Method Article

Estabilidad y estructura de Murciélago Mayor Histocompatibilidad Complejo Clase I con Heterologous β2-Microglobulina

DOI:

10.3791/61462

⸱

March 10th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Laboratory Medicine and Life Sciences, Wenzhou Medical University, 2NHC Key Laboratory of Biosafety, National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, 3Faculty of Health Sciences, University of Macau, 4CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 5Savaid Medical School, University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El protocolo describe métodos experimentales para obtener sustitutos estables del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) clase I a través de posibles β sustituciones de2-microglobulina (β2m) de diferentes especies. Se investigó la comparación estructural del MHC I estabilizado por β2m homólogas y heterologosas.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El principal complejo de histocompatibilidad (MHC) desempeña un papel fundamental en la presentación de péptidos de antígeno y las respuestas inmunes a las células T contra las enfermedades infecciosas y el desarrollo tumoral. El MHC híbrido I complejo con β heterologosa2-microglobulina (β2m) sustitución de diferentes especies se puede estabilizar in vitro. Este es un medio factible para estudiar MHC I de mamíferos, cuando el βhomónode 2 m no está disponible. Mientras tanto, se indica que la sustitución de mamíferos β2m no afecta significativamente la presentación de péptidos. Sin embargo, hay una integración limitada con respecto a la metodología y la tecnología para el MHC I híbrido complejo con heterologous β2-microglobulina (β2m). En este documento, se presentan métodos para evaluar la viabilidad de la sustitución heterologosa βde 2m en el estudio MHC I. Estos métodos incluyen la preparación de construcciones de expresión; purificación de los organismos de inclusión y refolding del complejo MHC; determinación de la termosabilidad proteica; cribado de cristal y determinación de la estructura. Este estudio proporciona una recomendación para entender la función y estructura del MHC I, y también es significativo para la evaluación de la respuesta de las células T durante las enfermedades infecciosas y la inmunoterapia tumoral.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El principal complejo de histocompatibilidad (MHC) existe en todos los vertebrados y es un conjunto de genes que determina la inmunidad mediada por células a patógenos infecciosos. MHC clase I presenta péptidos endógenos, tales como componentes virales producidos sobre la infección por virus, a los receptores de células T (TCR) en la superficie de las células CD8+ T para mediar la inmunidad celular y participar en la regulación inmune1. Un estudio estructural de la unión MHC I a péptidos proporciona información sobre motivos de unión de péptidos y características de presentación de moléculas MHC I, que desempeña un papel vital en la evaluación de las respuestas inmunes a células CD8+ T y el desarrollo de vacunas.

Desde la primera cristalización y determinación estructural del MHC I molecular por Bjorkman et al.2,el análisis de estructura cristalina de moléculas MHC I ha promovido en gran medida la comprensión de cómo los péptidos se unen a las moléculas MHC I, y ayuda a entender la interacción de cadenas ligeras con cadenas pesadas y péptidos. Una serie de estudios de seguimiento indicaron que aunque los genes que codifican la cadena de luz no están asociados con el MHC, la cadena de luz es una proteína clave para el montaje de moléculas MHC I3,4. Interactúa con los tres dominios de las moléculas de clase I de MHC en múltiples superficies. Cuando la cadena de luz está ausente, las moléculas MHC clase I no se pueden expresar correctamente en la superficie de las células que presentan antígenos y no pueden interactuar con TCR para ejercer sus funciones inmunológicas.

MHC I se compone de una cadena pesada (cadena H) y cadena de luz (es decir, β2-microglobulina (β2m)), y se ensambla a través de la unión a un péptido adecuado5. El segmento extracelular de la cadena H consta de α1, α2 y α3 dominios6. Los dominios α1 y α2 forman la ranura de unión de péptidos (PBG). La cadena βde 2m actúa como subunidad estructural del complejo de montaje en MHC I, estabilizando la conformación del complejo, y es una chaperona molecular para la cadena MHC I H plegable7,8,9. Una serie de estudios han demostrado que las cadenas MHC I H de varios mamíferos como murciélago (Chiroptera) (Ptal-N*01:01)10,rhesus macaque (Primates) (Mamu-B*17)11 (Mamu-A*01)12 (Mamu-A*02)13, ratón (Rodentia) (H-2Kd)14,15, perro (Carnivora) (DLA-88 * 50801)16, ganado (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 y equino (Periss (Eqca-N*00602 y Eqca-N*00601)18 puede combinarse con β heterologous2m (Tabla 1). Estas moléculas híbridas se utilizan a menudo en estudios estructurales y funcionales. Sin embargo, la metodología para el estudio funcional y estructural del MHC I híbrido con β heterologousde 2m aún no se resume. Mientras tanto, la base estructural para el intercambiado β2m entre diferentes taxones sigue sin estar clara.

