Summary
Este protocolo describe el retiro de lípidos endógenos de alergénicos, y su reemplazo con ligands usuario-especificados con la CLAR de la invertir-fase juntada con el recocido termal. 31 El P-RMN y el dicroísmo circular permiten la confirmación rápida del retiro/del cargamento del ligand, y la recuperación de la estructura alergénica nativa.
Abstract
Muchos alérgenos importantes se unen a moléculas hidrofóbicas similares a lípidos, incluyendo Mus m 1, Bet v 1, Der p 2 y Fel d 1. Estos ligandos se retienen fuertemente y tienen el potencial de influir en el proceso de sensibilización, ya sea a través de la estimulación directa del sistema inmunológico o la alteración de las propiedades biofísicas de la proteína alergénica. Para controlar estas variables, se requieren técnicas para la eliminación de ligandos endógenos unidos y, si es necesario, la sustitución por lípidos de composición conocida. El alérgeno de cucaracha Bla g 1 encierra una gran cavidad hidrofóbica que se une a una mezcla heterogénea de lípidos endógenos cuando se purifica utilizando técnicas tradicionales. Aquí, describimos un método a través del cual estos lípidos se eliminan utilizando HPLC de fase inversa seguido de recocido térmico para producir Bla g 1 en su forma apo o recargado con una mezcla definida por el usuario de cargas de ácidos grasos o fosfolípidos. El acoplamiento de este protocolo con ensayos bioquímicos revela que las cargas de ácidos grasos alteran significativamente la termoestabilidad y la resistencia proteolítica de Bla g 1, con implicaciones aguas abajo para la tasa de generación de epítopos de células T y alergenicidad. Estos resultados destacan la importancia de los protocolos del retiro/de la recarga del lípido tales como el descrito adjunto al estudiar alergénicos de fuentes recombinantes y naturales. El protocolo es generalizable a otras familias de alérgenos incluyendo lipocalins (Mus m 1), PR-10 (Bet v 1), MD-2 (Der p 2) y Uteroglobin (Fel d 1), proporcionando una valiosa herramienta para estudiar el papel de los lípidos en la respuesta alérgica.
Introduction
Un estudio de la base de datos de alérgenos revela que los alérgenos se encuentran en sólo el 2% de todas las familias de proteínas conocidas, lo que sugiere que las propiedades funcionales y biofísicas comunes contribuyen a la alergenicidad1. De estas propiedades, la capacidad de unir cargas lipídicas parece estar fuertemente sobrerrepresentada entre los alérgenos, lo que sugiere que estas cargas pueden influir en el proceso de sensibilización1. De hecho, se ha demostrado que el alérgeno de la nuez de Brasil Ber e 1 requiere co-administración con su lípido endógeno para realizar todo su potencial sensibilizante2. Estos lípidos podrían potencialmente estimular el sistema inmune directamente como lo ilustran los alérgenos ácaros Der p 2 y Der p 7, los cuales comparten una fuerte homología estructural con las proteínas de unión a LPS3,4,5. Sobre la base de esta observación se propuso que Derp 2 y Der p 7 podrían unirse a los lípidos bacterianos y estimular directamente el sistema inmune del huésped a través de la señalización mediada por TLR4, facilitando el proceso de sensibilización5,6. También es posible que los lípidos endógenos unidos podrían alterar las propiedades biofísicas de las propias proteínas alergénicas. Por ejemplo, la capacidad de Sin a 2 (mostaza) y Ara h 1 (cacahuetes) para interactuar con vesículas fosfolípidas mejoró significativamente su resistencia a la degradación gástrica y endosomal7,mientras que el ligando que se une al alérgeno principal del polen de abedul Bet v 1 alteró tanto la tasa de procesamiento endosomal como la diversidad de los péptidos resultantes8. Esto es particularmente relevante para la alergenicidad dada la correlación que se ha observado entre la estabilidad, la generación de epítopos de células T y la alergenicidad para proteínas como Bet v 1 y Bla g 1; este último de los cuales será objeto de este trabajo9,10.
Bla g 1 representa el miembro prototípico de la familia de proteínas de insectos alérgenos mayores (MA), y posee una estructura única compuesta por 12 hélices alfa anfipáticas que encierran una cavidad hidrofóbica anormalmente grande9,11. La estructura cristalina de rayos X disponible de Bla g 1 muestra densidad de electrones dentro de esta cavidad consistente con ligandos de fosfolípidos o ácidos grasos unidos; una conjetura confirmada por 31P-RMN y espectrometría de masas. Estas cargas eran de naturaleza heterogénea y su composición dependía en gran medida de la fuente alergénica, observó diferentes perfiles lipídicos para bla g 1 recombinante expresado en E. coli y P. pastoris. Curiosamente, Bla g 1 purificado de su fuente natural de alérgenos (frass cucaracha) contenía predominantemente ácidos grasos dentro de su sitio de unión, con una mezcla de palmitato, oleato y estearato que se identifica como sus ligandos "naturales"9,11. La capacidad de Bla g 1 para retener lípidos y ácidos grasos después de múltiples pasos de purificación dificulta los esfuerzos para estudiar la proteína de forma aislada. Por el contrario, se ha sugerido que los ligandos naturales palmitato, estearato y oleato de Bla g 1 (en adelante, nMix) juegan un papel clave tanto en su alergenicidad como en su función biológica nativa9. Sin embargo, estos ligandos no están presentes en Bla g 1 obtenidos de fuentes recombinantes, por lo que es difícil evaluar esta hipótesis. Se han observado problemas similares para otros alérgenos de unión a lípidos como Bet v1 12,13. Para facilitar el estudio sistemático de las interacciones lípido-alergénico hemos desarrollado un protocolo a través del cual los alérgenos pueden ser cuantitativamente despojados de sus lípidos endógeno unidos y reconstituidos en forma de Apo o cargados con ligandos específicos.
