Summary
Hier presenteren we een eenvoudige en efficiënte methode om levende meiotische en post-meiotische kiemcellen te isoleren van volwassen muispesten. Met behulp van een lage cytotoxiciteit, violet-opgewonden DNA bindende kleurstof en fluorescentie-geactiveerde celsorde, kan men zeer verrijkte spermatogene celpopulaties isoleren voor vele downstream toepassingen.
Abstract
Isolatie van meiotische spermatocyten is essentieel om moleculaire mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan meiose en spermatogenese. Hoewel er gevestigde celisolatieprotocollen zijn met Hoechst 33342-kleuring in combinatie met fluorescentie-geactiveerde celsorling, vereist het celsorteerders die zijn uitgerust met een ultraviolette laser. Hier beschrijven we een celisolatie protocol met behulp van de DyeCycle Violet (DCV) vlek, een lage cytotoxiciteit DNA binding kleurstof structureel vergelijkbaar met Hoechst 33342. DCV kan worden opgewekt door zowel ultraviolette als violet lasers, die de flexibiliteit van de apparatuur keuze verbetert, met inbegrip van een cel sorteerder niet uitgerust met een ultraviolette laser. Met behulp van dit protocol kan men drie live-cel subpopulaties isoleren in meiotische profase I, waaronder leptotene/zygotene, pachytene en diplotene spermatocyten, evenals post-meiotische ronde spermatids. We beschrijven ook een protocol voor een eencellige suspensie van muistestes. Over het algemeen vereist de procedure een korte tijd om te voltooien (4-5 uur, afhankelijk van het aantal benodigde cellen), wat veel downstreamtoepassingen vergemakkelijkt.
Introduction
Spermatogenese is een complex proces waarbij een kleine populatie spermatogonale stamcellen een continue productie van een groot aantal sperma gedurende het hele volwassen leven gedurende1,2. Tijdens spermatogenese vindt dynamische chromatine remodellering plaats wanneer spermatogene cellen meiose ondergaan om haploïde spermatids3,4,5te produceren . Isolatie van meiotische spermatocyten is essentieel voor moleculair onderzoek en er zijn verschillende benaderingen vastgesteld om meiotische zaadcyten te isoleren, waaronder scheiding op basis van sedimentatie6,7 en fluorescentie-geactiveerde celsordening (FACS)8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Deze methoden hebben echter technische beperkingen. Terwijl sedimentatie gebaseerde scheiding levert een groot aantal cellen5,6,7, het is arbeidsintensief. De gevestigde FACS-gebaseerde methode maakt gebruik van Hoechst 33342 (Ho342) om meiotische zaadtomen te scheiden op basis van DNA-inhoud en lichtverstrooiingseigenschappen en vereist FACS-celsorteerders die zijn uitgerust met een ultraviolette (UV) laser8,9,10,11. Alternatieve FACS-gebaseerde methoden vereisen transgene muislijnen die fluorescerende eiwitten uitdrukken, synchronisatie van spermatogenese12, of celfixatie en antilichaamlabeling die niet compatibel is met isolatie van levende cellen13. Hoewel er een andere alternatieve methode met behulp van een cel-permeabele DNA-bindende kleurstof, DyeCycle Groene vlek14,15,16,17, deze methode wordt aanbevolen voor de isolatie van spermatogene cellen van jeugdige testis. Daarom is er een kritische behoefte om een eenvoudige en robuuste isolatiemethode te ontwikkelen voor levende meiotische spermatocyten die kunnen worden toegepast op elke muisstam van elke leeftijd en die kan worden uitgevoerd met behulp van een FACS-celsorteerder.
Hier beschrijven we zo'n lang gezocht celisolatieprotocol met behulp van de DyeCycle Violet (DCV) vlek. DCV is een lage cytotoxiciteit, cel-permeabele DNA bindende kleurstof structureel vergelijkbaar met Ho342, maar met een excitatie spectrum verschoven naar de violette bereik18. Daarnaast heeft DCV een breder emissiespectrum in vergelijking met DCG. Zo kan het worden opgewekt door zowel UV-en violet lasers, die de flexibiliteit van de apparatuur verbetert, waardoor het gebruik van een FACS cel sorteerder niet uitgerust met een UV-laser. Het DCV-protocol dat hier wordt gepresenteerd, maakt gebruik van tweedimensionale scheiding met DCV-blauw en DCV-rood, waarbij het voordeel van het Ho342-protocol wordt nagebootst. Met dit voordeel stelt ons DCV-protocol ons in staat om sterk verrijkte kiemcellen te isoleren van de volwassen testis. We bieden een gedetailleerd gating protocol om levende spermatogene cellen te isoleren van volwassen muispesten van één muis (van twee teelballen). We beschrijven ook een efficiënt en snel protocol voor de voorbereiding van eencellige suspensie van muistestes die kunnen worden gebruikt voor deze celisolatie. De procedure vereist een korte tijd om te voltooien (voorbereiding van eencellige suspensie - 1 uur, kleurstof - 30 min, en celsorde - 2-3 uur: totaal - 4-5 uur, afhankelijk van het aantal benodigde cellen; Figuur 1). Na celisolatie kan een breed scala aan downstreamtoepassingen, waaronder RNA-seq, ATAC-seq, ChIP-seq en celcultuur, worden voltooid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol volgt de richtlijnen van het Institutional Animal Care and Use Committee (protocol nr. IACUC2018-0040) in het Cincinnati Children's Hospital Medical Center.
