Summary
Qui presentiamo un protocollo per visualizzare la correlazione spaziale delle fibre nervose immunoreattive peptidiche (CGRP) e dei vasi sanguigni correlati al gene calcitonina nel dura mater cranico usando rispettivamente immunofluorescenza e istochimica fluorescente con CGRP e phalloidina. Inoltre, l'origine di queste fibre nervose è stata tracciata retrogradamente con un tracciante neurale fluorescente.
Abstract
Lo scopo di questo studio era quello di esaminare la distribuzione e l'origine delle fibre nervose sensoriali immunoreattive del peptide (CGRP) immunoreattive del basamento cranico utilizzando l'immunofluorescenza, la ricostruzione tridimensionale (3D) e la tecnica di tracciamento retrogrado. Qui, le fibre nervose e i vasi sanguigni sono stati macchiati usando rispettivamente immunofluorescenza e tecniche istochimiche con CGRP e falloidina fluorescente. La correlazione spaziale delle fibre nervose durali CGRP-immuoreattive e dei vasi sanguigni è stata dimostrata dalla ricostruzione 3D. Nel frattempo, l'origine delle fibre nervose immunoreattive CGRP sono state rilevate con la tecnica di tracciamento neurale con fluorogold (FG) dall'area intorno all'arteria meningea media (MMA) nella dura mater cranica al ganglio trigeminale (TG) e gangli della radice dorsale cervicale (C). Inoltre, sono state esaminate anche le caratteristiche chimiche dei neuroni etichettati FG nei TG e nei DRG insieme al CGRP utilizzando doppie immunofluorescenze. Sfruttando il campione trasparente a montaggio intero e la ricostruzione 3D, è stato dimostrato che le fibre nervose immunoreattive CGRP e le arteriole etichettate con phalloidina corrono insieme o formano separatamente una rete neurovascolare uditivo in una vista 3D, mentre i neuroni etichettati FG sono stati trovati nei rami oftalmico, mascellare e mandibolare del TG, così come nei DRG C2-3 ipsilateral sul lato dell'applicazione del tracciante in cui alcuni dei neuroni etichettati FG presentavano espressione immunoreattiva CGRP. Con questi approcci, abbiamo dimostrato le caratteristiche distributivi delle fibre nervose immunoreattive CGRP intorno ai vasi sanguigni nella dura madre cranico, così come l'origine di queste fibre nervose da TG e DRG. Dal punto di vista metodologico, può fornire un prezioso riferimento per comprendere la complicata struttura neurovascolare del dura mater cranicio sotto la condizione fisiologica o patologica.
Introduction
Il dura mater cranico è lo strato più esterno di meningi per proteggere il cervello e contiene abbondanti vasi sanguigni e diversi tipi di fibre nervose1,2. Molti studi hanno dimostrato che la dura mater cranici sensibilizzata può essere il fattore chiave che porta al verificarsi di mal di testa, che coinvolge la vasodilatazione e l'innervazioneanomale 3,4,5. Pertanto, la conoscenza della struttura neurovascolare nella dura madre cranale è importante per comprendere la patogenesi del mal di testa, specialmente per l'emicrania.
Sebbene l'innervazione dura sia stata precedentemente studiata con l'immunoistochimica convenzionale, la correlazione spaziale delle fibre nervose e dei vasi sanguigni nella dura madre cranico è statameno studiata 6,7,8,9. Al fine di rivelare la struttura neurovascolare durale in modo più dettagliato, peptide correlato al gene calcitonina (CGRP) e phalloidin sono stati selezionati come marcatori per la colorazione rispettivamente delle fibre nervose durali e dei vasi sanguigni nella dura madre cranale a montaggio intero con immunofluorescenza e istochimica fluorescente10. Può essere una scelta ottimale ottenere una visione tridimensionale (3D) della struttura neurovascolare. Inoltre, il fluorogold (FG) è stato applicato sull'area intorno all'arteria meningea media (MMA) nel dura mater cranico per determinare l'origine delle fibre nervose immunoreattive CGRP, e rintracciato al ganglio trigemino (TG) e ai gangli della radice dorsale cervicale (C), mentre i neuroni etichettati FG sono stati ulteriormente esaminati insieme alla CGRP usando l'immunofluorescenza.
