza in vivo non sono inclusi nel presente documento, ma sono descritti da Yang et al.24).

2. Fissazione del tessuto polmonare e analisi del carico tumorale polmonare metastatico

  1. Gonfiaggio del tessuto polmonare per mantenere il formato strutturale dei polmoni per l'istopatologia
    1. Dopo aver seguito le procedure di eutanasia approvate (ad es. anidride carbonica al 30 - 70% di spostamento del volume della camera / min), fissare la carcassa del topo a una scheda di dissezione con perni. Spruzzare o applicare il 70% di etanolo per tenere la pelliccia del topo fuori mano durante la dissezione.
      NOTA: L'asfissia da anidride carbonica può causare emorragia polmonare come lesione di fondo prevista, specialmente a portate più lente.
    2. Aprire il torace con un'incisione della linea mediana, estendere l'incisione cranicamente / caudale attraverso il peritoneo e tagliare via il diaframma afferrando il processo xifoide.
    3. Usando un set separato di forbici per non opacizzare le lame, tagliare le costole lungo ciascun lato dello sterno e rimuovere con cura la gabbia toracica lasciando spazio ai polmoni per espandersi.
    4. Isolare la trachea rimuovendo le ghiandole salivari sottomandibolari e la muscolatura infraioide. Posizionare i perni su entrambi i lati della trachea può impedire movimenti indesiderati durante l'inserimento dell'ago.
    5. Riempire una siringa da 26 G con 2-3 mL di formalina tamponata neutra al 10% e inserirla nella trachea.
    6. Iniettare lentamente formalina e guardare per i polmoni di espandersi (di solito richiede ~ 1,5 ml di formalina).
    7. Una volta che la formalina inizia a fuoriuscire dai polmoni (evitare l'inflazione eccessiva), pizzicare la trachea con un paio di pinze, rimuovere l'ago della siringa e staccare l'intero apparato respiratorio. Posizionare polmoni, cuore, ecc. direttamente nella formalina poiché è possibile eseguire ulteriori rifilature del tessuto dopo la fissazione.
    8. Completa la lavorazione, l'incorporamento, il sezionamento del tessuto e la colorazione di ematossilina ed eosina (H & E) utilizzando metodi standard.
  2. Analisi del carico tumorale polmonare metastatico
    1. Scansione di sezioni polmonari colorate di H&E su uno scanner a vetrini ad alta risoluzione con ingrandimento 40x (Figura 3).
    2. Importare immagini in un software di analisi delle immagini (ad esempio, Visiopharm Image Analysis) per la quantificazione delle metastasi polmonari.
      NOTA: si consiglia ai nuovi utenti di ottenere una formazione in loco o online per utilizzare il software di analisi delle immagini. Numerosi webinar sono disponibili anche attraverso la pagina web commerciale.
    3. Selezionare l'app Visiopharm 10118 H&E Lung Metastasis dalla libreria di app del software.
      NOTA: lo scopo di questa app è quello di etichettare e quantificare le metastasi polmonari sui vetrini colorati di H & E. Come parte dell'app 10118 H&E Lung Metastasis, la prima fase di elaborazione delle immagini segmenta il tessuto polmonare con l'app Tissue Detection. La seconda fase di elaborazione delle immagini utilizza l'app Metastasis Detect che identifica le metastasi all'interno del tessuto polmonare. Le metastasi sono identificate attraverso la forma insieme a regioni che sono troppo deformate, troppo rosse o troppo sparse per essere identificate come metastasi.
    4. Regola i parametri che definiscono la forma e la scarsità per adattarli al meglio alle immagini rappresentative. Le aree segmentate delle metastasi tumorali e del tessuto polmonare normale possono essere visualizzate utilizzando etichette di colore diverse per ogni tipo di tessuto.
      NOTA: nel caso in cui l'app non sia in grado di separare con precisione le metastasi dal tessuto polmonare normale, potrebbe essere necessario scrivere un'app personalizzata che utilizza il programma Visiopharm Decision Forest come è stato fatto per gli esperimenti (vedere figura 2 e figura 3). Di seguito sono riportati i dettagli per la scrittura di un algoritmo personalizzato. In caso contrario, procedere al passaggio 2.2.9.
    5. Apri il programma Decision Forest, che funziona addestrando più classi [ad esempio, tessuto polmonare (non neoplastico), metastasi, globuli rossi, epitelio e / o spazio bianco] su un'immagine desiderata. Nella Figura 2, le metastasi tumorali sono blu, il tessuto normale è verde e l'epitelio bronchiolare è giallo. Inoltre, i globuli rossi sono in rosso e gli spazi d'aria in rosa.
    6. Segui la serie di domande sì o no richieste per addestrare in modo appropriato ogni classe per un'immagine. L'accuratezza dell'algoritmo determinerà il numero di domande sì/no. Per l'analisi, l'algoritmo/app personalizzato è stato scritto con una precisione impostata su 50 (intervallo 0-100).
    7. Regola le funzionalità per ogni classe applicando filtri per affinare, sfocare, ordinare per forma, ecc. per migliorare l'accuratezza dell'algoritmo/app. Visiopharm visualizza ogni classe attraverso una o più lenti note come funzionalità. Le funzionalità modificano il modo in cui la classe vede l'immagine per far risaltare determinati colori o intensità.
      NOTA: per l'algoritmo personalizzato, le metastasi di 8500 μm2 e superiori sono etichettate e misurate come metastasi. Ciò tiene conto della varianza delle dimensioni e delle metastasi troppo piccole per essere rilevate. Piccole aree deformate e piccole aree metastatiche inferiori a 8500 μm2 sono state incluse nella normale quantificazione tissutale.
    8. Salva le impostazioni modificate dall'app o dall'algoritmo personalizzato e quindi applica l'algoritmo / app a un intero set o serie di tessuti colorati H & E.
    9. Infine, esportare tutte le variabili di output, incluse quelle elencate nella Tabella 1. L'area in micron al quadrato (μm2) può essere quantificata per ciascun tipo di tessuto e le percentuali sono derivate dall'area totale del tessuto netto del campione (cioè tessuto totale meno spazio aereo).
    10. Quando si crea un algoritmo personalizzato, rivedere i markup dei tessuti in consultazione con un patologo veterinario certificato dall'American College of Veterinary Pathologists per garantire misurazioni accurate e distinguere tra i tipi di tessuto.

