Summary
Denne protokol beskriver fjernelsen af endogene lipider fra allergener og deres erstatning med brugerspecifikke ligands gennem omvendt fase HPLC kombineret med termisk udglødning. 31 år P-NMR og cirkulær dichroism giver mulighed for hurtig bekræftelse af ligand fjernelse / lastning, og inddrivelse af indfødte allergen struktur.
Abstract
Mange større allergener binder sig til hydrofobe lipidlignende molekyler, herunder Mus m 1, Bet v 1, Der p 2 og Fel d 1. Disse ligands er stærkt bevaret og har potentiale til at påvirke sensibiliseringsprocessen enten ved direkte at stimulere immunsystemet eller ændre de biofysiske egenskaber af det allergifremkaldende protein. For at kunne kontrollere for disse variabler kræves der teknikker til fjernelse af endogene bundne ligands og om nødvendigt udskiftning med lipider af kendt sammensætning. Kakerlakallergeneret Bla g 1 omslutter et stort hydrofobisk hulrum, der binder en heterogen blanding af endogene lipider, når de renses ved hjælp af traditionelle teknikker. Her beskriver vi en metode, hvorigennem disse lipider fjernes ved hjælp af omvendt fase HPLC efterfulgt af termisk udglødning for at give Bla g 1 i enten sin Apo-form eller genindlæses med en brugerdefineret blanding af fedtsyrer eller fosforlastningslaster. Koblingen af denne protokol med biokemiske assays viser, at fedtsyrelaster i væsentlig grad ændrer termo ustabiliteten og proteolytisk resistens hos Bla g 1 med nedstrømsvirkninger for satsen for T-celle epitopdannelse og allergenicitet. Disse resultater fremhæver vigtigheden af lipid fjernelse / ladning protokoller som den, der er beskrevet heri, når de studerer allergener fra både rekombinant og naturlige kilder. Protokollen er generaliserbar for andre allergen familier, herunder lipocalins (Mus m 1), PR-10 (Bet v 1), MD-2 (Der p 2) og Uteroglobin (Fel d 1), hvilket giver et værdifuldt redskab til at studere lipiders rolle i den allergiske reaktion.
Introduction
En undersøgelse af allergendatabasen afslører, at allergener findes i kun 2% af alle kendte proteinfamilier, hvilket tyder på, at almindelige funktionelle og biofysiske egenskaber bidrager til allergenicitet1. Af disse egenskaber synes evnen til at binde lipidfragter at være stærkt overrepræsenteret blandt allergener, hvilket tyder på, at disse laster kan påvirke sensibiliseringsprocessen1. Faktisk har det vist sig, at Brasilien Nut allergen Ber e 1 kræver co-administration med sin endogene lipid at realisere sin fulde sensibilisere potentiale2. Disse lipider kan potentielt stimulere immunsystemet direkte som illustreret af mide allergener Der p 2 og Der p 7, som begge deler en stærk strukturel homologi med LPS-bindende proteiner3,4,5. Baseret på denne observation blev det foreslået, at Derp 2 og Der p 7 kunne binde bakterielle lipider og direkte stimulere værts immunsystemet gennem TLR4-medieret signalering, hvilket letter sensibiliseringsprocessen5,6. Det er også muligt, at endogene bundet lipider kunne ændre de biofysiske egenskaber af allergifremkaldende proteiner selv. For eksempel forbedrede Sin a 2 (sennep) og Ara h 1 (jordnødder) evne til at interagere med fosfor vesikler betydeligt deres modstand mod gastrisk og endosomal nedbrydning7, mens ligand binding til det store birk pollenallergener Bet v 1 ændrede både hastigheden af endosomal behandling og mangfoldigheden af de resulterende peptider8. Dette er især relevant for allergenicitet i betragtning af den korrelation, der er observeret mellem stabilitet, T-celle epitop generation og allergenicitet for proteiner som Bet v 1 og Bla g 1; sidstnævnte vil blive genstand for dette arbejde9,10.
Bla g 1 repræsenterer det prototypiske medlem af insektet Major Allergen (MA) proteinfamilie og har en unik struktur bestående af 12 amfipatiske alfabæger, der omslutter et unormalt stort hydrofobisk hulrum9,11. Den tilgængelige røntgenkrystalstruktur i Bla g 1 viser elektrontætheden inden for dette hulrum i overensstemmelse med bundne fosfor- eller fedtsyreligler; en formodning bekræftet af 31P-NMR og massespektrometri. Disse laster var heterogene i naturen, og deres sammensætning var stærkt afhængig af allergenkilden, med forskellige lipidprofiler observeret for rekombinant Bla g 1 udtrykt i E. coli og P. pastoris. Mærkeligt nok indeholdt Bla g 1 renset fra sin naturlige allergenkilde (kakerlak frass) overvejende fedtsyrer inden for dets bindende sted, med en blanding af palmitate, oleat og stearit identificeret som dets "naturlige" ligands9,11. Bla g 1's evne til at fastholde lipider og fedtsyrer efter flere rensningstrin hindrer bestræbelserne på at studere proteinet isoleret. Omvendt er det blevet foreslået, at den naturlige palmitate, stearit, og oleate ligands af Bla g 1 (fremover benævnt nMix) spiller en central rolle i både dens allergenicitet og indfødte biologiske funktion9. Disse ligands er imidlertid ikke til stede i Bla g 1 fra rekombinant kilder, hvilket gør det vanskeligt at vurdere denne hypotese. Lignende problemer er blevet observeret for andre lipidbinding allergener såsom Bet v 112,13. For at lette den systematiske undersøgelse af lipid-allergen interaktioner har vi udviklet en protokol, hvorigennem allergener kan kvantitativt fratages deres endogene bundet lipider og rekonstitueres i enten Apo-form eller fyldt med specifikke ligands.
