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Neuroscience

इम्यूनोफ्लोरेसेंस और न्यूरल ट्रेसिंग के साथ चूहा कपाल ड्यूरा मेटर के कैल्सिटोनिन जीन से संबंधित पेप्टाइड इम्यूनोरेएक्टिव इनरवेशन की कल्पना करना

Published: January 6, 2021 doi: 10.3791/61742
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences
* These authors contributed equally

Summary

यहां हम क्रमशः सीजीआरपी और फालोइडिन के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस और फ्लोरोसेंट हिस्टोकेमिस्ट्री का उपयोग करके कपाल ड्यूरा मेटर में कैल्सिटोनिन जीन से संबंधित पेप्टाइड (सीजीआरपी) के स्थानिक सहसंबंध की कल्पना करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इसके अलावा, इन तंत्रिका फाइबर की उत्पत्ति एक फ्लोरोसेंट तंत्रिका ट्रेसर के साथ पता लगाया प्रतिगामी था।

Abstract

इस अध्ययन का उद्देश्य इम्यूनोफ्लोरेसेंस, त्रि-आयामी (3 डी) पुनर्निर्माण और प्रतिगामी अनुरेखण तकनीक का उपयोग करके कपाल ड्यूरा मेटर के कैल्शियम युक्त पेप्टाइड (सीजीआरपी)-इम्यूनोरेएक्टिव संवेदी तंत्रिका फाइबर के वितरण और उत्पत्ति की जांच करना था। यहां, तंत्रिका फाइबर और रक्त वाहिकाओं को क्रमशः सीजीआरपी और फ्लोरोसेंट फ्लोइडिन के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस और हिस्टोकेमिस्ट्री तकनीकों का उपयोग करके दाग दिया गया था। ड्यूरल सीजीआरपी-इम्यूरएक्टिव तंत्रिका फाइबर और रक्त वाहिकाओं के स्थानिक सहसंबंध को 3 डी पुनर्निर्माण द्वारा प्रदर्शित किया गया था। इस बीच, सीजीआरपी-इम्यूनोरेएक्टिव तंत्रिका फाइबर की उत्पत्ति का पता फ्लोरोगोल्ड (एफजी) के साथ तंत्रिका अनुरेखण तकनीक द्वारा कपाल ड्यूरा मेटर में ट्राइजेमिनल गैंगलियन (टीजी) और ग्रीवा (सी) डोरसल रूट गैंगलिया (डीआरजी) के लिए मध्य मेनिंगियल धमनी (एमएमए) के आसपास के क्षेत्र से लगाया गया था। इसके अलावा टीजी और डीआरजी में एफजी लेबल वाले न्यूरॉन्स की रासायनिक विशेषताओं की भी डबल इम्यूनोफ्लोरेसेंस का इस्तेमाल करते हुए सीजीआरपी के साथ मिलकर जांच की गई । पारदर्शी पूरे माउंट नमूने और 3 डी पुनर्निर्माण का लाभ उठाते हुए, यह दिखाया गया कि सीजीआरपी-इम्यूनोरेएक्टिव तंत्रिका फाइबर और फालोइडिन-लेबल वाले धमनियों को एक साथ चलाते हैं या अलग से 3 डी दृश्य में एक ड्यूरल न्यूरोवैस्कुलर नेटवर्क बनाते हैं, जबकि एफजी लेबल वाले न्यूरॉन्स टीजी की नेत्र, मैक्सिलरी और मंडीबुलर शाखाओं में पाए गए, साथ ही सी 2-3 डीआरजी इप्लीटरल को ट्रेसर एप्लीकेशन के पक्ष में पाया गया जिसमें कुछ एफजी-लेबल वाले न्यूरॉन्स सीजीआरपी-इम्यूनोरेएक्टिव एक्सप्रेशन के साथ प्रस्तुत किए गए । इन दृष्टिकोणों के साथ, हमने कपाल ड्यूरा मेटर में रक्त वाहिकाओं के आसपास सीजीआरपी-इम्यूनोरेएक्टिव तंत्रिका फाइबर की वितरणात्मक विशेषताओं के साथ-साथ टीजी और डीआरजी से इन तंत्रिका फाइबर की उत्पत्ति का प्रदर्शन किया। कार्यप्रणाली के नजरिए से, यह शारीरिक या रोग स्थिति के तहत कपाल ड्यूरा मेटर की जटिल न्यूरोवैस्कुलर संरचना को समझने के लिए एक मूल्यवान संदर्भ प्रदान कर सकता है।