Los alérgenos se purifican más comúnmente de sus fuentes naturales o recombinantes mediante cromatografía de afinidad y/o cromatografía de exclusión de tamaño. Aquí, introducimos un paso de purificación adicional en forma de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) empleando una columna C18 de fase inversa a partir de la cual el alérgeno se ela en un disolvente orgánico similar a los protocolos desarrollados para proteínas de unión a ácidos grasos14. La proteína resultante se somete entonces a un paso de recocido térmico en ausencia o presencia de ácidos grasos y/o fosfolípidos. Además de recuperar el pliegue nativo de Bla g 1, las temperaturas elevadas aumentan la solubilidad y accesibilidad de las cargas lipídicas, produciendo Bla g 1 en forma apo o uniformemente cargada con el ligando hidrofóbico deseado. 31 Los espectros de P-RMN de Bla g 1 purificados de esta manera confirmaron el retiro completo de ligands endógeno ligados y el reemplazo uniforme con los compuestos deseados, mientras que el dicroísmo circular confirmó la recuperación acertada del doblez de Bla g 1. La utilidad de este método se destaca en un trabajo reciente en el que se encontró que la unión a la carga mejora la termoestabilidad Bla g 1 y la resistencia proteolítica, alterando la cinética de la generación de epítopos de células T con posibles implicaciones para la sensibilización y la alergenicidad9.
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Protocol
1. Bla g 1 clonación
- Obtener el gen para el alérgeno de cucaracha Bla g 1.0101 (residuos 34-216), que representa una sola repetición del dominio MA. En aras de la simplicidad, Bla g 1 se utilizará a lo largo de la obra para representar esta sola repetición, en lugar de toda la transcripción de Bla g 1.0101.
- Subclone el gene de Bla g 1 en el vector deseado. En este estudio, el gen que contiene una etiqueta de la S-transferasa del glutatión N-terminal (GST) acoplada a un sitio de la hendidura de la proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV) fue insertado en un vector del pGEX para la expresión según lo descritopreviamente 11.
- Transforme el vector Bla g 1 pGEX en células BL21 DE3 E. coli.
- Prepare una acción de 10 ng/μL del vector deseado.
- Combine 1 μL de 10 ng/μL de ADN con 50 μL de células BL21 DE3 según lo proporcionado por el fabricante.
- Incubar la mezcla BL21 DE3-DNA durante 30 min sobre hielo. Transferir a un baño de agua de 42 °C durante 1 min, luego transferir inmediatamente de nuevo en el hielo para una incubación adicional de 1 min.
- Añadir 200 μL de medios LB a las células e incubar durante 1 h adicional a 37 °C.
- Platee las células transformadas en placas de agar LB que contienen 100 mg/L de ampicilina y crezca a 37 °C durante la noche.
2. Expresión inicial y purificación
- Inocular 1 L de medios LB que contengan 100 mg/L de ampicilina con una sola colonia de células BL21 DE3 transformadas con el vector Bla g 1 como se describe en 1.3. Crecer a 37 °C durante la noche.
- Al día siguiente, coseche las células (OD600 ~1,5) vía la centrifugación en 6.000 x g por 10 minutos y resuspend en 2 L de 2 medios YT que contienen 100 mg/L ampicilina. Permita que las células crezcan durante 1 h adicional a 37 °C a un OD600 > 0.6.
- Inducir la expresión de proteínas mediante la adición de 0,5 mM de IPTG. Transferir las células a 18 °C e incubar durante la noche.
- Al día siguiente, las células de la cosecha como se describe en 2.2. El pellet celular resultante puede congelarse y almacenarse a -20 °C.
- Pellet de resuspend obtenido de 1 L de cultivo en 50 mL de tampón de lisis (50 mM Tris-HCl pH 8,5, 100 mM NaCl) que contiene 1 comprimido inhibidor de proteasa (o equivalente) y 1 μL de bencosa nucleasa.
- Celdas Lyse usando un sonicador de sonda (500 W, 20 kHz) configurado a 30-50% de potencia durante 4 minutos con un ciclo de trabajo del 50%. Mantenga el lysate en un baño de hielo durante la sonicación
- Centrifugadora de lisate en 45.000 x g durante 20 min. Deseche la fracción insoluble (pellet).
- Eliminar 28 μL de proteína soluble. Combine con 7 μL de búfer SDS-PAGE 5x y almacene para el análisis SDS-PAGE. Repita este paso para las fracciones de flujo, lavado y elución de la columna GST antes y después de la incubación con TEV.
- Aplicar proteínas solubles (sobrenadante) a una columna de resina de glutatión (~10 mL de volumen total del lecho) equilibrada en PBS pH 7.4.
- Lave cualquier proteína no ligada usando 50 mL de PBS.
- Elute GST-Bla g 1 usando 50 mL de PBS que contenía 10 milímetros redujo el glutatión.
- Incubar la proteína eluida con 0,2 kU de TEV proteasa durante la noche a 4 °C, o a temperatura ambiente durante 6 h para eliminar la etiqueta GST.
3. Eliminación endógena de lípidos a través de HPLC de fase inversa
- Recoja el Bla g 1 escindido y concéntrelo a ~ 2 mL utilizando una unidad de filtro centrífuga con un corte de peso molecular de <10 kDa.