Lo scopo di questo studio era quello di fornire uno strumento efficace per studiare la struttura neurovascolare nella dura mater cranale per l'innervazione immunoreattiva CGRP e la sua origine. Sfruttando il dura mater trasparente a montaggio intero e combinando l'immunofluorescenza, il tracciamento retrogrado, le tecniche confocali e la ricostruzione 3D, ci aspettavamo di presentare una nuova visione 3D della struttura neurovascolare nella dura mater cranale. Questi approcci metodologici possono essere ulteriormente serviti per esplorare la patogenesi di diversi mal di testa.
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Protocol
Questo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell'Istituto di Agopuntura e Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences (numero di riferimento D2018-09-29-1). Tutte le procedure sono state condotte in conformità con la National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). In questo studio sono stati utilizzati dodici ratti maschi adulti Sprague-Dawley (peso 220 ± 20 g). Gli animali [numero di licenza SCXK (JING) 2017-0005] sono stati forniti dai National Institutes for Food and Drug Control.
1. Innervazione del dura mater cranale di ratto
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Perfusioni
- Iniettare per via intraperitoneale un sovradosaggio di soluzione di tribromoetanolo (250 mg/kg) al ratto per indurre l'eutanasia.
- Una volta che il respiro si ferma, per infusione transcardiale con 100 mL dello 0,9% di soluzione salina normale seguita da 250-300 mL di paraformaldeide al 4% in tampone fosfato 0,1 M (PB, pH 7,4).
- Dopo la perfusione, rimuovere la pelle della testa e aprire il cranio per esporre la dura madre e il lato dorsale del cervello. Quindi sezionare la dura mater cranale lungo il tronco encefalico fino al bulbo olfattivo nel modello a montaggio intero (Figura 1). Eseguire la post-fissazione in paraformaldeide al 4% per 2 ore, quindi crioproteggere in saccarosio al 25% in 0,1 M PB per più di 24 ore a 4 °C.
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Immunoistochimica a fluorescenza per l'etichettatura CGRP e phalloidin
NOTA: Una combinazione di colorazione fluorescente di CGRP e phalloidin è stata applicata per rivelare la correlazione spaziale delle fibre nervose durali e dei vasi sanguigni nel dura mater cranico del ratto nel modello a montaggio intero.- Risciacquare il dura mater craniciale in 0,1 M PB per circa 1 minuto.
- Incubare il dura mater in una soluzione di blocco contenente il 3% di siero normale d'asino e lo 0,5% di Tritone X-100 in 0,1 M PB per 30 min.
- Trasferire il dura mater in anticorpo anti-CGRP del topo (1:1000) in 0,1 M PB contenente l'1% di siero normale d'asino e lo 0,5% tritone X-100 durante la notte a 4 °C11.
- Lavare la dura mater tre volte in 0,1 M PB il giorno seguente.
- Incubare il dura mater in una soluzione mista di anticorpo secondario Alexa Fluor 488 dell'asino (1:500) e phalloidin 568 (1:1000) in 0,1 M PB contenente l'1% di siero normale d'asino e lo 0,5% di Tritone X-100 per 1,5 ore a temperatura ambiente (26 °C).
- Lavare la dura mater tre volte in 0,1 M PB.
- Tagliare i bordi e montarlo su vetrini al microscopio (vedere Tabella dei materiali).
- Indossare coverlips con 50% glicerina prima dell'osservazione.
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Osservazione e registrazione
- Osservare i campioni fluorescenti al microscopio fluorescente o a un sistema di imaging confocale.
- Scatta le immagini dell'intera dura mater montata da un microscopio fluorescente dotato di una fotocamera digitale (4x, NA: 0.13) e usa un tempo di esposizione di 500 ms. I mosaici di immagini della dura mater sono stati completati con un software di microscopio fluorescente (vedi Tabella dei materiali).