En este documento, se resume el procedimiento para la expresión MHC I, la refolding, la cristalización, la recopilación de datos de cristal y la determinación de la estructura. Además, se analizan posibles sustituciones de β2m de diferentes especies comparando la conformación estructural del MHC I estabilizada por β2m. Estos métodos serán útiles para un mayor estudio estructural del MHC I y la evaluación de la respuesta inmune de células T CD8+ en cáncer y enfermedades infecciosas.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparación de construcciones de expresión

  1. Recuperar las secuencias de genes de clase I MHC (incluyendo genes predichos) de murciélagos de la base de datos NCBI.
  2. Recupere secuencias de cadena pesada MHC I de mamíferos superiores de la base de datos de inmuno polimorfismo (IPD) (www.ebi.ac.uk/ipd/mhc) y la base de datos UniProt (www.uniprot.org).
  3. Para obtener complejos de MHC solubles, mutar las secuencias para eliminar las regiones citosólicas y transmembranas.
  4. Clonar los genes que codifican los ectodominios del murciélago Ptal-N*01:01 (GenBank no. KT98792919) (residuos 1–277) y bate β2m (GenBank no. XP_006920478.1) (residuos 1–98) en vectores pET-28a (Novagen, Beijing, China), respectivamente.
  5. Se insertaron las secuencias optimizadas (para Escherichia coli)entre los sitios NcoI y EcoR1 de un vector pET-28a modificado.
  6. Construir plásmidos de expresión humanos β2m como se describió anteriormente20.

2. Síntesis de péptidos

  1. Predicción de péptidos
    1. Como se describió anteriormente10, para detectar péptidos que pueden unirse a Ptal-N*01:01, predecir péptidos candidatos utilizando los cuerpos proteicos de virus relacionados con murciélagos virus hendra (HeV). Para obtener péptidos de alta afinidad basados en el modelo estructural del servidor en línea, NetMHCpan 4.0 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)21 y Rosetta FlexPepDock22 predijeron el enlace potencial en la fracción peptídica seleccionada. Además, también se pueden utilizar otros programas informáticos y bases de datos como BIMAS, la Base de Datos de Epitopos Inmunes (IEDB), NetCTL 1.2 y SYFPEITHI, todos ellos integrando la predicción de afinidad de unión peptido-MHC clase I, transportador asociado con la eficiencia de transporte de procesamiento de antígenos (TAP), escote proteasomal C-terminal y medio tiempo de disociación de moléculas de péptido-HLA clase I en sus lecturas.
    2. Para predecir péptidos de enlace alto, utilice el servidor NetMHCpan y Rosetta FlexPepDock.
      NOTA: Desafortunadamente, ninguna de las predicciones producidas coincidía con los datos experimentales. Esto puede indicar que las predicciones actuales de péptidos de unión mhc no eran adecuadas para mamíferos no humanos y no ratones como murciélagos, que pueden tener una forma diferente de unión de péptidos. Por lo tanto, necesitamos combinar varios software de predicción y resultados experimentales para un análisis exhaustivo para obtener péptidos de alta afinidad.
  2. Preparación y conservación de péptidos
    1. En lugar de generar péptidos personalizados, utilice proveedores de servicios especializados. Compre todos los péptidos siguiendo comercialmente las herramientas de predicción de péptidos, que tienen una puntuación de enlace más alta. La pureza del péptido se determinó que era >95% por HPLC y espectrometría de masas.
    2. Almacene todos los péptidos comprados como polvo liofilizado a −80 °C y disuelva en sulfóxido de dimetil (DMSO) antes de su uso.