Introduction

कपाल ड्यूरा मेटर मस्तिष्क की रक्षा के लिए मेनिंग्स की सबसे बाहरी परत है और इसमें बहुतायत से रक्त वाहिकाएं और विभिन्न प्रकार के तंत्रिका तंतुओं होते हैं1,2. कई अध्ययनों से पता चला है कि संवेदनशील कपाल ड्यूरा मेटर सिर दर्द की घटना के लिए अग्रणी कारक हो सकता है, जिसमें असामान्य वासोडिलेशन और इनरवेशन3,4,5शामिल हैं। इस प्रकार, कपाल ड्यूरा मेटर में न्यूरोवैस्कुलर संरचना का ज्ञान सिरदर्द के रोगजनन को समझने के लिए महत्वपूर्ण है, विशेष रूप से माइग्रेन के लिए।

यद्यपि ड्यूरा इनरवेशन का पहले पारंपरिक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के साथ अध्ययन किया गया है, लेकिन कपाल ड्यूरा मेटर में तंत्रिका फाइबर और रक्त वाहिकाओं के स्थानिक सहसंबंध का कम अध्ययन किया गया6,7,8,9। अधिक विस्तार से ड्यूरल न्यूरोवैस्कुलर संरचना को प्रकट करने के लिए, कैल्शियम जीन से संबंधित पेप्टाइड (सीजीआरपी) और फालोइडिन को क्रमशः इम्यूनोफ्लोरेसेंस और फ्लोरोसेंट हिस्टोकेमिस्ट्री10के साथ पूरे माउंट कपाल ड्यूरा मेटर में ड्यूरल तंत्रिका फाइबर और रक्त वाहिकाओं को धुंधला करने के लिए मार्कर के रूप में चुना गया था । न्यूरोवैस्कुलर संरचना के त्रि-आयामी (3 डी) दृश्य प्राप्त करने के लिए यह एक इष्टतम विकल्प हो सकता है। इसके अतिरिक्त, फ्लोरोगोल्ड (एफजी) को सीजीआरपी-इम्यूनोरेएक्टिव तंत्रिका फाइबर की उत्पत्ति निर्धारित करने के लिए कपाल ड्यूरा मेटर में मध्य मेनिंगियल धमनी (एमएमए) के आसपास के क्षेत्र पर लागू किया गया था, और ट्राइजेमिनल गैंगलियन (टीजी) और सर्वाइकल (सी) पृष्ठीय रूट गंगलिया (DRGs) का पता लगाया गया था, जबकि एफजी-लेबल वाले न्यूरॉन्स को इम्यूनोफ्लोरेंस का उपयोग करके सीजीआरपी के साथ एक साथ जांच की गई थी।

इस अध्ययन का उद्देश्य सीजीआरपी-इम्यूनोरेएक्टिव इनरवेशन और इसकी उत्पत्ति के लिए कपाल ड्यूरा मेटर में न्यूरोवैस्कुलर संरचना की जांच के लिए एक प्रभावी उपकरण प्रदान करना था। पारदर्शी पूरे माउंट ड्यूरा मेटर का लाभ उठाकर और इम्यूनोफ्लोरेसेंस, प्रतिगामी ट्रेसिंग, कॉन्फोकल तकनीक और 3 डी पुनर्निर्माण के संयोजन से, हमें कपाल ड्यूरा मेटर में न्यूरोवैस्कुलर संरचना का एक उपन्यास 3 डी दृश्य पेश करने की उम्मीद थी। इन पद्धतिगत दृष्टिकोणों को विभिन्न सिरदर्दों के रोगजनन की खोज के लिए आगे परोसा जा सकता है।

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Protocol

इस अध्ययन को इंस्टीट्यूट ऑफ एक्यूपंक्चर एंड मोक्सीबुशन, चाइना एकेडमी ऑफ चाइनीज मेडिकल साइंसेज (रेफरेंस नंबर D2018-09-29-1) की एथिक्स कमेटी ने मंजूरी दी थी । सभी प्रक्रियाओं की देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए स्वास्थ्य गाइड के राष्ट्रीय संस्थानों के अनुसार आयोजित किया गया (राष्ट्रीय अकादमी प्रेस, वाशिंगटन, डी.C, १९९६) । इस अध्ययन में बारह वयस्क स्प्राग-डावले पुरुष चूहों (वजन 220 ± 20 ग्राम) का उपयोग किया गया था। राष्ट्रीय खाद्य एवं औषधि नियंत्रण संस्थान द्वारा पशु [लाइसेंस संख्या एससीएक्सके (जेइंग) 2017-0005] प्रदान किए गए थे ।