1. Uitrustings- en reagensinstelling voor de bereiding van de schorsing van de testiculaire cel
- Bereid elke enzymvoorraad voor in 1x Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) en bewaar op -20 °C. (Tabel1).
OPMERKING: Bereid elk moment voor het experiment voor. - Één dag vóór het experiment: De verzamelende buizen van de laag (1.5 mL buizen) met Foetale runderserum (FBS) bij 4 °C 's nachts.
- Op de dag van het experiment: Stel het waterbad in op 37 °C.
- Prewarme Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) bij 37 °C en bereid 2 mL van 1x dissociatiebuffer voor elk monster vlak voor gebruik(Tabel 1) in 15 mL centrifugebuis.
LET OP: 2 mL dissociatie buffer is voorbereid voor twee teelballen. Raadpleeg tabel 1voor het recept voor de dissociatiebuffer.
2. Dierlijke dissectie en bereiding van de schorsing van de testiculaire cel
- Offer een 8 weken oude mannelijke muis door het verlaten in een kooldioxide kamer voor ten minste 10 min.
- Verwijder beide teelballen en plaats op een petrischaal van 60 mm met 2 mL ijskoude fosfaatgefferde zoutoplossing (PBS).
- Verwijder de tunica albuginea uit de teelballen. Verspreid de halfniferous tubuli lichtjes door voorzichtig te scheiden met tangen.
- Breng de halfniferous tubuli over in een petrischaaltje van 100 mm met een nieuwe druppel ijskoude PBS en ontwarren seminiferous tubuli zachtjes met tangen. Herhaal deze was 3 keer om interstitiële cellen zoveel mogelijk te verwijderen.
- Ontsluiting ontwarren halfniferous tubuli in een buis van 15 mL met 2 mL dissociatiebuffer bij 37 °C gedurende 20 minuten.
- Voorzichtig pipette de tubuli 20 keer met behulp van een 1000 μL micropipet.
- Incubeer voor 6 min. Herhaal zachte pipetting 20 keer.
- Incubeer gedurende 3 min. Herhaal zachte pipetting 10 keer totdat er geen zichtbare brokken blijven.
- Voeg 10 mL FACS buffer toe aan de ophanging. Centrifuge op 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en gooi de supernatant.
- Herhaal stap 2.9 twee keer om de spermatozoa en zoveel mogelijk puin te verwijderen.
3. Celvlekken
- Resuspend de celpellet met 3 mL FACS buffer(Tabel 1) en filter de celsuspensie door een 70 μm nylon celzeef in een buis van 50 mL.
OPMERKING: De verwachte celopbrengst is ongeveer 100 miljoen cellen per twee testikels (van een 8 weken oude B6 wild-type muis). - Tel het celnummer en split 10% van de cellen in een nieuwe buis als de onbevlekte negatieve controle en laat op ijs.
- Voeg 6 μL DCV-vlek (de oorspronkelijke concentratie is 5 mM) toe aan de resterende celsuspensie en meng goed. De uiteindelijke concentratie is 10 μM, en de capaciteit is ongeveer 100 miljoen cellen.
- Incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten in het donker. Schud de celopening voorzichtig om de 10 minuten.
- Voeg na incubatie, zonder wasstap, direct 5 μL DNase I (de voorraadconcentratie is 10 mg/mL) toe aan de celsuspensie en filter de cellen in een 5 mL FACS buis door de 35 μm nylon mesh cap. Houd de monsters op ijs tot het sorteren.
4. Stroom cytometrie en experimentele poorten
- Bereid de FACS-celsorteerder voor. Zorg ervoor dat facs-celsorteerder is uitgerust met excitatieoptica: Violet (405-nm) laser; Detectie optica: filtercombinatie van 450/50 bandpass [zelfde filterset van 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) voor DCV-blauwe detectie] en 665/30 bandpass [dezelfde filterset van Allophycocyanine (APC) voor DCV-rode detectie]. Hier gebruiken we Sony SH800S celsorteerder als voorbeeld.