3. Purificación de órganos de inclusión

  1. Transformación de E. coli
    1. Transformar 10 ng de plásmido que contiene el murciélago MHC I Ptal-N*01:01 H cadena, o humano β2m o murciélago β2m en 100 μL de BL21(DE3) E. coli. Bañarse en hielo durante 30 minutos.
    2. Choque de calor a 42 °C durante 90 s, seguido de bañarse en hielo durante 2 minutos.
    3. Añadir 800 μL de caldo lysogeny (LB: extracto de levadura, triptona y NaCl; ver la Tabla de Materiales)a paso 3.1.2 y agitar a 200 rotaciones por minuto (rpm) en una plataforma de balanceo a 37 °C durante 20 minutos.
    4. Aplicar 100 μL de suspensión bacteriana en la placa que contenga la resistencia a los antibióticos correspondiente (ampicilina: 100 ng/ml), que son las mismas que las construcciones anteriores.
  2. Inocular culturas
    1. Elija un solo clon bacteriano recientemente transformado en 3 ml de LB con medio antibiótico (ampicilina: 100 ng/ml) y cultivo a 37 °C, mientras tiembla a 200 rpm en una plataforma de balanceo para activar la bacteria. Las culturas se pueden inocular a altas horas de la noche, para estar listas para la inducción a la mañana siguiente.
    2. Con una noche de antelación, transfiera 500 μL del caldo bacteriano activado a 50 ml de LB con el medio antibiótico (ampicilina: 100 ng/ml) e incuba durante la noche a 37 °C, temblando a 200 rpm. Para mayor comodidad al preparar la siguiente inoculación, congele el caldo bacteriano activado restante en 1 mL de alícuotas (500 μL de cultivo con 500 μL de 40% de glicerol) a −80 °C hasta que se necesite la siguiente preparación.
    3. Para generar grandes cantidades de proteína recombinante, transfiera la preparación bacteriana a 2 L de LB con el medio antibiótico (ampicilina: 100 ng/ml) a una proporción de 1:100, incubar a 37 °C mientras tiembla a 200 rpm. Cultivo hasta que se logra una absorbancia de 0,6 a 600 nm. Añadir 1 mM isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside (IPTG) (variar la concentración de IPTG para diferentes MHCs, principalmente entre 0,1 mM-1 mM) al matraz para la inducción de la expresión proteica.
  3. Bacterias de la cosecha
    1. Transfiera la bacteria a botellas de centrífuga y centrífuga a 5000 x g durante 20 min a 4 °C. Todos los pasos a partir de ahora deben realizarse a 4 °C.
    2. Resuspend las bacterias en 60 ml de solución salina tampón de fosfato (PBS) y liberar la proteína recombinante expresada por disruptor celular ultrasónico.
      NOTA: En general, el programa que establecemos en esta máquina es ultrasónico 6S, intervalo 12S, 300 W, 99 veces).
  4. Purificación de órganos de inclusión
    1. Centrífuga la suspensión bacteriana sonicada a 12.000 x g durante 30 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a gastar el pellet en un volumen adecuado de búfer de lavado (0.5% Tritón-100, 50 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM TDT). Repita este proceso una vez más.
    2. Centrífuga a 12.000 x g durante 10-20 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a abrir los cuerpos de inclusión en el búfer de resuspensión (50 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM TDT). Retire una muestra de 20 μL (cuerpos de inclusión en búfer de resuspensión) para que SDS-PAGE pruebe la pureza de los sólidos de inclusión.
    3. Centrífuga la preparación restante a 12.000 x g durante 10-20 min. Deseche el sobrenadante. Pesar el pellet que contiene los cuerpos de inclusión y añadir buffer de disolución (6 M Gua-HCl, 10% glicerina, 50 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA) a una concentración final de 30 mg/mL. Revuelva lentamente usando un agitador magnético a 4 °C hasta que los cuerpos de inclusión se disuelvan en el búfer de disolución.
    4. Centrífuga 12.000 x g durante 10-20 min. Deseche los precipitados. Almacene los cuerpos de inclusión a −20 °C o −80 °C.
      NOTA: Antes de proceder con la purificación de los cuerpos de inclusión, confirme que la inducción y la expresión de proteína recombinante tuvieron éxito. Ejecutar muestras de cada cultivo (tomada antes y después de la inducción de IPTG) en un gel proteico; 15% SDS-PAGE (goma concentrada SDS-PAGE: H2O, 30% acrilamida, 1 M Tris-HCl pH 6.8, 10% SDS, 10% APS y TEMED; Gel de separación SDS-PAGE: H2O, 30% acrilamida, 1,5 M Tris-HCl pH 8,8, 10% SDS, 10% APS y TEMED; ver la Tabla de Materiales ) para el β2m, 10% SDS-PAGE para la cadena H.

