Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Visualisering af Calcitonin Gene-Related Peptid Immunoreactive Innervation af Rat Cranial Dura Mater med immunfluorescens og neural sporing

Published: January 6, 2021 doi: 10.3791/61742
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences
* These authors contributed equally

Summary

Her præsenterer vi en protokol til visualisering af rumlig korrelation af calcitonin genrelateret peptid (CGRP)-immunoreaktive nervefibre og blodkar i kraniedura mater ved hjælp af immunfluorescens og fluorescerende histokemi med henholdsvis CGRP og falloidin. Derudover var oprindelsen af disse nervefibre retrograd spores med en fluorescerende neurale sporstof.

Abstract

Formålet med denne undersøgelse var at undersøge fordelingen og oprindelsen af calcitonin genrelateret peptid (CGRP)-immunoreaktive sensoriske nervefibre af kraniet dura mater ved hjælp af immunfluorescens, tre-dimensionel (3D) genopbygning og retrograd sporing teknik. Her blev nervefibrene og blodkarrene farvet ved hjælp af immunfluorescens og histokemiteknikker med henholdsvis CGRP og fluorescerende falloidin. Den rumlige korrelation mellem dural CGRP-immuoreaktive nervefibre og blodkar blev demonstreret ved 3D-rekonstruktion. I mellemtiden blev oprindelsen af CGRP-immunoreaktive nervefibre opdaget ved neural sporingsteknik med fluorogold (FG) fra området omkring mellempulsåren (MMA) i kraniedura mater til trigeminal ganglion (TG) og cervikal (C) dorsal rod ganglier (DRGs). Desuden blev de kemiske egenskaber ved FG-mærkede neuroner i TG og DRGs også undersøgt sammen med CGRP ved hjælp af dobbelt immunfluorescens. Ved at drage fordel af den gennemsigtige helmonteringsprøve og 3D-rekonstruktion blev det påvist, at CGRP-immunoreaktive nervefibre og falloidinmærkede arterioler løber sammen eller danner et dural neurovaskulært netværk i 3D-visning, mens FG-mærkede neuroner blev fundet i oftalmiske, maxillary, og mandibulære grene af TG, samt C2-3 DRGs ipsilateral til siden af sporstof ansøgning, hvor nogle af FG-mærkede neuroner præsenteret med CGRP-immunoreaktive udtryk. Med disse tilgange demonstrerede vi de fordelingsmæssige egenskaber ved CGRP-immunoreaktive nervefibre omkring blodkarrene i kraniedura mater samt oprindelsen af disse nervefibre fra TG og DRGs. Set ud fra et metodeperspektiv kan det give en værdifuld reference til forståelse af den komplicerede neurovaskulære struktur af kraniedura mater under den fysiologiske eller patologiske tilstand.

Introduction

Den kraniale dura mater er det yderste lag af meninges for at beskytte hjernen og indeholder rigelige blodkar og forskellige former for nervefibre1,2. Mange undersøgelser har vist, at sensibiliseret kraniedura mater kan være den nøglefaktor, der fører til forekomsten af hovedpine, der involverer den unormale vasodilation og innervation3,4,5. Således er kendskabet til neurovaskulær struktur i kraniedura mater vigtig for at forstå patogenese af hovedpine, især for migræne.

Selv om dura innervation tidligere er blevet undersøgt med den konventionelle immunohistochemistry, den rumlige korrelation af nervefibre og blodkar i kraniet dura mater var mindre undersøgt6,7,8,9. For at afsløre den durale neurovaskulære struktur mere detaljeret blev calcitonin genrelateret peptid (CGRP) og falloidin valgt som markører for henholdsvis farvning af duralnervefibre og blodkar i hele monteret kranie dura mater med immunfluorescens og fluorescerende histokemi10. Det kan være et optimalt valg at opnå en tredimensionel (3D) visning af neurovaskulær struktur. Derudover blev fluorogold (FG) anvendt på området omkring midterste meningeal arterie (MMA) i kraniet dura mater at bestemme oprindelsen af CGRP-immunoreaktive nervefibre, og spores til trigeminus ganglion (TG) og livmoderhalskræft (C) dorsal rod ganglier (DRGs), mens FG-mærkede neuroner blev undersøgt yderligere sammen med CGRP ved hjælp af immunofluorescens.