- Agregue <12 mL a la parte superior del concentrador y gire a 5,000 x g durante 10-15 min en un rotor de cubo oscilante.
NOTA: El volumen de la muestra y la velocidad de giro variarán según el filtro específico y el tipo de rotor empleado. Consulte la documentación del fabricante antes de su uso.
- Agregue <12 mL a la parte superior del concentrador y gire a 5,000 x g durante 10-15 min en un rotor de cubo oscilante.
- Cargue el concentrado en un sistema de HPLC de 250 x 10 mm equipado con una columna de cromatografía de fase inversa C18 equilibrada con un tampón A al 97% (agua, ácido trifluoroacético al 0,1%) y un tampón B al 3% (acetonitrilo, ácido trifluoroacético al 0,1%).
NOTA: Se pueden utilizar columnas más pequeñas, pero la proteína puede tener que cargarse y eluerse utilizando varios ciclos para acomodar la capacidad de unión reducida. Al seleccionar una columna, asegúrese de que las perlas de resina tengan un tamaño de partícula de < 5 μm y un tamaño de poro de >200 Å para permitir la separación efectiva de moléculas del tamaño de una proteína
PRECAUCIÓN: El ácido trifluoroacético es altamente corrosivo y debe dispensarse dentro de una campana extractora de humos utilizando el EPP apropiado (es decir, guantes de nitrilo, bata de laboratorio y gafas). El acetonitrilo es moderadamente tóxico, volátil y altamente inflamable, debe usarse y dispensarse dentro de una campana extractora de humos usando epp apropiado (es decir, guantes de nitrilo, bata de laboratorio y gafas). - Elute Bla g 1 utilizando el protocolo mostrado en la Tabla 1 a un caudal de 1,5–4,0 mL/min. Monitoree el proceso de elución utilizando la absorbancia de fluorescencia a 280 nm.
- Recoger y agrupar Bla g 1 fracciones. Bla g 1 normalmente elue a >74% tampón B, o ~34–40 min.
Nota: El tiempo de elución variará ligeramente dependiendo de la velocidad de flujo o el tamaño de la columna. Recoger fracciones basadas en A280 para obtener los mejores resultados.
- Recoger y agrupar Bla g 1 fracciones. Bla g 1 normalmente elue a >74% tampón B, o ~34–40 min.
| Tiempo (Min) | Búfer A (%) | Búfer B (%) |
| 0 | 97 | 3 |
| 10 | 97 | 3 |
| 25 | 35 | 65 |
| 55 | 5 | 95 |
| 65 | 5 | 95 |
| 70 | 97 | 3 |
Tabla 1: Protocolo de elución para Bla g 1. Tabla que ilustra el gradiente de elución empleado en el aislamiento de Bla g 1 utilizando una columna de HPLC C18.
- Alícuota la muestra en tubos de ensayo de vidrio, sin llenar ningún tubo de ensayo más de la mitad del camino (~ 4 mL). Cubra los tubos con película de parafina y perfore la cubierta con dos agujeros para permitir la ventilación.
- Prepare una alícuota separada de 1 mL (alícuota de prueba). Esto se utilizará para determinar el rendimiento esperado.
- Congele las muestras y pruebe la alícuota colocándolas en un congelador de -80 °C durante 1 h, o inmersión en nitrógeno líquido. En el caso de los últimos, el tubo debe girarse continuamente para evitar la rotura del tubo de ensayo debido a la expansión de la fase líquida al congelarse.
- Seque las muestras de proteínas deslipidadas resultantes con un liofilizador. La proteína seca puede almacenarse a 4 °C durante varios meses en un recipiente sellado.
4. Reconstitución de Bla g 1 cargado de apo y carga
- Determinar el rendimiento anticipado de Bla g 1.
- Alícuota de prueba re-liofilizada, deslipidada (post-HPLC) en 5 mL de tampón de refolding, (50 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, 2% DMSO).
- Calentar la mezcla en un baño de agua (500 mL de casto con 250 mL de agua y remover la barra sobre una placa caliente) a 95 °C. Las soluciones de vórtice se incuban de forma intermitente e incuban a 95 °C durante 0,5–1 h.
- Retire el calor y deje que lentamente el baño de agua se equilibre a temperatura ambiente (~ 1 h). La proteína recocida se puede almacenar en esta forma durante la noche a 4 °C si es necesario.
- Pase la mezcla recocida de Bla g 1-lípido a través de un filtro de jeringa de 0,22 μM para eliminar el material particulado.
- Intercambio tampón de la proteína filtrada 3x en PBS pH 7.4 utilizando un filtro centrífugo con 10 kDa de corte como se discute en 3.1 para eliminar los ácidos grasos libres residuales y el disolvente orgánico.
- Evalúe la concentración de la proteína usando el análisis de BCA u otro método preferido tal como absorbancia ULTRAVIOLETA. Utilícese para determinar el rendimiento previsto para las alícuotas bla g 1 restantes.
- Reconstituir Apo- o carga cargada Bla g 1
- Resuspend Bla g 1 alícuotas en tampón de refolding como se describe en 4.1.1.
- Para producir Apo-Bla g 1, repita los pasos 4.1.2–4.1.6 para obtener el rendimiento deseado.
- Para cargar Bla g 1 con ácidos grasos, prepare soluciones de 20 mM de la carga de ácidos grasos deseada en metanol o DMSO. Entonces, salte al paso 4.2.5.