4. Reabanamiento del complejo MHC

NOTA: La eficiencia de los cuerpos de inclusión redilados afectará el rendimiento de la proteína obtenida. El plegado compite con la polimerización, por lo que generalmente se acepta que el reenfoque a bajas concentraciones de proteínas es el método más exitoso. En este documento, la concentración de los cuerpos de inclusión es de 30 mg/ml.

  1. Prepare el búfer de refolding.
    1. Variar la composición del búfer de refolding dependiendo de la proteína. Por ejemplo, el pH, la fuerza iónica, las condiciones de redox y la presencia de ligandos afectarán a los resultados de refolding. El más común es utilizar tampones basados en Tris o HEPES en un pH neutro con la concentración nacl de 50-500 mM, pero esto también depende de la proteína objetivo. A continuación se siguiente se encuentra la fórmula de búfer de refolding utilizada en este artículo.
    2. Prepare el búfer plegable con 100 mM Tris-HCl pH 8.0, 400 mM L-arginina, 2 mM EDTA-2Na.
    3. Enfríe el búfer a 4 °C en un matraz de 250-300 ml, y luego agregue 5 mM de glutatión reducido (GSH) y 0,5 mM de glutatión oxidado (GSSG). Revuelva lentamente usando un agitador magnético a 4 °C durante otros 10-20 minutos antes de agregar los cuerpos de inclusión y péptidos.
  2. Inyección y dilución de la cadena MHC H y β2m
    NOTA: La temperatura a la que se realiza el refolding puede variar, aunque generalmente, para minimizar la agregación, 4 °C es mejor. Utilizamos la dilución para redilar las proteínas.
    1. Utilizando una aguja de una jeringa de 1 ml, inyecte 1 ml de cuerpos de inclusión hβ2m o cuerpos de inclusión bβ2m en dos tampones de refolding (1 litro cada uno), respectivamente. Inyecte cerca de la varilla de agitación que gira vigorosamente para obtener una dilución rápida y eficiente. β2m se vuelve a multiplicar relativamente fácil y se mantiene estable incluso en ausencia de la cadena H.
    2. Después de la β2m se ha disuelto en solución de reenganquitación, disolver péptidos (5 mg/ml) en DMSO e inyectar rápidamente 200 μL en la solución de reenganquitación. Revuelva lentamente durante 10-20 minutos antes de agregar la cadena H.
    3. Inyecte la cadena H con el mismo procedimiento descrito anteriormente para β2m. La cadena H es muy inestable; por lo tanto, el orden de inyección es bastante importante. Inyecte 3 ml de sólidos de inclusión de cadena H en dos búferes de refolding diferentes (1 litro cada uno) con hβ2m o bβ2m, respectivamente. La inyección consecutiva de pequeños alícuotas en lugar de la aplicación única de toda la cantidad de proteína aumenta el rendimiento del MHC reabierto. Permitir que la reasignación continúe a 4 °C durante 8-10 h.
  3. Concentración de proteínas refolded
    1. Utilice ultrafiltración en una cámara presurizada con membrana MMCO de 10 kDa para la concentración de las proteínas de reenlaza. Este método es conveniente y se puede combinar con el intercambio de búferes. Agregue el búfer de intercambio (Tris-HCl de 20 mM, 50 mM NaCl pH 8.0) a la cámara y concéntrate en un volumen final de 30-50 mL.
    2. Transfiera la solución de refolding a un tubo centrífuga, gire a 12.000 x g durante 15 minutos a 4 °C para eliminar precipitados.
    3. Transfiera cuidadosamente el sobrenadante y concéntrate aún más a un volumen final de ~1 mL.
    4. Centrífuga a 12.000 xg durante 10-20 min. Transfiera el sobrenadante a un tubo estéril y purifique las proteínas utilizando una columna de exclusión de tamaño de 10/300 GL.
    5. Recoger las muestras en el pico y analizarlas utilizando SDS–PAGE (15% gel de poliacrilamida).
    6. Recoger el pico complejo MHC y concentrarse a una concentración final de 15 mg/ml.
    7. Diluir el complejo a 7,5 mg/ml y 15 mg/ml para cristalización.