Allergener er oftest renset fra deres naturlige eller rekombinante kilder ved hjælp af affinitet kromatografi og / eller størrelse-udelukkelse kromatografi. Her introducerer vi et ekstra rensningstrin i form af højtydende væskekromatografi (HPLC), der anvender en omvendt fase C18-kolonne, hvorfra allergenet er udråbt til et organisk opløsningsmiddel svarende til protokoller udviklet til fedtsyrebindingsproteiner14. Det resulterende protein udsættes derefter for et termisk udglødningstrin i mangel af eller tilstedeværelse af fedtsyrer og/eller fosfolipider. Ud over at genvinde den oprindelige Bla g 1 fold, øger de forhøjede temperaturer opløseligheden og tilgængeligheden af lipidlasterne, hvilket giver Bla g 1 i enten Apo-formen eller ensartet fyldt med den ønskede hydrofobe ligand. 31 år P-NMR spektre af Bla g 1 renset på denne måde bekræftede fuldstændig fjernelse af endogene bundet ligands og ensartet udskiftning med de ønskede forbindelser, mens cirkulær dichroism bekræftede en vellykket inddrivelse af Bla g 1 fold. Nytten af denne metode er fremhævet i et nyligt arbejde, hvor lastbinding blev fundet for at forbedre Bla g 1 termo ustabilitet og proteolytisk modstand, ændre kinetik af T-celle epitop generation med potentielle konsekvenser for sensibilisering og allergenicitet9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bla g 1 kloning
- Få gen til kakerlak allergen Bla g 1.0101 (rester 34-216), der repræsenterer en enkelt gentagelse af MA domænet. For nemheds skyld vil Bla g 1 blive brugt i hele værket til at repræsentere denne ene gentagelse i stedet for hele Bla g 1.0101-udskriften.
- Underengen Bla g 1 ind i den ønskede vektor. I denne undersøgelse blev genet, der indeholder et N-terminal glutathion S-transferase (GST) tag koblet til en tobaksethisk virus (TEV) protease kavalergang site indsat i en pGEX vektor for udtryk som beskrevet tidligere11.
- Bla g 1 pGEX vektor omdannes til BL21 DE3 E. coli-celler.
- Forbered en 10 ng/μL bestand af den ønskede vektor.
- 1 μL 10 ng/μL DNA-lager kombineres med 50 μL BL21 DE3-celler som oplyst af fabrikanten.
- Inkuber BL21 DE3-DNA-blanding i 30 minutter på is. Der overføres til et 42 °C vandbad i 1 min. og overføres straks tilbage på isen i yderligere 1 min. inkubation.
- Der tilsættes 200 μL LB-medier til cellerne og inkuberes i yderligere 1 time ved 37 °C.
- De omdannede celler plades på LB-Agar plader, der indeholder 100 mg/L ampicillin, og vokser ved 37 °C natten over.
2. Indledende udtryk og rensning
- Pod 1 L LB-medier, der indeholder 100 mg/l ampicillin med en enkelt koloni af BL21 DE3-celler omdannet med Den Bla g 1 vektor, der er beskrevet i 1.3. Vokse ved 37 °C natten over.
- Den næste dag høstes celler (OD600 ~1,5) via centrifugering ved 6.000 x g i 10 min og genbruges i 2 L af 2x YT-medier, der indeholder 100 mg /L ampicillin. Lad cellerne vokse i yderligere 1 time ved 37 °C til en OD600 > 0,6.
- Fremkalde proteinudtryk ved tilsætning af 0,5 mM IPTG. Celler overføres til 18 °C og inkuberes natten over.
- Den næste dag høstes celler som beskrevet i 2.2. Den resulterende cellepille kan fryses og opbevares ved -20 °C.
- Genbrugt pellet fremstillet af 1 L kultur i 50 mL lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 8,5, 100 mM NaCl), der indeholder 1 proteasehæmmertablet (eller tilsvarende) og 1 μL benzonasekerner.
- Lyse celler ved hjælp af en sonde sonicator (500 W, 20 kHz) indstillet til 30-50% strøm i 4 min med en 50% maksimal cyklus. Hold lysatet i et isbad under sonikering
- Centrifuge lysat ved 45.000 x g i 20 min. Kassér uopløselig fraktion (pellet).
- 28 μL opløseligt protein fjernes. Kombiner med 7 μL 5x SDS-PAGE buffer og lager til SDS-PAGE analyse. Gentag dette trin for flow-through-, vask- og elueringsfraktionerne for GST-kolonner før og efter inkubation med TEV.
- Der påføres opløselige proteiner (supernatant) på en glutathionharpikskolonne (~10 mL samlet sengevolumen) ekvilibreret i PBS pH 7.4.
- Eventuelle ubundne proteiner vaskes ud ved hjælp af 50 mL PBS.
- Elute GST-Bla g 1 ved hjælp af 50 mL PBS indeholdende 10 mM reduceret glutathion.
- Inkuber elueret protein med 0,2 kU TEV protease natten over ved 4 °C, eller stuetemperatur i 6 timer for at fjerne GST-tag.
3. Endogene lipid fjernelse via reverse-fase HPLC
- Opsamles den kløvede Bla g 1 og koncentreres til ~ 2 mL ved hjælp af en centrifugalfilterenhed med en <10 kDa molekylær vægt cut-off.
- Tilføj <12 mL prøve til toppen af koncentratoren og spin på 5.000 x g i 10-15 min i en swing-bucket rotor.
BEMÆRK: Prøvevolumen og spinhastighed vil variere afhængigt af det specifikke filter og den anvendte rotortype. Se producentens dokumentation inden brug.
- Tilføj <12 mL prøve til toppen af koncentratoren og spin på 5.000 x g i 10-15 min i en swing-bucket rotor.
- Koncentratet indlæses på et HPLC-system på 250 x 10 mm, der er udstyret med en C18-chromatografikolonne ekvilibreret med 97% buffer A (vand, 0,1% trifluoreddikesyre) og 3% buffer B (acetonomi, 0,1% trifluoreddikesyre).
BEMÆRK: Mindre kolonner kan anvendes, men protein kan være nødt til at blive lastet og elueret ved hjælp af flere cyklusser for at imødekomme den reducerede bindingskapacitet. Ved valg af en kolonne skal det sikres, at harpiksperlerne har en partikelstørrelse på < 5 μm og porestørrelse på >200 Å for at muliggøre effektiv adskillelse af molekyler på proteinstørrelse
ADVARSEL: Trifluoreddikesyre er stærkt ætsende og bør udleveres i en røghætte ved hjælp af passende PERSONLIGE VÆRDEMIDLER (dvs. nitrilhandsker, laboratoriekittel og beskyttelsesbriller). Acetonitrile er både moderat giftig, flygtig og meget brandfarlig, bør anvendes og udleveres i en røghætte ved hjælp af passende PPE (dvs. nitrilhandsker, laboratoriekittel og beskyttelsesbriller). - Elute Bla g 1 ved hjælp af protokollen i tabel 1 med en strømningshastighed på 1,5-4,0 mL/min. Elueringsprocessen overvåges ved hjælp af fluorescensabsorpræsorptance ved 280 nm.