- Para cargar Bla g 1 con fosfolípidos, prepare una acción de 10 mg/mL de la carga deseada en cloroformo dentro de un tubo de ensayo de vidrio.
- Evapore el cloroformo para producir una película lipídica. Agregue PBS al tubo de ensayo para producir una concentración final de fosfolípidos de 20 mM.
PRECAUCIÓN: El cloroformo es dañino si se inhala o se ingiere. Use en una campana extractora de humos químicos o emplee un respirador si hay ventilación inadecuada disponible. Emplear guantes de nitrilo, bata de laboratorio y gafas al manipular. Consulte MSDS antes de su uso. - Rehidrate la película lipídica calentándola por encima de la temperatura de transición de fase de la carga lipídica y vórtice hasta que la solución se vuelva turbia. Tenga en cuenta que la sonicación puede ser necesaria para resuspend completamente y rehidratar algunas cargas.
- Si se requiere sonicación, coloque el tubo de ensayo en el sonicador de baño (100 W, 42 kHz) y sonicar a la máxima potencia hasta que la carga se resuspended. Alternativamente, un sonicador de sonda (descrito en 2.6) se puede utilizar un 10-20% de potencia con un 50% ciclo de trabajo.
PRECAUCIÓN: Sonicación emplea ondas de sonido de alta frecuencia que pueden dañar la audición. Emplear EPP supresores de ruido (tapones para los oídos o silenciadores). Si es posible, coloque el sonicador dentro del gabinete o cámara de amortiguación de sonido.
- Evapore el cloroformo para producir una película lipídica. Agregue PBS al tubo de ensayo para producir una concentración final de fosfolípidos de 20 mM.
- Añadir la carga deseada de ácidos grasos o fosfolípidos para producir un exceso molar de ligandos de 20x en relación con Bla g 1 basado en el rendimiento anticipado determinado en 4.1. El volumen total de disolvente orgánico añadido en esta etapa no debe superar el 2%. Vórtice para mezclar.
NOTA: 1 L de bl 21 células DE3 típicamente produce ~ 0.25–0.4 nmol proteína, correspondiente a ~ 400 μM ligando por tubo. - Recocido de la proteína como se describe en 4.1.
5. Confirmación de la eliminación/carga de la carga de fosfolípidos a través de 31P-RMN
- Concentre muestras de Bla g 1 a >100 μM cargados de apo o carga utilizando una unidad de filtro centrífuga como se describe en 3.1.
- Fosfolípido de referencia de rehidrato en tampón de PBS a concentraciones finales de 2, 1,5, 1, 0,5 y 0,25 mM.
- Diluya las muestras 1:1 con tampón de colal (100 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl, 10% p/v colal) a un volumen total de ~600 μL.
NOTA: Cholate se emplea en este paso para extraer completamente y solubilizar los lípidos de la cavidad hidrofóbica Bla g 1. Esto asegura que el ambiente químico que rodea a los grupos de cabezas de fosfolípidos es consistente entre diferentes muestras, lo que permite su evaluación cuantitativa utilizando 31P-RMN. El uso de colato puede sustituirse por cloroformo/metanol como se describió anteriormente15. - Adquiera espectros 1D 31P-NMR de las muestras de Bla g 1 colalato-solubilizadas y los estándares de fosfolípidos de referencia utilizando una sonda de banda ancha.
NOTA: Los 31espectros P-NMR presentados en este trabajo se obtuvieron utilizando un espectrómetro de 600 MHz. Sin embargo, estudios anteriores que emplean técnicas similares sugieren que se puede lograr una sensibilidad aceptable en intensidades de campo tan bajas como 150-200 MHz15. - Procesar los datos resultantes utilizando el software apropiado16.
- Obtenga las intensidades máximas usando el software preferido de la visióndel RMN 17.
- Compare los espectros Bla g 1 31P-NMR con los obtenidos para las muestras de referencia de fosfolípidos para confirmar la eliminación de ligandos endógenos unidos y/o la unión de los ligandos deseados en función de los cambios químicos de los picos visibles (o la falta de ellos).
- Confirme la estequiometría de unión completa comparando la intensidad máxima del espectro Bla g 1 con la de los estándares de referencia de fosfolípidos.
6. Confirmando bla g 1 plegamiento
- Preparar muestras de 0,5 μM de Bla g 1 en tampón CD (100 mM KH2PO4,tampón pH 7,5). Cargue 2 mL de la muestra en una cubeta de CD de 10 mm con barra de agitación magnética.
- Mida el espectro de CD de Bla g 1 para confirmar la reconstitución de la estructura secundaria. Asegúrese de que el voltaje del fotomultiplicador (PMT) no exceda las recomendaciones del fabricante (generalmente 1 kV).
- Mida la señal de CD de 260–200 nm a 25 °C con un paso de datos de 0,2 nm y una velocidad de exploración de 20 nm/s con un tiempo de integración de datos de 1 s.
- Aumente la temperatura en la celda CD de 25 °C a 95 °C a una velocidad de 0,5 °C/min. Active la barra de agitación magnética para asegurarse de que la temperatura sea uniforme en toda la muestra.
- Monitor CD a 222 nm, tomando lecturas cada 2 °C.
- Ajuste los datos resultantes a una curva de Boltzman de 2 estados para determinar la temperatura de fusión. Debido a la alta estabilidad de Bla g 1, la temperatura de fusión (MT25)se definió como la temperatura a la que la proteína ha perdido el 25% de su CD inicial a 222 nm.