1. चूहे कपाल ड्यूरा मेटर का इनरवेशन

  1. परफ्यूजन
    1. इंट्रापेरिटोनली इच्छामृत्यु को प्रेरित करने के लिए चूहे को ट्राइब्रोमोथेनॉल समाधान (250 मिलीग्राम/किलो) का ओवरडोज इंजेक्ट करें।
    2. एक बार सांस बंद हो जाती है, तो 0.9% सामान्य खारा के 100 मिली लीटर के साथ ट्रांसकार्डेल रूप से व्याप्त होता है और इसके बाद 0.1 एम फॉस्फेट बफर (पीबी, पीएच 7.4) में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के 250-300 एमएल के बाद।
    3. परफ्यूजन के बाद, सिर की त्वचा को हटा दें और मस्तिष्क के ड्यूरा मेटर और पृष्ठीय पक्ष को बेनकाब करने के लिए खोपड़ी खोलें। फिर पूरे माउंट पैटर्न(चित्रा 1)में घ्राण बल्ब के साथ कपाल ड्यूरा मेटर को विच्छेदन करें। 2 घंटे के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में पोस्ट-फिक्सेशन करें, और फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे से अधिक के लिए 0.1 मीटर पीबी में 25% सुक्रोज में क्रायोप्रोटेक्ट करें।
  2. सीजीआरपी और फालोइडिन लेबलिंग के लिए फ्लोरेसेंस इम्यूनोइस्टोकेमिस्ट्री
    नोट: सीजीआरपी और फालिडिन के फ्लोरोसेंट स्टेनिंग का एक संयोजन पूरे माउंट पैटर्न में चूहे कपाल ड्यूरा मेटर में ड्यूरल तंत्रिका फाइबर और रक्त वाहिकाओं के स्थानिक संबंध को प्रकट करने के लिए लागू किया गया था।
    1. लगभग 1 मिनट के लिए 0.1 एम पीबी में कपाल ड्यूरा मेटर कुल्ला।
    2. 30 मिनट के लिए 0.1 एम पीबी में 3% सामान्य गधे सीरम और 0.5% ट्राइटन एक्स-100 वाले अवरुद्ध समाधान में ड्यूरा मेटर को इनक्यूबेट करें।
    3. ड्यूरा मेटर को माउस एंटी-सीजीआरपी एंटीबॉडी (1:1000) में 0.1 एम पीबी में स्थानांतरित करें जिसमें 1% सामान्य गधा सीरम और 0.5% ट्राइटन एक्स-100 रात भर 4 डिग्री सेल्सियस11पर होता है।
    4. अगले दिन 01 एम पीबी में तीन बार ड्यूरा मेटर धोएं।
    5. गधे विरोधी माउस एलेक्सा फ्लोर 488 माध्यमिक एंटीबॉडी (1:500) और 0.1 एम पीबी में 568 (1:1000) के मिश्रित समाधान में ड्यूरा मेटर को इनक्यूबेट करें जिसमें 1% सामान्य गधा सीरम और 0.5% ट्राइटन एक्स-100 तापमान कक्ष (26 डिग्री सेल्सियस) पर 1.5 एच के लिए है।
    6. 01 एम पीबी में तीन बार ड्यूरा मेटर धोएं।
    7. किनारों को ट्रिम करें और इसे माइक्रोस्कोप स्लाइड पर माउंट करें (सामग्री की तालिकादेखें)।
    8. अवलोकन से पहले 50% ग्लिसरीन के साथ कवरस्लिप पर रखो।
  3. अवलोकन और रिकॉर्डिंग
    1. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप या कॉन्फोकल इमेजिंग सिस्टम के तहत फ्लोरोसेंट नमूनों का निरीक्षण करें।
    2. डिजिटल कैमरा (4x, एनए: 0.13) से लैस फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप द्वारा पूरे माउंट ड्यूरा मेटर की छवियों को लें, और 500 एमएस के एक्सपोजर समय का उपयोग करें। ड्यूरा मेटर की छवि मोज़ेक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप (सामग्रीकी तालिका देखें) के एक सॉफ्टवेयर के साथ पूरी की गई थी।
    3. एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके ड्यूरा मेटर में सीजीआरपी-इम्यूनोरेएक्टिव तंत्रिका फाइबर और फ्लोलोइडिन-लेबल रक्त वाहिकाओं की छवियां लें। उत्तेजन और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य 488 एनएम (हरा) और 594 एनएम (लाल) थे। कॉन्फोकल पिनहोल 110 (20x) और 105 माइक्रोन (40x) है। इमेज कैप्चर का रेजोल्यूशन 640 x 640 पिक्सल है।
    4. प्रत्येक 40 माइक्रोन मोटी अनुभाग से 2 माइक्रोन फ्रेम में 20 छवियों को कैप्चर करें और 3डी विश्लेषण के लिए एक कॉन्फोकल इमेज प्रोसेसिंग संबद्ध सॉफ्टवेयर सिस्टम के साथ एकल इन-फोकस इमेज इंटीग्रेशन करें: सेट स्टार्ट फोकल प्लेन | सेट एंड फोकल प्लेन | | चरण आकार निर्धारित करें गहराई पैटर्न | चुनें इमेज कैप्चर | जेड श्रृंखला।
    5. दृश्य को अनुकूलित करने के लिए छवियों की चमक और विपरीत को समायोजित करने के लिए एक फोटो संपादन सॉफ्टवेयर का उपयोग करें। छवियों से कोई डेटा न निकालने पर ध्यान दें।

