Summary
Le but de ce protocole est de bioimprimer directement les cellules épithéliales du sein sous forme de sphéroïdes multicellulaires sur les réseaux endothéliales pré-formés pour créer rapidement des modèles de co-culture mammaire-endothéliale 3D qui peuvent être utilisés pour des études de dépistage de médicaments.
Abstract
La bioimpression est en train d’émerger comme un outil prometteur pour fabriquer des modèles 3D de cancer humain qui récapitulent mieux les caractéristiques critiques de l’architecture tissulaire in vivo. Dans la bioimpression actuelle de l’extrusion couche par couche, les cellules individuelles sont extrudées dans un bioink ainsi que des indices spatiaux et temporels complexes pour favoriser l’auto-assemblage hiérarchique des tissus. Cependant, cette technique de biofabrication repose sur des interactions complexes entre les cellules, les bioinks et les indices biochimiques et biophysiques. Ainsi, l’auto-assemblage peut prendre des jours, voire des semaines, peut nécessiter des bioinks spécifiques, et peut ne pas toujours se produire quand il ya plus d’un type de cellule impliqués. Nous avons donc développé une technique pour bioimprimer directement les sphéroïdes épithéliales pré-formés du sein 3D dans une variété de bioinks. Les sphéroïdes épithéliales 3D pré-formés de sein bioimprimés ont soutenu leur viabilité et leur architecture polarisée après impression. Nous avons en outre imprimé les sphéroïdes 3D sur les réseaux cellulaires endothéliales vasculaires pour créer un modèle de co-culture. Ainsi, la nouvelle technique de bioimpression crée rapidement un modèle de sein humain 3D plus pertinent physiologiquement à moindre coût et avec une plus grande flexibilité que les techniques traditionnelles de bioimpression. Cette technique polyvalente de bioimpression peut être extrapolée pour créer des modèles 3D d’autres tissus dans des bioinks supplémentaires.
Introduction
Les modèles de tumeurs vascularisées in vitro 3D sont des outils essentiels pour l’étude mécaniste de la croissance et de la métastase du cancer. Pour le cancer du sein en particulier, les cellules épithéliales du sein cultivés à Matrigel s’organisent en sphéroïdes polarisés qui ressemblent plus étroitement à l’architecture in vivo mammaire acinus1,2,3,4,5,6,7,8. La culture cellulaire épithéliale du sein 3D influe également sur la fonction cellulaire, les cultures 3D montrant des différences dans la modulation des récepteurs du facteur épidermique de croissance (EGF)8,9; fonction oncogène, y compris ErbB210; croissance et apoptose signalant11,12; et résistance à lachimiothérapie 13,14. Les cellules endothéliales vasculaires réagissent également différemment aux stimuli environnementaux dans la culture 3D vs 2Dtraditionnelle 15,16,17,18. Cependant, une grande partie de la compréhension des interactions épithéliales vasculaires endothéliales et mammaires provient de la culture 2D à l’aide d’inserts moyens conditionnés ou Transwell, ou de modèles 3D dans lesquels les deux types de cellules sont physiquementséparés 19,20,21,22,23. Ces modèles de co-culture fournissent un aperçu physiologique limité, puisque la culture 3D et le contact cellule-cellule sont essentiels à l’endothélial vasculaire – interactions cellulaires épithélialesdu sein 24,25,26.
Les modèles 3D de cancer ont été fabriqués utilisant une série de techniques, y compris la formation sphéroïde de chute suspendue, la bioimpression, l’assemblage magnétique, et la culture dans les hydrogels ou sur les échafaudagesmachinés 5,27,28,29. Plus récemment, des modèles de tumeur 3D ont été créés avec plusieurs types de cellules disposés dans leurs structures 3D respectives. Dans un exemple d’une plate-forme de tumeur-sur-une-puce, le cancer, l’endothélial, et les cellules stromal ont été mélangés dans une matrice et puis injectés dans les trois chambres centrales de tissu dans un dispositif de polydimethylsiloxane (PDMS). Les chambres tissulaires étaient bordées par deux canaux extérieurs qui représentaient une artère et un venule. Après 5-7 jours de culture, les cellules endothéliales ont formé un réseau microvasculaire et les cellules cancéreuses ont proliféré pour former de petites tumeurs près de la vascularisation. Cette plate-forme a ensuite été utilisée pour filtrer les médicaments et les combinaisons demédicaments 30. D’autres plates-formes tumorales ont été créées pour étudier les métastases et les types de cancer avec des stimuli mécaniques spécifiques (p. ex., tension mécanique dans le poumon)31,32. Cependant, ces plates-formes n’incluent généralement pas à la fois la vasculature et le cancer dans leurs structures 3D respectives.