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Representative Results

Se si utilizzano cellule non etichettate per l'iniezione della vena della coda, può essere difficile confermare la colonizzazione polmonare fino a (1) il tempo dell'autopsia se si possono osservare macrometastasi o (2) dopo l'analisi istologica se esistono metastasi microscopiche. Con un ampio carico di tumore polmonare metastatico, i topi avranno faticato a respirare. Come con qualsiasi studio sul tumore, i topi devono essere attentamente monitorati per tutta la durata dello studio. L'uso di cellule marcate è un modo semplice per confermare il successo dell'iniezione della vena della coda; da qui l'uso di cellule MDA-MB-231 marcate con luciferasi nella dimostrazione. Tuttavia, l'imaging in vivo non è sempre possibile o necessario a seconda del disegno sperimentale e di altri fattori. La Figura 1A mostra il segnale di bioluminescenza nello spazio toracico meno di 2 ore dopo l'iniezione della vena caudale di cellule MDA-MB-231 marcate con luciferasi come conferma di un'iniezione accurata. Per questo esperimento, la conta dei fotoni nella regione toracica aumenta nel tempo e un forte segnale di bioluminescenza è presente al giorno 24 post-iniezione (Figura 1B e C; si noti il cambiamento nella barra della scala). Al momento dell'autopsia, in questi topi sono state osservate molte lesioni polmonari macroscopiche (Figura 1D).

Dopo una corretta elaborazione e colorazione dei tessuti, le sezioni polmonari macchiate di H & E possono essere scansionate o visualizzate. La quantificazione del carico del tumore polmonare metastatico può essere efficacemente ottenuta utilizzando un software di analisi delle immagini e un algoritmo personalizzato. Utilizzando l'algoritmo personalizzato, l'intero tessuto polmonare viene segmentato in base a diverse caratteristiche del tessuto (Figura 2A e B). Segmentando il tessuto polmonare in questo modo, il software può quantificare i vari parametri elencati nella Tabella 1. Questa analisi è stata eseguita su tessuto polmonare di topi iniettati con cellule MDA-MB-231 seguite da un trattamento con un farmaco progettato per bloccare la colonizzazione metastatica o un controllo del veicolo (DMSO). I dati grezzi di questa analisi sono mostrati nella Tabella 2. Inoltre, la Figura 3A mostra immagini H&E rappresentative di metastasi polmonari MDA-MB-231 da dmSO o topi trattati con farmaci. Mentre una differenza nel carico tumorale metastatico tra questi gruppi di trattamento può essere stata facilmente trascurata in quanto il numero totale di noduli polmonari non è diverso, un'analisi completa di tutti i parametri indica una differenza significativa nell'area percentuale netta di metastasi polmonari (Figura 3B, C). Ciò sottolinea la necessità di un approccio completo e approfondito per analizzare il carico tumorale polmonare metastatico come il metodo qui descritto.