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Representative Results
Mediante cromatografía de afinidad, el GST-Bla g 1 recombinante se aisló fácilmente a un alto nivel de pureza(Figura 1A),produciendo un rendimiento de ~2-4 mg/L de cultivo celular. La incubación durante la noche con proteasa tev a 4 °C es suficiente para eliminar la etiqueta GST, produciendo el producto final a ~ 24 kDa. Tenga en cuenta que en este caso hay una cantidad significativa de GST-Bla g 1 en las fracciones de flujo y lavado, lo que sugiere que se superó la capacidad de unión de la resina de glutatión. El uso de más resina o múltiples ciclos de carga y elución de muestras podría proporcionar remedio para este problema.
La aplicación del Bla g 1 a una columna C18 de fase inversa produce un perfil de elución distintivo(Figura 1B),con dos picos grandes en ~ 50% buffer B, y un segundo pico grande en ~ 75% buffer B. El análisis SDS-PAGE de las fracciones resultantes sugiere que el primero corresponde a la etiqueta GST escindida, mientras que el segundo corresponde a Bla g 1. De vez en cuando un tercer pico más pequeño ocurrirá en el medio correspondiente al GST-Bla g 1 residual, sin hendidura. La presencia de este producto sin escindir se puede eliminar aumentando la cantidad de TEV empleada en la reacción de escisión o extendiendo el tiempo de incubación. Si bien la escisión incompleta reducirá el rendimiento, la separación obtenida en la columna C18 es suficiente para garantizar que la pureza del producto final Bla g 1 permanezca sin compromisos. Una consecuencia de la HPLC de fase inversa es que el producto proteico final se ela en un ambiente de disolvente orgánico. Si bien esto facilita la eliminación de cualquier ligando hidrofóbico, se requiere la eliminación de este disolvente a través de la liofilización, produciendo un polvo blanco esponjoso (Figura 1C).
El recocido de la proteína es necesario para reconstituir el plegamiento nativo de Bla g 1 y se puede llevar a cabo en ausencia o presencia de una carga lipídica. La adición de DMSO a las cargas secas de Bla g 1 y fosfolípidos antes del tampón de replegado facilita el proceso de solubilización, aunque algunas cargas lipídicas de cadena más larga no se disolverán completamente incluso a temperaturas elevadas. Sin embargo, no se observó que esto afectara la eficacia de carga entre los lípidos probados en nuestros estudios (Figura 1C). Del mismo modo, el exceso de lípidos a menudo se precipitará fuera de la solución o formará vesículas grandes al enfriarse, lo que resulta en una apariencia turbia después del recocido (Figura 1C). Esto tampoco se observó para afectar la eficiencia de carga, y los agregados se eliminan fácilmente a través de la filtración y los pasos posteriores de intercambio de búfer para producir una solución clara y transparente. A pesar de las duras condiciones, no se observó termólisis para Bla g 1.
Figura 1: Purificación inicial de Bla g 1. a) SDS-PAGE que muestre la fracción de proteínas solubles después de la lisis inicial (S); flujo a través (FT), lavado (W) y elución de la columna de glutatión-sefarosa (E); y el producto final Bla g 1 después de la escisión tev de la etiqueta GST (TEV). El perfil de elución hplc del producto Bla g 1 resultante después de la escisión tev se muestra en (B). Un280 se muestra en azul, mientras que el gradiente de elución (% Buffer B) se muestra en verde. Las fracciones correspondientes a la etiqueta GST escindida (H1, H2), GST-Bla g 1 (H3) residual sin hendidura y Bla g 1 (H4) purificado se indican con flechas rojas en ~ 50%, ~ 65% y ~ 74% Buffer B respectivamente. El análisis SDS-PAGE de las fracciones H1-H4 se muestra en(A)y se etiqueta en consecuencia. (C) Imágenes representativas que muestran Bla g 1 en varias etapas del proceso de recocido. Nótese que la precisión y el alcance de la formación de precipitados como se muestra en ii y iii depende del tipo de carga lipídica empleada. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
31 Los espectros de RMN P de Apo-Bla g 1 purificados de esta manera no muestran fosfolípidos detectables ni por RMN(Figura 2A)ni por cromatografía de capa delgada (datos no mostrados). Por el contrario, espectros similares obtenidos para Bla g 1 cargado con un fosfolípido de distearoilfosfatidilcolina (DSPC) muestran un pico fuerte correspondiente al grupo principal de fosfatidilcolina. Para la comparación, un espectro representativo de 31P-RMN de Bla g 1 purificado a partir de E. coli recombinante sin el uso del protocolo de eliminación/recocido lipídico aquí descrito (ecBla g 1) muestran una mezcla heterogénea de lípidos endógenos extraídos del sistema de expresión recombinante(Figura 2B). Aprovechando la naturaleza cuantitativa de la RMN, se puede producir una curva estándar utilizando muestras de referencia de concentraciones conocidas de DSPC (Figura 2C). Comparando la intensidad de la señal de 31P obtenida de DSPC-Bla g 1 contra esta curva estándar se obtiene una estequiometría de unión de 4,7 ± 0,5 lípidos por proteína; un valor que se compara favorablemente con la estequiometría de unión completa predicha obtenida a partir de estudios in silico y análisis estructural9. Tenga en cuenta que esta técnica sólo detectará ligandos que contienen un núcleo de 31P como fosfolípidos, lisfosfolípidos, lipopolisacáridos, etc. Sin embargo, este protocolo se puede adaptar fácilmente para el análisis de 13C-RMN. En este caso, los ácidos grasos etiquetadosmetil-13C serían recomendados debido a sus propiedades favorables de la relajación del RMN. La restricción del etiquetado isotópico a un solo sitio también facilita la interpretación espectral, ya que solo se espera un pico, al tiempo que reduce el costo en relación con las contrapartes uniformes con 13etiquetas C. Un enfoque alternativo sería emplear mass-spec para identificar ligandos unidos, como se demostró en un estudio anterior que identificó una mezcla de ácidos grasos como la carga natural de Bla g 1 aislado de la cucaracha frass (nBla g 1)9. Sin embargo, las limitadas capacidades de cuantificación de las especificaciones de masa impidían una medición precisa de la estequiometría de unión sin estándares suficientes.