- Scatta immagini delle fibre nervose immunoreattive CGRP e dei vasi sanguigni etichettati con phalloidina nella dura madre usando un microscopio confocale. Le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione erano di 488 nm (verde) e 594 nm (rosso). Il foro a spillo confocale è 110 (20x) e 105 μm (40x). La risoluzione dell'acquisizione dell'immagine è di 640 x 640 pixel.
- Cattura 20 immagini in fotogrammi da 2 μm da ogni sezione spessa 40 μm ed esegui un'integrazione di immagini singole a fuoco con un sistema software associato all'elaborazione delle immagini confocali per l'analisi 3D come segue: Set Start Focal Plane | Impostare il piano focale finale | Impostare le dimensioni dei | Selezionate Serie profondità (Depth Pattern| Acquisizione immagini | Serie Z.
- Usa un software di fotoritocco per regolare la luminosità e il contrasto delle immagini per ottimizzare la visualizzazione. Prestare attenzione a non rimuovere alcun dato dalle immagini.
2. Studio di tracciamento retrogrado con FG
- Procedure chirurgiche
- Determinare l'area di coordinate di interesse nella dura mater cranicia del ratto.
- Preparare una micro siringa da 10 μL e testarla con paraffina liquida.
- Anestetizzare i ratti con soluzione di tribromoetanolo (150 mg/kg) mediante iniezione intraperitoneale. Verificare la profondità in anestesia per la mancanza di risposta al dito del dito del piedi.
- Radere la testa al topo con un rasoio elettrico.
- Mettere le barre dell'orecchio smussate sul topo e posizionarlo sul dispositivo stereotassico. Quindi mettere il porta bocca e applicare un unguento oftalmico sugli occhi.
- Pulire il sito chirurgico della pelle della testa usando il 10% di iodio di povidone seguito dal 75% di etanolo.
- Fai un'incisione lungo la linea mediana del cuoio capelluto.
- Rimuovere senza mezzi termini il periostio e i tessuti muscolari dal cranio utilizzando applicatori sterili con punta di cotone (Figura 1A).
- Praticare un piccolo foro (~5-7 mm) utilizzando un trapano a bava con una punta rotonda (#106) sulle ossa parietali e temporali sinistra sopra l'MMA12e assicurarsi che il dura mater cranici sia stato mantenuto intatto(Figura 1B).
- Costruire una banca intorno al foro con cemento silicato dentale per limitare la diffusione del tracciante(Figura 1C).
- Aggiungere 2 μL di 2% FG nel foro intorno a MMA con una microsiringa da 10 μL (Figura 1D).
- Coprire il foro con un piccolo pezzo di spugna emostatica.
- Mettere un pezzo di pellicola di paraffina sul foro e sigillare i bordi con cera ossea per evitare perdite di tracciante ed evitare di contaminare i tessuti circostanti.
- Suturare la ferita con filo sterile.
- Tenere i ratti in una zona calda fino a quando non si sono completamente ripresi.
- Riportare i ratti nelle loro gabbie e aggiungere un antibiotico e un analgesico nell'acqua potabile.
- Perfusioni e sezioni
- Dopo 7 giorni di sopravvivenza, perfondere questi ratti come accennato in precedenza nelle procedure di cui al punto 1.1.
- Sezionare i DDG TG e C1-4, quindi post-fissarli e crioproteggerli come sopra menzionato nella sezione 1.1.3 (Figura 1F).
- Tagliare i TG e i DRG allo spessore di 30 μm su un sistema di microtomi criostatici in direzione sagittale e montati su vetri rivestiti di silani.
- Doppia immunofluorescenza per l'etichettatura FG e CGRP nei TG e nei DRG
NOTA: Sebbene l'etichettatura FG possa essere osservata direttamente con l'illuminazione UV sotto lampada al mercurio senza colorazioneaggiuntiva 13,14,15,16, i neuroni etichettati con FG sono stati ulteriormente esaminati nei TG e nelle DRAG cervicali utilizzando doppie immunofluorescenze con FG e CGRP per rivelare le origini delle fibre nervose duralI CGRP-immunoreattive nei TG e nei DRG.- Cerchia le sezioni con la penna istochimica.