Per i dati presentati nella Figura 3, tutte le analisi statistiche sono state condotte utilizzando GraphPad Prism 7. I dati sono stati considerati normalmente distribuiti dopo aver superato uno dei seguenti test di normalità standard: D'Agostino-Pearson omnibus, Shapiro-Wilk e Kolmogorov-Smirnov. Il confronto tra il veicolo e i gruppi trattati con farmaci (Figura 3) è stato fatto mediante t-test di Student a due code spaiato. La significatività statistica è stata stabilita a P ≤ 0,05.

Figure 1
Figura 1: Conferma della bioluminescenza in vivo del successo dell'iniezione della vena caudale.
(A) Segnale di bioluminescenza rappresentativo nei topi 1 ora dopo l'iniezione della vena di coda di cellule MDA-MB-231 marcate con luciferasi. (B) Segnale di bioluminescenza rappresentativo nello stesso set di topi di (A) 24 giorni dopo l'iniezione della vena caudale di cellule MDA-MB-231 marcate con luciferasi. [Notare la variazione della barra di scala tra (A) e (B)]. (C) Quantificazione della conta dei fotoni nel tempo nei topi iniettati con vena caudale MDA-MB-231. Le barre di errore rappresentano ± medie SEM. (n = 8 topi) (D) Tessuto polmonare rappresentativo non tumorale (a destra) e macrometastasi MDA-MB-231 nei polmoni (a sinistra) al momento dell'autopsia. Barre della scala = 50 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Segmentazione dei tessuti utilizzando il software Visiopharm.
(A) Frammenti rappresentativi di ricarichi di tessuti non segmentati e segmentati utilizzando l'algoritmo software personalizzato. (B) Legenda per tutte le categorie di tessuti segmentati tramite software. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Analisi del carico tumorale polmonare metastatico rappresentativo dei tessuti colorati con H&E.
(A) Colorazione H&E rappresentativa del tessuto polmonare da topi e controllo non iniettati (DMSO) e topi trattati con farmaci a seguito di iniezione della vena caudale di cellule MDA-MB-231. Le metastasi tumorali rappresentative sono indicate con frecce. Barre di scala = 500 μm per ingrandimento 4x e 200 μm per ingrandimento 10x. (B) Grafico della percentuale di metastasi polmonari nette area di controllo e topi trattati con farmaci. Le barre di errore rappresentano la media ± SD. (*) P = 0,022 dal t-test dello studente. (C) Tabella riassuntiva dell'analisi del carico tumorale polmonare metastatico (n = 9 DMSO; n = 9 trattati farmacologicamente). Dopo aver verificato la normale distribuzione dei dati, tutti i valori P nella tabella sono stati determinati dal t-test di Student non accoppiato e a due code. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Parametro Descrizione
Area totale del tessuto (μm2) Area in micron quadrati comprensiva di tutte le metastasi tumorali, polmone normale e aree di globuli rossi.
Conteggio delle metastasi Numero totale di metastasi all'interno del tessuto polmonare.
Percentuale di area metastasi (μm2) Area totale delle metastasi divisa per l'area netta del tessuto x 100.
Tessuto totale + Area spazio bianco (μm2) Area in micron quadrati comprensiva di tutto il tessuto e lo spazio bianco.
Area tissutale netta (μm2) Area tissutale in micron quadrati (mets e polmone normale) senza spazio bianco e globuli rossi.
Area metastasi totale (μm2) Area totale delle metastasi in micron quadrati come segmentato dall'algorithim della foresta di decisione.
Area metastasi media (μm2) Area media (media) in micron quadrati di metastasi all'interno di ogni immagine.
Area metastasi mediana (μm2) Area di metastasi mediana in micron quadrati. Un numero uguale di metastasi scende al di sotto di questo valore e un numero uguale di metastasi è maggiore del valore mediano.