- Maak een nieuw experiment en stel de volgende werkploeelsin die parameters weergeven die moeten worden geoptimaliseerd: Klik op de menubalk" Werkbladhulpmiddelen" om een forward scatter - area (FSC-A) vs. scatter - area (BSC-A) density plot op een lineaire schaal te maken. Klik op "Nieuw Histogram" om een DCV-blauwe histogramplot op logaritmische schaal te maken.
- Kort vortex de onbevlekte negatieve controle (vanaf stap 3.2) en laad het monster.
- Klikop ' Start' en 'Record' om te beginnen met het verwerken van het niet-bevlekte monster. Terwijl het monster wordt uitgevoerd, klikt u op "Detector - en drempelinstellingen" om FSC- en BSC-spanningen te optimaliseren door zowel de pmt-spanningen (fotomultiplierbuis) omhoog of omlaag aan te passen om de niet-gekleurde cellen op de schaal van het FSC/BSC-plot te plaatsen.
- Pas de PMT-spanning op en neer op "FL1: DAPI" terwijl het monster wordt uitgevoerd om de positie van de DCV-negatieve populatie te lokaliseren in het eerste decennium van de DCV-blauwe histogram logaritmische plot(figuur 2A). Na het voltooien van de PMT-spanningsaanpassing klikt u op' Stoppen' om het niet-vastgehouden monster te lossen.
- Kort vortex het monster (vanaf stap 3.5) en laad het monster.
- Klik op' Volgende buis' om een nieuw werkblad voor het met DCV bevlekte voorbeeld te maken; en klik op "Start" en "Record" om het dcv-gekleurde monster te verkrijgen, ≥ 1 x 106 gebeurtenissen op te nemen. Voeg de volgende werkkavels toe: Klik op de menubalk "Werkbladgereedschappen" om een FSC-H (hoogte) vs. FSC-W (breedte) dichtheidsplot op een lineaire schaal te maken; Klik op" Nieuwe dichtheid" om een DCV-blauw vs. DCV-rode dichtheidsplot op een lineaire schaal te maken. Na het opnemen van ≥ 1 x10 6-gebeurtenissen klikt u opStoppenen lost u het monster.
- Klik op de FSC-A vs. BSC-A dichtheidsplot op "Polygon" op de menubalk "Plot Tools" om een grote poort "Cellen" te tekenen om de meeste cellen op te nemen en kleine brokstukken uit te sluiten (figuur 2B). Breng de poort "Cellen" aan op FSC-H vs. FSC-W dichtheidsplot. Klikop Rechthoekom een poort met éénenkele cellente tekenen om niet-enkele cellen uit te sluiten(figuur 2C).
- Pas de poort"Single Cells"toe op DCV-blauw vs. DCV-rode dichtheidsplot en pas de schaal aan om een uitgebreid profiel vast te leggen zoals weergegeven in figuur 2D. Klik op "Polygon" op de menubalk" Plot Tools" om een "DCV"poort te tekenen om de niet-gekleurde cellen en zijpopulatie uit te sluiten (figuur 2D).
- Breng "DCV" poort aan op DCV-blauwe histogram plot op een lineaire schaal. De drie grote pieken hebben betrekking op verschillende DNA-gehalte: 1C, 2C en 4C (Figuur 2E).
- Klik op "New Density" om een DCV-blauw vs. DCV-rode dichtheidsplot op lineaire schaal te maken en "DCV" poort toe te passen om terug te gaan gating van figuur 2E om de 1C- en 4C-populaties(figuur 2F)te lokaliseren. Klik op "Ellipse" om een poort te tekenen op de 1C-populatie, die zich binnen een gecondenseerd gebied (poort 1C) bevindt. Klik op" Polygon" om een poort te tekenen op de 4C-populatie die een continue curve is (poort 4C).
- Klik op "Nieuwe dichtheid" om een DCV-blauw vs. DCV-rood dichtheidsperceel op een lineaire schaal te maken en "4C" poort toe te passen; pas de schaal aan om in te zoomen en klik op" Polygon" om een "4C_1" poort te tekenen voor een nauwkeurigere selectie(figuur 2G).
- Klik op "Nieuwe dichtheid" om een nieuwe FSC-A vs. BSC-A dichtheidsplot op lineaire schaal te maken en "4C_1" poort toe te passen; er zullen drie verrijkte populaties worden gescheiden door de grootte die overeenkomt met leptoteen (L) /zye (Z), pachytene (P) en diplotene (D) spermatocyten. Klik op" Polygon" of "Ellipse" om 3 poorten te tekenen: "L/Z", "P" en "D" op basis van de groeiende grootte (Figuur 2H).
- Klik op "New Dot Plot" om een DCV-blauw vs. DCV-rode kleur stip plot op een lineaire schaal toe te passen poort en ervoor te zorgen dat de drie populaties zijn in een continue volgorde binnen de "4C_1" poort ( Figuur2I).