Formålet med denne undersøgelse var at tilvejebringe et effektivt redskab til undersøgelse af den neurovaskulære struktur i kraniedura mater for CGRP-immunoreaktiv innervation og dens oprindelse. Ved at drage fordel af den gennemsigtige helmonteringsdura mater og kombinere immunfluorescens, retrograd sporing, konfokale teknikker og 3D-rekonstruktion forventede vi at præsentere et nyt 3D-billede af den neurovaskulære struktur i kraniedura mater. Disse metodologiske tilgange kan yderligere serveres til at udforske patogenese af forskellige hovedpiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne undersøgelse blev godkendt af den etiske komité ved Institute of Akupunktur og Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences (referencenummer D2018-09-29-1). Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med National Institutes of Health Guide for care and use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). Tolv voksne Sprague-Dawley hanrotter (vægt 220 ± 20 g) blev anvendt i denne undersøgelse. Dyr [licensnummer SCXK (JING) 2017-0005] blev leveret af National Institutes for Food and Drug Control.

1. Innervation af rottefjerding

  1. Perfusioner
    1. Intraperitoneally injicere en overdosis af tribromoethanolopløsning (250 mg/kg) til rotten for at fremkalde aktiv dødshjælp.
    2. Når åndedrættet stopper, perfuse transcardialt med 100 mL på 0,9% normal saltvand efterfulgt af 250-300 mL 4% paraformaldehyd i 0,1 M fosfatbuffer (PB, pH 7,4).
    3. Efter perfusion skal du fjerne hovedhuden og åbne kraniet for at udsætte dura mater og dorsal side af hjernen. Derefter dissekeres den kraniale dura mater langs hjernestammen til den olfaktoriske pære i hele monteringsmønsteret (figur 1). Der udføres postfiksering i 4% paraformaldehyd i 2 timer, og kryobeskyttes i 25% saccharose i 0,1 M PB i mere end 24 timer ved 4 °C.
  2. Fluorescens immunohistochemistry for CGRP og falloidin mærkning
    BEMÆRK: En kombination af fluorescerende farvning af CGRP og falloidin blev anvendt til at afsløre den rumlige korrelation mellem duralnervefibre og blodkar i rottekirke dura mater i hele monteringsmønsteret.
    1. Skyl kraniedura mater i 0,1 M PB i ca. 1 min.
    2. Inkuber dura mater i en blokeringsopløsning, der indeholder 3% normalt æselserum og 0,5% Triton X-100 i 0,1 M PB i 30 min.
    3. Dura mater overføres til anti-CGRP-antistof (1:1000) i 0,1 M PB, der indeholder 1% normalt æselserum og 0,5% Triton X-100 natten over ved 4 °C11.
    4. Dura mater vaskes tre gange i 0,1 M PB den følgende dag.
    5. Dura mater inkuberes i en blandet opløsning af æselantimusen Alexa Fluor 488 sekundært antistof (1:500) og falloidin 568 (1:1000) i 0,1 M PB indeholdende 1% normalt æselserum og 0,5% Triton X-100 for 1,5 timer ved stuetemperatur (26 °C).
    6. Vask dura mater tre gange i 0,1 M PB.
    7. Trim kanterne, og monter dem på mikroskopdias (se Materialeoversigt).
    8. Sæt på coverslips med 50% glycerin før observation.
  3. Observation og registrering
    1. Overhold fluorescerende prøver under et fluorescerende mikroskop eller et konfokalt billedsystem.
    2. Tag billederne af hele monteringsdura mater med et fluorescerende mikroskop udstyret med et digitalt kamera (4x, NA: 0,13), og brug en eksponeringstid på 500 ms. Billedet mosaikker af dura mater blev afsluttet med en software af fluorescerende mikroskop (se Tabel over materialer).
    3. Tag billeder af CGRP-immunoreaktive nervefibre og falloidin-mærkede blodkar i dura mater ved hjælp af et konfokalt mikroskop. Excitations- og emissionsbølgelængderne var 488 nm (grøn) og 594 nm (rød). Det konfokale pinhole er 110 (20x) og 105 μm (40x). Billedoptagelsens opløsning er 640 x 640 pixel.
    4. Tag 20 billeder i 2 μm rammer fra hver 40 μm tyk sektion og udfør enkelt in-focus billedintegration med et konfokalt billedbehandlingsrelateret softwaresystem til 3D-analyse som følger: Set Start Focal Plane | Angiv | Angiv trinstørrelse | Vælg dybdemønster | | til hentning af billeder Z-serien.
    5. Brug en fotoredigeringssoftware til at justere lysstyrken og kontrasten i billeder for at optimere visualiseringen. Vær opmærksom på ikke at fjerne data fra billederne.