Tabella 1: Parametri misurati con il software. Elenco dei parametri insieme a una descrizione di ogni misurazione calcolata utilizzando l'algoritmo personalizzato.

Diapositiva Conteggio delle metastasi Percentuale di area metastasi (μm2) Tessuto totale + Area spazio bianco (μm2) Spazio bianco totale (μm2) Area tissutale netta (μm2) Area metastasi totale (μm2) Area globuli rossi (μm2) Area metastasi media (μm2) Area metastasi mediana (μm2)
171 Diapositiva polmonare 1 435 8.90 185698000 83201800 92031400 8189250 10464800 18825.86 14748.73
171 Diapositiva polmonare 2 323 8.37 185698000 83201800 92054740 7708990 10441460 23866.84 14748.73
172 Diapositiva polmonare 1 151 2.73 181546000 89509904 81571296 2225220 10464800 14736.56 12486.37
172 Diapositiva polmonare 2 142 2.60 170708000 81735504 80558196 2093040 8414300 14739.72 12119.62
173 Diapositiva polmonare 1 634 11.60 234104992 102153000 115606692 13406800 16345300 21146.37 15472.22
173 Diapositiva polmonare 2 667 12.70 223180992 86778600 122374592 15542700 14027800 23302.40 16531.00
174 Diapositiva polmonare 1 40 0.55 192452992 80340896 87591096 485121 24521000 12128.03 10484.05
174 Diapositiva polmonare 2 34 0.51 183918000 71287904 91242796 464830 21387300 13671.47 11181.81
175 Diapositiva polmonare 1 780 23.93 179544992 44799200 126995782 30388600 7750010 38959.74 19307.76
175 Diapositiva polmonare 2 1001 12.58 169191536 43425608 120610754 15169100 5155174 15153.95 19703.08
188 Diapositiva polmonare 1 569 13.20 162290000 54210000 98486310 12997300 9593690 22842.36 14463.91
188 Diapositiva polmonare 2 271 5.15 157146000 54250800 91996500 4738100 10898700 17483.76 12657.83
189 Diapositiva polmonare 1 74 1.70 185292992 95700800 77779392 1318820 11812800 17821.89 14551.08
189 Diapositiva polmonare 2 74 1.76 182272992 95700800 74759392 1318820 11812800 17821.89 14551.08
816 Diapositiva polmonare 1 246 5.65 185876000 87568896 81916204 4631050 16390900 18825.41 14371.99
816 Diapositiva polmonare 2 565 6.05 183220000 76954304 90305396 5462670 15960300 9668.44 14244.82
876 Diapositiva polmonare 1 468 10.36 208308000 99300096 100947064 10454500 8060840 22338.68 16011.37
876 Diapositiva polmonare 2 528 11.74 199750896 81642568 110450391 12963400 7657937 24551.89 16699.13
877 Diapositiva polmonare 1 732 17.98 219340992 99918600 107869992 19397100 11552400 26498.77 18137.52
877 Diapositiva polmonare 2 605 14.64 207925504 88539712 108168329 15839700 11217463 26181.32 18014.64
878 Diapositiva polmonare 1 377 10.05 178534000 85610896 81931104 8232340 10992000 21836.45 16671.03
878 Diapositiva polmonare 2 376 9.88 170544000 75337904 86108406 8511710 9097690 22637.53 16754.38
879 Diapositiva polmonare 1 205 5.22 167556000 89999000 68123630 3553860 9433370 17335.90 13845.69
879 Diapositiva polmonare 2 213 4.64 167931008 80789400 78489588 3638720 8652020 17083.19 14058.12
881 Diapositiva polmonare 1 1122 38.81 218880000 79713504 130893816 50802300 8272680 45278.34 22044.99
881 Diapositiva polmonare 2 628 21.67 184200992 74502600 99122692 21475200 10575700 34196.18 19857.40
882 Diapositiva polmonare 1 678 24.05 194476992 83941904 98484788 23684500 12050300 34932.89 20748.06
882 Diapositiva polmonare 2 645 21.93 185537040 75790040 101412430 22241700 8334570 34483.26 20325.11
883 Diapositiva polmonare 1 429 10.79 179400992 84955696 84699866 9138800 9745430 21302.56 15080.23
883 Diapositiva polmonare 2 342 85.30 175220992 76210896 90472386 77170200 8537710 225643.86 17078.26
884 Diapositiva polmonare 1 359 6.42 206751008 87752600 103825008 6669710 15173400 18578.58 14333.41
884 Diapositiva polmonare 2 480 9.12 200990000 77052496 111060804 10125700 12876700 21095.21 15679.88
885 Diapositiva polmonare 1 332 7.79 191398000 92896304 84752596 6605490 13749100 19896.05 14500.11
885 Diapositiva polmonare 2 537 81.02 187475008 85938000 89378408 72411104 12158600 134843.77 15360.29
886 Diapositiva polmonare 1 305 7.93 158435008 80433296 76541662 6068720 1460050 19897.44 14500.11
886 Diapositiva polmonare 2 898 8.84 155460000 70808600 83457470 7380490 1193930 8218.81 14744.92