- Evenzo klikt u voor de 1C-populatie op "Nieuwe dichtheid" om een nieuwe FSC-A vs. BSC-A-dichtheidsplot op lineaire schaal te maken en "1C"-poort toe te passen, de uniforme grootte van cellen als zuivere ronde spermatidpopulatie te selecteren en op "Ellipse" te klikken om een" RS"poort te tekenen (figuur 2J).
5. Sorteren mannelijke kiemcel subpopulaties
- Bereid 1,5 mL buizen met 500 μL 50% FBS voor celverzameling en laad de opvangbuis in de collector en klik op "Load Collection".
- Klik op "Next Tube", "Start"," Record" en "SortEer start". Voor het gebruik van een tweerichtingssysteem waarmee twee populaties van belang tegelijkertijd in het verzamelapparaat kunnen worden gesorteerd, volgt u pairwise combinaties: leptotene (L) /zygotene (Z) en pachytene (P) spermatocyten op basis van L/Z en P-achterpoorten; Ronde spermatids (RS) en diplotene (D) spermatocyten op basis van RS en D back-gates.
- Terwijl het monster wordt uitgevoerd, past u de stroomsnelheid aan op ~ 3000 gebeurtenissen/s om de meest efficiënte sortering te krijgen.
6. Zuiverheidsanalyse van gesorteerde cellen
- Verzamel ≥ 10.000 cellen/elke populatie. Voer celimmunimstaining uit om de subfase te bevestigen.
- Centrifuge op 300 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant voorzichtig weg, met ongeveer 110 μL van de vloeistof in de bodem van de buis.
- Neem een druppel celsuspensie van 10 μL om onder de microscoop te observeren en de overzichtscelmorfologie en het getal te evalueren.
- Breng 100 μL celsuspensie aan op elk van de glijbanen van de monsterkamer (zie Tabel met materialen)en laad de kamers op de Cytospin.
- Draai de monsters op 30 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Teken een cirkel rond de cel met een hydrofobe pen. Droge glijbanen op lab bank voor een paar minuten bij kamertemperatuur.
- Drop 50 μL PBS in de cirkel van de dia en tik eraf.
- Voeg primaire antilichaamoplossing (Verdun primaire antilichamen met 5% Donkey Serum in PBS met 0,02% Polysorbate 20) in de cirkel van de dia en incubeer bij 4 °C 's nachts.
OPMERKING: Om de subfase van meiotische spermatocyten te beoordelen, werd SYCP3 gedetecteerd, een marker van meiotische chromosoomassen, en γH2AX, een marker van DNA-schaderespons. (Voor de concentratie van antilichamen) verwijzen wij u naar de tabel met materialen). - Tik de primaire antilichaamoplossing van de dia's af.
- Drop 50 μL PBS in de cirkel van de dia en tik eraf. Herhaal dit een keer.
- Voeg secundaire antilichaamoplossing (verdun secundaire antilichamen in PBS met 0,02% Polysorbate 20) toe aan de cirkel van de dia en broed bij kamertemperatuur gedurende 1 uur in het donker.
- Drop 50 μL PBS in de cirkel van de dia en tik eraf. Herhaal dit een keer.
- Voeg 50 μL DAPI (voorraadconcentratie is 0,1 μg/mL) vlek toe gedurende 5 minuten en tik af.
- Voeg 1-2 druppels montagemedia toe aan de dia's. Bedek de montagemedia voorzichtig met een afdekglas en druk voorzichtig op het afdekglas om extra montagemedia en luchtbel te verwijderen. De dia's zijn klaar voor microscopie evaluatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een representatief resultaat van dit sorteerprotocol wordt weergegeven in figuur 3. De totale sorteertijd van twee teelballen (één muis) is meestal ongeveer 3 uur, wat afhankelijk is van de concentratie van celsuspensie en de sorteersnelheid. Na sortering wordt de zuiverheid van spermatocyten bevestigd door immunostaining van SYCP3 en γH2AX (figuur 3A). De representatieve zuiverheid van gesorteerde L/Z, P, D spermatocytenfracties liggen rond respectievelijk 80,4%, 90,6% en 87,6% (figuur 3C). We hebben de substages bepaald op basis van de criteria die we eerder19hebben gepubliceerd. Kortom, in de leptoteen en zygotene fase, synapsis tussen homologe chromosomen is onvolledig, die wordt aangegeven door dunne draden van SYCP3 kleuring. Brede γH2AX domeinen worden waargenomen in de hele nucleaire chromatine als gevolg van geprogrammeerde DNA double-streng breaks. In de pachytene stadium, homologe chromosomen zijn volledig synapsed, en γH2AX specifiek accumuleert op de geslachtschromosomen. In de diplotene fase ondergaan homologe chromosomen geleidelijk desynapsis. De zuiverheid van RS wordt bevestigd door nucleus kleuring met DCV (Figuur 3B). RS kan nauwkeurig worden beoordeeld met DNA-kleuring: een unieke DAPI-intense chromocenter omringd door euchromatine; of combineren met specifieke markers, zoals Sp56 die wordt uitgedrukt in de ontwikkeling van acrosomale korrel van spermatid en histone variant H1T die sterk wordt uitgedrukt in kern na de mid-pachytene stadium (Figuur 3B).