- Incubare le sezioni per 30 min in una soluzione di blocco contenente il 3% di siero normale d'asino e lo 0,5% di Tritone X-100 in 0,1 M PB.
- Trasferire i campioni nella soluzione di antifluorogoldo di coniglio (1:1000) e anticorpo anti-CGRP del topo (1:1000) in 0,1 M PB contenente l'1% di siero normale d'asino e lo 0,5% tritone X-100 durante la notte a 4 °C.
- Lavare le sezioni tre volte in 0,1 M PB il giorno seguente.
- Incubare in una soluzione mista di anticorpo secondario alexa fluor 594 (1:500) e anti-topo d'asino Alexa Fluor 488 (1:500) in 0,1 M PB contenente l'1% di siero normale d'asino e lo 0,5% tritone X-100 per 1,5 ore a temperatura ambiente.
- Lavare e applicare le coperture alle sezioni come procedure nei passaggi 1.2.6 e 1.2.8.
- Osservazione e registrazione
- Scatta immagini dei neuroni etichettati FG in TG e DRG sotto illuminazione UV tramite microscopio fluorescente dotato di una fotocamera digitale.
- Cattura le immagini dei neuroni etichettati FG e CGRP in TG e DRG sotto un microscopio fluorescente dotato di una fotocamera digitale.
- Utilizzare il software di modifica per regolare la luminosità e il contrasto delle immagini e aggiungere etichette nelle immagini.
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Representative Results
Struttura neurovascolare del dura mater craniciale
Dopo la colorazione istochimica immunofluorescente e fluorescente con CGRP e phalloidin, le fibre nervose immunoreattive CGRP e le arteriole duriali e i tessuti connettivi etichettati con falloidina sono stati chiaramente dimostrati in tutta la dura madre cranica a montaggio intero in un modello 3D(Figura 2C,D, E, F). È stato dimostrato che sia le fibre nervose immunoreattive CGRP spesse che sottili corrono in parallelo alle arteriole uditive, intorno alla parete vascolare o tra i vasi sanguigni (Figura 2D, E,F). Sfruttando i vantaggi della ricostruzione 3D, la morfologia delle arteriole durali e la correlazione spaziale delle fibre nervose e delle arteriole duriche CGRP-immunoreattive potrebbero essere chiaramente dimostrate da diverse prospettive.
Neuroni con etichetta retrograda nei TG e nei DRG
Sette giorni dopo l'applicazione FG sulla regione dell'MMA nel dura mater cranica del ratto (Figura 3A), i neuroni etichettati FG sono stati rilevati nei TG e nelle DRAG cervicali sul lato ipsilaterale dell'applicazione del tracciante, che è stato osservato direttamente sotto l'illuminazione UV della microscopia fluorescente(figura 3B,C). Neuroni etichettati FG sono stati trovati in tutti e tre i rami di TG con maggiore concentrazione sulle divisioni oftalmica (V1) e mascellare (V2), e con meno sulla divisione mandibolare (V3) (Figura 3B). Nel frattempo, alcuni dei neuroni con etichetta FG sono stati osservati anche nei DRG C2-3 (Figura 3C).
Inoltre, sono state eseguite anche doppie immunofluorescenze con FG e CGRP sulle sezioni di TG e DRG cervicali. Secondo il diametro dei neuroni immunoreattivi CGRP nei TG e nei DRG, la maggior parte di essi si trova principalmente nei neuroni sensoriali di piccolo e medio diametro (<50 μm). Alcuni di questi tipi di neuroni immunoreattivi CGRP sono stati etichettati anche con FG nei DRG TG e C2-3, indicando che le fibre nervose immunoreattive CGRP nella dura madre cranale hanno avuto origine da queste sottopopolazioni di neuroni sensoriali nei TG e drg(Figura 4).