Figura 2: Verificación de la eliminación de lípidos y la carga de Bla g 1. (A) 31espectros P-RMN de Apo- (negro) o DSPC-cargados Bla g 1 (rojo) preparados utilizando el protocolo de recocido descrito en este trabajo que demuestra la eliminación completa de lípidos en el primero, y la carga homogénea de lípidos fosfatidilcolina (PC) logrados en el segundo. Por el contrario, Bla g 1 purificado de E. coli recombinante sin despojo de lípidos y recocido (ecBla g 1) muestra una mezcla heterogénea de fosfatidiletanolamina endógena (PE) y fosfatidilglicerol (PG) lípidos cuando se analiza utilizando este método(B). Una curva estándar representativa obtenida a partir de muestras de referencia DSPC de concentraciones conocidas se muestra en (C), a partir de la cual se puede obtener la estequiometría de unión Bla g 1. Figuras adaptadas de Foo et al. (2019) y presentadas bajo la Licencia Creative Commons CC BY9. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
Las estructuras cristalinas de Bla g 1 revelan un pliegue único que consiste en 12 alfa-hélices anfipáticas. El dicroísmo circular representa un método rápido y conveniente para evaluar si este pliegue se ha reconstituido con éxito después del proceso de recocido. Los espectros de CD para Apo- y lípidos (nMix)-cargados de Bla g 1 muestran mínimos ~220 y 210 nm indicativos de una estructura predominantemente alfa-helicoidal (Figura 3A). Este espectro es extremadamente similar al obtenido para ecBla g 1 y nBla g 1, proporcionando evidencia adicional de que la estructura nativa de Bla g 1 se recupera con éxito. Esto se confirmó aún más mediante el uso de 19F y 1H-15 N solución-RMN, una discusión completa de los cuales está disponible en otra parte9. Los ensayos de desnaturalización térmica basados en CD muestran una pérdida cooperativa de la estructura secundaria alfa-helicoidal indicativa de un dominio globular plegado (Figura 3B). El análisis de las temperaturas de fusión resultantes (Figura 3C) muestran un aumento significativo en la unión del ligando nMix. Esta termoestabilidad elevada está en línea con la calculada para nBla g 1, lo que indica que somos capaces de reproducir completamente el estado natural de Bla g 1. Tenga en cuenta que ecBla g 1 también muestra una mejora similar, si no mayor, en la termoestabilidad, que ilustra el potencial de lípidos residuales endógenos unidos para interferir con la caracterización biofísica de alérgenos purificados utilizando enfoques tradicionales basados en FPLC. En cambio, la capacidad de quitar cuantitativo y de recargar cargas hidrofóbicas de alérgenos tales como Bla g 1 proporciona una avenida única de examinar el papel de lípidos en la respuesta alérgica. Aquí, describimos un método para examinar la influencia de los cargamentos del lípido en la estructura, la estabilidad, y el proceso endosomal de las proteínas alergénicas ellos mismos, aunque otras vías del estudio podrían ser consideradas.
Figura 3: Confirmación de la recuperación exitosa del bla g 1 doblez. (A)Espectros de CD de Apo- (negro) o nMix-cargado (rojo) Bla g 1 purificado y recocido utilizando el protocolo descrito en este documento, con mínimos a ~ 220 y 210 nm indicativos de una estructura predominantemente alfa-helicoidal consistente con la estructura cristalina de rayos X disponible. Los espectros Bla g 1 cargados de Apo- y nMix son extremadamente similares con los obtenidos para Bla g 1 purificados de E. coli recombinante (ecBla g 1, verde) o de su fuente alergénica natural (nBla g 1, azul) sin el protocolo de eliminación de lípidos y recocido, apoyando aún más la recuperación exitosa de la estructura nativa en el primero. (B)Perfiles térmicos representativos para Apo- (negro) y nMix-cargado (rojo) Bla g 1 mostrando una curva sigmoidal indicativa de despliegue cooperativo. nBla g 1 (azul) y ecBla g 1 (verde) se muestran como referencia. Las temperaturas de fusión calculadas (MT25)de Bla g 1 se muestran en (C). La unión de n LigandosMix (rojo) produce un aumento significativo en la termoestabilidad en relación con Apo-Bla g 1 (negro). Esto refleja la tendencia observada para nBla g 1 (azul), lo que sugiere que somos capaces de recuperar con éxito el estado nativo. La estabilidad aún mayor observada para ecBla g 1 destaca el potencial de los lípidos endógenos unidos para interferir con la caracterización biofísica de alérgenos. Los valores de MT25 presentados en C representan el valor medio obtenido de al menos tres ensayos independientes. Las barras de error representan los valores de desviación estándar correspondientes. Figuras adaptadas de Foo et al. (2019) y presentadas bajo la Licencia Creative Commons CC BY9. Haga clic aquí para ver una versión más amplia de esta figura.