- Indsamle og pool Bla g 1 fraktioner. Bla g 1 normalt elutes ved >74% buffer B, eller ~ 34-40 min.
BEMÆRK: Elueringstiden varierer en smule afhængigt af strømningshastigheden eller kolonnestørrelsen. Saml brøker baseret på A280 for at opnå de bedste resultater.
- Indsamle og pool Bla g 1 fraktioner. Bla g 1 normalt elutes ved >74% buffer B, eller ~ 34-40 min.
| Klokkeslæt (min.) | Buffer A (%) | Buffer B (%) |
| 0 | 97 | 3 |
| 10 | 97 | 3 |
| 25 | 35 | 65 |
| 55 | 5 | 95 |
| 65 | 5 | 95 |
| 70 | 97 | 3 |
Tabel 1: Protokollen om den 1. Tabel, der illustrerer den elueringsgradient, der anvendes i isolation af Bla g 1 ved hjælp af en C18 HPLC-kolonne.
- Prøven til prøveglassernsage, uden reagensglas, der er mere end halvvejs (~4 mL). Dæk rør med paraffinfilm og perforere dækslet med to huller for at tillade udluftning.
- Forbered en separat 1 mL aliquot (test aliquot). Dette vil blive brugt til at bestemme det forventede udbytte.
- Prøverne fryses og prøves ved at anbringe dem i en fryser på -80 °C i 1 time eller ved nedsænkning i flydende nitrogen. I tilfælde af senere skal røret roteres kontinuerligt for at undgå brud på reagensglasset på grund af udvidelse af væskefasen ved frysning.
- Tør de resulterende delipiderede proteinprøver ved hjælp af en lyophilizer. Tørret protein kan opbevares ved 4 °C i flere måneder i en forseglet beholder.
4. Rekonstituering af Apo- og lastbelastet Bla g 1
- Bestem det forventede Bla g 1-udbytte.
- Resuspend lyophilized, delipidated (post-HPLC) test aliquot i 5 mL refolding buffer, (50 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 2% DMSO).
- Blandingen opvarmes i et vandbad (500 mL bægerglas med 250 mL vand og omrøres over en kogeplade) til 95 °C. Hvirvelopløsninger periodisk og inkuberes ved 95 °C i 0,5-1 timer.
- Fjern varmen og lad langsomt vandbadet ekvilibrere til stuetemperatur (~1 time). Udglødet protein kan opbevares i denne form natten over ved 4 °C, hvis det er nødvendigt.
- Der overføres en 1-lipidblanding af bla g gennem et 0,22 μM sprøjtefilter for at fjerne partikler.
- Bufferbytter det filtrerede protein 3x til PBS pH 7.4 ved hjælp af et centrifugalfilter med 10 kDa cutoff som beskrevet i 3.1 for at fjerne restfrie fedtsyrer og organisk opløsningsmiddel.
- Vurder proteinkoncentrationen ved hjælp af BCA-analyse eller anden foretrukken metode såsom UV-absorbans. Brug dette til at bestemme det forventede udbytte for de resterende Bla g 1 aliquots.
- Rekonstituer Apo- eller lastbelastet Bla g 1
- Genbrugte 1 aliquots i refoldingsbuffer som beskrevet i 4.1.1.
- Hvis du vil fremstille Apo-Bla g 1, skal du gentage trin 4.1.2-4.1.6 for at opnå det ønskede udbytte.
- For at læsse Bla g 1 med fedtsyrer skal der fremstilles 20 mM lageropløsninger af den ønskede fedtsyrelast i methanol eller DMSO. Gå derefter til trin 4.2.5.
- For at indlæse Bla g 1 med fosforlipider skal der fremstilles en 10 mg/ml bestand af den ønskede last i kloroform inde i et glasreagensglas.
- Fordampe kloroform til at producere en lipid film. Tilsættes PBS til reagensglasset for at producere en endelig fosforkoncentration på 20 mM.
ADVARSEL: Kloroform er skadelig, hvis den indåndes eller sluges. Anvendes i en kemisk røghætte eller anvendes åndedrætsværn, hvis der er utilstrækkelig ventilation til rådighed. Brug nitrilhandsker, laboratoriekittel og beskyttelsesbriller ved håndtering. Se MSDS før brug. - Rehydrer lipidfilmen ved at opvarme den over faseovergangstemperaturen for lipidlasten og hvirvlen, indtil opløsningen bliver overskyet. Bemærk, at sonikering kan være påkrævet for fuldt ud at genbruge og rehydrere nogle laster.
- Hvis sonikering er påkrævet, skal reagensglasset anbringes i badesononicatoren (100 W, 42 kHz) og sonikeres ved maksimal effekt, indtil lasten genbruges. Alternativt kan en sonde sonicator (beskrevet i 2,6) anvendes en 10-20% effekt med en 50% maksimal cyklus.
ADVARSEL: Sonication anvender højfrekvente lydbølger, som kan beskadige hørelsen. Anvende støjdæmpende PV (ørepropper eller lyddæmpere). Hvis det er muligt, skal du placere sonicator i lyddæmpende skab eller kammer.
- Fordampe kloroform til at producere en lipid film. Tilsættes PBS til reagensglasset for at producere en endelig fosforkoncentration på 20 mM.
- Den ønskede fedtsyre eller fosforlast tilsættes for at opnå et 20x stort overskud af ligands i forhold til bla g 1 på grundlag af det forventede udbytte bestemt i 4.1. Den samlede mængde organisk opløsningsmiddel, der tilsættes i dette trin, bør ikke overstige 2 %. Vortex at blande.
BEMÆRK: 1 L af Bl 21 DE3 celler giver typisk ~0,25-0,4 nmol protein, svarende til ~400 μM ligand pr. rør. - Anneal proteinet som beskrevet i 4.1.
5. Bekræftelse af fjernelse/lastning af fosforfra via 31P-NMR
- Koncentratprøver af Apo- eller cargo-loaded Bla g 1 til >100 μM ved hjælp af en centrifugalfilterenhed som beskrevet i 3.1.
- Rehydreringsreferencephospholipid i PBS-buffer til endelige koncentrationer på 2, 1,5, 1, 0,5 og 0,25 mM.
- Fortyndede prøver 1:1 med cholate buffer (100 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 10% w/v cholate) til et samlet volumen på ~600 μL.