Figura 1: Fotografie delle principali viste sperimentali del presente studio. (A) Un'incisione lungo la linea mediana del cuoio capelluto. (B) Un foro sopra la dura mater cranica che mostra l'arteria meningea centrale (MMA). (C) Una piccola banca attorno al foro cerchiata con cemento silicato dentale per l'applicazione del tracciante sulla dura madre craniciale. (D) Applicazione del fluorogoldo (FG) nel foro con microsiringa. (E) La dura mater trasparente a montaggio intero. (F) La vista esterna del ganglio trigeminale (TG). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Correlazione tra le fibre nervose immunoreattive peptidiche (CGRP) e le arteriole etichettate con phalloidina (Pha) sull'intero montante dura mater. (B)Il dura mater a montaggio intero è stato appiattito e montato sul vetrino. (C) Distribuzione delle fibre nervose immunoreattive CGRP e dei vasi sanguigni etichettati Pha lungo l'arteria meningea media (MMA). (D,E) Le foto ingrandite dalle stesse aree di d ed e nel pannello C. (F) Le immagini ingrandite e regolate dal pannello E con la cornice in un motivo 3D. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Distribuzione di neuroni fluorogold (FG) etichettati nel ganglio trigemino (TG) e nel ganglio della radice dorsale cervicale (C) (DRG) sotto illuminazione UV. (A) La regione di dura mater con applicazione FG. (B) Distribuzione di neuroni con etichetta FG nei rami oftalmico (V1), mascellare (V2) e mandibolare (V3) del TG. (C) Distribuzione di neuroni con etichetta FG distribuiti nel DRG C2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Le fotografie rappresentative che mostrano i neuroni sensoriali etichettati nel ganglio trigemino (TG) e nel ganglio della radice dorsale cervicale (DRG) utilizzando doppie immunofluorescenze con fluorogold (FG) e peptide correlato al gene della calcitonina (CGRP). (A,B) I neuroni etichettati con FG, CGRP, e sia FG che CGRP sono stati dimostrati in rosso, verde e giallo, rispettivamente in TG (A) e DRG (B). (A1-B1), (A2-B2): I pannelli A e B sono stati mostrati separatamente con l'etichettatura FG (A1, B1) e l'etichettatura CGRP (A2, B2). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo studio, abbiamo dimostrato con successo la distribuzione e l'origine delle fibre nervose cgrp-immunoreattive nel dura mater cranico utilizzando l'immunofluorescenza, la ricostruzione 3D e gli approcci di tracciamento neurale con anticorpo CGRP e tracciante neurale FG, fornendo le evidenze istologiche e chimiche per comprendere meglio la rete neurovascolare udirica.
Come era noto, il CGRP svolge un ruolo fondamentale nella patogenesi dell'emicrania4,17. È stato dimostrato che l'aumento del CGRP può portare alla vasodilatazione e all'infiammazione neurogenica per causare la sensibilizzazione periferica e centrale lungo la via trigeminale4,18. Le fibre nervose immunoreattive CGRP appartengono agli assoni sensoriali peptidergici non mielinati responsabili del trasporto dei segnalinocicettivi 19. Essendo coerenti con studi precedenti, qui, abbiamo chiaramente dimostrato la distribuzione delle fibre nervose immunoreattive CGRP nella dura madre cranico e tracciato la loro origine da neuroni sensoriali di piccolo e medio diametro nei TG e drg. Queste strutture cellulari potrebbero essere le fonti per sintetizzare e rilasciare CGRP. D'altra parte, la phalloidina è una sonda specifica per l'actina filamentosa (F-actina) che è abbondante nelle cellule muscolari ed endoteliali lisce. Come candidato corretto, la phalloidina è stata utilizzata per etichettare le strutture vascolari e i tessuticonnettivi 10,20,21. Il nostro recente studio ha dimostrato che, a differenza dell'actina muscolare alfa liscia e del CD31, la filloidina è più affidabile e sensibile per la colorazione delle arteriole duriali, ed è l'ottimale da combinare con il CGRP per dimostrare in dettaglio la rete neurovascolare cranica, che è stata pubblicata qui10,21.