2. एफजी के साथ प्रतिगामी ट्रेसिंग अध्ययन

  1. सर्जिकल प्रक्रियाएं
    1. चूहे कपाल ड्यूरा मेटर में रुचि के समन्वय क्षेत्र का निर्धारण करें।
    2. 10 माइक्रो-सिरिंज तैयार करें और लिक्विड पैराफिन से इसका परीक्षण करें।
    3. इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन के माध्यम से ट्राइब्रोमोथेनॉल समाधान (150 मिलीग्राम/किलो) के साथ चूहों को एनेस्थेटाइज करें। अंगुली चुटकी के लिए प्रतिक्रिया की कमी से संज्ञाहरण में गहराई के लिए जांच करें ।
    4. एक बिजली के उस्तरा के साथ चूहे के सिर दाढ़ी।
    5. चूहे को कुंद कान सलाखों रखो और स्टीरियोटैक्सिक डिवाइस पर जगह है। इसके बाद मुखधारक को लगाएं और आंखों पर नेत्र मरहम लगाएं।
    6. सिर की त्वचा की सर्जिकल साइट को 10% पोविडोन आयोडीन का उपयोग करके साफ करें और इसके बाद 75% इथेनॉल।
    7. खोपड़ी के मिडलाइन के साथ एक चीरा बनाओ।
    8. स्पष्ट रूप से बाँझ कपास इत्तला दे दी applicators(चित्रा 1A)का उपयोग कर खोपड़ी से दूर periosteum और मांसपेशियों के ऊतकों को हटा दें ।
    9. एमएमए12के ऊपर बाएं पैरीटल और लौकिक हड्डियों पर एक गोल टिप बिट (#106) के साथ एक बर्र ड्रिल का उपयोग करके एक छोटा छेद (~ 5-7 मिमी) ड्रिल करें, और सुनिश्चित करें कि कपाल ड्यूरा मेटर को बरकरार रखा गया था(चित्रा 1 बी)।
    10. ट्रेसर(चित्रा 1C)के प्रसार को सीमित करने के लिए दंत सिलिकेट सीमेंट के साथ छेद के चारों ओर एक बैंक का निर्माण करें।
    11. एमएमए के आसपास छेद में 2% एफजी के 2 माइक्रोल जोड़ें 10 माइक्रो-सिरिंज(चित्रा 1D)के साथ।
    12. छेद को हीमोस्टेटिक स्पंज के एक छोटे से टुकड़े से कवर करें।
    13. छेद पर पैराफिन फिल्म का एक टुकड़ा रखो और ट्रेसर के रिसाव को रोकने के लिए और आसपास के ऊतकों को दूषित से बचने के लिए हड्डी मोम के साथ किनारों सील।
    14. बाँझ धागे के साथ घाव सीवन।
    15. चूहों को गर्म क्षेत्र में तब तक रखें जब तक कि वे पूरी तरह से ठीक न हो जाए।
    16. चूहों को उनके पिंजरों में वापस लौटाएं और पीने के पानी में एक एंटीबायोटिक और एनाल्जेसिक जोड़ें।
  2. परफ्यूजन और सेक्शन
    1. 7 जीवित रहने के दिनों के बाद, धारा 1.1 में प्रक्रियाओं में ऊपर उल्लिखित इन चूहों को छिद्रित करें।
    2. टीजी और सी 1-4 डीआरजी को विच्छेदन करें, फिर पोस्ट-फिक्स करें और उन्हें धारा 1.1.3(चित्रा 1F)में उल्लिखित के रूप में क्रायोप्रोटेक्ट करें।
    3. सागिटल दिशा में क्रायोस्टेट माइक्रोटॉम सिस्टम पर 30 माइक्रोम की मोटाई पर टीजी और डीआरजी को काटें और सिलेन-लेपित ग्लास स्लाइड पर चढ़कर।
  3. टीजी और डीआरजी में एफजी और सीजीआरपी-लेबलिंग के लिए डबल इम्यूनोफ्लोरेसेंस
    नोट: हालांकि एफजी-लेबलिंग को सीधे पारा लैंप के तहत यूवी रोशनी के साथ देखा जा सकता है बिना अतिरिक्त धुंधला13,14,15,16,एफजी के साथ लेबल किए गए न्यूरॉन्स को टीजी और डीआरजी में ड्यूरल सीजी-इम्यूनोरेएक्टिव तंत्रिका फाइबर की उत्पत्ति का खुलासा करने के लिए एफजी और सीजीआरपी के साथ डबल इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके टीजी और सर्वाइकल डीआरजी में आगे की जांच की गई।
    1. हिस्टोकेमिकल पेन से सेक्शन को सर्कल करें।
    2. 0.1 एम पीबी में 3% सामान्य गधे सीरम और 0.5% ट्राइटन एक्स-100 वाले अवरुद्ध समाधान में 30 मिनट के लिए वर्गों को इनक्यूबेट करें।
    3. नमूनों को खरगोश विरोधी फ्लोरोगोल्ड (1:1000) और माउस एंटी-सीजीआरपी एंटीबॉडी (1:1000) के समाधान में 0.1 एम पीबी में स्थानांतरित करें जिसमें 1% सामान्य गधा सीरम और 0.5% ट्राइटन एक्स-100 रात 4 डिग्री सेल्सियस पर होता है।
    4. अगले दिन 0.1 एम पीबी में तीन बार अनुभागों को धोएं।
    5. गधे विरोधी खरगोश एलेक्सा फ्लोर 594 (1:500) और गधे विरोधी माउस एलेक्सा फ्लोर 488 (1:500) माध्यमिक एंटीबॉडी के मिश्रित समाधान में 0.1 एम पीबी में 1% सामान्य गधा सीरम और 0.5% ट्राइटन एक्स-100 के मिश्रित समाधान में 1.5 एच के लिए कमरे के तापमान पर।
    6. चरण 1.2.6 और 1.2.8 में प्रक्रियाओं के रूप में वर्गों पर कवर्लिप्स को धोएं और लागू करें।
  4. अवलोकन और रिकॉर्डिंग
    1. डिजिटल कैमरे से लैस फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप द्वारा यूवी रोशनी के तहत टीजी और डीआरजी में एफजी-लेबल न्यूरॉन्स की छवियां लें।
    2. डिजिटल कैमरे से लैस फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत टीजी और डीआरजी में एफजी और सीजीआरपी लेबल वाले न्यूरॉन्स की छवियों को कैप्चर करें।
    3. छवियों की चमक और विपरीत को समायोजित करने और चित्रों में लेबल जोड़ने के लिए संपादन सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।