2. Retrograd sporingsundersøgelse med FG

  1. Kirurgiske indgreb
    1. Bestem det koordinerede område af interesse for rotte kranial dura mater.
    2. Forbered en mikrosprøjte på 10 μL, og test den med flydende paraffin.
    3. Bedøve rotterne med tribromoethanolopløsning (150 mg/kg) via intraperitoneal injektion. Kontroller dybden i anæstesi ved manglende reaktion på tå knivspids.
    4. Barber rottens hoved med en elektrisk barbermaskine.
    5. Sæt stumpe ørestænger til rotten og læg den på den stereotaxiske enhed. Sæt derefter mundholderen og påfør oftalmisk salve på øjnene.
    6. Rengør det kirurgiske sted i hovedhuden ved hjælp af 10% povidone jod efterfulgt af 75% ethanol.
    7. Lav et snit langs midterlinjen i hovedbunden.
    8. Fjern periosteum og muskelvævet direkte fra kraniet ved hjælp af sterile bomuldsspidsapplikatorer (Figur 1A).
    9. Bor et lille hul (~5-7 mm) ved hjælp af en burr boremaskine med en rund spids bit (#106) på venstre parietal og tidsmæssige knogler over MMA12, og sørg for, at kraniet dura mater blev holdt intakt (Figur 1B).
    10. Byg en bank rundt om hullet med dental silikatcement for at begrænse spredningen af sporstof (Figur 1C).
    11. Der tilsættes 2 μL 2% FG i hullet omkring MMA med en mikrosprøjte på 10 μL (Figur 1D).
    12. Dæk hullet med et lille stykke hemostatisk svamp.
    13. Sæt et stykke paraffinfilm på hullet og forsegle kanterne med knoglevoks for at forhindre lækage af sporstof og for at undgå at forurene det omgivende væv.
    14. Sutur såret med steril tråd.
    15. Hold rotterne i et varmt område, indtil de er helt kommet sig.
    16. Returner rotterne tilbage til deres bure og tilsæt et antibiotikum og smertestillende i drikkevandet.
  2. Perfusioner og sektioner
    1. Efter 7 overlevelsesdage, perfuse disse rotter som nævnt ovenfor i procedurerne i punkt 1.1.
    2. DissekerE TG og C1-4 DRGs, derefter post-fix og cryoprotect dem som nævnt ovenfor i afsnit 1.1.3(Figur 1F).
    3. TG og DRGs klippes i en tykkelse på 30 μm på et kryostatmikrtomsystem i sagittalretningen og monteres på silanbelagte glasrutsjebaner.
  3. Dobbelt immunfluorescens for FG- og CGRP-mærkning i TG og DRGs
    BEMÆRK: Selv om FG-mærkningen kan observeres direkte med UV-belysning under kviksølvlampe uden yderligere farvning13,14,15,16, blev de mærkede neuroner med FG yderligere undersøgt i TG og cervikal DRGs ved hjælp af dobbelte immunfluorescences med FG og CGRP for at afsløre oprindelsen af dural CGRP-immunoreaktive nervefibre i TG og DRGs.
    1. Cirkel sektionerne med den histokemiske pen.
    2. Inkuber sektionerne i 30 minutter i en blokeringsopløsning, der indeholder 3% normalt æselserum og 0,5% Triton X-100 i 0,1 M PB.
    3. Prøverne overføres til opløsningen af kaninantifluororgold (1:1000) og mod cgrp-antistof (1:1000) i 0,1 M PB, der indeholder 1% normalt æselserum og 0,5% Triton X-100 natten over ved 4 °C.
    4. Vask sektionerne tre gange i 0,1 M PB den følgende dag.
    5. Inkuber i en blandet opløsning af æsel anti-kanin Alexa Fluor 594 (1:500) og æsel anti-mus Alexa Fluor 488 (1:500) sekundære antistof i 0,1 M PB indeholder 1% normal æsel serum og 0,5% Triton X-100 for 1,5 timer ved stuetemperatur.
    6. Der vaskes og påføres coverslips på afsnittene som procedurerne i trin 1.2.6 og 1.2.8.
  4. Observation og registrering
    1. Tag billeder af de FG-mærkede neuroner i TG og DRGs under UV-belysning ved fluorescerende mikroskop udstyret med et digitalt kamera.
    2. Tag billeder af FG- og CGRP-mærkede neuroner i TG og DRGs under et fluorescerende mikroskop udstyret med et digitalt kamera.
    3. Brug redigeringssoftwaren til at justere billedernes lysstyrke og kontrast og til at tilføje etiketter på billederne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Neurovaskulær struktur af kraniedura mater
Efter immunfluorescerende og fluorescerende histokemisk farvning med CGRP og falloidin blev CGRP-immunoreaktive nervefibre og falloidinmærkede duralarterioler og bindevæv tydeligt demonstreret i hele monterings kraniedura mater i et 3D-mønster (Figur 2C,D, E, F). Det blev vist, at både tykke og tynde CGRP-immunoreaktive nervefibre løber parallelt med duralarterilerne, omkring den vaskulære væg eller mellem blodkarrene (Figur 2D,E, F). Ved at tage fordele af 3D-rekonstruktionen kunne morfologien af duralarterioler og den rumlige korrelation mellem dural CGRP-immunoreaktive nervefibre og arterioler tydeligt påvises fra forskellige perspektiver.