RS zuiverheid is ongeveer 90,1% na het sorteren(Figuur 3C). De steekproefgrootte van zuiverheidsanalyse is meer dan 1.000 cellen voor elk experiment; de zuiverheid van de L/P- en D-populaties wordt gemiddeld uit 6 onafhankelijke experimenten berekend; de zuiverheid van P- en RS-populaties wordt gemiddeld uit 3 onafhankelijke experimenten gehaald. De levensvatbaarheid van deze geïsoleerde cellen is meestal meer dan 95%(figuur S1). De totale opbrengst van elke fractie van een enkele volwassen muis wordt geschat en vermeld in Fig 3C, die voldoende cellen biedt voor verschillende downstream-analyses. Onlangs hebben we dit protocol gebruikt om wild-type pachytene spermatocyten te isoleren voor ChIP-seq analyse20,21.
| Reagens | Ingrediënt | Voorraadconcentratie | Volume |
| (HBSS-basis) | |||
| Dissociatiebuffer | DMEM (DMEM) | - | 2 ml |
| (DMEM-basis) | FBS | - | 40 μl |
| Hyaluronidase Hyaluronidase | 100 mg/ml | 30 μl | |
| DNase I | 10 mg/ml | 50 μl | |
| Collagenase Type I | 100 mg/ml | 40 μl | |
| Recombinant Collagenase | 14000 eenheid/ml | 100 μl | |
| FACS-buffer | Pbs | - | 980 ml |
| (PBS-basis) | FBS | - | 20 ml |
Tabel 1: Reagensrecept. De dissociatiebuffer moet vlak voor gebruik worden opgesteld. Verwarm DMEM voor het begin van de dissectie. De enzymvoorraden kunnen op elk moment vóór het experiment worden bereid en bij -20 °C worden opgeslagen. FACS-buffer moet vacuüm gefilterd en opgeslagen bij 4 °C; voorverwarmen tot kamertemperatuur voor gebruik.
Figuur 1: Workflow van murine spermatogenic cellen isolatie op DCV-gebaseerde sorteren. Dit beeld illustreert de algemene procedure, van weefseldissociatie tot FACS-sortering, tot het binnen één dag oogsten van geïsoleerde spermatogene cellen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: FACS-analyse van volwassen murine-testiculaire cellen op basis van DCV-fluorescentie en lichtverstrooiing. (A) Verworven onbevlekte cellen in het eerste decennium van een DCV-blauwe histogram plot (linkerkant van de rode balk). b) (C) Puin en niet-eencellige uitgesloten door lichtverstrooiing. (D) Uitsluiting van niet-gekleurde cellen en zijdepopulaties op basis van dcv-fluorescentie. (E) DNA-inhoud bepaling op basis van DCV-blauwe fluorescentie. Linkerpiek (groen) en rechterpiek (roze) komen overeen met 1C- en 4C-populaties. (F) Gating op 1C en 4C testiculaire populaties op basis van DCV-blauw/DCV-rode fluorescentie. (G) Nauwkeurige gating op 4C-testiculaire populaties. (H) Back-gating van Gate 4C van het DCV-perceel op een FSC/BSC-perceel. Op basis van regio's met minimale overlappingen op het FSC/BSC-perceel worden de poorten L/Z, P en D gemaakt om hun respectieve spermatocytenpopulaties te verrijken. (I) Kleur stip plot met de L / Z, P, en D populaties zijn in continue orde binnen Gate 4C. (J) Back-gating van Gate 1C van de DCV plot op een FSC / BSC plot. RS-poort werd opgericht om ronde spermatid bevolking te verrijken met een uniforme grootte, wat resulteert in een grotere zuiverheid van de bevolking tijdens het sorteren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Representatieve resultatenbeelden en statistieken van spermatogene cellen verkregen uit sortering. (A) Immunofluorescentiekarakterisering van gesorteerde spermatocyten. Bovenste paneel: DCV-kleuring met kernpatroon van de levende spermatocyten direct na het sorteren; L/Z (leptotene/zygotene), P (pachytene) en D (diplotene). Lager paneel: Bevestiging van meiotische substadia voor elke populatie door immunostaining voor SYCP3 (groen) en γH2AX (rood). (B) Representatieve DCV-afbeelding met kernpatroon van RS. Schaalbalken: 50 μm (bovenste panelen) en 10 μm (onderste vergrote panelen). Right Panels: Immunofluorescentie bevestiging van ronde spermatids gekleurd met Sp56 en H1T. (C) De zuiverheid van L/Z, P en D werd bevestigd door immunostaining, de steekproefgrootte bedroeg meer dan 1.000 cellen voor elk onafhankelijk experiment, in totaal 6 onafhankelijke experimenten. De RS zuiverheid werd bevestigd door kern vlekken met een totaal van 3 onafhankelijke experimenten. Het totale celnummer van de testiculaire celsuspensie van een 8 weken oude WT B6-muis was ongeveer 100 miljoen cellen voor het sorteren. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur S1: De levensvatbaarheid van geïsoleerde pachytene spermatocyten. Een representatieve afbeelding toont de cel levensvatbaarheid van geïsoleerde pachytene spermatocyten (Rood: PI; Blauw: DCV). PI kon tijdens het sorteren niet worden gecombineerd met DCV. Echter, onder microscoop, de DCV-rood signaal was vrij laag; daarom werden PI-positieve dode cellen gemakkelijk onderscheiden van andere levende cellen. De levensvatbaarheid is meestal meer dan 95%. Schaalbalken: 10 μm. Klik hier om dit cijfer te downloaden.
Figuur S2: Onvolledige dissociatie of puin verstoort de gating. De A-populatie (rode cirkel) bevat puin en polymeer van spermatids (aangegeven door pijl). De grotere A-populatie zal kruisen met B-populatie (gele cirkel) en uiteindelijk vervuilen de 4C-bevolking. Schaalbalken: 200 μm. Klik hier om dit cijfer te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier presenteren we een praktisch en eenvoudig protocol om subpopulaties van spermatocyten en spermatids te isoleren van een enkele volwassen mannelijke muis. Om de reproduceerbaarheid van dit protocol te waarborgen, zijn er enkele kritieke stappen die aandacht nodig hebben. Vóór enzymvertering, wasstap is gericht op het verwijderen van interstitiële cellen; na de spijsvertering, deze stap helpt om spermatozoa en puin te verwijderen. Wassen/centrifugeren 3 keer is belangrijk. In ons dissociatiebufferrecept vergemakkelijkt de combinatie van verschillende enzymen de dissociatie van teelballen in de eencellige suspensie zonder overmatige celschade. Voorzichtig pipetten om te voorkomen dat luchtbellen ook helpt om de integriteit van de cel te beschermen. Controleer de celsuspensie onder een microscoop na dissociatie om ervoor te zorgen dat de suspensie eencellig niveau bereikt. Onvolledige dissociatie of verontreiniging van het puin door overmatige spijsvertering zal de zuiverheid van gesorteerde cellen beïnvloeden; zoals weergegeven in figuur S2, de rechtopstaande bevolking bevat puin en tetramer van spermatids. DCV-vlekken vereisen incubatie in het donker en daarna niet meer gewassen.
Om potentiële problemen bij het oplossen en terugslaan van spermatocyten subpopulaties op te lossen, als een optie voor optimalisatie, raden we aan om een gesynchroniseerde wildtypemuis te gebruiken om een specifieke fase van spermatocyten22,23,24te helpen lokaliseren. Het is ook vermeldenswaard dat sommige knock-out muis stammen met spermatogenese arrestatie fenotypes kunnen hebben ongewone DCV profielen, omdat ze missen een aantal subpopulaties. Een goede wildtype controle wordt sterk aanbevolen in dit geval. Bovendien kan dit protocol mogelijk worden toegepast op volwassen muizen van elke leeftijd. De leeftijd van de experimentele muis kan echter een verwarrende factor zijn vanwege het variabele aandeel kiemcellen.
In de loop der jaren zijn verschillende protocollen ontwikkeld om kiemcellen te zuiveren. Als een van de meest populaire methoden scheidt de sedimentatie van de STA-PUT-snelheid kiemcellen door de BSA-gradiënt en levert een goede opbrengst van intacte kiemcellen6,7. Sta-PUT vereist echter niet alleen speciale apparaten die mogelijk niet direct beschikbaar zijn voor veel laboratoria, maar ook tijdrovend en arbeidsintensief zijn om in een koude ruimte bij 4 °C uit te voeren. In tegenstelling tot STA-PUT, dat geschikt is voor grootschalige scheiding, zou deze FACS-gebaseerde methode een hoge zuiverheid en nauwkeurige breuk kunnen bieden voor een kleinschalig experiment. Een grootschalige sortering met behulp van ons protocol is mogelijk, maar verlengt de sorteertijd aanzienlijk en kan de levensvatbaarheid van cellen in gevaar brengen. Daarom is STA-PUT nog steeds een praktische optie wanneer een groot aantal cellen nodig is5,25,26.