La biofabrication est très prometteuse dans l’avancement des modèles de tumeurs vascularisées 3D in vitro, puisqu’elle permet un contrôle spatial serré de l’emplacement cellulaire. Malgré la croissance de la bioimpression au cours de la dernière décennie, peu d’études se concentrent spécifiquement surles tumeurs 33,34. Dans un exemple, l’impression 3D des cellules HeLa dans un hydrogel gélatine/alginate/fibrinogen a été utilisée pour créer un modèle in vitro de cancer du col de l’utérus. Les cellules tumorales ont été bioimprimées sous forme de cellules individuelles, puis autorisées à former des sphéroïdes, ce qui a montré un taux de prolifération plus élevé, une augmentation de l’expression de la métalloprotéine de matrice et une chémoresistance plus élevée que les cellules de la culture 2D35. Dans ces études, comme dans beaucoupd’autres 36,37, suspensions cellulaires dissociées ont été bioimprimés, puis les cultures cellulaires ont été fournis avec les indices mécaniques et biochimiques nécessaires pour permettre aux cellules de former une structure 3D. Cependant, l’auto-assemblage cellulaire peut prendre des jours ou des semaines, peut nécessiter des indices environnementaux spatiaux et temporels complexes, ou peut ne pas se produire lorsque deux types de cellules sont co-cultivés. Par exemple, les cellules épithéliales de sein ont induit la mort cellulaire dans les cellules endothéliales dans la co-culture 2D, et les cellules épithéliales dissociées de sein n’ont pas former des sphéroïdes 3D une fois bioimprimées dans les hydrogels d’alginate/gélatine38. Les cellules épithéliales ou cancéreuses dissociées du sein formaient des sphéroïdes dans des bioinks à base d’alginate seulement lorsqu’elles étaient piégées dans des moules circulaires PDMS. Dans d’autres cas, des sphéroïdes ont été formés utilisant des gouttelettes suspendues dans des plaques circulaires de puits d’attachement ultra-basses, puis mélangés dans des bioinks à base d’alginate39,40.
Nous décrivons maintenant une méthode alternative de biomanufacturing de tissu 3D dans ce protocole. Plutôt que de semer des cellules dissociées et d’attendre que ces cellules forment les structures 3D, nous décrivons comment créer et bioimprimer des sphéroïdes tumoraux 3D sur un réseau de tubes vasculaires pour créer un modèle de co-culture tumorale qui peut être utilisé presque immédiatement. Les sphéroïdes tumoraux peuvent être cultivés in vitro ou dérivés de tissus humains (organoïdes). De même, les tubes vasculaires peuvent être cultivés ou peuvent être dérivés de fragments microvasculaires de tissu adipeux. Les bioinks peuvent aller de l’alginate biologiquement inactif au Matrigel41 très biologiquementactif. Puisque ce modèle de co-culture de tumeur 3D peut être créé avec une série de structures cellulaires et de bioinks, il peut incorporer plusieurs types de cellules, matrices extracellulaires, et gradients dechimiokine 15,42. Alors que dans sa formulation actuelle, les réseaux endothéliales ne peuvent pas être perfusés, les itérations futures pourraient intégrer cette méthode avec des microfluides ou des systèmes sur puce. La bioimpression de sphéroïdes épithéliales du sein 3D sur les réseaux endothéliales permet une biofabrication rapide des modèles mammaires humains pour le dépistage des drogues et la médecine de précisionpersonnalisée 27.
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Protocol
1. Croissance épithéliale des cellules mammaires et médias d’analyse
- MCF10Une cellule épithéliale du sein
NOTE : La ligne épithéliale immortalisée non tumorigenic de cellules épithéliales de sein est dérivée d’un patient présentant la maladie fibrocystic43. Les cellules n’expriment pas le récepteur d’oestrogène.- Pour préparer le facteur épidermique de croissance (EGF) de 20 μg/mL, dissoudre 100 μg d’EGF lyophilisé dans 500 μL de dHstérile 2O pour faire 200 μg/mL EGF. Ajouter 500 μL de 200 μg/mL EGF dans 4,5 mL de BSA stérile de 0,1 % en dH2O pour faire une solution de stock EGF de 20 μg/mL. Conserver les aliquots EGF préparés 20 μg/mL à -20 °C jusqu’à 12 mois.
- Pour préparer 500 μg/mL d’hydrocortisone, diluer 1 mg d’hydrocortisone dans 1 mL d’éthanol absolu (200 preuves). Ajouter 1 mL de DMEM F:12 stérile à ce mélange pour faire une solution de stock d’hydrocortisone de 500 μg/mL. Conserver les aliquots de stock d’hydrocortisone à -80 °C jusqu’à 12 mois.
- Pour préparer la toxine du choléra de 10 μg/mL, dissoudre 1 mg de toxine du choléra en poudre lyophilisée dans 1 mL de dHstérile 2O pour faire une solution de stock de toxine de choléra de 1 mg/mL. Conserver les aliquots de stock de toxines du choléra à -80 °C jusqu’à 12 mois.
- Pour préparer le milieu de croissance, ajouter 500 μL d’EGF (20 μg/mL), 500 μL d’hydrocortisone (500 μg/mL), 5 μL de toxine du choléra (1 mg/mL), 500 μL d’insuline bovine (10 mg/mL), 10 mL de pénicilline et de streptocotomycine, et 25 mL de sérum cheval à 500 mL de DMEM F:12 pour une concentration finale de 20 ng/mL EGF, 500 ng/mL d’hydrocortisone, 10 ng/mL de toxine choléra, 10 ng/mL d’insuline bovine, 2% v/v pénicilline et streptocotomycine, et 5% v/v sérum cheval. La concentration d’antibiotiques a été portée à 2 % pour tenir compte de la diminution de la stérilité dans le processus de bioimpression; cependant, la concentration d’antibiotiques peut être abaissée à 1%.