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Discussion
El protocolo descrito en este trabajo se ha aplicado con éxito para estudiar sistemáticamente las propiedades de unión lipídicas de Bla g 1. Esto reveló una correlación entre la unión a la carga, la termoestabilidad y el procesamiento endosomal, el último de los cuales se correlacionó con la disminución en la generación de un epítopo de células T conocido con posibles implicaciones para la inmunogenicidad9,18. Además de Bla g 1, se ha demostrado que otros alérgenos como Pru p 3 y Bet v 1 retienen sus cargas endógenamente unidas cuando se purifican utilizando métodos estándar de cromatografía de afinidad y exclusión de tamaño13,19,20,21,22. Estos invitados no deseados podrían alterar las propiedades biofísicas e inmunológicas de estas proteínas de una manera similar, destacando la necesidad de técnicas para asegurar la delipidación completa como la que se presenta aquí.
Mientras que el uso de hplc de fase inversa en la purificación de alérgenos se ha descritopreviamente 2,el acoplamiento con un protocolo de recocido térmico proporciona la oportunidad bastante inusual de reconstituir alérgenos con una gama de ligandos naturales y no naturales, lo que permite a los usuarios sondear las interacciones lípido-alérgeno. Este paso de desnaturalización térmica se encontró que era esencial para dos propósitos principales. En primer lugar, se requiere la desnaturalización térmica para facilitar el acceso de los ligandos a sus cavidades de unión que, debido a su naturaleza hidrofóbica, a menudo se entierran lejos del disolvente acuoso9,22. En segundo lugar, los ligandos hidrofóbicos como los ácidos grasos y los fosfolípidos a menudo forman estructuras supramoleculares más grandes, como micelas o vesículas, cuando se colocan en un ambiente acuoso. La concentración de ligandos monoméricos o "libres" disponibles para la unión a proteínas se puede aproximar utilizando la concentración crítica de micelas (CMC). DSPC y otros fosfolípidos de cadena larga tienen valores de CMC en el rango de nM, lo que indica que prácticamente no hay ligandos libres disponibles para bla g 1 unión. Incluso los lípidos de cadena corta y los ácidos grasos tienen CMC en el rango bajo de μm a mM, lo que indica que una gran proporción de estos ligandos permanecen en la fase micelar o bicapa23. Sin embargo, las altas temperaturas empleadas en nuestro protocolo de desnaturalización dispersan estos agregados más grandes, facilitando la unión. Estudios anteriores han empleado típicamente períodos de incubación prolongados para facilitar este proceso. Sin embargo, la falta de un proceso de desnaturalización/recocido térmico plantea dudas sobre la eficacia de la carga. Por ejemplo, la incubación del alérgeno ácaro Der p 5 con el análogo de ácido graso fluorescente 11-(Dansylamino)ácido undecanoico (DAUDA) produjo una estequiometría de unión de 0,66 a pesar de poseer una gran cavidad hidrofóbica a la par con Bla g 124. Del mismo modo, se encontró que la especificidad de unión y la estequiometría de los nsLTPs de las plantas varían mucho dependiendo de si los lípidos y la proteína se solubilizan primero en metanol antes de la adición de tampón acuoso, lo que indica que la accesibilidad del ligando y /o del sitio de unión fue un factor limitante25.
Además de Bla g 1, hemos aplicado con éxito la misma estrategia a varias otras proteínas de dominio MA de cucarachas y mosquitos(A. aegypti),así como Der p 2 (datos no mostrados). Observamos que tanto el Bla g 1 homólogos y Der p 2 eluted en un momento diferente que Bla g 1 de la columna C18 (paso 3.3). Los gradientes de elución en este paso pueden necesitar ser optimizados para otras proteínas. Alternativamente, se pueden emplear columnas de HPLC con una fase estacionaria menos hidrofóbica (por ejemplo, C8), aunque en el caso de Bla g 1 el aumento de la hidrofobicidad de la columna C18 fue necesario para eliminar completamente los contaminantes fosfolípidos diacilicos de ecBla g 1. A pesar de las diferencias en las propiedades biofísicas y bioquímicas, hemos encontrado que este protocolo es extremadamente robusto y podría aplicarse fácilmente a otras proteínas alergénicas. Si bien las duras condiciones empleadas pueden presentar una limitación potencial, el aumento de la resiliencia observado para muchos alérgenos reduce su impacto26,27. De hecho, se ha observado que varios alérgenos alimentarios y de inhalación como Der p 2, Ber e 1, Ara a 6 y Lep w 1 recuperan su estructura e inmunogenicidad después de la desnaturalización térmica, aunque la optimización de las condiciones de amortiguación puede ser necesaria28,29,30,31,32,33; por ejemplo, la desnaturalización reversible de nsLTP(Cor a 8) y thaumatins (Mal d 2 y Acto d 2) sólo se observa en condiciones ácidas (pH <4)28,30,31. Además, cabe señalar que los autores no intentaron optimizar ni el momento ni las temperaturas empleadas en el protocolo de recocido. Es posible que la solubilización del ligando y el plegamiento/desdoblamiento de proteínas puedan lograrse utilizando una temperatura máxima más baja, como se observa con Ber e 1, para la que se logra una desnaturalización reversible a 82 °C29. Se espera que el uso de tales medidas amplíe la gama de alérgenos a los cuales este protocolo puede ser aplicado.
Otra consideración importante a la hora de adaptar este protocolo a otros sistemas alergénicos es la concentración de ligandos necesarios durante el proceso de recocido. En el caso de Bla g 1 el rendimiento esperado es de ~0.25–0.4 μmol de proteína por cultivo celular de 1 L. Dada la estequiometría de unión demostrada de 8 ácidos grasos o 4 lípidos de cadena diacil por alérgeno, se empleó un exceso molar de carga de 20-40 veces (5-10 μmol). Cabe señalar que la capacidad de unión lipídica de Bla g 1 y sus homólogos es única; por ejemplo, los nsLTP son generalmente aceptados para unirse como máximo a dos ligandos lipídicos25, mientras que los lipocalinos tienen menos de 1 estequiometría34. Como tal, la carga completa de estos tipos de alérgenos se puede lograr con un menor exceso de ligandos. Una consideración final al adaptar este protocolo a otros sistemas alergénicos es la presencia de enlaces disulfuro, que pueden ser problemáticos si no se forman adecuadamente antes de la desnaturalización. Un posible enfoque sería llevar a cabo el proceso de recocido en presencia de un agente reductor como la TDT de 2 mM. Los enlaces disulfuro nativos podrían volver a formarse posteriormente mediante la adición de glutatión reducido y oxidado como se describe para el fragmento alergénico de maní estudiado por Aalberse et al.35. En este caso, la recuperación del enlace correcto del disulfuro debe evaluarse empíricamente mediante espectrometría de masas35.
En este trabajo describimos una técnica a través de la cual los alérgenos pueden ser deslipidados y re-recocidos con diversas cargas de fosfolípidos y ácidos grasos. Sin embargo, hay muchas otras clases de ligandos potencialmente inmunogénicos o adyuvantes presentes dentro de los reservorios de alérgenos comunes. Por ejemplo, se ha propuesto que los alérgenos de gatos, perros y ácaros se unen a lipopolisacáridos (LPS) y otros lípidos bacterianos del polvodoméstico 36,mientras que el Bet v 1 ha demostrado extraer flavonoides complejos de la matriz de polen13. El protocolo descrito en este trabajo se puede adaptar fácilmente para explorar el papel de estos lípidos de una manera más detallada. Como prueba de concepto hemos podido demostrar que la cavidad hidrofóbica de Bla g 1 es capaz de unirse al ácido lipoteicoico (LTA) de las paredes celulares de bacterias grampositivas, pero excluye lps de especies gramnegativas, reflejando potencialmente el mayor número de cadenas acilo en estas últimas9. Llevando esto un paso más allá, uno podría utilizar el protocolo de desnaturalización térmica / recocido para incorporar sondas fluorescentes y otros análogos de ácidos grasos no naturales en proteínas alergénicas. De hecho, pudimos cargar la cavidad hidrofóbica del homólogo del mosquito de Bla g 1 con DAUDA, abriendo vías adicionales para examinar los efectos de los ligandos lipídicos sobre la enfermedad alergénica.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer al Dr. Tom Kirby, Scott Gabel y al Dr. Robert London por su ayuda y asistencia a lo largo de este trabajo, junto con el Dr. Bob Petrovich y Lori Edwards por el uso de su instrumentación y su asistencia en la generación de las construcciones Bla g 1 empleadas en este estudio. Agradecemos a Andrea Adams por su ayuda con la espectrometría de masas, y al Dr. Eugene DeRose por su ayuda con la instrumentación de RMN. Esta investigación fue apoyada por el Programa de Investigación Intramuros de los NIH, Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental, Z01-ES102906 (GAM). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales del Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bla g 1 Gene | Genescript | N/a | Custom gene synthesis service. GenBank Accession no AF072219 Residues 34-216 |
| Affinity purified natural Bla g 1 (nBla g 1) | Indoor biotechnologies | N/a | Custom order |
| Agilent 1100 Series HPLC System | Agilent | G1315B, G1311A, G1322A | UV Detector, Pump, and Degasser |
| Agilent DD2 600 MHz spectrometer | Agilent | N/a | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Amicon | UFC-1008 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Benzonase | Sigma-Aldrich | E1014-5KU | |
| Broad- band 5 mm Z-gradient probe | Varian | N/a | |
| ChemStation for LC (Software) | Agilent | N/a | |
| cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Distearoylphosphatidylcholine (18:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850365C | |
| E. Coli BL21 DE3 Cells | New England Biolabs | C2530H | |
| Freezone 4.5 Freeze Dry System | Labconco | 7750000 | |
| Glutathione Resin | Genescript | L00206 | |
| Glutathione, Reduced | Fisher Scientific | BP25211 | |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | 34060 | |
| Jasco CD spectropolarimeter | Jasco | J-815 | |
| Millex Syringe Filter Unit | EMD Millipore | SLGS033SS | |
| NMRPipe (Software) | Delaglio et al. | N/a | Delaglio, F. et al. Nmrpipe - a Multidimensional Spectral Processing System Based On Unix Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277–293 (1995). |
| NMRViewJ (Software) | Johnson et al. | N/a | Johnson, B. A. & Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. J. Biomol. NMR 4, 603–614 (1994). |
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Pierce BCA Protein Assay | Sigma-Aldrich | BCA1-1KT | |
| Polaris 5 C18-A 250x10.0 mm HPLC Column | Agilent | SKU: A2000250X100 | |
| SD-200 Vacuum Pump | Varian | VP-195 | |
| Sodium Cholate Hydrate | Sigma-Aldrich | C6445 | |
| Sodium Palmitate | Sigma-Aldrich | P9767 | |
| Sodium Stearate | Sigma-Aldrich | S3381 | |
| VnmrJ (Software) | Varian | N/a |
References
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