Retrograd-mærkede neuroner i TG og DRGs
Syv dage efter FG-ansøgningen om MMA-området i rotteklonial dura mater (figur 3A) blev de FG-mærkede neuroner påvist i TG og livmoderhalskræft DRGs på ipsilateral side af sporstofapplikationen, som blev direkte observeret under UV-belysning af fluorescerende mikroskopi (Figur 3B, C). FG-mærkede neuroner blev fundet i alle tre grene af TG med højere koncentration på oftalmiske (V1) og maxillary (V2) divisioner, og med mindre på mandibular division (V3) (Figur 3B). I mellemtiden blev nogle af de FG-mærkede neuroner også observeret i C2-3 DRGs (Figur 3C).

Derudover blev der også udført dobbelt immunfluorescens med FG og CGRP på afsnittene TG og cervikal DRGs. Ifølge diameteren af CGRP-immunoreaktive neuroner i TG og DRGs, de fleste af dem blev primært fundet i små og mellemstore diameter sensoriske neuroner (<50 μm). Nogle af disse typer af CGRP-immunoreaktive neuroner blev også mærket med FG i TG og C2-3 DRGs, hvilket tyder på, at CGRP-immunoreaktive nervefibre i kraniet dura mater stammede fra disse delpopulation af sensoriske neuroner i TG og DRGs(Figur 4).