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Representative Results

कपाल ड्यूरा मेटर की न्यूरोवैस्कुलर संरचना
सीजीआरपी और फालोडिन के साथ इम्यूनोफ्लोरोसेंट और फ्लोरोसेंट हिस्टोकेमिकल धुंधला होने के बाद, सीजीआरपी-इम्यूनोरेएक्टिव तंत्रिका फाइबर और फालोडिन-लेबल ड्यूरल धमनियों और कनेक्टिव ऊतकों को 3डी पैटर्न(चित्रा 2 सी,डी, ई, एफ)में पूरे माउंट कपाल ड्यूरा मेटर में स्पष्ट रूप से प्रदर्शित किया गया था। यह दिखाया गया था कि मोटी और पतली सीजीआरपी-इम्यूनोरेएक्टिव तंत्रिका फाइबर दोनों ड्यूरल धमनियों के समानांतर, संवहनी दीवार के चारों ओर, या रक्त वाहिकाओं के बीच(चित्रा 2D,ई, एफ)चलते हैं। 3 डी पुनर्निर्माण का लाभ उठाकर, ड्यूरल धमनियों की आकृति विज्ञान और ड्यूरल सीजीआरपी-इम्यूनोरेएक्टिव तंत्रिका फाइबर और धमनियों के स्थानिक सहसंबंध को विभिन्न दृष्टिकोणों से स्पष्ट रूप से प्रदर्शित किया जा सकता है।