5. Cristalización, recopilación de datos y procesamiento

  1. Realice la cristalización del MHC complejo y péptido utilizando la técnica de difusión de vapor de caída sentado.
  2. Examine los complejos Ptal-N*01:01/peptide con kits de cristal comerciales (por ejemplo, kit de pantalla de cristal I/II, kit de pantalla de índice, kit PEGIon I/II y el kit PEGRx).
  3. Selle la solución resultante y el equilibrio contra 100 μL de solución de reservorio a 4 o 18 °C.
  4. Observe el crecimiento del cristal en la cultura durante 3 días, 1 semana, 2 semanas, 1 mes, 3 meses y 6 meses. Utilice un microscopio para ver si cada gota en la placa de cristal tiene cristales.
    NOTA: Se observaron cristales Ptal-N*01:01/HeV1(bβ2m) en 0,2 M NaCl, 0,1 M Bis-Tris (pH 5,5) y 25% (w/v) polietilenglicol 3.350 a una concentración de 7,5 mg/ml. Se observaron cristales Ptal-N*01:01/HeV1(hβ2m) en HEPES de 0,1 M, pH 7,0, 2% w/v polietileno glicol 3.350 a una concentración de 7,5 mg/ml.
  5. Para la protección criogénica, transfiera los cristales a una solución de almacenamiento que contenga un 20% de glicerol y luego enfríe rápidamente en una corriente de nitrógeno gaseoso de 100 K.
  6. Recopile datos de difracción de rayos X de la línea de haz BL19U de la instalación de radiación sincrotrón de Shanghái (Shanghái, China).

6. Determinación y análisis de la estructura

  1. Con datos estructurales de alta resolución, procese y escale la intensidad de la colección utilizando el programa Denzo y el paquete de software HKL2000 (https://hkl-xray.com/)23.
  2. Después de elegir un mejor modelo inicial en el Banco de Datos de Proteínas (PDB), determine las estructuras utilizando el reemplazo molecular con el programa Phaser MR en CCP424 (http://www.ccp4.ac.uk/). El modelo utilizado fue la estructura coordinada con el código 5F1I del Banco de Datos de Proteínas (PDB).
  3. Utilice el refinado modelo de rayos X para el refinamiento de juntas inicial. Utilice los modos de refinamiento Phenix solo y articular para la radiografía y el refinamiento de neutrones y rayos X de la articulación, respectivamente.
  4. Después de cada ronda de refinamiento, compruebe manualmente el modelo contra Fo − Fc y 2Fo - Fc mapas de densidad nuclear positiva en Coot25 (https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/). Esto facilita la correcta colocación de las aguas y ciertos átomos D. Todas las figuras de estructuras fueron creadas por PyMOL (http://www.pymol.org/).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trabajos anteriores informaron que el péptido HeV1 (DFANTFLP) derivado del HeV fue presentado por Ptal-N*01:0110,19. En este documento seevaluó la capacidad de unión de este péptido a Ptal-N*01:01 con murciélago homólogo β2m (bβ

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La construcción de un complejo proteico híbrido a través de la sustitución heterologosa de diferentes taxones es una estrategia común para las investigaciones funcionales y estructurales cuando el complejo homólogo no está disponible, como en el MHC I y sus ligandos. Sin embargo, hay una integración limitada con respecto a la metodología y la tecnología. En este documento, se analizó la estructura del murciélago MHC I, Ptal-N*01:01, estabilizado por bβ2m o hβ2m. Los aminoácidos clave de β unión de