Figure 1
Figur 1:Fotografier af de vigtigste eksperimentelle synspunkter i denne undersøgelse. (B) Et hul over kraniedura mater, der viser den midterste meningeal arterie (MMA). (C) En lille bank omkring hullet omgivet af dental silikatcement til påføring af røbestof på kraniedura mater. (D) Anvendelse af fluorogold (FG) i hullet med mikrosprøjte. (E)Den gennemsigtige helmontering dura mater. (F)Den udvendige visning af trigeminal ganglion (TG). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Korrelation mellem calcitonin genrelateret peptid (CGRP)-immunoreaktive nervefibre og falloidin (Pha)-mærkede arterioler på hele monterelsen kranie dura mater. (A) Den gennemsigtige helmontering dura mater. (B) Hele monteringsdura mater blev fladtrykt og monteret på rutsjebanen. (C) Fordeling af CGRP-immunoreaktive nervefibre og Pha-mærkede blodkar langs den midterste meningeal arterie (MMA). (D,E) De forstørrede fotos fra de samme områder af d og e i panel C. (F) De forstørrede og justerede billeder fra panel E med rammen i et 3D-mønster. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Fordeling af fluor (FG)-mærkede neuroner i trigeminalganglion (TG) og livmoderhalskræft (C) dorsal rodganglion (DRG) under UV-belysning. (B) Distribution af FG-mærkede neuroner i TG's oftalmiske (V1), maxillary -, mandibulære (V3) grene. (C) Distribution af FG-mærkede neuroner fordelt i C2 DRG. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: De repræsentative fotografier, der viser de mærkede sensoriske neuroner i trigeminal ganglion (TG) og cervikal dorsal rodganglion (DRG) ved hjælp af dobbelt immunfluorescens med fluorogold (FG) og calcitonin genrelateret peptid (CGRP). CGRP, og både FG og CGRP blev påvist i henholdsvis rød, grøn og gul i TG (A) og DRG (B). (A1-B1), (A2-B2): Panel A og B blev separat vist med FG-mærkning (A1, B1) og CGRP-mærkning (A2, B2). Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne undersøgelse har vi med succes demonstreret distributionen og oprindelsen af CGRP-immunoreaktive nervefibre i kraniedura mater ved hjælp af immunfluorescens, 3D-rekonstruktion og neurale sporingsmetoder med CGRP-antistof og FG neurale sporstof, hvilket giver de histologiske og kemiske beviser for bedre at forstå det durale neurovaskulære netværk.

Som det var kendt, CGRP spiller en kritisk rolle i patogenese af migræne4,17. Det blev vist, at øget CGRP kan føre til vasodilatation og neurogen betændelse for at forårsage den perifere og centrale sensibilisering langs trigeminusvejen4,18. CGRP-immunoreaktive nervefibre tilhører de umyelinerede peptidergiske sensoriske axoner, der er ansvarlige for transport af nociceptive signaler19. At være i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, her, vi klart demonstreret fordelingen af CGRP-immunoreaktive nervefibre i kraniet dura mater og spores deres oprindelse fra små og mellemstore diameter sensoriske neuroner i TG og DRGs. Disse cellulære strukturer kunne være kilderne til syntetisering og frigivelse CGRP. På den anden side er falloidin en specifik sonde til filamentøs actin (F-actin), der er rigelig i de glatte muskuløse og endotelceller. Som en ordentlig kandidat blev falloidin brugt til mærkning af vaskulære strukturer og bindevæv10,20,21. Vores seneste undersøgelse har vist, at i modsætning til alfa glat muskel actin og CD31, falloidin er mere pålidelig og følsom for farvning dural arterioler, og er den optimale til at kombinere med CGRP for at demonstrere kranie neurovaskulære netværk i detaljer, som er blevet offentliggjort eslewhere10,21.

Neurale tarmkanalen sporing teknik er et vigtigt redskab til at undersøge neurale oprindelse og opsigelse. I denne undersøgelse blev FG brugt til retrograd sporing af oprindelsen af CGRP-immunoreaktive nervefibre i kraniedura mater. Da kraniedura mater er en tynd membran, kan sporstofet ikke påføres bekvemt ved hjælp af injektion. I stedet blev FG direkte tilføjet på regionen omkring MMA i kraniedura mater efter den metode, der var blevet indført tidligere22,23, men man skal sørge for at holde dura mater intakt. Desuden blev der gjort en indsats for at forhindre lækage af FG til de tilstødende væv. Fordi FG-mærkningen kan observeres direkte under UV-belysning af kviksølvlampe24, kontrollerede vi ved denne tilgang stedet for FG-applikation; det blev konstateret, at ud over den neurale formering, FG var begrænset i regionen kredsede med dental silikat cement uden at forurene de omkringliggende væv. Den anden fordel er, at FG-mærkede neuroner også kan farves i den forventede farve ved hjælp af immunfluorescens med FG-antistof, hvilket gør det mere bekvemt at blive brugt sammen med andre biomarkører14,15,16. Gennem denne undersøgelse, beviste vi, at FG ikke kun passer til retrograd sporing af dural innervation, men er også en ordentlig kandidat til at kombinere med CGRP til bestemmelse af de kemiske egenskaber af FG-mærkede neuroner.