Tabella 2: Tabella rappresentativa dei risultati. Tabella dei risultati per ogni parametro dell'algoritmo da una coorte di topi coda-vena iniettata con cellule MDA-MB-231.

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Discussion

Mentre i ricercatori continuano a utilizzare l'iniezione endovenosa di cellule tumorali come modello sperimentale per le metastasi, mancano pratiche standard per analizzare il carico tumorale metastatico risultante. In alcuni casi, differenze significative nel carico tumorale metastatico in caso di manipolazione di particolari linee cellulari e/o uso di composti chimici possono essere osservate macroscopicamente. Tuttavia, in altri casi, sottili differenze nella semina e nella crescita metastatica possono essere trascurate o male interpretate senza un'analisi patologica approfondita. Questo studio avanza i protocolli di iniezione della vena caudale precedentemente pubblicati includendo un metodo completo di analisi del carico tumorale polmonare metastatico. È importante sottolineare che questo metodo di analisi della patologia digitale può anche essere applicato alla quantificazione del carico tumorale metastatico polmonare a seguito di iniezione ortotopica di cellule tumorali che sono in grado di metastasi spontanee e altri modelli sperimentali di metastasi (cioè intracardiaci, ecc.) e modelli di xenotrapianto derivato dal paziente (PDX). L'uso dell'imaging digitale e dello sviluppo di algoritmi software da parte di patologi veterinari garantisce la riproducibilità, l'accuratezza e la completezza di questo approccio per analizzare il carico tumorale polmonare metastatico25.

È assolutamente necessaria una decisione ponderata delle linee cellulari, della concentrazione cellulare e degli endpoint sulla base di studi pubblicati in precedenza o di un'attenta ottimizzazione sperimentale. Dato che la semina metastatica e la colonizzazione dipendono fortemente dalle interazioni con varie popolazioni di cellule immunitarie26,27, l'uso di topi immunocompatibili è l'ideale, anche se non sempre fattibile. Per lo stesso motivo, l'interpretazione di studi sperimentali di metastasi che utilizzano topi atimici o NSG, che mancano di componenti chiave delle cellule immunitarie, deve essere presa con cautela. Ci sono diverse linee cellulari di tumore mammario di topo, comprese le cellule MVT1 utilizzate in questo studio, che sono state derivate dal ceppo di topo FVB / N22,28,29. Esistono anche altri modelli sinergici. Per quanto riguarda la concentrazione cellulare, l'iniezione di un gran numero di cellule può accelerare notevolmente e migliorare il carico tumorale polmonare metastatico. Tuttavia, se i polmoni sono sopraffatti, può essere difficile distinguere i singoli focolai metastatici e gli emboli hanno maggiori probabilità di verificarsi. Inoltre, la procedura di iniezione della vena caudale richiede un'ampia pratica e formazione prima di eseguire iniezioni in modo sicuro e / o di routine. Molte istituzioni offriranno formazione tecnica e possono fornire topi per scopi pratici. Il corretto posizionamento dell'ago e un'iniezione regolare dovrebbero indicare il successo; tuttavia, per scopi di allenamento / pratica, il colorante Evans Blue può essere utilizzato per aiutare a determinare il successo dell'iniezione (1% in PBS sterile). Le estremità del topo diventeranno blu poco dopo l'iniezione, ma l'animale dovrebbe essere eutanasizzato in seguito.