BEMÆRK: Cholate er ansat i dette trin til fuldt ud at udtrække og opløse lipider fra Bla g 1 hydrofobiske hulrum. Dette sikrer, at det kemiske miljø omkring fosforhovedgrupperne er konsistent mellem forskellige prøver, hvilket giver mulighed for kvantitativ vurdering ved hjælp af 31P-NMR. Anvendelsen af cholat kan erstatte chloroform/methanol som beskrevet tidligere15. - Der erhverves 1D 31P-NMR-spektre af de cholate-opløselige Bla g 1-prøver og referencephospholipidstandarder ved hjælp af en bredbåndssonde.
BEMÆRK: De 31P-NMR-spektre, der præsenteres i dette værk, blev fremstillet ved hjælp af et 600 MHz spektrometer. Tidligere undersøgelser med lignende teknikker tyder imidlertid på , at der kan opnås acceptabel følsomhed ved feltstyrker helt ned til 150-200 MHz15. - Behandl de resulterende data ved hjælp af relevant software16.
- Få maksimale intensiteter ved hjælp af foretrukken NMR-visningssoftware17.
- Sammenlign 1 31P-NMR-spektre med dem, der er opnået for fosforreferenceprøverne, for at bekræfte fjernelsen af endogene bundne ligands og/eller binding af ønskede ligands baseret på de synlige toppes kemiske forskydninger (eller mangel på samme).
- Bekræft fuld binding af støkiometri ved at sammenligne topintensiteten af 1-spektret med fosforreferencestandardernes.
6. Bekræftelse af Bla g 1 foldning
- Der fremstilles 0,5 μM prøver af Bla g 1 i CD-buffer (100 mM KH2PO4, buffer pH 7.5). 2 mL af prøven indlæses i en 10 mm CD-cuvette med magnetisk rørestang.
- Måle CD-spektret af Bla g 1 for at bekræfte rekonstitueringen af den sekundære struktur. Sørg for, at Photomultiplier (PMT) spænding ikke overstiger producentens anbefalinger (generelt 1 kV).
- Cd-signalet måles fra 260-200 nm ved 25 °C med en datatafstand på 0,2 nm og en scanningshastighed på 20 nm/s med en dataintegrationstid på 1 s.
- Temperaturen i cd-cellen øges fra 25 °C til 95 °C med en hastighed på 0,5 °C/min. Aktiver magnetisk omrøringsstang for at sikre, at temperaturen er ensartet på tværs af prøven.
- Monitor CD ved 222 nm, idet aflæsninger hver 2 °C.
- Tilpas resulterende data til en 2-tilstand Boltzman kurve til at bestemme smeltetemperaturen. På grund af den høje stabilitet i Bla g 1 blev smeltetemperaturen (MT25)defineret som den temperatur, hvor proteinet har mistet 25% af sin oprindelige cd ved 222 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af affinitetskromatografi blev rekombinant GST-Bla g 1 let isoleret til et højt renhedsniveau (figur 1A), hvilket gav et udbytte på ~2-4 mg/l cellekultur. Inkubation natten over med TEV-protease ved 4 °C er tilstrækkelig til at fjerne GST-mærket, hvilket giver det endelige produkt ved ~24 kDa. Bemærk, at der i dette tilfælde er en betydelig mængde GST-Bla g 1 i gennemstrømnings- og vaskefraktionerne, hvilket tyder på, at glutathionharpiksbindingskapaciteten blev overskredet. Brugen af mere harpiks eller flere cyklusser af prøvebelastning og -udtagning kan afhjælpe dette problem.
Anvendelsen af Bla g 1 på en C18-kolonne i omvendt fase giver en karakteristisk elutionsprofil (Figur 1B) med to store toppe ved ~50% buffer B og en anden stor top på ~75% buffer B. SDS-PAGE-analyse af de resulterende fraktioner tyder på, at førstnævnte svarer til det kløvede GST-mærke, mens sidstnævnte svarer til Bla g 1. Lejlighedsvis en tredjedel, mindre top vil forekomme i midten svarende til resterende, un-kløvet GST-Bla g 1. Tilstedeværelsen af dette ikke-kløvede produkt kan elimineres ved at øge mængden af TEV, der anvendes i kavalergangsreaktionen eller forlænge inkubationstiden. Selv om ufuldstændig kavalergang vil reducere udbyttet, er adskillelsen opnået på C18-kolonnen tilstrækkelig til at sikre, at renheden af det endelige Bla g 1-produkt forbliver kompromisløs. En konsekvens af den omvendte fase af HPLC er, at det endelige proteinprodukt elueres til et organisk opløsningsmiddelmiljø. Mens dette letter fjernelsen af eventuelle hydrofobe ligands, er fjernelse af dette opløsningsmiddel via lyophilization påkrævet, hvilket giver et fluffy hvidt pulver (Figur 1C).
Udglødning af proteinet er nødvendig for at rekonstruere den indfødte Bla g 1 fold og kan udføres enten i mangel eller tilstedeværelse af en lipid last. Tilføjelse af DMSO til de tørrede Bla g 1- og fosforlaster forud for refoldingsbufferen letter opløselsesprocessen, selv om nogle længere kæde lipidfragter ikke vil opløses helt selv ved forhøjede temperaturer. Dette blev dog ikke observeret for at påvirke belastningseffekten blandt de lipider, der blev testet i vores undersøgelser (Figur 1C). Tilsvarende vil overskydende lipider ofte bundfælde ud af opløsning eller danne store vesikler ved afkøling, hvilket resulterer i et overskyet udseende efter udglødning (Figur 1C). Dette blev heller ikke observeret for at opnå lasteeffektivitet, og eventuelle aggregater fjernes let gennem filtreringen og efterfølgende bufferudvekslingstrin for at give en klar, gennemsigtig løsning. På trods af de barske forhold blev der ikke observeret termolyse for Bla g 1.