In vergelijking met de vorige FACS-methode op basis van Ho342 kleurstof8,9,10,11, maakt ons protocol gebruik van DCV, dat een breder excitatiespectrum heeft en kan worden toegepast op de meeste huidige FACS sorteerders uitgerust met een UV of 405 nm violet laser18. Hoewel er een ander protocol is met DCG14,15,16,17, is het verschil tussen ons protocol en het DCG-protocol dat ons DCV-protocol tweedimensionale scheiding met DCV-blauw en DCV-rood gebruikt, waarbij het voordeel van het Ho342-protocol wordt nagebootst. Met dit voordeel stelt ons DCV-protocol ons in staat om sterk verrijkte kiemcellen te isoleren van volwassen testis. Het DCG-protocol maakt geen gebruik van tweedimensionale scheiding en wordt aanbevolen voor isolatie van kiemcellen van jonge muizen. De tweedimensionale scheiding kan een betere resolutie hebben om de substadia van spermatocyten te scheiden. Echter, onze methode is nog steeds niet in staat om leptoteen en zygotene spermatocyten afzonderlijk te isoleren, evenals "2C" celtypes, waaronder spermatogonia, preleptoteen spermatocyten, en secundaire spermatocyten.
Aangezien het brede emissiespectrum van DCV-vlek het lekken naar andere kanalen veroorzaakt, kunnen de meeste celleefbaarheidskleurstoffen zoals PI en 7AAD niet worden gecombineerd vanwege vals-positieve signalen. Andere cel levensvatbaarheid kleurstoffen met emissie in ver-rode of nabij-infrarood kanalen misschien de moeite waard om te proberen in de toekomst. Maar in onze ervaring, gesorteerde cellen tonen meestal ≥ 95% levensvatbaarheid na 2 uur facs sorteren (Figuur S1), wat voldoende is voor downstream-analyse.
Gesorteerde cellen verkregen uit onze procedure kunnen worden gebruikt voor verschillende downstream-experimenten, waaronder de volgende generatie sequencing analyse (RNA-seq, ATAC-seq, en ChIP-seq). Cellen die hier worden verkregen, kunnen ook worden gebruikt voor de kortetermijncultuur27. Tot slot bieden we een eenvoudig maar efficiënt protocol, inclusief een eencellige schorsingsvoorbereidingsprocedure van een uur en de gedetailleerde gatingstrategie voor FACS op basis van DCV-kleurstof, dat geschikt is voor kleinschalige spermatogene celisolatie en snel kan worden overgenomen door veel onderzoekers, zelfs flow cytometrie beginners.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende belangen hebben.
Acknowledgments
Wij danken leden van de laboratoria Namekawa, Yoshida en Maezawa voor hun hulp; Katie Gerhardt voor het bewerken van het manuscript; Mary Ann Händel voor het delen van de H1T antilichaam, de Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC) Research Flow Cytometrie Core voor het delen van de FACS apparatuur ondersteund door NIH S10OD023410; Grant-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI; 17K07424) aan T.N.; Lalor Foundation Postdoctoral Fellowship naar A.S.; AMED-CREST (JP17gm1110005h0001) aan S.Y.; de Onderzoeksprojectsubsidie van de Azabu University Research Services Division, Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT)-Ondersteund Programma voor het Private University Research Branding Project (2016-2019), Grant-in-Aid for Research Activity Start-up (19K21196), de Takeda Science Foundation (2019) en de Uehara Memorial Foundation Research Incentive Grant (2018) aan S.M.; National Institute of Health R01 GM122776 naar S.H.N.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 ml tube | Watson | 131-7155C | |
| 100 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351029 | |
| 15 mL Centrifuge tube | Watson | 1332-015S | |
| 5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 µm nylon mesh) | Corning, Falcon | 352235 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Watson | 1342-050S | |
| 60 mm Petri dish | Corning, Falcon | 351007 | |
| 70 µm nylon mesh | Corning, Falcon | 352350 | |
| Cell sorter | Sony | SH800S | |
| Centrifuge | |||
| Collagenase, recombinant, Animal-derived-free | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 036-23141 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington | LS004196 | |
| Cover glass | Fisher | 12-544-G | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Fisher | D1306 | working concentration: 0.1 μg/mL |
| Dnase I | Sigma | D5025-150KU | |
| Donkey serum | Sigma | S30-M | |
| Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885076 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Histone H1t antibody | gift from Mary Ann Handel | 1/2000 diluted | |
| Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H3506-1G | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P5493-4L | |
| Pipettemen | |||
| ProLong Gold Antifade Mountant | Fisher | P36930 | |
| rH2AX antibody | Millipore | 05-635 | working concentration: 2 μg/mL |
| Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody | QED Bioscience | 55101 | working concentration: 0.5 μg/mL |
| Sterilized forceps and scissors | |||
| Superfrost /Plus Microscope Slides | Fisher | 12-550-15 | |
| SYCP3 antibody | Abcam | ab205846 | working concentration: 5 μg/mL |
| TWEEN 20 (Polysorbate 20) | Sigma | P9416 | |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV) | Invitrogen | V35003 | |
| Water bath |
References
- Griswold, M. D. Spermatogenesis: The Commitment to Meiosis. Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).