Det skal her bemærkes, at de nuværende metoder fortrinsvis anvendes til unge dyr. I den tidlige fase af rotten er kraniedura mater mere gennemsigtig i hele monteringsstilen. Denne funktion gør det mere bekvemt at visualisere den neurovaskulære struktur af kraniedura mater i et 3D-mønster uden yderligere gennemsigtig behandling.

Sammenfattende giver denne undersøgelse en værdifuld tilgang til effektivt at udforske innervationen af kraniedura mater fra de sensoriske neuroner i TG og cervikal DRGs, især undertypen af små og mellemstore sensoriske neuroner med CGRP-immunoreaktivt udtryk. Fra perspektivet af metoden, kan det give en værdifuld reference til yderligere at undersøge de andre former for nervefibre i kraniet dura mater, samt deres oprindelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af projektet national key R&d Program of China (Project Code no. 2019YFC1709103; no. 2018YFC1707804) og National Natural Science Foundation of China (Project Code no. 81774211; nr. 81774432; nr. 81801561).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L) Invitrogen by Thermo Fisher Scientific A21202 Protect from light; RRID: AB_141607
Brain stereotaxis instrument Narishige SR-50
CellSens Dimension Olympus Version 1.1 Software of fluorescent microscope
Confocal imaging system Olympus FV1200
Fluorogold (FG) Fluorochrome 52-9400 Protect from light
Fluorescent imaging system Olympus BX53
Freezing microtome Thermo Microm International GmbH
Olympus FV10-ASW 4.2a Olympus Version 4.2 Confocal image processing software system
Micro Drill Saeyang Microtech Marathon-N7
Mouse anti-CGRP Abcam ab81887 RRID: AB_1658411
Normal donkey serum Jackson ImmunoResearch 017-000-121
Phalloidin 568 Molecular Probes A12380 Protect from light
Photoshop and  Illustration Adobe CS6 Photo editing software
Rabbit anti- Fluorogold Abcam ab153 RRID: AB_90738
Sprague Dawley National Institutes for Food and Drug Control SCXK (JING) 2014-0013
Superfrost plus microscope slides Thermo #4951PLUS-001 25x75x1mm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kekere, V., Alsayouri, K. Anatomy, Head and Neck, Dura Mater. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2020).
  2. Shimizu, T., et al. Distribution and origin of TRPV1 receptor-containing nerve fibers in the dura mater of rat. Brain Research. 1173, 84-91 (2007).
  3. Jacobs, B., Dussor, G. Neurovascular contributions to migraine: moving beyond vasodilation. Neuroscience. 338, 130-144 (2016).
  4. Dodick, D. W. A phase-by-phase review of migraine pathophysiology. Headache. 58, Suppl 1 4-16 (2018).
  5. Amin, F. M., et al. Investigation of the pathophysiological mechanisms of migraine attacks induced by pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide-38. Brain: A Journal of Neurology. 137, Pt 3 779-794 (2014).
  6. Keller, J. T., Marfurt, C. F. Peptidergic and serotoninergic innervation of the rat dura mater. The Journal of Comparative Neurology. 309 (4), 515-534 (1991).
  7. Messlinger, K., Hanesch, U., Baumgärtel, M., Trost, B., Schmidt, R. F. Innervation of the dura mater encephali of cat and rat: ultrastructure and calcitonin gene-related peptide-like and substance P-like immunoreactivity. Anatomy and Embryology. 188 (3), 219-237 (1993).
  8. Lennerz, J. K., et al. Calcitonin receptor-like receptor (CLR), receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1), and calcitonin gene-related peptide (CGRP) immunoreactivity in the rat trigeminovascular system: differences between peripheral and central CGRP receptor distribution. The Journal of Comparative Neurology. 507 (3), 1277-1299 (2008).