टीजी और डीआरजी में प्रतिगामी लेबल न्यूरॉन्स
चूहा कपाल ड्यूरा मेटर(चित्रा 3 ए)में एमएमए के क्षेत्र में एफजी आवेदन के सात दिन बाद, ट्रेसर एप्लिकेशन के इप्सिलाटेरल साइड पर टीजी और सर्वाइकल डीआरजी में एफजी-लेबल न्यूरॉन्स का पता चला, जिसे सीधे फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी(चित्रा 3 बी,सी)की यूवी रोशनी के तहत देखा गया था। एफजी लेबल न्यूरॉन्स नेत्र (V1) और अधिकतम (V2) डिवीजनों पर उच्च एकाग्रता के साथ टीजी की सभी तीन शाखाओं में पाया गया, और मंडीबुलर डिवीजन (V3)(चित्रा 3B)पर कम के साथ । इस बीच, सी 2-3 डीआरजी(चित्रा3 सी) में कुछ एफजी-लेबल न्यूरॉन्स भी देखे गए।

इसके अलावा टीजी और सर्वाइकल डीआरजी के सेक्शनों पर एफजी और सीजीआरपी के साथ डबल इम्यूनोफ्लोरेसेंस भी किया गया। टीजी और डीआरजी में सीजीआरपी-इम्यूनोरेएक्टिव न्यूरॉन्स के व्यास के अनुसार, उनमें से अधिकांश मुख्य रूप से छोटे और मध्यम व्यास संवेदी न्यूरॉन्स (<50 माइक्रोन) में पाए गए थे। सीजीआरपी-इम्यूनोएक्टिव न्यूरॉन्स के इन प्रकार के कुछ भी टीजी और सी 2-3 DRGs में एफजी के साथ लेबल थे, यह दर्शाता है कि कपाल ड्यूरा मेटर में CGRP-इम्यूनोरीटेक्टिव तंत्रिका फाइबर टीजी और DRGs(चित्रा 4)में संवेदी न्यूरॉन्स के इन उपजनसंख्या से उत्पन्न हुआ ।

Figure 1
चित्र 1-वर्तमान अध्ययन में मुख्य प्रायोगिक विचारों की तस्वीरें। (A)खोपड़ी के मध्य रेखा के साथ एक चीरा । (ख)कपाल ड्यूरा मेटर के ऊपर एक छेद जो मिडिल मेनिंगियल धमनी (एमएमए) दिखाता है । (ग)छेद के चारों ओर एक छोटा सा बैंक कपाल ड्यूरा मेटर पर ट्रेसर के आवेदन के लिए दंत सिलिकेट सीमेंट के साथ परिक्रमा की । (घ)माइक्रो-सिरिंज के साथ छेद में फ्लोरोगोल्ड (एफजी) का आवेदन। (ई)पारदर्शी पूरे माउंट ड्यूरा मेटर । (च)ट्राइजेमिनल गैंगलियन (टीजी) का बाहर का दृश्य । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2-कैल्सिटोनिन जीन से संबंधित पेप्टाइड (सीजीआरपी) के बीच सहसंबंध- इम्यूनोरेएक्टिव तंत्रिका फाइबर और फालोइडिन (फा) - पूरे माउंट कपाल ड्यूरा मेटर पर लेबल वाली धमनियां। (ख)पूरे माउंट ड्यूरा मेटर चपटा और स्लाइड पर घुड़सवार था । (ग)मध्य मेनिंगियल धमनी (एमएमए) के साथ सीजीआरपी-इम्यूनोरेएक्टिव तंत्रिका फाइबर और फा-लेबल रक्त वाहिकाओं का वितरण। (D,E) पैनल सी में डी और ई के एक ही क्षेत्रों से बढ़ाया तस्वीरें(एफ)एक 3 डी पैटर्न में फ्रेम के साथ पैनल ई से बढ़ाया और समायोजित छवियों । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3-फ्लोरोगोल्ड (एफजी) का वितरण - यूवी रोशनी के तहत ट्राइजेमिनल गैंगलियन (टीजी) और सर्वाइकल (सी) पृष्ठीय रूट गैंगलियन (डीआरजी) में लेबल किए गए न्यूरॉन्स। (ख)टीजी की नेत्र (वी 1), मैक्सिलरी (वी2) और मंडीबुलर (वी3) शाखाओं में एफजी-लेबल वाले न्यूरॉन्स का वितरण। 1)सी 2 डीआरजी में वितरित एफजी लेबल वाले न्यूरॉन्स का वितरण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:प्रतिनिधि तस्वीरें ट्राइजेमिनल गैंगलियन (टीजी) और सर्वाइकल डॉरसल रूट गैंगलियन (डीआरजी) में फ्लोरोगोल्ड (एफजी) और कैल्सिटोनिन जीन से संबंधित पेप्टाइड (सीजीआरपी) के साथ डबल इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके लेबल वाले संवेदी न्यूरॉन्स को दिखा रही हैं।(ए, बी)एफजी के साथ लेबल किए गए न्यूरॉन्स, सीजीआरपी, और एफजी और सीजीआरपी दोनों को क्रमशः टीजी (ए) और डीआरजी (बी) में लाल, हरे और पीले रंग में प्रदर्शित किया गया था। (A1-B1), (A2-B2): पैनल ए और बी को अलग से एफजी-लेबलिंग (A1, B1) और सीजीआरपी-लेबलिंग (A2, B2) के साथ दिखाया गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस अध्ययन में, हमने इम्यूनोफ्लोरेसेंस, 3 डी पुनर्निर्माण और सीजीआरपी एंटीबॉडी और एफजी तंत्रिका ट्रेसर के साथ तंत्रिका अनुरेखण दृष्टिकोण का उपयोग करके कपाल ड्यूरा मेटर में सीजीआरपी-इम्यूनोरेएक्टिव तंत्रिका फाइबर के वितरण और उत्पत्ति का सफलतापूर्वक प्रदर्शन किया है, जो ड्यूरल न्यूरोवैस्कुलर नेटवर्क को बेहतर ढंग से समझने के लिए हिस्टोलॉजिकल और रासायनिक साक्ष्य प्रदान करते हैं।

जैसा कि ज्ञात था, सीजीआरपी माइग्रेन4,17के रोगजनन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यह दिखाया गया कि सीजीआरपी में वृद्धि से ट्राइजेमिनल पाथवे4,18के साथ परिधीय और केंद्रीय संवेदीकरण का कारण बन सकता है । सीजीआरपी-इम्यूनोरेएक्टिव तंत्रिका फाइबर बिना किसी मान्यता वाले संकेतों के परिवहन के लिए जिम्मेदार अउम्मीदव पेप्टिडेर्गिक संवेदी अक्षों से संबंधित हैं19। पिछले अध्ययनों के अनुरूप होने के नाते, यहां, हमने स्पष्ट रूप से कपाल ड्यूरा मेटर में सीजीआरपी-इम्यूनोरेएक्टिव तंत्रिका फाइबर के वितरण का प्रदर्शन किया और टीजी और डीआरजी में छोटे और मध्यम व्यास संवेदी न्यूरॉन्स से उनकी उत्पत्ति का पता लगाया। ये सेलुलर संरचनाएं सीजीआरपी को संश्लेषित करने और जारी करने के लिए स्रोत हो सकती हैं। दूसरी ओर, फालोइडिन फिलामेंटस ऐक्टिन (एफ-ऐक्टिन) के लिए एक विशिष्ट जांच है जो चिकनी मांसपेशियों और एंडोथेलियल कोशिकाओं में प्रचुर मात्रा में है। एक उचित उम्मीदवार के रूप में,10,20, 21संवहनी संरचनाओं और संयोजी ऊतकों को लेबल करने के लिए पीएलोइडिन का उपयोग कियागयाथा। हमारे हालिया अध्ययन से पता चला है कि, अल्फा चिकनी मांसपेशी ऐक्टिन और सीडी 31 के विपरीत, फालोडिन ड्यूरल धमनी को धुंधला करने के लिए अधिक विश्वसनीय और संवेदनशील है, और कपाल न्यूरोवैस्कुलर नेटवर्क का विस्तार से प्रदर्शन करने के लिए सीजीआरपी के साथ गठबंधन करने के लिए इष्टतम है, जिसे10,21प्रकाशित किया गया है।