La tecnica di tracciamento del tratto neurale è uno strumento importante per indagare l'origine neurale e la terminazione. Nel presente studio, FG è stato utilizzato per tracciare retrogrado l'origine delle fibre nervose immunoreattive CGRP nella dura madre cranico. Poiché il dura mater cranico è una membrana sottile, il tracciante non può essere applicato comodamente tramite iniezione. Invece, FG è stato aggiunto direttamente sulla regione intorno a MMA nel dura mater cranici secondo il metodo che era stato introdotto inprecedenza 22,23, ma bisogna fare attenzione a mantenere intatto il dura mater. Inoltre, lo sforzo è stato fatto per prevenire la perdita di FG ai tessuti adiacenti. Poiché l'etichettatura FG può essere osservata direttamente sotto l'illuminazione UV della lampada amercurio 24, con questo approccio, abbiamo controllato il sito dell'applicazione FG; è stato scoperto che oltre alla propagazione neurale, FG era limitato nella regione cerchiata con cemento silicato dentale senza contaminare i tessuti circostanti. L'altro vantaggio è che i neuroni etichettati FG possono anche essere macchiati nel colore previsto usando l'immunofluorescenza con anticorpo FG, rendendolo più conveniente da usare insieme ad altri biomarcatori14,15,16. Attraverso questo studio, abbiamo dimostrato che FG non solo si adatta per il tracciamento retrogrado dell'innervazione udirale, ma è anche un candidato adeguato da combinare con il CGRP per determinare le caratteristiche chimiche dei neuroni etichettati FG.
Va notato in questa sede che i metodi attuali sono preferibilmente utilizzati per gli animali giovani. Nella fase iniziale del ratto, il mater dura cranico è più trasparente in stile a montaggio intero. Questa caratteristica rende più conveniente visualizzare la struttura neurovascolare del mater dura craniciale in un modello 3D senza un ulteriore trattamento trasparente.
In sintesi, il presente studio fornisce un approccio prezioso per esplorare efficacemente l'innervazione del dura mater cranici dai neuroni sensoriali nei TG e nelle DRAG cervicali, in particolare il sottotipo di neuroni sensoriali di piccolo e medio diametro con espressione immunoreattiva CGRP. Dal punto di vista metodologico, può fornire un prezioso riferimento per indagare ulteriormente gli altri tipi di fibre nervose nella dura madre cranico, così come le loro origini.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato supportato dal progetto del National Key R&D Program of China (Project Code n. 2019YFC1709103; n. 2018YFC1707804) e National Natural Science Foundation of China (Project Code n. 81774211; n. 81774432; n. 81801561).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | A21202 | Protect from light; RRID: AB_141607 |
| Brain stereotaxis instrument | Narishige | SR-50 | |
| CellSens Dimension | Olympus | Version 1.1 | Software of fluorescent microscope |
| Confocal imaging system | Olympus | FV1200 | |
| Fluorogold (FG) | Fluorochrome | 52-9400 | Protect from light |
| Fluorescent imaging system | Olympus | BX53 | |
| Freezing microtome | Thermo | Microm International GmbH | |
| Olympus FV10-ASW 4.2a | Olympus | Version 4.2 | Confocal image processing software system |
| Micro Drill | Saeyang Microtech | Marathon-N7 | |
| Mouse anti-CGRP | Abcam | ab81887 | RRID: AB_1658411 |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Phalloidin 568 | Molecular Probes | A12380 | Protect from light |
| Photoshop and Illustration | Adobe | CS6 | Photo editing software |
| Rabbit anti- Fluorogold | Abcam | ab153 | RRID: AB_90738 |
| Sprague Dawley | National Institutes for Food and Drug Control | SCXK (JING) 2014-0013 | |
| Superfrost plus microscope slides | Thermo | #4951PLUS-001 | 25x75x1mm |
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