Inoltre, l'importanza delle tecniche standard di necropsia e campionamento dei tessuti per controllare e prevenire artefatti di vetrini che possono compromettere la scansione e l'analisi delle diapositive da parte del software di analisi delle immagini non può essere sottolineata abbastanza. L'inflazione dei polmoni al momento dell'autopsia è un passo fondamentale per mantenere l'integrità dei tessuti e migliora la successiva colorazione H & E e l'analisi finale. Per coerenza con la risoluzione e la riproducibilità, si consiglia di scansionare tutte le diapositive di un set di studio con lo stesso obiettivo. In questo studio, tutte le diapositive sono state scansionate a 40 volte per garantire l'accuratezza delle impostazioni dell'algoritmo e la corretta identificazione delle metastasi tumorali quando applicate ai campi analizzati. Per ogni diapositiva, gli stessi lobi polmonari sono stati costantemente scansionati e analizzati per ciascun topo. Si raccomanda inoltre vivamente che un patologo riveda i markup tissutali per l'accuratezza dell'algoritmo applicato e che lo stesso algoritmo venga applicato a ogni diapositiva in uno studio.

Il protocollo presentato può essere modificato in base al design sperimentale, alle preferenze dell'utente e alle misurazioni dei risultati desiderati. Una di queste modifiche include l'uso di una camera di induzione dell'anestesia piuttosto che di un dispositivo di ritenuta convenzionale per un animale cosciente. In termini di salute e benessere degli animali, nessuno dei due approcci è superiore all'altro e ognuno ha il proprio insieme di vantaggi e limitazioni30. Inoltre, per i topi neri o marroni, potrebbe essere necessaria una fonte di luce o un dispositivo di riscaldamento per visualizzare le vene della coda. Lampade a infrarossi o un bagno d'acqua calda possono essere utilizzati per dilatare le vene. Tuttavia, la temperatura deve essere attentamente monitorata. Inoltre, sono disponibili dispositivi di ritenuta illuminati e altre versioni commerciali di dispositivi di ritenuta per roditori. Alcuni ricercatori preferiscono le siringhe Luer-Lok per iniezioni. Troviamo più difficile eliminare le bolle d'aria con le siringhe Luer-Lok, ma è una questione di preferenza. La vitalità delle cellule è una considerazione importante per la procedura di iniezione della vena della coda e, pertanto, conteggi cellulari accurati e il mantenimento delle cellule sul ghiaccio prima dell'iniezione sono passaggi necessari. Se si confronta la semina polmonare e la colonizzazione di linee cellulari manipolate, è fondamentale determinare eventuali differenze nelle dimensioni e nella vitalità delle cellule prima dell'iniezione in quanto ciò potrebbe complicare l'interpretazione dei risultati. La morte cellulare e / o danni possono verificarsi quando si utilizza un ago a scartamento ridotto; tuttavia, non è consigliabile utilizzare un ago più grande di 25 G in quanto potrebbe causare dolore e disagio all'animale.

Come un modo per convalidare che le lesioni polmonari sono formate da cellule tumorali iniettate, l'immunocolorazione può essere eseguita su sezioni di tessuto. Se si utilizzano linee cellulari umane, gli anticorpi specifici dell'uomo possono essere utilizzati per discernere le lesioni metastatiche. In alternativa, se si utilizzano linee cellulari marcate (ad esempio, GFP), è possibile utilizzare gli anticorpi corrispondenti. Inoltre, molte linee cellulari di cancro al seno sono positive per i marcatori epiteliali (cioè citocheratine, E-caderina ed EpCAM), ma è essenziale una conoscenza preliminare dell'espressione. Tuttavia, anche l'epitelio polmonare che riveste le vie aeree sarà positivo per questi marcatori e, quindi, anche la struttura deve essere considerata. Ci possono essere casi in cui lo sviluppo del tumore polmonare primario deve essere escluso. Per fare ciò, la colorazione immunoistochimica per il fattore di trascrizione tiroideo-1 (TTF1) può essere utilizzata come marcatore dell'adenocarcinoma polmonare primario. La colorazione TTF1 deve essere valutata da un patologo certificato.