- Pour préparer Assay Medium, ajouter 500 μL d’hydrocortisone (500 μg/mL), 5 μL de toxine du choléra (1 mg/mL), 500 μL d’insuline bovine (10 mg/mL), 10 mL de pénicilline et de streptocotomycine, et 25 mL de sérum chevalin à 500 mL de DMEM F:12 pour une concentration finale de 500 ng/mL d’hydrocortisone, 10 ng/mL de toxine du choléra, 10 ng/mL d’insuline bovine, 2% de pénicilline v/v et de streptocotomycine, et 5% de sérum de cheval v/v.
- MDA-MB-231
NOTE : La ligne épithéliale triple-négative (manquant du récepteur d’oestrogène, du récepteur de progestérone, et du récepteur épidermique de facteur de croissance 2) ligne épithéliale de cellules de cancer du sein est créée de l’effusion pleurale d’un patient féminin présentant l’adénocarcinome mammaire métastatique44. Les cellules représentent un cancer du sein agressif, invasif et mal différencié.- Pour préparer la croissance et l’analyse moyenne, ajouter 50 mL de sérum bovin fœtal, 10 mL de pénicilline et de streptomycine, et 25 mL de sérum de cheval à 500 mL de DMEM pour une concentration finale 10% v/v sérum bovin fœtal, 2% v/v pénicilline et streptomycine, et 5% v/v sérum de cheval.
2. Culture cellulaire épithéliale du sein
- Graines 500.000 MCF10A ou MDA-MB-231 cellules dans un plat de culture tissulaire de 10 cm (P100) avec 10 mL de MCF10A ou MDA-MB-231 médias de croissance. McF10A et MDA-MB-231 cellules atteignent >90% confluence en 48 heures.
- Pour passer les cellules épithéliales du sein, lavez d’abord les cellules avec 10 mL de PBS chaud.
- Détachez les cellules épithéliales du sein en ajoutant 2 mL de Trypsin-EDTA à 0,05% au plat. Placer le plat dans un incubateur de 37 °C, 5 % de CO2 pendant 20 à 25 minutes.
- Ajouter 5 mL de MCF10A ou MDA-MB-231 Growth Medium aux cellules trypsinisées pour neutraliser la trypsine. Pipette le mélange cellule-média de haut en bas pour résuspendre les cellules et briser les grappes cellulaires.
- Ajouter la suspension cellulaire à un tube conique de 15 mL et une centrifugeuse à 1 200 x g pendant 3 minutes. Aspirez soigneusement le supernatant et resuspendez la pastille cellulaire dans 5 mL de MCF10A ou MDA-MB-231 Growth Medium.
- Plaque 1 mL de suspension cellulaire dans 5 nouveaux plats de culture tissulaire de 10 cm avec MCF10A ou MDA-MB-231 Growth Medium. Placer les plats dans un incubateur de 37 °C et 5 % de CO2. Les cellules seront prêtes à être de nouveau en 2-3 jours. Les cellules MCF10A peuvent être maintenues jusqu’au passage numéro 35, après quoi elles présentent des changements morphologiques. Les cellules MDA-MB-231 peuvent être maintenues jusqu’au passage numéro 24, après quoi elles présentent des changements morphologiques.
3. Formation épithéliale de sphéroïde de sein
- Congeler 200 pointes de pipette de μL pendant 30 minutes avant de commencer l’essai. Maintenir la solution matricielle réduite par facteur de croissance (p. ex., Matrigel) (10 mg/mL) sur la glace pendant tout le processus.
- Pipette lentement 30 μL de solution matricielle glacée à l’aide de pointes de pipette glacées de 200 μL dans chaque puits d’une glissière de chambre de 8 puits. Commencez par les côtés et faites glisser la pointe de pipette le long des coins, ajoutant une goutte finale au centre du puits pour assurer le revêtement même de chaque puits. Évitez les bulles d’air pendant cette étape pour assurer une couche de solution matricielle uniforme. Utilisez de nouveaux bouts de pipette pour chaque puits.
- La chambre d’incubation glisse dans un incubateur de CO2 à 37 °C pendant 15 à 20 minutes pour polymériser la solution matricielle.
- Resuspendez les cellules MCF10A trypsinisées dans mcf10A Assay Medium à 200 000 cellules/mL ou résuspendez les cellules MDA-MB-231 trypsinisées dans le milieu de croissance MDA-MB-231 à 200 000 cellules/mL.
- Si vous utilisez des cellules MCF10A, préparez un milieu de croissance sphéroïde MCF10A frais en ajoutant 5 μL d’EGF (20 μg/mL) et 100 μL de solution matricielle à 5 mL d’Assay Medium pour une concentration finale de solution matricielle de 2 %.
- Retirez la glissière de chambre précoated avec la solution matricielle de l’incubateur. Ajouter 50 μL de suspension cellulaire MCF10A ou MDA-MB-231 (10 000 cellules) à chaque puits. Si vous utilisez des cellules MCF10A, ajoutez 450 μL de MCF10A Spheroid Growth Medium. Si vous utilisez des cellules MDA-MB-231, ajoutez 450 μL de MDA-MB-231 Growth Medium préméxés avec une solution matricielle de 2 % (9 μL). Placez immédiatement la glissière de chambre dans un incubateur de 37 °C, 5 % de CO2.
- Remplacer le milieu tous les 44 jours. Pipette soigneusement 200 μL de vieux supports à partir d’un coin de chaque puits à l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL. Au cours de ce processus, inclinez la glissière de la chambre à 45° pour s’assurer que les sphéroïdes ne sont pas dérangés. Ajouter 200 μL de mcf10A Sphéroïde de croissance moyenne fraîchement préparée ou milieu de croissance MDA-MB-231 préalablement mélangé avec une solution matricielle de 2 % à chaque puits au coin des gouttes pour s’assurer que les sphéroïdes restent attachés à la couche matricielle. Seulement ~50% du média est remplacé de sorte que toutes les cytokines produites par les sphéroïdes ne soient pas complètement épuisées.
REMARQUE : Les sphéroïdes épithéliales du sein MCF10A prennent jusqu’à 8 jours pour polariser et former des centres creux. Les sphéroïdes épithéliales du sein MDA-MB-231 prennent jusqu’à 5 jours pour se former et n’ont pas de centres creux.
4. Formation du réseau cellulaire endothélial
- Culture des cellules endothéliales des veines ombilicales humaines (HUVEC)
- Ajouter le contenu d’un seul kit de croissance endothéliale Medium-2 contenant le facteur de croissance de l’insuline, le facteur de croissance fibroblaste, le facteur de croissance endothéliale vasculaire, l’acide ascorbique, facteur de croissance épidermique, héparine et gentamicine-amphotericine B, ainsi que 50 mL de sérum bovin fœtal, 5 mL de pénicilline-streptomycine et 5 mL de glutamine de 200 mM à 500 mL d’Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2) pour créer un milieu de croissance endotélial complet (EGM-2).
- Graine 500.000 cellules endothéliales dans un plat de culture tissulaire de 10 cm dans 10 mL d’EGM-2. Placer les cellules dans un incubateur de 37 °C, 5 % de CO2 jusqu’à ce qu’elles atteignent la confluence de 80 % (environ 48 heures).
- Pour passer les cellules, laver les cellules endothéliales avec 10 mL de PBS chaud. Détachez HUVEC en ajoutant 2 mL de Trypsin-EDTA de 0,05 % au plat de culture tissulaire de 10 cm. Surveillez de près les cellules par microscopie à contraste de phase. Les cellules sont prêtes lorsqu’elles sont en boule, mais restent attachées au plat.
- Aspirer soigneusement la trypsine hors du plat. Ajouter 8 mL d’EGM-2 au plat. Lavez les cellules du plat en pipetting l’EGM-2 de haut en bas sur toute la surface du plat.
- Alternativement, ajouter 5 mL d’EGM-2 aux cellules trypsinisées pour neutraliser la trypsine. Pipette le mélange cellule-média de haut en bas pour résuspendre les cellules et briser les grappes cellulaires. Ajouter la suspension cellulaire à un tube conique de 15 mL et une centrifugeuse à 1 200 x g pendant 3 minutes. Aspirez soigneusement le supernatant et resuspendez la pastille cellulaire dans 10 mL d’EGM-2.
- Ajouter 1 mL de suspension cellulaire à 9 mL d’EGM-2 dans un plat de culture tissulaire de 10 cm. Placer les plats dans un incubateur de 37 °C et 5 % de CO2. Échangez les 2/3 du milieu avec l’EGM-2 frais tous les 2 jours. Les cellules seront prêtes à passer dans 3-5 jours. HUVEC peut être maintenu jusqu’au passage 8, après quoi ils ne parviennent pas à former des réseaux.
- Formation du réseau de cellules endothéliales (HUVEC)
- Congeler 200 pointes de pipette de μL pendant 30 minutes avant de commencer l’essai. Maintenez la solution matricielle réduite de facteur de croissance (10 mg/mL) sur la glace pendant tout le processus.
- Pipette lentement 30 μL de solution matricielle glacée à l’aide de pointes de pipette glacées de 200 μL dans chaque puits d’une glissière de chambre de 8 puits. Commencez par les côtés et faites glisser la pointe de pipette le long des coins, ajoutant une goutte finale au centre du puits pour assurer le revêtement même de chaque puits. Évitez les bulles d’air pendant cette étape pour assurer une couche de solution matricielle uniforme. Utilisez de nouveaux bouts de pipette pour chaque puits.
- La chambre d’incubation glisse dans un incubateur de 37 °C, 5 % de CO2 pendant 15 à 20 minutes pour polymériser matrigel.
- Pré-tacher un plat de 10 cm de HUVEC avec 10 μL de traqueur de globules rouges (1:1000) pendant 30 minutes dans 37 °C, incubateur de CO2 à 5 %.
- Laver les cellules endothéliales avec 10 mL de PBS chaud. Détachez HUVEC en ajoutant 2 mL de Trypsin-EDTA de 0,05 % au plat de culture tissulaire de 10 cm. Placer le plat dans un incubateur de 37 °C et 5 % de CO2 pendant 5 minutes pour détacher complètement les cellules.
- Ajouter 5 mL d’EGM-2 au plat pour neutraliser la trypsine. Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 25 mL. Centrifugeuse HUVEC à 1200 x g pendant 5 minutes. Aspirer le supernatant et résusquer la pastille cellulaire dans 5 mL d’EBM-2 sans sérum.
- Comptez les cellules à l’aide du bleu Trypan pour déterminer les cellules viables. Créez une solution 1 x 106 cellules/mL.
- Ajouter 100 000 HUVEC à chaque puits avec 200 μL d’EBM-2 sans sérum. Si plus de cellules sont ajoutées, elles créeront un monomouche de surface plutôt qu’un réseau de tubes.
- Incuber huvec dans un incubateur de 37 °C, 5 % de CO2. Après 6 heures, image HUVEC réseaux par microscopie de contraste de phase. Les réseaux sont maintenant prêts pour la coculture avec les sphéroïdes mammaires.
5. Bioimpression des sphéroïdes épithéliales du sein sur les réseaux HUVEC pré-formés
REMARQUE : Un système de biodéposition à double buse doit être utilisé pour le processus de biofabrication. Dans ce cas, le système avait trois bras de mouvement pour permettre le contrôle spatial micron-échelle du dépôt des matériaux ainsi que deux moteurs à vis pour déposer bioink à partir de seringues de 10 mL. Le système doit être fonctionnalisé avec un système de filtration d’air particulaire à haut rendement ainsi que des capacités de stérilisation UV pour maintenir un environnement stérile pendant la bioimpression. Le bioimprimeur est stérilisé UV pendant une heure avant le processus d’impression.
- Créez des sphéroïdes épithéliales du sein et des réseaux HUVEC comme décrit précédemment. Estimer le nombre de sphéroïdes épithéliales du sein dans chaque puits en comptant les sphéroïdes dans des images de microscopie de contraste de phase représentative.
- Couper 0,5 cm de l’extrémité d’une pointe de pipette de 1000 μL. Utilisez la pointe de pipette coupée pour pipette soigneusement tous les sphéroïdes de la glissière de chambre de 8 puits et dans un tube de 50 mL. Resuspendez les sphéroïdes dans le bioink sélectionné à 100 sphéroïdes/100 μL.
REMARQUE : Des concentrations sphéroïdes plus élevées peuvent entraîner un regroupement sphéroïde et empêcher la visualisation des interactions entre les sphéroïdes et les réseaux endothéliales. - Passez le mélange sphéroïde à travers une passoire cellulaire de 70 μm pour enlever les sphéroïdes grands ou groupés.
- Chargez les sphéroïdes mis en commun dans une seringue stérile de 10 mL et capuchonez-la à l’aide d’une aiguille stérile de calibre 25. Attachez la seringue au système de biodéposition.
- Aspirez le milieu des réseaux HUVEC dans la glissière de chambre de 8 puits.
- Extrudez 100 μL de sphéroïdes épithéliales du sein sur 6 puits des réseaux HUVEC à un débit de 1 mL/min. Maintenir 2 puits de réseaux HUVEC en tant que contrôles.
- Ajoutez 400 μL de MCF10A Spheroid Growth Medium si vous utilisez des sphéroïdes MCF10A imprimés sur les réseaux HUVEC ou ajoutez 400 μL MDA-MB-231 Growth Medium préalablement mélangés à une solution matricielle de 2 % si vous utilisez des sphéroïdes MDA-MB-231 imprimés sur les réseaux HUVEC. Le milieu de croissance sphéroïde respectif doit être utilisé dans les puits de contrôle HUVEC.
- Incuber des co-cultures dans un incubateur de CO 2 à 37 °C,5 % pendant 24 à 96 heures sans changement de média. Les co-cultures resteront viables dans le milieu d’origine jusqu’à quatre jours.
6. Microscopie confoccale
- Immunofluorescence et préparation tampon de lavage PBS-Glycine
- Préparer immunofluorescence (IF) tampon 10x solution de stock en ajoutant 2,5 g d’azide de sodium, 5 g d’albumine de sérum bovin, 10 mL de Triton X-100, et 2,05 mL de Tween-20 dans 500 mL de 10x PBS. Ajuster le pH à 7,4. Conserver la solution de stock jusqu’à un an à 4 °C pour éviter la sédimentation.
- Créez un tampon IF de travail en diluant 50 mL de tampon IF 10x dans 450 mL d’eau déionisée stérile. Conservez la solution de travail à température ambiante jusqu’à une semaine.
- Préparez une solution de stock tampon 10x PBS-Glycine en ajoutant 37,5 g de glycine à 500 mL de 10 x PBS. Ajuster le pH à 7,4. Conserver la solution de stock jusqu’à 6 mois à 4 °C pour éviter la sédimentation.
- Créez une solution PBS-Glycine de travail en diluant 50 mL de tampon PBS-Glycine de 10 x dans 450 mL d’eau déionisée stérile. Conservez la solution de travail à 4 °C jusqu’à une semaine.
- Label Bioprinted Samples and Image par Confocal Microscopy
- Aspirer le milieu des co-cultures 3D bioimprimées et rincer 3 fois avec du PBS chaud. Fixer les co-cultures 3D bioimprimées avec 4% de paraformaldéhyde pendant 1 h à température ambiante. Rincer les échantillons 3 fois pendant 20 minutes avec 1x PBS-Glycine.
- Bloquer les échantillons avec tampon IF mélangé avec 10% sérum de chèvre pendant 90 minutes (bloc primaire), suivi de 40 minutes avec tampon IF plus 10% sérum de chèvre et fragment Affinipure Fab (1:100, bloc secondaire).
- Si vous utilisez des sphéroïdes MCF10A, étiquetez des échantillons avec un anticorps primaire pour l’intégrase α6 (1:100) dans le tampon de blocage secondaire pendant la nuit à 4 °C, suivi d’un anticorps secondaire Alexa Fluor 488 (1:200) et hoescht 33342 (1:1000) pour 1 h à température ambiante protégée de la lumière. Les lignées cellulaires MCF10A expriment des niveaux élevés d’intégrine α6, ce qui est essentiel pour montrer la polarisation et la morphologie sphéroïdes.
- Si vous utilisez des sphéroïdes MDA-MB-231, qui expriment de faibles niveaux d’intégrine α6, étiquetez des échantillons avec Alexa Fluor 488 phalloidin (1:100) et Hoescht 33342 (1:1000) dans le tampon de blocage secondaire pendant 4 heures à température ambiante protégée de la lumière. La phalloidine permet la visualisation de filament d’actine ainsi la morphologie amorphe et envahissante sphéroïde peut être évaluée.
- Laver les échantillons avec 1X PBS-glycine 3 fois pendant 20 minutes.
- Préparez des échantillons pour le montage en enlevant la glissière de chambre à l’aide de l’outil du fabricant. Ajouter une petite goutte de solution antifade à chaque puits. Placez un coverslip de 22 mm x 60 mm sur chaque glissière de chambre et scellez soigneusement les bords avec du vernis à ongles clair.
- Échantillons d’image à l’aide d’un microscope confocal comme piles Z d’environ 10 tranches en étapes de 5 μm. Si vous le souhaitez, compressez les plans Z en un seul plan à l’aide de la commande Extended Focus dans un logiciel d’imagerie cellulaire.
- Quantifier l’adhérence sphéroïde aux réseaux endothéliales à l’aide de l’image J. Le nombre de sphéroïdes adhérents peut être quantifié à l’aide du plugin d’analyse avec la taille et la circularité appropriées des particules. Normalisez le nombre de sphéroïdes attachés à la zone d’image.
- Pour assurer la reproductibilité, quantifier le nombre de sphéroïdes adhérents dans 4 x 4 images carrelées de co-cultures. Si le nombre de sphéroïdes est statistiquement significativement inférieur à celui d’autres expériences, l’expérience doit être répétée.
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Representative Results
Les cellules épithéliales du sein devraient s’auto-organiser en sphéroïdes 3D après 5-8 jours de culture sur la solution matricielle et dans le milieu de culture avec la solution matricielle de 2%. Les sphéroïdes épithéliales du sein MCF10A non tumoriogènes devraient apparaître ronds et avoir un centre creux, l’intégrine α6 polarisée jusqu’au bord externe du sphéroïde(figure 1, inset montre des centres creux). Les cellules épithéliales très invasives du cancer du sein MDA-MB-231 forment des sphéroïdes irréguliers. Les sphéroïdes doivent être utilisés lorsqu’ils mesurent entre 100 et 300 μm de diamètre. Lorsque les sphéroïdes deviennent trop gros et se rapprochent, les sphéroïdes se réunissent pour former des mégasphéroïdes. En outre, les sphéroïdes épithéliales de sein de MDA-MB-231 peuvent montrer des cellules migrant hors des sphéroïdes si maintenues dans la culture de Matrigel pendant trop longtemps.
HUVEC devrait s’auto-organiser en réseaux en forme de tube après 6-8 heures de culture clairsemée et sans sérum. Les échantillons auront des nœuds multicellulaires avec des connexions qui sont formées de lignes de 1-3 cellules en parallèle. Les réseaux HUVEC peuvent être photographiés par microscopie de contraste de phase ou par microscopie confoccale s’ils sont étiquetés avec Cell Tracker et Hoescht (Figure 2). L’analyseur d’angiogenèse ImageJ peut être utilisé pour quantifier les jonctions réseau, les segments et les branches. Les réseaux HUVEC mourront s’ils sont laissés dans un milieu sans sérum pendant plus de 16 heures.
Lorsque les sphéroïdes épithéliales du sein sont bioimprimés sur les réseaux HUVEC, les sphéroïdes et les réseaux doivent maintenir leur morphologie originale pendant au moins 24 heures. Les sphéroïdes épithéliales du sein MCF10A apparaîtront comme des objets ronds qui adhèrent directement aux réseaux endothéliales, tandis que les sphéroïdes épithéliales du sein MDA-MB-231 apparaîtront plus amorphes mais encore attachés ou à proximité des réseaux endothéliales (figure 3). Les réseaux HUVEC seront maintenus lorsqu’ils seront co-cultivés avec des sphéroïdes épithéliales du sein. Pendant les co-cultures de plus de 24 heures, les cellules épithéliales du sein peuvent migrer hors des sphéroïdes et le long des réseaux endothéliales. Dans notre expérience, ceci se produit plus tôt dans les cellules épithéliales tumorigenic plutôt que non tumorigenic de sein38. Nous avons déjà démontré à l’aide de co-cultures bioimprimées que le dépistage des drogues peut être entrepris dès 2 heures après la bioimpression sphéroïde, par exemple pour tester l’adhérence sphéroïde sur les réseaux endothéliales45. Nous avons également montré que les sphéroïdes mammaires 3D sont plus résistants aux médicaments anticancéreux comme paclitaxel que lorsqu’ils sont imprimés en cellules individuelles ou en co-culture41,45. En l’absence de sphéroïdes bioimprimés, les puits de contrôle du réseau HUVEC ne parviennent pas à tenir leur morphologie réseau et meurent après 16 h.
Figure 1 : Images confocales représentatives de microscopie de sphéroïdes épithéliales du sein. Les sphéroïdes MCF10A ont été étiquetés pour l’intégrine α6 (vert) et les noyaux (bleu). Le phénotype cellulaire peut être confirmé après la bioimpression lorsque les sphéroïdes apparaissent ronds avec un centre creux (encart) et ont l’intégrine α6 polarisée aux bords extérieurs. Les sphéroïdes MDA-MB-231 ont été étiquetés pour l’actine (verte) et les noyaux (bleu). Le phénotype cellulaire peut être confirmé lorsque les sphéroïdes sont irrégulièrement formés sans centres creux et ont des processus cellulaires envahissant la matrice environnante. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Images représentatives des réseaux HUVEC par contraste de phase et microscopie confoccale. Les réseaux HUVEC apparaissent comme de petits nœuds multicellulaires avec des lignes de cellules reliant les nœuds. Pour la microscopie confoccale, les cellules ont été étiquetées avec Cell Tracker Red et Hoescht pour les noyaux (bleu). Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Images représentatives de sphéroïdes épithéliales du sein co-cultivés avec les réseaux HUVEC. Les sphéroïdes MCF10A, étiquetés pour l’intégrine α6 (vert) et les noyaux (bleus), restent ronds et semblent adhérer directement aux réseaux endothéliales. Les sphéroïdes MDA-MB-231, étiquetés pour l’actine (verte) et les noyaux (bleu), semblent amorphes mais restent proches ou sur les réseaux endothéliales. Les co-cultures maintiennent cette morphologie pendant au moins 24 heures après la bioimpression, après quoi les cellules mammaires peuvent migrer le long des tubes endothéliales. Barre d’échelle = 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Ce protocole est le premier du genre à bioimprimer les sphéroïdes dans leur architecture 3D pour la co-culture avec les cellules endothéliales également dans leur architecture 3D. Les étapes critiques du protocole incluent la formation initiale de sphéroïdes épithéliales du sein et de réseaux HUVEC. Il faut faire preuve d’une extrême prudence dans l’alimentation des sphéroïdes épithéliales du sein, car ils sont facilement perturbés par la solution matricielle. De même, les sphéroïdes épithéliales du sein doivent être traités avec soin lorsqu’ils sont pipetted hors de la solution matricielle et mélangés dans les réseaux. Les réseaux HUVEC ne doivent pas être plaqués à une densité trop élevée ou laissés pendant plus de 16 heures, car ils formeront un monocouche ou mourront, respectivement. Enfin, toute bioimpression doit se produire dans un environnement stérile à 37 °C afin de maximiser la viabilité cellulaire.
Les sphéroïdes épithéliales du sein peuvent être bioimprimés dans une variété de bioinks en plus de Matrigel, y compris les mélanges d’alginate et d’alginate-collagène. Nous avons démontré que les sphéroïdes étaient viables et maintenu leur morphologie lorsqu’ils étaient imprimés en bioinks à base d’alginate41. Ainsi, alors que nous présentons la bioimpression ici dans le bioink à base de solutions matricielles, d’autres bioinks moins coûteux et plus faciles à utiliser sont également possibles. Nous avons en outre utilisé d’autres lignées de cellules cancéreuses du sein, y compris MCF-7 et génétiquement modifié MCF10A-NeuN cellules avec un succèssimilaire 38,41,45. D’autres moyens pourraient également être utilisés pour créer les sphéroïdes épithéliales du sein. Par exemple, Lee et coll. ont utilisé des tableaux de micro puits hydrogel produits à l’aide de timbres PDMS pour créer des sphéroïdes de taille uniforme detaille contrôlée 46. Enfin, d’autres cellules endothéliales telles que les cellules endothéliales dérivées de tumeurs pourraient être utilisées, et plutôt que de former des réseaux HUVEC, les microvéssels dérivés des tissus adipeux pourraient être directement bioimprimés sous forme de structures vasculaires 3D47.
Une limitation primaire de cette méthode était le défi dans le contrôle de l’emplacement et du nombre de sphéroïdes bioimprimés. Les sphéroïdes devaient être imprimés avec des buses relativement grandes et des liquides inviscides pour prévenir les dommages aux sphéroïdes. Des bioinks gélissant rapidement pourraient mieux contrôler l’emplacement des sphéroïdes. Les sphéroïdes ne pouvaient pas non plus être comptés dans le bioink, puisqu’ils étaient trop grands pour notre compteur cellulaire. Nous nous sommes plutôt appuyés sur des dénombrements sphéroïdes dérivés d’images de contraste de phase prises avant de pipetting sphéroïdes de la surface de Matrigel. D’autres moyens de former les sphéroïdes pourraient mieux contrôler leur nombre et leur taille. Nous avons pu contrôler le nombre et la taille de sphéroïdes avec une précision modérée en utilisant des passoires cellulaires et des sphéroïdes de culture de la même manière à chaque fois. Une dernière limitation est que les cellules épithéliales du sein migrent hors des sphéroïdes et le long des réseaux endothéliales au fil du temps. Il est possible que d’autres bioinks abrogeraient cette limitation.
La bioimpression directe des sphéroïdes épithéliales du sein sur les réseaux HUVEC pré-formés permet la création d’un modèle de co-culture tumorale in vitro 3D en peu de temps. Les chercheurs peuvent ensuite examiner rapidement les interactions entre les sphéroïdes et la vascularisation avec un débit plus élevé. À l’avenir, les sphéroïdes épithéliales du sein pourraient être bioimprimés sur des vasculatures perfusées, ce qui permettrait d’étudier les effets du débit. En outre, les organoïdes dérivés de tumeurs et les cellules endothéliales pourraient être bioimprimés pour permettre la médecine de précision par l’essai de l’efficacité du médicament dans un modèle spécifique au patient.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par NIH 1R01HL140239-01 à AMC. Nous tenons à remercier le Cell Imaging Center de l’Université Drexel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37°C incubator, 5% CO2 and 95% humidity | Sanyo | MCO-20AIC | Cell incubation |
| 3D Bio printer | custom-made | None | Used for bioprinting |
| 8-well chamber slides | VWR, Radnor, PA | 53106-306 | for seeding spheroids |
| 25-gauge needle | Sigma, St. Louis, MO | Z192406-100EA | bioprinting syringe needle |
| Absolute ethanol (200 proof ) | Sigma, St.Louis, MO | E7023-500ML | reconsitution of media components |
| Affinipure F(ab′)2 fragment goat anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA | 115006020 | secondary block - Immunofluorescence |
| Alexa Fluor 488 (1:200) | Thermo Fisher, Waltham, MA | A-11006 | Seconday antibody-Immunofluorescence |
| Bovine insulin | Sigma, St.Louis, MO | I-035-0.5ML | MCF10A Media additive |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma, St.Louis, MO | A2153-500G | Blocking agent -Immunofluorescence |
| Falcon 70 µm Cell Strainer | Corning, Corning, NY | 352350 | Remove large or clustered spheroids |
| CellTracker™ Red CMTPX Dye | Thermo Fisher, Waltham, MA | C34552 | pre-stain for HUVEC tubes |
| Compact Centrifuge | Hermle- Labnet, Edison ,NJ | Z206A | For cell centrifugations |
| Cholera Toxin | Sigma, St.Louis, MO | C8052-.5MG | MCF10A Media additive |
| Conical tubes 15 mL | VWR, Radnor, PA | 62406-200 | Collecting and resuspending cells |
| Countess II-FL Cell counter | Thermo Fisher, Waltham, MA | AMQAF1000 | counting cells |
| Glass pipettes (10 mL) | VWR, Radnor, PA | 76184-746 | cell resuspension |
| DMEM F:12 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 11320033 | MCF10A basal media |
| DMEM 1X | VWR, Radnor, PA | 10-014-CV | MDA-MB-231 basal media |
| Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2) | Lonza, Durham, NC | CC-3156 | HUVEC basal media |
| Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2) | Lonza, Durham, NC | CC-3162 | Accompanied with a Bulletkit (containing growth factors) |
| Alexa Fluor™ 488 Phalloidin | Thermo Fisher, Waltham, MA | Labelling MDA-MB-231 spheroids | |
| Fetal Bovine serum | Cytiva, Logan, UT | SH30071.03 | HUVEC/MDA-MB-231 media additive |
| Goat serum | Thermo Fisher, Waltham, MA | 16210064 | Immunofluorescence labelling component |
| Glycine | Sigma, St.Louis, MO | G8898-500G | immunofluorescence buffer component |
| Hoescht 33342 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 62249 | Nuclei stain immunofluorescence |
| Horse Serum | Thermo Fisher, Waltham, MA | 16050130 | MCF10A Media additive |
| Hydrocortisone | Sigma, St.Louis, MO | H0888-5G | MCF10A Media additive |
| Human Umblical Vein Endothelial cells (HUVECs) | Cell applications, San Diego , CA | 200-05f | Endothelial cell lines |
| Integrin α6 | Millipore, Billerica, MA | MAB1378 | Immunofluorescence spheroid labelling component |
| Live Dead assay | Thermo Fisher, Waltham, MA | L3224 | Live and dead cell stain assay for cell viability |
| LSM 700 Confocal microscope | Zeiss, Thornwood, NY | Used to visualize cells | |
| Matrigel - growth factor reduced 10 mg/ml | VWR, Radnor, PA | 354230 | Spheroid formation |
| MCF10A cells | ATCC | CRL-10317 | Breast cell line |
| MDA-MB-231 cells | ATCC | HTB-26 | Breast cell line |
| Paraformaldehyde | Sigma, St.Louis, MO | 158127-500G | cell fixative |
| Penicillin and streptomycin | Thermo Fisher, Waltham, MA | 15140122 | MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Media additive |
| Phosphate Buffered Saline 1X (PBS) | Thermo Fisher, Waltham, MA | 7001106 | Wash buffer for cells before trypsinization |
| Phosphate buffer saline 10X | Thermo Fisher, Waltham, MA | AM9625 | immunofluorescence buffer component |
| Prolong gold antifade | Thermo Fisher, Waltham, MA | P36934 | immunofluorescence mountant medium |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor, EGF | Peprotech, Rocky Hill, NJ | AF-100-15 | MCF10A/ assay media component |
| Sodium Azide | Sigma, St.Louis, MO | S2002-25G | immunofluorescence buffer component |
| Sterile syringe (10 mL) | VWR, Radnor, PA | 75846-757 | bioprinting process |
| Tissue culture dish (10cm) | VWR, Radnor, PA | 25382-166 | monolayer cell culture |
| Triton X-100 | Sigma, St.Louis, MO | T8787-250ML | immunofluorescence buffer component |
| Trypan blue 0.4% | Thermo Fisher, Waltham, MA | 15250061 | cell counter additive |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fisher, Waltham, MA | 25300054 | cell detachment |
| Tween -20 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 85113 | immunofluorescence buffer component |
| Vascular Endothelial Growth factor (VEGF165) | Peprotech, Rocky Hill, NJ | 100-20 | HUVEC tube additive |
| Volocity 6.3 cell imaging software | PerkinElmer, Hopkinton, MA | Z stack compresser |
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