Figur 1: Indledende rensning af Bla g 1. a) SDS-PAGE, der viser den opløselige proteinfraktion efter den oprindelige lysis (S) gennemstrømning (FT), vask (W) og eluering fra glutathion-sepharose-kolonnen (E) og det endelige Bla g 1-produkt efter TEV-kavalergangen af GST-mærket (TEV). HPLC-elueringsprofilen for det resulterende Bla g 1-produkt efter TEV-kavalergang er vist i (B). En280 vises med blåt, mens elueringsgradienten (% Buffer B) vises med grønt. Brøker svarende til den kløvede GST-kode (H1, H2), resterende ikke-kløvet GST-Bla g 1 (H3) og renset Bla g 1 (H4) er angivet med røde pile på henholdsvis ~50%, ~65% og ~74% Buffer B. SDS-PAGE analyse af brøker H1- H4 er vist i (A) og mærket i overensstemmelse hermed. (C) Repræsentative billeder, der viser Bla g 1 på forskellige stadier af udglødningsprocessen. Bemærk, at den nøjagtige og omfanget af bundfald dannelse som afbildet i ii og iii er afhængig af den type lipid last ansat. Klik her for at se en større version af dette tal.
31 år P-NMR-spektre af Apo-Bla g 1 renset på denne måde viser ingen påviselige fosfolipider, hverken ved NMR (Figur 2A) eller tyndlagskromatografi (data vist ikke). Lignende spektre, der er fremstillet for Bla g 1, og som er fyldt med en distearoylphosphatidylcholin (DSPC) fosforlipid, viser derimod en stærk top svarende til fosfatidylcholinhovedgruppen. Til sammenligning viser et repræsentativt 31P-NMR-spektrum af Bla g 1 renset fra rekombinant E. coli uden brug af lipidfjernelses-/udglødningsprotokollen, der er beskrevet heri (ecBla g 1), en heterogen blanding af endogene lipider udvundet af det rekombinante udtrykssystem (Figur 2B). Ved at drage fordel af NMR's kvantitative karakter kan der udarbejdes en standardkurve ved hjælp af referenceprøver af kendte DSPC-koncentrationer(figur 2C). Hvis man sammenligner 31P-signalintensiteten fra DSPC-Bla g 1 med denne standardkurve, giver det en bindende støkiometri på 4,7 ± 0,5 lipider pr. protein; en værdi , der kan sammenlignes positivt med den forventede fuldstændige bindings-stomi , der er opnået ved silicoundersøgelser og strukturel analyse9. Bemærk, at denne teknik kun vil detektere ligands, der indeholder en 31P kerne såsom fosfolipider, lysophospholipider, lipopolysaccharider osv. Denne protokol kan dog let tilpasses til 13C-NMR-analyser. I dette tilfælde vil methyl-13C mærkede fedtsyrer blive anbefalet på grund af dets gunstige NMR afslapningsegenskaber. Begrænsning af isotopmærkning til et enkelt sted letter også spektralfortolkning, da der kun forventes en enkelt top, samtidig med at omkostningerne reduceres i forhold til ensartede 13C-mærkede modstykker. En alternativ fremgangsmåde ville være at anvende massespecifikationer til at identificere bundne ligands, som det fremgår af en tidligere undersøgelse, der identificerede en blanding af fedtsyrer som den naturlige last af Bla g 1 isoleret fra kakerlak frass (nBla g 1)9. Den begrænsede kvantantitationskapacitet for massespecifikation forhindrede imidlertid en nøjagtig måling af bindende støkiometri uden tilstrækkelige standarder.
Figur 2: Kontrol af fjernelse af lipider og pålæsning af Bla g 1. (A) 31P-NMR-spektre af Apo- (sort) eller DSPC-belastet Bla g 1 (rød), tilberedt ved hjælp af den i dette arbejde beskrevne udglødningsprotokol, der viser fuldstændig fjernelse af lipider i førstnævnte, og homogen belastning af phosphatidylcholin (PC) lipider opnået i sidstnævnte. I modsætning hertil viser Bla g 1 renset fra rekombinant E. coli uden lipidstripping og udglødning (ecBla g 1) en heterogen blanding af endogene phosphatidylethanolamin (PE) og phosphatidylglycerol (PG) lipider, når de analyseres ved hjælp af denne metode (B). En repræsentativ standardkurve fra DSPC-referenceprøver af kendte koncentrationer er vist i (C), hvorfra der kan opnås bla g 1 bindende støkiometri. Tal tilpasset fra Foo et al. (2019) og præsenteret under Creative Commons CC BY License9. Klik her for at se en større version af dette tal.
Krystalstrukturer af Bla g 1 afslører en unik fold bestående af 12 amfipatiske alfa-helices. Cirkulær dikhroisme repræsenterer en hurtig og bekvem metode til at vurdere, om denne fold er blevet rekonstitueret efter udglødningsprocessen. Cd-spektre for Apo- og lipid (nMix)-loaded Bla g 1 viser minima ~220 og 210 nm tegn på en overvejende alfa-spiralisk struktur (Figur 3A). Dette spektrum ligner meget det, der opnås for ecBla g 1 og nBla g 1, hvilket giver yderligere bevis for, at den oprindelige struktur i Bla g 1 med succes genvindes. Dette blev yderligere bekræftet ved brug af 19F og 1H-15N løsning-NMR, hvoraf en fuld diskussion er tilgængelig andetsteds9. Cd-baserede termiske denatureringsanalyser viser et kooperativt tab af alfahelisk sekundær struktur, der indikerer et foldet kugleformet domæne (Figur 3B). Analysen af de resulterende smeltetemperaturer (figur 3C) viser en betydelig stigning i nMix ligand binding. Denne forhøjede termostabilitet er i overensstemmelse med den, der er beregnet for nBla g 1, hvilket indikerer, at vi er i stand til fuldt ud at reproducere den naturlige tilstand af Bla g 1. Bemærk, at ecBla g 1 også viser en lignende, hvis ikke større forbedring i termo ustabilitet, der illustrerer potentialet for resterende endogene bundet lipider til at forstyrre biofysiske karakterisering af allergener renset ved hjælp af traditionelle FPLC-baserede tilgange. I modsætning hertil giver evnen til kvantitativt at fjerne og genindlæse hydrofobe laster fra allergener som Bla g 1 en unik vej til at undersøge lipiders rolle i den allergiske reaktion. Her beskriver vi en metode til at undersøge lipidfragtens indflydelse på strukturen, stabiliteten og den endosomale behandling af de allergifremkaldende proteiner selv, selvom andre undersøgelsesmuligheder kunne overvejes.