  9. Eftekhari, S., Warfvinge, K., Blixt, F. W., Edvinsson, L. Differentiation of nerve fibers storing CGRP and CGRP receptors in the peripheral trigeminovascular system. The Journal of Pain: Official Journal of the American Pain Society. 14 (11), 1289-1303 (2013).
  10. Xu, D. S., et al. Characteristics of distribution of blood vessels and nerve fibers in the skin tissues of acupoint "Taichong" (LR3) in the rat. Zhen Ci Yan Jiu. 41 (6), 486-491 (2016).
  11. Cui, J. J., et al. The expression of calcitonin gene-related peptide on the neurons associated Zusanli (ST 36) in rats. Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (8), 630-634 (2015).
  12. Andres, K. H., von Düring, M., Muszynski, K., Schmidt, R. F. Nerve fibres and their terminals of the dura mater encephali of the rat. Anatomy and Embryology. 175 (3), 289-301 (1987).
  13. Leng, C., Chen, L., Li, C. Alteration of P2X1-6 receptor expression in retrograde Fluorogold-labeled DRG neurons from rat chronic neuropathic pain model. Biomedical Reports. 10 (4), 225-230 (2019).
  14. Huang, T. L., et al. Factors influencing the retrograde labeling of retinal ganglion cells with fluorogold in an animal optic nerve crush model. Ophthalmic Research. 51 (4), 173-178 (2014).
  15. Huang, T. L., Chang, C. H., Lin, K. H., Sheu, M. M., Tsai, R. K. Lack of protective effect of local administration of triamcinolone or systemic treatment with methylprednisolone against damages caused by optic nerve crush in rats. Experimental Eye Research. 92 (2), 112-119 (2011).
  16. Tsai, R. K., Chang, C. H., Wang, H. Z. Neuroprotective effects of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in neurodegeneration after optic nerve crush in rats. Experimental Eye Research. 87 (3), 242-250 (2008).
  17. Iyengar, S., Ossipov, M. H., Johnson, K. W. The role of calcitonin gene-related peptide in peripheral and central pain mechanisms including migraine. Pain. 158 (4), 543-559 (2017).
  18. Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology. Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).
  19. Kou, Z. Z., et al. Alterations in the neural circuits from peripheral afferents to the spinal cord: possible implications for diabetic polyneuropathy in streptozotocin-induced type 1 diabetic rats. Frontiers in neural circuits. 8, 6 (2014).
  20. Alarcon-Martinez, L., et al. Capillary pericytes express α-smooth muscle actin, which requires prevention of filamentous-actin depolymerization for detection. eLife. 7, 34861 (2018).
  21. Wang, J., et al. A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater. Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).
  22. Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. Central projections of sensory innervation of the rat superior sagittal sinus. Neuroscience. 129, 431-437 (2004).
  23. Liu, Y., Broman, J., Edvinsson, L. Central projections of the sensory innervation of the rat middle meningeal artery. Brain Research. 1208, 103-110 (2008).
  24. Schmued, L. C., Fallon, J. H. Fluoro-Gold: a new fluorescent retrograde axonal tracer with numerous unique properties. Brain Research. 377 (1), 147-154 (1986).

Tags

Neurovidenskab Problem 167 kranie dura mater mellemste meningeal arterie calcitonin genrelateret peptid neural sporingsteknik fluorogold
Visualisering af Calcitonin Gene-Related Peptid Immunoreactive Innervation af Rat Cranial Dura Mater med immunfluorescens og neural sporing
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, J., Xu, D., Cui, J., She, C.,… More

Wang, J., Xu, D., Cui, J., She, C., Wang, H., Wu, S., Zou, L., Zhang, J., Bai, W. Visualizing the Calcitonin Gene-Related Peptide Immunoreactive Innervation of the Rat Cranial Dura Mater with Immunofluorescence and Neural Tracing. J. Vis. Exp. (167), e61742, doi:10.3791/61742 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter