Summary
このプロトコルは、アレルゲンからの内在性脂質の除去と、熱アニーリングと結合された逆相HPLCによるユーザ指定リガンドとの置換を記述する。 31P-NMRおよび円形二色症はリガンドの除去/負荷の速い確認、およびネイティブアレルゲン構造の回復を可能にする。
Abstract
多くの主要なアレルゲンは、Mus m、Bet v 1、Der p 2、およびFel d 1を含む疎水性脂質様分子に結合します。これらのリガンドは強く保持されており、免疫系を直接刺激するか、アレルギー性タンパク質の生物物理学的性質を変化させることによって感作プロセスに影響を与える可能性を有する。これらの変数を制御するためには、内因性結合リガンドの除去と、必要に応じて既知の組成物の脂質と置換する技術が必要である。ゴキブリアレルゲンブラg1は、従来の技術を使用して精製した場合に内因性脂質の異種混合物を結合する大きな疎水性空洞を囲む。ここでは、逆相HPLCを用いてこれらの脂質を除去し、続いて熱アニーリングを行い、そのアポ形態でBla g 1を得るか、または脂肪酸またはリン脂質カルゴのユーザ定義混合物でリロードする方法について述べた。このプロトコルと生化学的アッセイを結合すると、脂肪酸貨物はBla g 1のサーモスタ性とタンパク質分解性を有意に変化させ、T細胞エピトープ生成およびアレルゲン性の速度に下流の影響を及ぼすことが明らかになった。これらの結果は、組換え源と天然源の両方からアレルゲンを研究する際にここに記載されているような脂質除去/リロードプロトコルの重要性を強調している。このプロトコルは、リポカリン(Mus m 1)、PR-10(Bet v 1)、MD-2(Der p 2)、ウトログロビン(Fel d 1)を含む他のアレルゲンファミリーに一般化可能であり、アレルギー反応における脂質の役割を研究するための貴重なツールを提供する。
Introduction
アレルゲンデータベースの調査では、アレルゲンは全ての既知のタンパク質ファミリーの2%にしか見つからないことが明らかになっており、一般的な機能的および生物的性質がアレルゲン性1に寄与することを示唆している。これらの特性のうち、脂質貨物を結合する能力はアレルゲンの間で強く過剰に表現されているように見えるが、これらの貨物が感作プロセス1に影響を与える可能性があることを示唆している。実際、ブラジルナッツアレルゲンBer e1は、その完全な感作電を実現するためにその内因性脂質との共投与を必要とすることが示されている2.これらの脂質は、MITアレルゲンDer p2およびDer p 7によって示されるように免疫系を直接刺激する可能性があり、どちらもLPS結合タンパク質3、4、5と強い構造相同性を共有する。この観察に基づいて、Derp2とDerp7は細菌脂質を結合し、TLR4媒介シグナル伝達を介して宿主免疫系を直接刺激し、感作プロセス5,6を促進することが提案された。また、内因性に結合した脂質が、アレルギー性タンパク質自体の生物物理学的性質を変化させる可能性もあります。例えば、Sina2(マスタード)およびArah1(ピーナッツ)とリン脂質小胞と相互作用する能力は胃および内皮分解7に対する耐性を有意に増強し、一方で主要な白樺花粉アレルゲンBet v 1へのリガンド結合は、内経処理の速度と得られるペプチドの多様性を両方とも変化させた。これは特に、安定性、T細胞エピトープ生成、およびBet v 1およびBla g 1などのタンパク質のアレルゲン性との間で観察された相関関係を考えると、アレルゲン性に関連する。後者は、この作品9、10の主題になります。
Bla g 1は、昆虫主アレルゲン(MA)タンパク質ファミリーの原型型的なメンバーを表し、異常に大きな疎水性キャビティ9,11を囲む12の両生媒性アルファヘリックスからなるユニークな構造を有する。Bla g 1の利用可能なX線結晶構造は、結合したリン脂質または脂肪酸リガンドと一致するこの空洞内の電子密度を示す。31P-NMRと質量分析によって確認された推測。これらの貨物は本質的に異種であり、その組成はアレルゲン源に大きく依存しており、大腸菌およびP.パストリスで発現する組換えブラg1について異なる脂質プロファイルが観察された。不思議なことに、天然のアレルゲン源(ゴキブリのフラス)から精製されたBla g 1は、その結合部位に主に脂肪酸を含み、パルミチン酸塩、オレエー酸酸、ステアレートの混合物がその「天然」リガンド9,11として同定された。複数の精製ステップに従って脂質および脂肪酸を保持するBla g 1の能力は、単離でタンパク質を研究する努力を妨げる。逆に、天然のパルミチン酸、ステアリン酸、および、Bla g 1のオレエー酸リガンド(それ以降はnMixと呼ばれる)がそのアレルゲン性およびネイティブ生物学的機能9の両方において重要な役割を果たすることが示唆されている。しかし、これらのリガンドは組換え源から得られたBla g 1には存在せず、この仮説を評価することは困難である。同様の問題は、ベットv 112,13のような他の脂質結合アレルゲンに対して観察されている。脂質とアレルゲン相互作用の体系的な研究を容易にするために、アレルゲンを内因的に結合した脂質を定量的に取り除き、アポ形態または特異的リガンドを装填するプロトコルを開発しました。
アレルゲンは、アフィニティークロマトグラフィーおよび/またはサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、自然または組み換え源から最も一般的に精製されます。ここでは、アレルゲンが脂肪酸結合タンパク質14用に開発されたプロトコルと同様の有機溶媒に溶出される逆相C18カラムを採用した、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)の形で追加の精製工程を導入する。得られたタンパク質は、次いで、脂肪酸および/またはリン脂質の存在または存在下で熱アニーリングステップを行う。天然のBla g1を回収することに加えて、高温は脂質貨物の溶解性および入手可能性を高め、所望の疎水性リガンドを均一にアポ形態または均一に装填した状態でBla g1を得る。 31このように精製されたBla g 1のP-NMRスペクトルは、所望の化合物との内因的に結合したリガンドおよび均一な置換の完全な除去を確認し、環状二色は、ブラg1倍の正常な回収を確認した。この方法の有用性は、貨物結合がBla g 1のサーモスタ性およびタンパク質分解性を増強し、感作およびアレルギー性に潜在的な影響を及ぼすT細胞エピトープ生成の運動学を変化させることが判明した最近の研究で強調されている。
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Protocol
1. ブラ g 1 クローニング
- ゴキブリアレルゲンブラg1.0101(残基34-216)に対する遺伝子を得て、MAドメインの単一反復を表す。簡単にするために、Bla g 1は、Bla g 1.0101トランスクリプト全体ではなく、この単一の繰り返しを表すために、作業全体で使用されます。
- 目的のベクターにBla g1遺伝子をサブクローニングする。本研究では、タバコエッチウイルス(TEV)プロテアーゼ切断部位に結合したN末端グルタチオンS-トランスビターゼ(GST)タグを含む遺伝子を、前述の11の発現のためにpGEXベクターに挿入した。
- Bla g 1 pGEX ベクターを BL21 DE3 大腸菌 細胞に変換します。
- 目的のベクトルの10 ng/μLストックを準備します。
- メーカーが提供するBL21 DE3細胞の50 μLと10 ng/μL DNAストックの1 μLを組み合わせます。
- BL21 DE3-DNA混合物を氷上で30分間インキュベートします。42°Cの水浴に1分間移し、すぐに氷の上に戻して1分間のインキュベーションを行います。
- 200 μL の LB 培地を細胞に加え、37 °C でさらに 1 時間インキュベートします。
- 100 mg/L アンピシリンを含む LB-寒天プレートに形質転換した細胞をプレートし、一晩で 37 °C で成長します。
2. 初期表現と精製
- 1.3に記載されているようにBl21 DE3細胞の単一コロニーを有する100mg/Lアンピシリンを含むLB培地の1Lを接種する。一晩で37°Cで成長します。
- 翌日、100mg/Lアンピシリンを含む2X YT培地の2Lで6,000xgの遠心分離を介して細胞(OD600〜1.5)を収穫する。 細胞が37°Cで1時間成長し、OD600>0.6に成長させます。
- 0.5 mM IPTGを添加してタンパク質発現を誘導する。細胞を18°Cに移し、一晩インキュベートする。
- 翌日、2.2に記載されたように細胞を収穫する。得られた細胞ペレットを、-20°Cで凍結保存することができる。
- 1 Lの培養液から得られたペレットを50 mLのリシスバッファー(50 mM Tris-HCl pH 8.5, 100 mM NaCl)に1個のプロテアーゼ阻害剤錠剤(または同等)と1 μLのベンゾナーゼヌクレアーゼを含む。
- プローブソニケーター(500 W、20 kHz)を使用したLyseセルは、50%のデューティサイクルで4分間30〜50%のパワーに設定されています。超音波処理中に氷浴中にライセートを保管してください
- 遠心分離機は45,000 x g で20分間にリセートする。不溶性分画(ペレット)を捨てる。
- 可溶性タンパク質28μLを除去します。5x SDS-PAGEバッファの7 μLと組み合わせて、SDS-PAGE分析用に保存します。TEVでインキュベーションの前後に、GSTカラムのフロースルー、洗浄、溶出分分についてこの手順を繰り返します。
- PBS pH 7.4で平衡化したグルタチオン樹脂カラム(約10mL総床容積)に可溶性タンパク質(上清)を適用します。
- 50 mLのPBSを使用して、非結合タンパク質を洗い流します。
- 10 mM減少グルタチオンを含有するPBSの50 mLを用いたエルテグGST-ブラg 1.
- 溶出したタンパク質を4°Cで一晩0.2kU TEVプロテアーゼ、または6時間室温でインキュベートしてGSTタグを除去する。
3. 逆相HPLCによる内因性脂質除去
- 切断されたブラg1を回収し、<10kDa分子量カットオフを有する遠心フィルターユニットを用いて〜2mLに濃縮する。
- <12 mL サンプルをコンセントレータの上部に加え、スイングバケットローターで10~15分間5,000 x g でスピンします。
注: サンプルの体積とスピン速度は、特定のフィルタと使用するロータの種類によって異なります。使用前に製造元のマニュアルを参照してください。
- <12 mL サンプルをコンセントレータの上部に加え、スイングバケットローターで10~15分間5,000 x g でスピンします。
- 濃縮液を、97%バッファーA(水、0.1%トリフルオロ酢酸)と3%バッファーB(アセトニトリル、0.1%トリフルオロ酢酸)と平衡したC18逆相クロマトグラフィーカラムを搭載した250 x 10 mm HPLCシステムに積み込みます。
注:より小さなカラムを使用することもできますが、タンパク質は、結合容量の低下に対応するために複数のサイクルを使用してロードおよび溶出する必要があります。カラムを選択する際、樹脂ビーズの粒子径が5μm<、孔径>200Åの孔径を持ち、タンパク質サイズの分子を効果的に分離できるようにしてください。
注意:トリフルオロ酢酸は腐食性が高く、適切なPPE(すなわち、ニトリル手袋、ラボコートおよびゴーグル)を使用して、ヒュームフード内に分配されるべきである。アセトニトリルは、適度に有毒で揮発性で、非常に可燃性が高く、適切なPPE(すなわち、ニトリル手袋、ラボコートおよびゴーグル)を使用してヒュームフード内で使用および分配されるべきである。 - Elute Bla g 1 は 、流 速 1.5 ~ 4.0 mL/min で表 1 に示すプロトコルを使用します。280nmで蛍光吸光度を用いて溶出プロセスを監視します。
- 収集し、プールブラg 1分数。通常、Bla g 1 は >74% バッファー B、または~34 ~ 40 分で溶出します。
注: 溶出時間は流量や列のサイズによって若干異なります。最良の結果を得るには、A280 に基づいて分数を収集します。
- 収集し、プールブラg 1分数。通常、Bla g 1 は >74% バッファー B、または~34 ~ 40 分で溶出します。
| 時間(分) | バッファ A (%) | バッファB (%) |
| 0 | 97 | 3 |
| 10 | 97 | 3 |
| 25 | 35 | 65 |
| 55 | 5 | 95 |
| 65 | 5 | 95 |
| 70 | 97 | 3 |
表1: Bla g 1 の溶出プロトコル.C18 HPLCカラムを用いたBla g1の分離に採用された溶出勾配を示す表。
- アリコートは試料をガラス試験管に、試験管を半分以上充填しない(〜4mL)。パラフィンフィルムでチューブをカバーし、通気を可能にするために2つの穴でカバーを穿孔します。
- 別の1 mLアリコート(テストアリコート)を準備します。これは、予想利回りを決定するために使用されます。
- サンプルを凍結し、1時間、または液体窒素に浸漬して-80°Cの冷凍庫に入れて、アリコートをテストします。後述の場合、凍結時の液相の膨張による試験管の破損を避けるために、チューブを連続的に回転させる必要があります。
- 得られた脱脂タンパク質サンプルを凍結乾燥剤を使用して乾燥する。乾燥したタンパク質は、密閉容器内に数ヶ月間4°Cで保存することができる。
4. アポと貨物積載のブラg 1の再構成
- 予想されるBla g 1の収率を決定します。
- 再懸濁乾燥し、脱脂(ポストHPLC)リフォールディングバッファーの5 mLでの試験アリコート(50 mM HEPES pH 7.4、100 mM NaCl、2%DMSO)。
- 水浴(250 mL水で500 mLビーカー、ホットプレート上でバーをかき混ぜる)で混合物を95°Cに加熱します。渦液は断続的に、95°Cで0.5~1時間インキュベートします。
- 熱を取り除き、ゆっくりと水浴を室温(〜1時間)に平衡させます。アニールタンパク質は、必要に応じて4°Cでこの形態で一晩保存することができます。
- 0.22 μMのシリンジフィルターを通してアニールされたBla g 1-脂質混合物を通して粒子状物質を除去する。
- バッファーは、残留遊離脂肪酸および有機溶媒を除去するために3.1で説明したように、10 kDaカットオフを有する遠心フィルターを使用して、濾過されたタンパク質3xをPBS pH 7.4に交換する。
- BCAアッセイまたはUV吸光度などの他の好ましい方法を用いてタンパク質濃度を評価する。これを使用して、残りの Bla g 1 アリコートの予想利回りを決定します。
- アポまたは貨物積載のブラg 1を再構成する
- 4.1.1 で説明されているように、再折りたたみバッファー内の Bla g 1 アリコートを再中断します。
- Apo-Bla g 1 を生成するには、ステップ 4.1.2 ~ 4.1.6 を繰り返して、希望する歩留まりを得る。
- 脂肪酸とのBla g 1をロードするには、メタノールまたはDMSOで所望の脂肪酸貨物の20 mMストック溶液を調製する。 次に、ステップ 4.2.5 に進みます。
- リン脂質を含むBla g 1をロードするには、ガラス試験管内のクロロホルムに所望の貨物の10mg/mLストックを調製します。
- クロロホルムを蒸発させて、脂質膜を作製する。PBSを試験管に加えるし、20 mMの最終的なリン脂質濃度を作り出す。
注意:クロロホルムは吸入または飲み込むと有害です。化学発煙フードで使用するか、不十分な換気が利用可能な場合は、呼吸器を採用.ニトリル手袋、ラボコート、ゴーグルを取り扱う際に使用してください。使用前にMSDSを参照してください。 - 脂質の温度を上の温度で加熱し、溶液が白濁するまで渦を加熱して、脂質膜を水分補給します。超音波処理は、完全に再中断し、いくつかの貨物を水分補給する必要があることに注意してください。
- 超音波処理が必要な場合は、浴超音波装置(100 W、42 kHz)に試験管を置き、貨物が再中断されるまで最大電力で超音波処理します。あるいは、プローブ超音波処理器(2.6に記載)は、50%のデューティサイクルで10〜20%のパワーを使用することができます。
注意:超音波処理は、聴覚を損傷する可能性のある高周波音波を採用しています。ノイズ抑制PPE(耳栓またはマフラー)を採用。可能であれば、音減衰キャビネットまたはチャンバー内に超音波処理器を配置します。
- クロロホルムを蒸発させて、脂質膜を作製する。PBSを試験管に加えるし、20 mMの最終的なリン脂質濃度を作り出す。
- 所望の脂肪酸またはリン脂質貨物を加えて、4.1で決定された予想収率に基づいて、Bla g 1に対して20倍のモル過剰のリガンドを生成します。この工程で添加した有機溶媒の総容積は2%を超えてはなりません。混ぜる渦。
注:Bl 21 DE3細胞の1 Lは、通常、チューブあたり〜400 μMリガンドに対応する、〜0.25〜0.4 nmolタンパク質を生成します。 - 4.1に記載したタンパク質をアニールする。
5. リン脂質貨物の取り外し/積載 を確認する 31P-NMR
- 3.1に記載されている遠心フィルタユニットを使用して、Apoまたは貨物積載のBla g 1~>100 μMのサンプルを濃縮します。
- 参照リン脂質をPBSバッファーに2、1.5、1、0.5、0.5、0.25 mMの最終濃度にリハイドレートします。
- サンプル1:1を、約600μLの総容量に、100 mM Tris pH 8.0、100 mM NaCl、10%w/vのチョレートを用いた希釈液。
注:Cholateは、このステップで、Bla g 1疎水性キャビティから脂質を完全に抽出し、可溶化するために使用されます。これにより、リン脂質ヘッドグループを取り巻く化学環境が異なるサンプル間で一貫していることを保証し 、31P-NMRを使用した定量的評価が可能になります。前述の15に記載したクロロホルム/メタノールの代用が可能な状態で、この使用はクロロホルム/メタノールに代用できる。 - 広帯域プローブを用いて 、1D31P-NMRスペクトルを取得し、1サンプルの軟化ブラg1サンプルと参照リン脂質標準を取得します。
注:この研究で提示された 31P-NMRスペクトルは、600MHzの分光計を使用して得られました。しかし、同様の技術を採用した以前の研究では、150〜200 MHzの低いフィールド強度で許容感度を達成できることを示唆しています。 - 適切なソフトウェア16を使用して、結果のデータを処理します。
- 好ましいNMR表示ソフトウェア17を用いてピーク強度を得る。
- Bla g 1 31P-NMR スペクトルをリン脂質参照サンプル用に得られたスペクトルと比較して、可視ピークの化学シフト(またはそれらの欠如)に基づいて、内因性に結合したリガンドおよび/または所望のリガンドの結合を確認します。
- Bla g 1スペクトルのピーク強度をリン脂質基準規格のピーク強度と比較して、完全結合量測定を確認する。
6. ブラg 1折りたたみの確認
- 0.5 μM のサンプルの Bla g 1 を CD バッファ (100 mM KH2PO4、バッファ pH 7.5) に用意します。サンプル2 mLを磁気攪拌棒で10mmのCDキュベットに積み込みます。
- 2次構造の再構成を確認するために、Bla g 1のCDスペクトルを測定する。フォトマルチプライヤ(PMT)電圧がメーカーの推奨値(一般的に1 kV)を超えないようにしてください。
- 25 °Cで260~200 nmのCD信号を測定し、データピッチは0.2 nm、スキャンレートは20 nm/sで、データ統合時間は1sです。
- CD セル内の温度を 25 °C から 95 °C まで 0.5 °C/分の速度で上げます。磁気攪拌棒を有効にして、サンプル全体で温度が均一であることを確認します。
- 222 nmでCDを監視し、2°Cごとに測定値を取ります。
- 結果のデータを 2 状態のボルツマン曲線に合わせて、融解温度を決定します。Bla g 1の安定性が高いため、溶融温度(MT25)は、タンパク質が222nmで最初のCDの25%を失った温度と定義されました。
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Representative Results
アフィニティクロマトグラフィーを用いて、組換えGST-Bla g 1は高い純度(図1A)に容易に単離され、細胞培養の収率は〜2〜4mg/Lを産生する。4°CでTEVプロテアーゼを用いた一晩のインキュベーションは、GSTタグを除去するのに十分であり、〜24kDaで最終生成物を得る。なお、この場合、フロースルーおよび洗浄画分にかなりの量のGST-Bla g 1があり、グルタチオン樹脂結合能力を超えたことを示唆している。より多くの樹脂またはサンプルの負荷と溶出の複数のサイクルを使用すると、この問題の改善を提供することができます。
逆相C18カラムにBla g 1を適用すると、特徴的な溶出プロファイル(図1B)が得られ、~50%バッファBで2つの大きなピークが生じ、得られた分数の2番目の大きなピークが~75%バッファB.SDS-PAGE分析は、前者が切断されたGSTタグに対応していることを示唆し、後者はBla g 1に対応することを示唆している。時には、残存、切断されていないGST-Bla g 1に対応する中間に、3番目に小さいピークが発生します。この未切断物の存在は、切断反応に採用されるTEVの量を増加させたり、インキュベーション時間を延長することによって排除することができる。不完全な切断は収率を低下させるが、C18カラムで得られた分離は、最終的なBla g 1製品の純度が損なわれないようにするのに十分である。逆相HPLCの結果として、最終的なタンパク質製品が有機溶媒環境に溶出されます。これは任意の疎水性リガンドの除去を容易にするが、凍結乾燥を介してこの溶媒の除去が必要であり、ふわふわした白色粉末を得る(図1C)。
タンパク質のアニーリングは、天然のBla g1フォールドを再構成するために必要であり、脂質貨物の不在または存在下のいずれかで行うことができる。再折バッファーの前に乾燥したBla g 1およびリン脂質カルゴにDMSOを添加すると可溶化プロセスが容易になりますが、一部の長鎖脂質貨物は高温でも完全に溶解しません。しかし、これは我々の研究で試験した脂質の中で負荷の有効性に影響を与えることを観察されなかった(図1C)。同様に、過剰な脂質は、冷却時に溶液から沈殿したり、大きな小胞を形成したりすることが多く、アニーリング後に曇り出現を引き起こす(図1C)。これはまた、負荷効率に影響を与えるために観察されなかった、と任意の凝集体は、明確な、透明な溶液を得るために濾過および後続のバッファ交換ステップを介して容易に除去される。過酷な条件にもかかわらず、Bla g 1の熱的な観察は行なわれた。
図1:Bla g 1の初期精製(A) 初期溶解後の可溶性タンパク質画分を示す SDS-PAGE (S);フロースルー(FT)、洗浄(W)、およびグルタチオン-セファローズカラムからの溶出(E);GSTタグ(TEV)のTEV切断後の最終的なBla g 1製品。TEV切断後に得られたBla g1製品のHPLC溶出プロファイルを(B)に示す。280は青で示され、溶出勾配(%バッファ B)は緑色で示されます。切断されたGSTタグ(H1、H2)に対応する画分、残存非切断GST-Bla g 1(H3)、および精製されたブラg1(H4)は、それぞれ〜50%、〜65%、および〜74%緩衝Bの赤色矢印で示される。分画H1-H4のSDS-PAGE分析は、(A)に示され、それに応じて標識される。(C) アニール処理の様々な段階での Bla g 1 を示す代表的な画像。なお、iiおよびiiiに示される沈殿物形成の正確性および程度は、使用される脂質貨物の種類に依存する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
31この方法で精製したApo-Bla g1のP-NMRスペクトルは、NMR(図2A)または薄層クロモトグラフィー(データは示さない)のいずれによっても検出可能なリン脂質を示さない。対照的に、ディステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)リン脂質を搭載したBla g1について得られた同様のスペクトルは、ホスファチジルコリンヘッドグループに対応する強いピークを示す。比較のために、本明細書に記載の脂質除去/アニール性プロトコルを使用せずに組換え大腸菌から精製されたブラg1の代表的な31P-NMRスペクトル(ecBla g1)は、組換え発現系から抽出された内因性脂質の不均一混合物を示す(図2B)。NMRの定量性を活かし、公知のDSPC濃度の参考サンプルを用いて標準曲線を作製することができる(図2C)。DSPC-Bla g 1から得られた31Pシグナル強度をこの標準曲線と比較すると、タンパク質当たり4.7±0.5脂質の結合量測定が得られます。シリコ研究と構造解析9から得られた予測完全結合ストイチオメトリーと良好に比較する値。なお、この技術は、リン脂質、リゾリン脂質、リポ多糖などの31P核を含むリガンドのみを検出する。しかし、このプロトコルは13C-NMR分析のために容易に適応することができる。この場合、メチル−13C標識脂肪酸は、その良好なNMR緩和特性のために推奨されるであろう。同位体標識を単一の部位に制限すると、1つのピークのみが予想されるとともに、均一な13C標識の対応に対するコストを削減しながら、スペクトル解釈も容易になります。別のアプローチは、ゴキブリのフラから分離されたブラg1の天然貨物として脂肪酸の混合物を同定した以前の研究で示されるように、結合リガンドを同定するためにマススペックを採用することであろう(nBla g 1)9。しかし、質量仕様の定量能力が限られているため、十分な基準を持たない結合量測定の正確な測定が妨げられていました。
図2:ブラg1の脂質除去とローディングの検証(A)31P-NMRスペクトルのApo-(黒)またはDSPC負荷ブラg1(赤色)を用いて作製した前者の脂質の完全な除去を示す本研究に記載されたアニール化プロトコルを用いて調製し、ホスファチジルコリン(PC)脂質の均質なローディングを後者で達成した。これに対し、組換え性大腸菌から精製されたブラg1は、脂質剥離やアニーリングを伴わない(ecBla g1)、この方法を用いて分析した場合の内因性ホスファチジルエタノールアミン(PE)とホスファチジルグリセロール(PG)脂質の不均一な混合物を示す(B)。既知の濃度のDSPC参照サンプルから得られる代表的な標準曲線は、(C)に示されており、そこからBla g1結合ストイチオメトリーが得られる。図はFooら(2019)から適応し、クリエイティブ・コモンズCC BYライセンス9の下で提示された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
Bla g 1の結晶構造は、12の両生類アルファヘリックスからなるユニークなフォールドを明らかにします。円二色性は、このフォールドがアニーリングプロセス後に正常に再構成されたかどうかを評価するための迅速かつ便利な方法を表します。アポと脂質(nMix)を搭載したブラg 1のCDスペクトルは、主にαヘリカル構造を示すミニマ〜220および210 nmを示す(図3A)。このスペクトルは、ecBla g 1およびnBla g1について得られたものと極めて類似しており、Bla g 1のネイティブ構造が正常に回収されるというさらなる証拠を提供する。これは、19Fおよび1 H-15N溶液-NMRの使用を通じてさらに確認されたが、その完全な議論は他の場所9で入手可能である。CDベースの熱変性アッセイは、折り畳まれた球状ドメインを示すα-らせん二次構造の協調的損失を示す(図3B)。得られた融解温度の分析(図3C)は、nMixリガンド結合時に有意な増加を示す。この高いサーモスコ性は、nBla g1について計算されたものと一致しており、Bla g 1の自然な状態を完全に再現できることを示している。なお、ecBla g1も同様の、上記の安定性において大きな増強を図示し、従来のFPLCベースのアプローチを用いて精製されたアレルゲンの生体物理特性を妨げる残留内因性結合脂質の可能性を示す。対照的に、ブラg1などのアレルゲンから疎水性の貨物を定量的に除去およびリロードする能力は、アレルギー反応における脂質の役割を調べるユニークな道を提供する。ここでは、脂質貨物がアレルギー性タンパク質自体の構造、安定性、および内因性処理に及ぼす影響を調べる方法について述べるが、他の研究手段を検討することができる。
図3:Bla g 1倍の正常な回復を確認する。(A)A)のCDスペクトルApo-(黒)またはnMix-ロード(赤)ブラg1は、本明細書に記載されたプロトコルを用いて精製およびアニールされ、利用可能なX線結晶構造と一致する主にαヘリカル構造を示す〜220および210nmのミニマを有する。Apo-およびnMix-ロードされたBla g 1スペクトルはいずれも、組換え大腸菌(ecBla g 1,green)から精製されたBla g 1、または脂質除去およびアニールプロトコルを含まない天然のアレルギー源(nBla g 1,青)から得られたものと極めて類似しており、前者の天然構造の回復に成功を支える。(B)アポ(黒)とnMix搭載(赤)ブラg1の代表的な熱プロファイルは、シグモイド曲線を示す協調的展開を示す。nBla g 1 (青) と ecBla g 1 (緑) を参照として示します。Bla g 1の計算された融解温度(MT25)は(C)に示されている。nMixリガンド(赤)の結合は、Apo-Bla g 1(黒)に対する安定性の有意な増加をもたらす。これは、nBla g 1(青)に対して観察された傾向を反映しており、ネイティブ状態を正常に回復できることを示唆しています。ecBla g 1に対して観察されたさらに大きな安定性は、内因性に結合した脂質がアレルゲンの生物物理学的特徴付けを妨げる可能性を強調する。Cで提示されるMT25値は、少なくとも3つの独立試験から得られた平均値を表す。誤差範囲は、対応する標準偏差値を表します。図はFooら(2019)から適応し、クリエイティブ・コモンズCC BYライセンス9の下で提示された。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本研究で説明したプロトコルは、ブラg1の脂質結合特性を体系的に研究するためにうまく応用されている。これにより、貨物結合性、サーモスク性、および内因性処理との間の相関が明らかになっており、後者は、免疫原性に対する潜在的な意味を有する既知のT細胞エピトープの生成の減少と相関していた。Bla g 1に加えて、Pru p 3およびBet v 1のような他のアレルゲンは、標準アフィニティーおよびサイズ排除クロマトグラフィー法13、19、20、21、22を用いて精製した場合に、それらの内因性結合貨物を保持することが示されている。これらの歓迎されないゲストは、これらのタンパク質の生物物理学的および免疫学的特性を同様の方法で変更することができ、ここで提示されるような完全な脱脂を確実にする技術の必要性を強調する。
アレルゲンの精製における逆相HPLCの使用は以前2に記載されていましたが、熱アニーリングプロトコルと結合すると、アレルゲンを自然および非天然リガンドの範囲で再構成するかなり珍しい機会を提供し、脂質とアレルゲン相互作用をプローブすることができます。この熱変性ステップは、主に2つの目的に不可欠であることが分かった。第一に、熱変性は、その疎水性の性質のために、しばしば水性溶媒9、22から埋もれている結合空洞へのリガンドアクセスを容易にするために必要とされる。第二に、脂肪酸やリン脂質などの疎水性リガンドは、水性環境に入れるとミセルや小胞などの大きな超分子構造を形成することが多い。タンパク質結合に利用可能な単量体、または「遊離」リガンドの濃度は、臨界ミセル濃度(CMC)を用いて近似することができる。DSPCおよび他の長鎖リン脂質は、nM範囲内にCMC値を有し、Bla g1結合に対して利用できる遊離リガンドが事実上存在することを示す。短鎖脂質および脂肪酸であっても、CMCは低μm〜mM範囲にあり、これらのリガンドの大部分がミセルまたは二層相23に残っていることを示す。しかし、当社の変性プロトコルで採用されている高温は、これらの大きな凝集体を分散させ、結合を促進します。これまでの研究では、このプロセスを容易にするために、通常、長時間の潜伏期間を採用しています。しかし、熱変性/アニーリングプロセスの欠如は、負荷の有効性に疑問を提起します。例えば、ダニアレルゲンDer 5を蛍光脂肪酸アナログ11-(ダンシルアミノ)ウンデカン酸(DAUDA)でインキュベートすると、Bla g 124と同等の大きな疎水性キャビティを有していたにもかかわらず、0.66の結合ストイチオメトリーが得られた。同様に、植物nsLPSの結合特異性および量合測定は、水性緩衝液を添加する前にメタノール中で脂質およびタンパク質が最初に可溶化されているかどうかによって大きく異なることを発見した。リガンドおよび/または結合部位のアクセシビリティが制限因子であった。
Bla g 1に加えて、ゴキブリや蚊(A.aegypti)とDer p 2(データは示されていない)からいくつかの他のMAドメインタンパク質に同じ戦略を適用することに成功しました。我々は、ブラg1ホモログとDer p2の両方がC18カラムからブラg1とは異なる時間に溶出したことを指摘した(ステップ3.3)。このステップの溶出勾配は、他のタンパク質に対して最適化する必要がある場合があります。 あるいは、疎水性の少ない静止相を有するHPLCカラム(例えば、C8)が採用され得るが、しかし、Bla g1の場合には、C18カラムの疎水性の増加は、ecBla g1からジアシルリン脂質汚染物質を完全に除去する必要があった。生物物理学的および生化学的特性の違いにもかかわらず、我々はこのプロトコルが非常に堅牢であり、他のアレルギー性タンパク質に容易に適用できることを発見した。過酷な条件を採用すると潜在的な制限を提示する可能性がありますが、多くのアレルゲンに対して観察される回復力の増加は、その影響を減少させます26,27.実際、温度変性に続く構造と免疫原性を回復するために、Der p 2、Ber e 1、Ara a 6、Lep w 1などのいくつかの食物および吸入アレルゲンが観察されているが、バッファー条件の最適化は28、29、30、31、32、33;例えば、nsLTP(Cor a 8)およびソーマチン(Mal d 2およびAct d 2)の可逆的変性は、酸性(pH<4)条件28、30、31の下でのみ観察される。さらに、著者らは、アニーリングプロトコルで使用されるタイミングまたは温度のいずれかを最適化しようとしなかったことに留意すべきである。リガンド可溶化およびタンパク質の折りたたみ/展開は、82°C29で可逆的変性が達成されるBer e 1で見られるより低い最高温度を使用して達成することができる。このような措置の使用は、このプロトコルを適用できるアレルゲンの範囲を拡大することが期待される。
このプロトコルを他のアレルゲンシステムに適応させる際のもう一つの重要な考慮事項は、アニーリングプロセス中に必要なリガンドの濃度です。Bla g 1の場合、期待される収率は、1 L細胞培養あたり〜0.25~0.4μmolのタンパク質です。アレルゲンあたり8つの脂肪酸または4つのジアシル鎖脂質の実証された結合量測定を考えると、20〜40倍の大臼歯過剰の貨物(5-10 μmol)が採用されました。なお、ブラg1とその同族体の脂質結合能は一意である。例えば、nsLTPは一般に、2つの脂質リガンド25 個で結合することが一般的に認められており、リポカリンは1未満のストイチオメトリー34を有する。したがって、これらのタイプのアレルゲンの完全なローディングは、リガンドの小さな過剰で達成され得る。このプロトコルを他のアレルゲン系に適応させる際の最終的な考慮事項は、変性前に適切に形成されない場合に問題となる可能性のある二硫化結合の存在である。考えられるアプローチの1つは、2 mM DTTのような還元剤の存在下でアニーリングプロセスを行うであろう。天然ジスルフィド結合は、Aalberseらら35で研究されたピーナッツアレルゲン断片について説明されているように、還元および酸化型グルタチオンの添加を経て再形成することができる。この場合、正しい二硫化物結合の回収は、質量分析35によって経験的に評価されるべきである。
本研究では、アレルゲンを脱脂し、種々のリン脂質および脂肪酸の貨物を再焼き起こすことができる技術を説明する。しかし、一般的なアレルゲン貯留層内に存在する潜在的に免疫原性またはアジュベントリガンドの他の多くのクラスがあります。例えば、ネコ、イヌ、ダニアレルゲンは、ハウスダスト36からリポ多糖類(LPS)および他の細菌脂質を結合することが提案されているが、一方、Bet v 1は花粉マトリックス13から複雑なフラボノイドを抽出することが示されている。本研究で説明するプロトコルは、より詳細な方法でこれらの脂質の役割を探索するために容易に適応させることができる。概念実証として、Bla g 1の疎水性キャビティがグラム陽性菌の細胞壁からリポテイコ酸(LTA)を結合できることを実証することができたが、グラム陰性種からLPSを除外し、後者の9でより多くのアシル鎖を反映する可能性がある。さらに一歩踏み込むと、熱変性/アニーリングプロトコルを利用して、蛍光プローブやその他の非天然脂肪酸類似体をアレルゲンタンパク質に組み込むことができます。実際、ブラg1の蚊ホモローグの疎水性空洞をDAUDAでロードし、脂質リガンドがアレルギー性疾患に及ぼす影響を調べる追加の道を開くことができた。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
トム・カービー博士、スコット・ガベル博士、ロバート・ロンドン博士の助けと支援に感謝し、ボブ・ペトロヴィッチ博士とロリ・エドワーズ博士が、この研究で採用されているBla g 1コンストラクトの生成に役立ててくれたボブ・ペトロヴィッチ博士とロリ・エドワーズ博士と共に支援を受けました。アンドレア・アダムスの質量分析の支援、NMR計装の支援にユージン・デローズ博士に感謝します。この研究は、NIHの壁内研究プログラム、環境衛生科学研究所、Z01-ES102906(GAM)によって支援されました。コンテンツは著者の責任であり、必ずしも国立環境衛生科学研究所の公式見解を表すものではありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bla g 1 Gene | Genescript | N/a | Custom gene synthesis service. GenBank Accession no AF072219 Residues 34-216 |
| Affinity purified natural Bla g 1 (nBla g 1) | Indoor biotechnologies | N/a | Custom order |
| Agilent 1100 Series HPLC System | Agilent | G1315B, G1311A, G1322A | UV Detector, Pump, and Degasser |
| Agilent DD2 600 MHz spectrometer | Agilent | N/a | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Amicon | UFC-1008 | |
| Ampicillin | Fisher Scientific | BP1760-5 | |
| Benzonase | Sigma-Aldrich | E1014-5KU | |
| Broad- band 5 mm Z-gradient probe | Varian | N/a | |
| ChemStation for LC (Software) | Agilent | N/a | |
| cOmplete Mini Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836153001 | |
| Distearoylphosphatidylcholine (18:0 PC) | Avanti Polar Lipids | 850365C | |
| E. Coli BL21 DE3 Cells | New England Biolabs | C2530H | |
| Freezone 4.5 Freeze Dry System | Labconco | 7750000 | |
| Glutathione Resin | Genescript | L00206 | |
| Glutathione, Reduced | Fisher Scientific | BP25211 | |
| Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside (IPTG) | Fisher Scientific | 34060 | |
| Jasco CD spectropolarimeter | Jasco | J-815 | |
| Millex Syringe Filter Unit | EMD Millipore | SLGS033SS | |
| NMRPipe (Software) | Delaglio et al. | N/a | Delaglio, F. et al. Nmrpipe - a Multidimensional Spectral Processing System Based On Unix Pipes. J. Biomol. NMR 6, 277–293 (1995). |
| NMRViewJ (Software) | Johnson et al. | N/a | Johnson, B. A. & Blevins, R. A. NMR View: A computer program for the visualization and analysis of NMR data. J. Biomol. NMR 4, 603–614 (1994). |
| Oleic acid | Sigma-Aldrich | O1008 | |
| Pierce BCA Protein Assay | Sigma-Aldrich | BCA1-1KT | |
| Polaris 5 C18-A 250x10.0 mm HPLC Column | Agilent | SKU: A2000250X100 | |
| SD-200 Vacuum Pump | Varian | VP-195 | |
| Sodium Cholate Hydrate | Sigma-Aldrich | C6445 | |
| Sodium Palmitate | Sigma-Aldrich | P9767 | |
| Sodium Stearate | Sigma-Aldrich | S3381 | |
| VnmrJ (Software) | Varian | N/a |
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