Figur 3: Bekræftelse af en vellykket genopretning af Bla g 1-folden. (A) CD-spektre af Apo- (sort) eller nMix-loaded (rød) Bla g 1 renset og udglødet ved hjælp af den heri beskrevne protokol, med minima ved ~220 og 210 nm, der indikerer en overvejende alfa-spiralisk struktur, der er i overensstemmelse med den tilgængelige røntgenkrystalstruktur. Både Apo- og nMix-loaded Bla g 1 spektre er meget ens med den, der opnås for Bla g 1 renset fra rekombinant E. coli (ecBla g 1, grøn) eller fra dens naturlige allergifremkaldende kilde (nBla g 1, blå) uden lipid fjernelse og udglødning protokol, yderligere støtte en vellykket genopretning af den oprindelige struktur i førstnævnte. (B) Repræsentative termiske profiler for Apo- (sort) og nMix-loaded (rød) Bla g 1, der viser en sigmoidal kurve, der indikerer kooperativ udfoldelse. nBla g 1 (blå) og ecBla g 1 (grøn) vist som reference. De beregnede smeltetemperaturer (MT25) på Bla g 1 er vist i (C). Binding af nMix ligands (rød) giver en betydelig stigning i termo ustabilitet i forhold til Apo-Bla g 1 (sort). Dette afspejler den observerede tendens for nBla g 1 (blå), hvilket tyder på, at vi er i stand til at genvinde den oprindelige tilstand. Den endnu større stabilitet observeret for ecBla g 1 fremhæver potentialet i endogene bundet lipider til at forstyrre biofysiske karakterisering af allergener. MT25-værdier i C repræsenterer den middelværdi, der opnås ved mindst tre uafhængige forsøg. Fejllinjer repræsenterer de tilsvarende standardafvigelsesværdier. Tal tilpasset fra Foo et al. (2019) og præsenteret under Creative Commons CC BY License9. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den protokol, der er beskrevet i dette arbejde, er blevet anvendt til systematisk at undersøge Bla g 1's lipidbindingsegenskaber. Dette afslørede en sammenhæng mellem lastbinding, termo ustabilitet og endosomal behandling, hvoraf sidstnævnte var korreleret med fald i genereringen af en kendt T-celle epitop med potentielle konsekvenser for immunogenicitet9,18. Ud over Bla g 1 har andre allergener som Pru p 3 og Bet v 1 vist sig at bevare deres endogene laster , når de er renset ved hjælp af standard-affinitet og størrelsesudelukkelseskromatografimetoder13,19,20,21,22. Disse uvelkomne gæster kunne ændre disse proteiners biofysiske og immunologiske egenskaber på samme måde og fremhæve behovet for teknikker til at sikre fuldstændig delipidation som den, der præsenteres her.
Mens brugen af omvendt fase HPLC i rensning af allergener er blevet beskrevet tidligere2, kobling det med en termisk udglødning protokol giver den temmelig usædvanlige mulighed for at rekonstruere allergener med en række naturlige og un-naturlige ligands, giver brugerne mulighed for at sonde lipid-allergen interaktioner. Dette termiske denatureringstrin blev anset for at være afgørende for to hovedformål. For det første er termisk denaturering nødvendig for at lette ligand adgang til deres bindende hulrum, som på grund af deres hydrofobe natur ofte begraves væk fra det vandige opløsningsmiddel9,22. For det andet danner hydrofobe ligands som fedtsyrer og fosfolipider ofte større supramolelekylære strukturer som miceller eller vesikler, når de placeres i et vandigt miljø. Koncentrationen af monomeriske eller "frie" ligands til rådighed for proteinbinding kan tilnærmes ved hjælp af den kritiske micellekoncentration (CMC). DSPC og andre langkædede fosforlipider har CMC-værdier i nM-området, hvilket indikerer, at der stort set ikke er nogen frie ligands til rådighed for Bla g 1-binding. Selv kortkædede lipider og fedtsyrer har CMC'er i det lave μm til mM-område, hvilket indikerer, at en stor del af disse ligands forbliver i micellar eller bilayer fase23. Men de høje temperaturer, der anvendes i vores denaturering protokol spreder disse større aggregater, lette bindende. Tidligere undersøgelser har typisk anvendt længere inkubationsperioder for at lette denne proces. Manglen på en termisk denaturerings-/udglødningsproces rejser imidlertid tvivl om lastens effektivitet. F.eks. gav inkubation af miteallergeneret Der p 5 med den fluorescerende fedtsyreanalog 11-(Dansylamino)undecanosyre (DAUDA) en bindende stomiomtteri på 0,66 på trods af at have et stort hydrofobisk hulrum på niveau med Bla g 124. På samme måde viste det sig, at plante-nSLTP'ernes bindende specificitet og afføring varierede meget, alt efter om lipider og protein først opløses i methanol før tilsætning af vandig buffer, hvilket indikerer, at ligand og/eller bindende tilgængelighed af lokalitet var en begrænsende faktor25.
Ud over Bla g 1 har vi med succes anvendt den samme strategi på flere andre MA-domæneproteiner fra kakerlakker og myg (A. aegypti) samt Der p 2 (data vist ikke). Vi bemærkede, at både Bla g 1-homologerne og Der p 2 eluterede på et andet tidspunkt end Bla g 1 fra C18-kolonnen (trin 3.3). Elueringsgradienterne i dette trin skal muligvis optimeres til andre proteiner. Alternativt kan HPLC-kolonner med en mindre hydrofobisk stationær fase (f.eks. På trods af forskellene i biofysiske og biokemiske egenskaber har vi fundet, at denne protokol er ekstremt robust og let kan anvendes på andre allergifremkaldende proteiner. Mens de barske betingelser, der anvendes , kan udgøre en potentiel begrænsning , reducerer den øgede modstandsdygtighed, der observeres for mange allergener, dens indvirkning26,27. Der er således observeret flere fødevare- og inhalationsallergener som Der p 2, Ber e 1, Ara a 6 og Lep w 1 for at genvinde deres struktur og immunogenicitet efter termisk denaturering, selv om optimering af bufferbetingelser kan være påkrævet28,29,30,31,32,33; f.eks. observeres reversibel denaturering af nsLTP'er (Cor a 8) og thaumatins (Mal d 2 og Act d 2) kun under sure (pH-<4) betingelser28,30,31. Derudover skal det bemærkes, at forfatterne ikke forsøgte at optimere hverken timingen eller temperaturerne, der blev anvendt i udglødningsprotokollen. Det er muligt, at ligandopløselighed og proteinfoldning/udfoldelse kan opnås ved hjælp af en lavere maksimal temperatur som set med Ber e 1, for hvilken reversibel denaturering opnås ved 82 °C29. Anvendelsen af sådanne foranstaltninger forventes at udvide det udvalg af allergener, som denne protokol kan anvendes på.