- Yoshida, S. Mouse Spermatogenesis Reflects the Unity and Diversity of Tissue Stem Cell Niche Systems. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , 036186 (2020).
- Rathke, C., Baarends, W. M., Awe, S., Renkawitz-Pohl, R.
- Maezawa, S., et al. SCML2 promotes heterochromatin organization in late spermatogenesis. Journal of Cell Science. 131 (17), 217125 (2018).
- Maezawa, S., Yukawa, M., Alavattam, K. G., Barski, A., Namekawa, S. H. Dynamic reorganization of open chromatin underlies diverse transcriptomes during spermatogenesis. Nucleic Acids Research. 46 (2), 593-608 (2018).
- Bellve, A. R. Purification, culture, and fractionation of spermatogenic cells. Methods in Enzymology. 225, 84-113 (1993).
- Bryant, J. M., Meyer-Ficca, M. L., Dang, V. M., Berger, S. L., Meyer, R. G. Separation of spermatogenic cell types using STA-PUT velocity sedimentation. Journal of Visualized Experiments. (80), e50648 (2013).
- Gaysinskaya, V., Bortvin, A.
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry Part A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. Journal of Visualized Experimments. (50), e2602 (2011).
- Gaysinskaya, V., Soh, I. Y., van der Heijden, G. W., Bortvin, A. Optimized flow cytometry isolation of murine spermatocytes. Cytometry Part A. 85 (6), 556-565 (2014).
- Romer, K. A., de Rooiji, D. G., Kojima, M. L., Page, D. C. Isolating mitotic and meiotic germ cells from male mice by developmental synchronization, staging, and sorting. Developmental Biology. 443 (1), 19-34 (2018).
- Lam, K. G., Brick, K., Cheng, G., Pratto, F., Camerini-Otero, R. D. Cell-type-specific genomics reveals histone modification dynamics in mammalian meiosis. Nature Communications. 10 (1), 3821 (2019).
- Geisinger, A., Rodriguez-Casuriaga, R. Flow Cytometry for the Isolation and Characterization of Rodent Meiocytes. Methods in Molecular Biology. 1471, 217-230 (2017).
- da Cruz, I., et al. Transcriptome analysis of highly purified mouse spermatogenic cell populations: gene expression signatures switch from meiotic-to postmeiotic-related processes at pachytene stage. BMC Genomics. 17, 294 (2016).
- Rodriguez-Casuriaga, R., et al. Rapid preparation of rodent testicular cell suspensions and spermatogenic stages purification by flow cytometry using a novel blue-laser-excitable vital dye. MethodsX. 1, 239-243 (2014).
- Trovero, M. F., et al. Revealing stage-specific expression patterns of long noncoding RNAs along mouse spermatogenesis. RNA Biology. 17 (3), 350-365 (2020).
- Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye. Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).
- Alavattam, K. G., Abe, H., Sakashita, A., Namekawa, S. H. Chromosome Spread Analyses of Meiotic Sex Chromosome Inactivation. Methods in Molecular Biology. 1861, 113-129 (2018).
- Maezawa, S., et al. Super-enhancer switching drives a burst in gene expression at the mitosis-to-meiosis transition. Nature Structural & Molecular Biology. , (2020).
- Sakashita, A., et al. Endogenous retroviruses drive species-specific germline transcriptomes in mammals. Nature Structural & Molecular Biology. , (2020).
- Agrimson, K. S., et al. Characterizing the Spermatogonial Response to Retinoic Acid During the Onset of Spermatogenesis and Following Synchronization in the Neonatal Mouse Testis. Biology of Reproduction. 95 (4), 81 (2016).
- Hogarth, C. A., et al. Turning a spermatogenic wave into a tsunami: synchronizing murine spermatogenesis using WIN 18,446. Biology of Reproduction. 88 (2), 40 (2013).
- Patel, L., et al. Dynamic reorganization of the genome shapes the recombination landscape in meiotic prophase. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (3), 164-174 (2019).
- Alavattam, K. G., et al. Attenuated chromatin compartmentalization in meiosis and its maturation in sperm development. Nature Structural & Molecular Biology. 26 (3), 175-184 (2019).
- Adams, S. R., et al. RNF8 and SCML2 cooperate to regulate ubiquitination and H3K27 acetylation for escape gene activation on the sex chromosomes. PLoS Genetics. 14 (2), 1007233 (2018).
- Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Developmental Biology. 169 (2), 557-567 (1995).