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que declarar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio fue apoyado por el fondo abierto del laboratorio clave estatal de Biotecnología Farmacéutica, Universidad Nan-jing, China (Grant no. KF-GN-201905), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (subvenciones 81971501). William J. Liu cuenta con el apoyo del Programa de Jóvenes Científicos Excelentes de la NSFC (81822040) y beijing New-star Plan of Science and Technology (Z181100006218080).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Membrana MMCO de 10 kDaMillipo Merck PLGC07610
30% de acrilamidaLABLEADA3291-500ml*5
5× Carga de proteína SDSNovoproteinPM099-01A
AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa corteMerck milliporeUFC901096
ampicilinaInalco1758-9314
APSSigmaA3678-100G
BL21(DE3) cepaTIANGENCB105-02
DMSOMP219605580Use guantes adecuados y protección para los ojos y la cara. En caso de contacto con los ojos, enjuague inmediatamente con abundante agua y consulte a un médico.
DTTSolarbioD1070Los guantes y gafas deben usarse y operarse en una cocina ventilada. En caso de contacto con los ojos, enjuague inmediatamente con abundante agua y consulte a un médico.
EDTA-2NaKeyGEN BioTECHKGT515500
GlicerinaHUSHI 10010618
GSHAmresco0399-250G
GSSGAmresco0524-100G
Clorhidrato de guanidinaAmrescoE424-5KG
h & beta; 2mnuestro laboratorioZhang, S. et al. Base estructural de la presentación de alelos cruzados por HLA-A*0301 y HLA-A*1101 revelada por dos complejos de péptidos derivados del VIH. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011).
IPTGInalco1758-1400
L-Clorhidrato de ArgininaAmresco0877-5KG
NaCl SolarbioS8210
Marcadorde Proteínas Fermentas26614
SDSBoao Rui JingA112130
Superdex Increase 200 10/300 GLGE Healthcare 28990944
TEMEDThermo17919Los guantes y las gafas deben usarse y operarse en una cocina ventilada.
Tris-HClAmresco0497-5KG
Triton X-100BiorulerRH30056-100mL
TriptonaOxoidLP0042
Extracto de levaduraOxoidLP0021