En anden vigtig overvejelse ved tilpasning af denne protokol til andre allergensystemer er koncentrationen af ligands, der kræves under udglødningsprocessen. For Bla g 1 er det forventede udbytte ~0,25-0,4 μmol protein pr. 1 L cellekultur. I betragtning af den påviste bindende støkiometri af 8 fedtsyrer eller 4 diacyl kæde lipider pr allergen, en 20-40 gange molar overskud af last (5-10 μmol) blev ansat. Det skal bemærkes, at Bla g 1's lipidbindingsevne og dens homologer er enestående; for eksempel nsLTP's er generelt accepteret at binde højst to lipid ligands25, mens lipocalins har mindre end 1 støkiometri34. Som sådan, fuldstændig belastning af disse typer af allergener kan opnås med et mindre overskud af ligands. En sidste overvejelse ved tilpasning af denne protokol til andre allergensystemer er tilstedeværelsen af disulfidbindinger, hvilket kan være problematisk, hvis det ikke dannes korrekt før denaturering. En mulig fremgangsmåde ville være at gennemføre udglødningsprocessen i nærværelse af et reduktionsmiddel som f.eks. De indfødte disulfidbindinger kunne efterfølgende re-dannes ved tilsætning af reduceret og oxideret glutathion som beskrevet for jordnøddeallergener fragment undersøgt af Aalberse et al.35. I dette tilfælde bør inddrivelsen af den korrekte disulfidbinding vurderes empirisk ved massespektrometri35.
I dette arbejde beskriver vi en teknik, hvorigennem allergener kan delipideres og genudtyndes med forskellige fosfor- og fedtsyrelaster. Der er dog mange andre klasser af potentielt immunogene eller adjuventerende ligands til stede inden for almindelige allergen reservoirer. For eksempel er katte-, hunde- og mideallergener blevet foreslået at binde lipopolysaccharider (LPS) og andre bakterielle lipider fra husstøv36, mens Bet v 1 har vist sig at udtrække komplekse flavonoider fra pollenmatrixen13. Den protokol, der er beskrevet i dette arbejde, kan let tilpasses til at udforske disse lipiders rolle på en mere detaljeret måde. Som et bevis på konceptet har vi været i stand til at påvise, at det hydrofobe hulrum i Bla g 1 er i stand til at binde lipoteichoinsyre (LTA) fra cellevæggene af gram positive bakterier, men udelukker LPS fra gram negative arter, hvilket potentielt afspejler det større antal acylkæder i sidstnævnte9. Tager dette et skridt videre, kunne man bruge den termiske denaturering / udglødning protokol til at indarbejde fluorescerende sonder og andre ikke-naturlige fedtsyre analoger i allergen proteiner. Faktisk var vi i stand til at indlæse hydrofobisk hulrum af myg homolog af Bla g 1 med DAUDA, åbning yderligere veje til at undersøge virkningerne af lipid ligands på allergifremkaldende sygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Dr. Tom Kirby, Scott Gabel, og Dr. Robert London for deres hjælp og bistand i hele dette arbejde, sammen med Dr. Bob Petrovich og Lori Edwards for brugen af deres instrumentering og deres bistand til at generere Bla g 1 konstruktioner ansat i denne undersøgelse. Vi takker Andrea Adams for hjælp med massespektrometrien og Dr. Eugene DeRose for hjælp til NMR-instrumenteringen. Denne forskning blev støttet af Intramural Research Program af NIH, National Institute of Environmental Health Sciences, Z01-ES102906 (GAM). Indholdet er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institute of Environmental Health Sciences.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bla g 1 Gene | Genescript | N/a | Custom gene synthesis service. GenBank Accession no AF072219 Residues 34-216 |
| Affinity purified natural Bla g 1 (nBla g 1) | Indoor biotechnologies | N/a | Custom order |
| Agilent 1100 Series HPLC System | Agilent | G1315B, G1311A, G1322A | UV Detector, Pump, and Degasser |
| Agilent DD2 600 MHz spectrometer | Agilent | N/a | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Amicon | UFC-1008 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Benzonase | Sigma-Aldrich | E1014-5KU | |
| Broad- band 5 mm Z-gradient probe | Varian | N/a | |
| ChemStation for LC (Software) | Agilent | N/a | |
| cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Distearoylphosphatidylcholine (18:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850365C | |
| E. Coli BL21 DE3 Cells | New England Biolabs | C2530H | |
| Freezone 4.5 Freeze Dry System | Labconco | 7750000 | |
| Glutathione Resin | Genescript | L00206 | |
| Glutathione, Reduced | Fisher Scientific | BP25211 | |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | 34060 | |
| Jasco CD spectropolarimeter | Jasco | J-815 | |
| Millex Syringe Filter Unit | EMD Millipore | SLGS033SS | |
| NMRPipe (Software) | Delaglio et al. | N/a | Delaglio, F. et al. Nmrpipe - a Multidimensional Spectral Processing System Based On Unix Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277–293 (1995). |
| NMRViewJ (Software) | Johnson et al. | N/a | Johnson, B. A. & Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. J. Biomol. NMR 4, 603–614 (1994). |
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Pierce BCA Protein Assay | Sigma-Aldrich | BCA1-1KT | |
| Polaris 5 C18-A 250x10.0 mm HPLC Column | Agilent | SKU: A2000250X100 | |
| SD-200 Vacuum Pump | Varian | VP-195 | |
| Sodium Cholate Hydrate | Sigma-Aldrich | C6445 | |
| Sodium Palmitate | Sigma-Aldrich | P9767 | |
| Sodium Stearate | Sigma-Aldrich | S3381 | |
| VnmrJ (Software) | Varian | N/a |
References
- Radauer, C., Bublin, M., Wagner, S., Mari, A., Breiteneder, H. Allergens are distributed into few protein families and possess a restricted number of biochemical functions. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 121 (4), 847-852 (2008).
- Dearman, R. J., Alcocer, M. J. C., Kimber, I. Influence of plant lipids on immune responses in mice to the major Brazil nut allergen Ber e 1. Clinical and Experimental Allergy. 37 (4), 582-591 (2007).
- Ichikawa, S., et al. Lipopolysaccharide binding of the mite allergen Der f 2. Genes to Cells. 14 (9), 1055-1065 (2009).
- Mueller, G. A., et al. The structure of the dust mite allergen Der p 7 reveals similarities to innate immune proteins. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (4), 909-917 (2010).