तंत्रिका पथ ट्रेसिंग तकनीक तंत्रिका मूल और समाप्ति की जांच करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है। वर्तमान अध्ययन में, एफजी का उपयोग कपाल ड्यूरा मेटर में सीजीआरपी-इम्यूनोरिएक्टिव तंत्रिका फाइबर की उत्पत्ति का पता लगाने के लिए किया गया था। चूंकि कपाल ड्यूरा मेटर एक पतली झिल्ली है, इसलिए इंजेक्शन के माध्यम से ट्रेसर को आसानी से लागू नहीं किया जा सकता है। इसके बजाय, एफजी सीधे कपाल ड्यूरा मेटर में एमएमए के आसपास के क्षेत्र पर विधि है कि पहले22,23शुरू किया गया था के अनुसार जोड़ा गया था, लेकिन देखभाल के लिए ड्यूरा मेटर बरकरार रखने के लिए लिया जाना चाहिए । इसके अलावा अगल-बगल के ऊतकों में एफजी के रिसाव को रोकने का प्रयास किया गया। क्योंकि एफजी-लेबलिंग सीधे पारा दीपक24की यूवी रोशनी के तहत देखा जा सकता है, इस दृष्टिकोण से, हमने एफजी आवेदन की साइट की जांच की; यह पाया गया कि तंत्रिका प्रचार के अलावा, एफजी आसपास के ऊतकों को दूषित किए बिना दंत सिलिकेट सीमेंट के साथ परिक्रमा क्षेत्र में सीमित था । दूसरा लाभ यह है कि एफजी-लेबल वाले न्यूरॉन्स को एफजी एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके अपेक्षित रंग में भी दाग दिया जा सकता है,जिससे अन्य बायोमार्कर14, 15,16के साथ उपयोग किया जाना अधिक सुविधाजनक होजाताहै। इस अध्ययन के माध्यम से, हमने साबित कर दिया कि एफजी न केवल ड्यूरल इनरवेशन का पता लगाने के लिए फिट बैठता है बल्कि एफजी-लेबल न्यूरॉन्स की रासायनिक विशेषताओं का निर्धारण करने के लिए सीजीआरपी के साथ गठबंधन करने के लिए एक उचित उम्मीदवार भी है।

यहां यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि वर्तमान तरीकों का उपयोग युवा जानवरों के लिए अधिमानतः किया जाता है। चूहे के शुरुआती चरण में, कपाल ड्यूरा मेटर पूरे माउंट शैली में अधिक पारदर्शी है। यह सुविधा आगे पारदर्शी इलाज के बिना 3 डी पैटर्न में कपाल ड्यूरा मेटर की न्यूरोवैस्कुलर संरचना की कल्पना करना अधिक सुविधाजनक बनाती है।

संक्षेप में, वर्तमान अध्ययन टीजी और सर्वाइकल डीआरजी में संवेदी न्यूरॉन्स से कपाल ड्यूरा मेटर के इनरवेशन का प्रभावी ढंग से पता लगाने के लिए एक मूल्यवान दृष्टिकोण प्रदान करता है, विशेष रूप से सीजीआरपी-इम्यूनोरेएक्टिव अभिव्यक्ति के साथ छोटे और मध्यम व्यास वाले संवेदी न्यूरॉन्स का उपप्रकार। कार्यप्रणाली के नजरिए से, यह कपाल ड्यूरा मेटर में अन्य प्रकार के तंत्रिका फाइबर के साथ-साथ उनके मूल की जांच करने के लिए एक मूल्यवान संदर्भ प्रदान कर सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन को चीन के राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान एवं विकास कार्यक्रम (परियोजना कोड संख्या 2019YFC1709103; संख्या 2018YFC1707804) और नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (प्रोजेक्ट कोड नंबर 81774211; नंबर 81774432; नंबर 81801561) द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L) Invitrogen by Thermo Fisher Scientific A21202 Protect from light; RRID: AB_141607
Brain stereotaxis instrument Narishige SR-50
CellSens Dimension Olympus Version 1.1 Software of fluorescent microscope
Confocal imaging system Olympus FV1200
Fluorogold (FG) Fluorochrome 52-9400 Protect from light
Fluorescent imaging system Olympus BX53
Freezing microtome Thermo Microm International GmbH
Olympus FV10-ASW 4.2a Olympus Version 4.2 Confocal image processing software system
Micro Drill Saeyang Microtech Marathon-N7
Mouse anti-CGRP Abcam ab81887 RRID: AB_1658411
Normal donkey serum Jackson ImmunoResearch 017-000-121
Phalloidin 568 Molecular Probes A12380 Protect from light
Photoshop and  Illustration Adobe CS6 Photo editing software
Rabbit anti- Fluorogold Abcam ab153 RRID: AB_90738
Sprague Dawley National Institutes for Food and Drug Control SCXK (JING) 2014-0013
Superfrost plus microscope slides Thermo #4951PLUS-001 25x75x1mm

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References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 167 कपाल ड्यूरा मेटर मिडिल मेनिंगियल धमनी कैल्सिटोनिन जीन से संबंधित पेप्टाइड न्यूरल ट्रेसिंग तकनीक फ्लोरोगोल्ड
इम्यूनोफ्लोरेसेंस और न्यूरल ट्रेसिंग के साथ चूहा कपाल ड्यूरा मेटर के कैल्सिटोनिन जीन से संबंधित पेप्टाइड इम्यूनोरेएक्टिव इनरवेशन की कल्पना करना
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