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vyas, J. M., Van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. The known unknowns of antigen processing and presentation. Nature Reviews Immunology. 8 (8), 607-618 (2008).
  2. Bjorkman, P. J., et al. Structure of the human class I histocompatibility antigen, HLA-A2. Nature. 329 (6139), 506-512 (1987).
  3. Seong, R. H., Clayberger, C. A., Krensky, A. M., Parnes, J. R. Rescue of Daudi cell HLA expression by transfection of the mouse beta 2-microglobulin gene. Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 288-299 (1988).
  4. Zijlstra, M., et al. Beta 2-microglobulin deficient mice lack CD4-8+ cytolytic T cells. Nature. 344 (6268), 742-746 (1990).
  5. Gao, G. F., et al. Crystal structure of the complex between human CD8alpha(alpha) and HLA-A2. Nature. 387 (6633), 630-634 (1997).
  6. Bjorkman, P. J., Parham, P. Structure, function, and diversity of class I major histocompatibility complex molecules. Annual Review of Biochemistry. 59, 253-288 (1990).
  7. Achour, A., et al. Structural basis of the differential stability and receptor specificity of H-2Db in complex with murine versus human beta 2-microglobulin. Journal of Molecular Biology. 356 (2), 382-396 (2006).
  8. Kubota, K. Association of serum beta 2-microglobulin with H-2 class I heavy chains on the surface of mouse cells in culture. Journal of Immunology. 133 (6), 3203-3210 (1984).
  9. Bernabeu, C., van de Rijn, M., Lerch, P. G., Terhorst, C. P. Beta 2-microglobulin from serum associates with MHC class I antigens on the surface of cultured cells. Nature. 308 (5960), 642-645 (1984).
  10. Lu, D., et al. Peptide presentation by bat MHC class I provides new insight into the antiviral immunity of bats. PLoS Biology. 17 (9), 3000436(2019).
  11. Wu, Y., et al. Structural basis of diverse peptide accommodation by the rhesus macaque MHC class I molecule Mamu-B*17: insights into immune protection from simian immunodeficiency virus. Journal of Immunology. 187 (12), 6382-6392 (2011).
  12. Chu, F., et al. First glimpse of the peptide presentation by rhesus macaque MHC class I: crystal structures of Mamu-A*01 complexed with two immunogenic SIV epitopes and insights into CTL escape. Journal of Immunology. 178 (2), 944-952 (2007).
  13. Liu, J., et al. Diverse peptide presentation of rhesus macaque major histocompatibility complex class I Mamu-A*02 revealed by two peptide complex structures and insights into immune escape of simian immunodeficiency virus. Journal of Virology. 85 (14), 7372-7383 (2011).
  14. Liu, W. J., et al. Protective T cell responses featured by concordant recognition of Middle East respiratory syndrome coronavirus-derived CD8+ T cell epitopes and host MHC. Journal of Immunology. 198 (2), 873-882 (2017).
  15. Mitaksov, V., Fremont, D. H. Structural definition of the H-2Kd peptide-binding motif. Journal of Biological Chemistry. 281 (15), 10618-10625 (2006).
  16. Xiao, J., et al. Diversified anchoring features the peptide presentation of DLA-88*50801: first structural insight into domestic dog MHC class I. Journal of Immunology. 197 (6), 2306-2315 (2016).
  17. Li, X., et al. Two distinct conformations of a rinderpest virus epitope presented by bovine major histocompatibility complex class I N*01801: a host strategy to present featured peptides. Journal of Virology. 85 (12), 6038-6048 (2011).
  18. Yao, S., et al. Structural illumination of equine MHC class I molecules highlights unconventional epitope presentation manner that is evolved in equine leukocyte antigen alleles. Journal of Immunology. 196 (4), 1943-1954 (2016).
  19. Wynne, J. W., et al. Characterization of the antigen processing machinery and endogenous peptide presentation of a bat MHC class I molecule. Journal of Immunology. 196 (11), 4468-4476 (2016).
  20. Zhang, S., et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Molecular Immunology. 49 (1-2), 395-401 (2011).
  21. Hoof, I., et al. NetMHCpan, a method for MHC class I binding prediction beyond humans. Immunogenetics. 61 (1), 1-13 (2009).
  22. Raveh, B., London, N., Zimmerman, L., Schueler-Furman, O. Rosetta FlexPepDock ab-initio: simultaneous folding, docking and refinement of peptides onto their receptors. PLoS One. 6 (4), 18934(2011).
  23. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).
  24. Brunger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54, Pt 5 905-921 (1998).
  25. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, Pt 4 486-501 (2010).
  26. Glithero, A., et al. Crystal structures of two H-2Db/glycopeptide complexes suggest a molecular basis for CTL cross-reactivity. Immunity. 10 (1), 63-74 (1999).
  27. Tungatt, K., et al. Induction of influenza-specific local CD8 T-cells in the respiratory tract after aerosol delivery of vaccine antigen or virus in the Babraham inbred pig. PLoS Pathogens. 14 (5), 1007017(2018).
  28. McCoy, W. H. t, Wang, X., Yokoyama, W. M., Hansen, T. H., Fremont, D. H. Structural mechanism of ER retrieval of MHC class I by cowpox. PLoS Biology. 10 (11), 1001432(2012).
  29. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
  30. Zhao, M., et al. Heterosubtypic protections against human-infecting avian influenza viruses correlate to biased cross-T-cell responses. mBio. 9 (4), (2018).
  31. Zhao, L., Cao, Y. J. Engineered T cell therapy for cancer in the clinic. Search Results. 10, 2250(2019).
  32. Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).
  33. Gouet, P., Robert, X., Courcelle, E. ESPript/ENDscript: Extracting and rendering sequence and 3D information from atomic structures of proteins. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3320-3323 (2003).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

MHC Class IBeta 2 MicroglobulinProtein RefoldingInclusion Body PurificationCrystallization TechniqueX ray DiffractionPeptide BindingThermostability AssessmentExpression ConstructsSize Exclusion Chromatography

Related Articles