- Reginald, K., Chew, F. T. The major allergen Der p 2 is a cholesterol binding protein. Scientific Reports. 9 (1), 1556 (2019).
- Trompette, A., et al. Allergenicity resulting from functional mimicry of a Toll-like receptor complex protein. Nature. 457 (7229), 585-589 (2009).
- Angelina, A., et al. The lipid interaction capacity of Sin a 2 and Ara h 1, major mustard and peanut allergens of the cupin superfamily, endorses allergenicity. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 71 (9), 1284-1294 (2016).
- Soh, W. T., et al. Multiple roles of Bet v 1 ligands in allergen stabilization and modulation of endosomal protease activity. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 74 (12), 2382-2393 (2019).
- Foo, A. C. Y., et al. Hydrophobic ligands influence the structure, stability, and processing of the major cockroach allergen Bla g 1. Scientific Reports. 9 (1), 18294 (2019).
- Machado, Y., et al. Fold Stability is a key factor for immunogenicity and allergenicity of the major birch pollen allergen Bet v1.0101. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. 137 (5), 1525-1534 (2016).
- Mueller, G. A., et al. The novel structure of the cockroach allergen Bla g 1 has implications for allergenicity and exposure assessment. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (6), (2013).
- Mogensen, J. E., Wimmer, R., Larsen, J. N., Spangfort, M. D., Otzen, D. E. The major birch allergen , Bet v 1 , shows affinity for a broad spectrum of physiological ligands. The Journal of Biological Chemistry. 277 (26), 23684-23692 (2002).
- Seutter von Loetzen, C., et al. Secret of the major birch pollen allergen Bet v 1: identification of the physiological ligand. Biochemical Journal. 457 (3), 379-390 (2014).
- Ibáñez-Shimabukuro, M., et al. Structure and ligand binding of As-p18, an extracellular fatty acid binding protein from the eggs of a parasitic nematode. Bioscience Reports. 39 (7), 1-16 (2019).
- Beyer, K., Klingenberg, M. ADP/ATP carrier protein from beef heart mitochondria has high amounts of tightly bound cardiolipin, as revealed by 31P nuclear magnetic resonance. Biochemistry. 24 (15), 3821-3826 (1985).
- Delaglio, F., et al. Nmrpipe - a multidimensional spectral processing system based on unix pipes. Journal of Biomolecular NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
- Johnson, B. A., Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. Journal of Biomolecular NMR. 4 (5), 603-614 (1994).
- Dillon, M. B. C., et al. Different Bla-g T cell antigens dominate responses in asthma versus rhinitis subjects. Clinical and Experimental Allergy. 45, 1856-1867 (2015).
- Pasquato, N., et al. Crystal structure of peach Pru p 3, the prototypic member of the family of plant non-specific lipid transfer protein pan-allergens. Journal of Molecular Biology. 356 (3), 684-694 (2006).
- Dubiela, P., et al. Impact of lipid binding on the tertiary structure and allergenic potential of Jug r 3, the non-specific lipid transfer protein from walnut. Scientific Reports. 9 (2007), 1-11 (2019).
- Abdullah, S. U., et al. Ligand binding to an allergenic lipid transfer protein enhances conformational flexibility resulting in an increase in susceptibility to gastroduodenal proteolysis. Scientific Reports. 6, 30279 (2016).
- Derewenda, U., et al. The crystal structure of a major dust mite allergen Der p 2 , and its biological implications. Journal of Molecular Biology. 318 (1), 189-197 (2002).
- Lipfert, J., Columbus, L., Chu, V. B., Lesley, S. A., Doniach, S. Size and shape of detergent micelles determined by small-angle X-ray scattering. The Journal of Physical Chemistry. B. 111 (43), 12427-12438 (2007).
- Pulsawat, P., et al. The house dust mite allergen Der p 5 binds lipid ligands and stimulates airway epithelial cells through a TLR2-dependent pathway. Clinical and Experimental Allergy. 49 (3), 378-390 (2019).
- Douliez, J. P., Michon, T., Marion, D. Steady-state tyrosine fluorescence to study the lipid-binding properties of a wheat non-specific lipid-transfer protein (nsLTP1). Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1467 (1), 65-72 (2000).
- Ogburn, R. N., et al. Are dust mite allergens more abundant and/or more stable than other Dermatophagoides pteronyssinus proteins. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (3), 1030-1032 (2017).
- Cabrera, A., et al. Are allergens more abundant and/or more stable than other proteins in pollens and dust. Allergy: European Journal of Allergy and Clinical Immunology. , 1267-1269 (2019).
- Offermann, L. R., et al. Structural and functional characterization of the hazelnut allergen Cor a 8. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (41), 9150-9158 (2015).
- Koppelman, S. J., et al. Reversible denaturation of Brazil nut 2S albumin (Ber e1) and implication of structural destabilization on digestion by pepsin. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (1), 123-131 (2005).
- Smole, U., Bublin, M., Radauer, C., Ebner, C., Breiteneder, H. Mal d 2, the thaumatin-like allergen from apple, is highly resistant to gastrointestinal digestion and thermal processing. International Archives of Allergy and Immunology. 147 (4), 289-298 (2008).
- Bublin, M., et al. Effects of gastrointestinal digestion and heating on the allergenicity of the kiwi allergens Act d 1, actinidin, and Act d 2, a thaumatin-like protein. Molecular Nutrition and Food Research. 52 (10), 1130-1139 (2008).
- Griesmeier, U., et al. Physicochemical properties and thermal stability of Lep w 1, the major allergen of whiff. Molecular Nutrition and Food Research. 54 (6), 861-869 (2010).
- de Jongh, H. H. J., et al. Effect of heat treatment on the conformational stability of intact and cleaved forms of the peanut allergen Ara h 6 in relation to its IgE-binding potency. Food Chemistry. 326, 127027 (2020).
- Glasgow, B. J., Abduragimov, A. R. Ligand binding complexes in lipocalins: Underestimation of the stoichiometry parameter (n). Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1866 (10), 1001-1007 (2018).
- Aalberse, R. C., et al. Identification of the amino-terminal fragment of Ara h 1 as a major target of the IgE-binding activity in the basic peanut protein fraction. Clinical and Experimental Allergy. 50 (3), 401-405 (2020).
- Bublin, M., Eiwegger, T., Breiteneder, H. Do lipids influence the allergic sensitization process. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (3), 521-529 (2014).