Qui, un algoritmo personalizzato è stato scritto utilizzando un algoritmo di classificazione della foresta di decisioni perché l'algoritmo di metastasi polmonare stabilito non poteva essere messo a punto per il rilevamento accurato di metastasi di dimensioni variabili. Questo algoritmo personalizzato consente misurazioni complesse, consente una segmentazione accurata delle metastasi in base alle dimensioni e supporta un taglio delle dimensioni in modo che le piccole aree deformate e le strutture normali non vengano interpretate erroneamente e possano quindi essere incluse nel set di dati finale. Prevediamo che questo algoritmo sarà applicabile alla maggior parte degli studi di metastasi polmonari in vivo, ma gli utenti potrebbero dover regolare le impostazioni all'interno del software per soddisfare le loro esigenze di studio individuali. Tuttavia, questo algoritmo funge da piattaforma per gli investigatori che desiderano analizzare il carico metastatico polmonare in modo simile. Esistono molte opzioni diverse per le piattaforme di analisi delle immagini in cui l'accesso o la disponibilità, i costi e la formazione, nonché il livello di esperienza possono dettare la migliore piattaforma da utilizzare36. La gamma di opzioni include piattaforme gratuite come QuPath e piattaforme più costose, ma sofisticate, come Visiopharm. Si consiglia di consultare un nucleo di patologia di analisi delle immagini e un patologo quando si decide quale piattaforma può essere disponibile e meglio utilizzata per un particolare progetto di ricerca.

I modelli spontanei di tumore mammario di topo (ad esempio, MMTV-PyMT) o i metodi di iniezione ortotopica di grasso mammario rappresentano il modello fisiologicamente più rilevante per lo studio delle metastasi polmonari. Un grave inconveniente del modello di iniezione della vena caudale è che non ricapitola l'intera cascata metastatica ed è quindi limitato allo studio dello stravaso delle cellule tumorali e della colonizzazione degli organi secondari. Tuttavia, questo modello sperimentale di metastasi è rilevante per la ricerca sul cancro al seno in quanto le metastasi polmonari formate a seguito dell'iniezione della vena caudale hanno profili genomici simili alle lesioni metastatiche che si sviluppano dopo l'impianto ortotopico delle stesse cellule31. Al fine di stabilire un modello di metastasi polmonari, un gran numero di cellule viene spesso iniettato per via endovenosa che potrebbe non rappresentare accuratamente il processo di metastasi in quanto riguarda la semina, la reazione immunitaria e la dormienza. Inoltre, in base alla via circolatoria, le metastasi polmonari sono più comuni con l'iniezione della vena della coda32. Con la maggior parte delle linee cellulari di cancro al seno, i rapporti pubblicati indicano un'incidenza relativamente bassa di metastasi ossee, epatiche o cerebrali dopo l'iniezione della vena della coda7. Metodi sperimentali alternativi di metastasi come iniezioni intracardiache, intratibiali, della vena porta e intracarotidi sono più appropriati per esaminare le metastasi in altri siti33,34,35,36,37. Ancora una volta, sono preferiti modelli di tumore mammario spontaneo o metodi di iniezione ortotopica di cuscinetti di grasso che ricapitolano tutti i passaggi della cascata metastatica. I problemi con il carico tumorale metastatico coerente, la durata dello studio e il numero di animali necessari per tali studi sono un aspetto negativo. Tuttavia, il metodo di analisi della patologia digitale qui presentato può essere applicato alle metastasi polmonari formate attraverso qualsiasi modello di metastasi spontaneo o sperimentale.

Il metodo di analisi produce anche alcune limitazioni come la soggettività nella creazione di algoritmi. Anche se l'imaging di vetrini interi consente l'analisi digitale su un'intera sezione di tessuto e su tutti i lobi polmonari di un singolo topo, è limitata a un'analisi bidimensionale di un tessuto 3D. La stereologia sta diventando una pratica comune che ottiene informazioni 3D per l'analisi delle immagini e può tenere conto di fattori come il restringimento dei tessuti che si verifica durante l'elaborazione dei tessuti38. La stereologia, tuttavia, ha i suoi limiti come i vincoli di tessuto, risorse e tempo.

Dato il numero di pazienti oncologici affetti da diffusione metastatica della loro malattia, il metodo di iniezione della vena caudale per studiare le metastasi continuerà ad essere uno strumento utile in termini di comprensione della complicata biologia della diffusione metastatica e nel determinare l'efficacia pre-clinica di nuove terapie. I modelli murini in vivo di metastasi, in particolare quelli che utilizzano animali immunocompatibili, stanno diventando ancora più importanti per la ricerca sul cancro, dato il diffuso interesse per l'immunoterapia29. Inoltre, i modelli sperimentali di metastasi sono fondamentali in termini di studio dei geni soppressori delle metastasi (cioè quelli che sopprimono il potenziale metastatico delle cellule tumorali senza influenzare la crescita del tumore primario) e, pertanto, continuano ad essere un prezioso strumento di ricerca.

L'imaging digitale e l'analisi dei vetrini sono diventati rapidamente un pilastro nella modellazione diagnostica e sperimentale dei topi39. L'utilizzo del tipo di approccio qui descritto per analizzare il carico tumorale metastatico polmonare consentirà analisi ad alto rendimento in modo più completo e accurato. Inoltre, la patologia di imaging digitale fornisce una strada per progetti di ricerca più collaborativi che coinvolgono patologi specializzati in aree come i modelli murini di metastasi del cancro al seno. Mentre i metodi di imaging tissutale multiplex e le tecnologie di imaging 3D (come menzionato sopra) continuano a essere sviluppati, la patologia di imaging digitale, sofisticati programmi software per l'analisi delle immagini e l'esperienza dei patologi saranno certamente necessari per far progredire la ricerca sulle metastasi.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

I dati rappresentativi sono stati finanziati attraverso il National Cancer Institute (K22CA218549 a S.T.S). Oltre alla loro assistenza nello sviluppo del metodo di analisi completo qui riportato, ringraziamo l'Ohio State University Comprehensive Cancer Center Comparative Pathology and Mouse Phenotyping Shared Resource (Direttore - Krista La Perle, DVM, PhD) per i servizi di istologia e immunoistochimica e il Pathology Imaging Core per lo sviluppo e l'analisi degli algoritmi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
alcohol prep pads Fisher Scientific 22-363-750 for cleaning tail prior to injection
dissection scissors Fisher Scientific 08-951-5 for mouse dissection and lung tissue inflation
DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate Fisher Scientific MT10013CV cell culture media base for MDA-MB-231 and MVT1 cell lines
Dulbecco's Phosphate-Buffered Salt Solution 1x Fisher Scientific MT21030CV used for resuspending tumor cells for injection
ethanol (70 % solution) OSU used to minimize mouse's fur during dissection; use caution - flammable
Evan's blue dye Millipore Sigma E2129 used at 1 % in sterile PBS for practice with tail-vein injection method; use caution - dangerous reagent
Fetal Bovine Serum Millipore Sigma F4135 cell culture media additive; used at 10% in DMEM
forceps Fisher Scientific 10-270 for dissection and lung tissue inflation
FVB/NJ mice The Jackson Laboratory 001800 syngeneic mouse strain for MVT1 cells
hemacytometer (Bright-Line) Millipore Sigma Z359629 for use in cell culture to obtain cell counts
insulin syringe (28 G) Fisher Scientific 14-829-1B for tail-vein injections (BD 329424)
MDA-MB-231 cells ATCC human breast cancer cell line
MVT1 cells mouse mammary tumor cells
needles (26 G) Fisher Scientific 14-826-15 used to inflate the mouse's lungs
neutral buffered formalin (10%) Fisher Scientific 245685 used as a tissue fixative and to inflate lung tissue; use caution - dangerous reagent
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice The Jackson Laboratory 005557 maintained by OSUCCC Target Validation Shared Resource
Penicillin Streptomycin 100x ThermoFisher 15140163 cell culture media additive
sterile gauze Fisher Scientific NC9379092 for applying pressue to mouse's tail if bleeding occurs
syringe (5 mL) Fisher Scientific 14-955-458 used to inflate mouse lung tissue
tail-vein restrainer Braintree Scientific, Inc. TV-150 STD used to restrain mouse for tail-vein injections
Trypan blue (0.4 %) ThermoFisher 15250061 used in cell culture to assess viability
Trypsin-EDTA 0.25 % ThermoFisher 25200-114 used in cell culture to detach tumor cells from plate

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Erratum

Formal Correction: Erratum: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells
Posted by JoVE Editors on 12/02/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells. The author list was updated.

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Katie A. Thies1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

to:

Katie A. Thies1, Sarah Steck1, Sue E. Knoblaugh2, and Steven T. Sizemore1
1Department of Radiation Oncology, Arthur G. James Comprehensive Cancer Center and Richard L. Solove Research Institute, The Ohio State University Medical Center
2Department of Veterinary Biosciences, Comparative Pathology and Digital Imaging Shared Resource, The Ohio State University

Analisi patologica delle metastasi polmonari a seguito di iniezione laterale della vena della coda di cellule tumorali
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Thies, K. A., Steck, S., Knoblaugh, S. E., Sizemore, S. T. Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells. J. Vis. Exp. (159), e61270, doi:10.3791/61270 (2020).

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