Summary
Das Ziel dieses Protokolls ist es, Brustepithelzellen als multizelluläre Sphäroide direkt auf vorgeformte endotheliale Netzwerke zu bioprinten, um schnell 3D-Brust-Endothel-Kokulturmodelle zu erstellen, die für Arzneimittelscreening-Studien verwendet werden können.
Abstract
Bioprinting entwickelt sich zu einem vielversprechenden Werkzeug, um 3D-Humankrebsmodelle herzustellen, die kritische Merkmale der In-vivo-Gewebearchitektur besser rekapitulieren. Beim aktuellen Schicht-für-Schicht-Extrusionsbioprinting werden einzelne Zellen in einem Bioink zusammen mit komplexen räumlichen und zeitlichen Hinweisen extrudiert, um die hierarchische Gewebeselbstmontage zu fördern. Diese Biofabrikationstechnik beruht jedoch auf komplexen Wechselwirkungen zwischen Zellen, Bioinken und biochemischen und biophysikalischen Hinweisen. Daher kann die Selbstmontage Tage oder sogar Wochen dauern, kann bestimmte Bioinks erfordern und kann nicht immer auftreten, wenn mehr als ein Zelltyp beteiligt ist. Deshalb haben wir eine Technik entwickelt, um vorgeformte 3D-Brustepithelialsphäride in einer Vielzahl von Bioinks direkt zu bioprinten. Biobedruckte vorgeformte 3D-Brustepithelialsphäride hielten ihre Lebensfähigkeit aufrecht und polarisierten die Architektur nach dem Druck. Zusätzlich haben wir die 3D-Sphäroide auf vaskuläre Endothelzellnetzwerke gedruckt, um ein Co-Kultur-Modell zu erstellen. So schafft die neuartige Bioprinting-Technik schnell ein physiologisch relevanteres 3D-Brustmodell zu geringeren Kosten und mit einer höheren Flexibilität als herkömmliche Bioprinting-Techniken. Diese vielseitige Bioprinting-Technik kann extrapoliert werden, um 3D-Modelle anderer Gewebe in zusätzlichen Bioinks zu erstellen.
Introduction
3D-in-vitro-vaskularisierte Tumormodelle sind wesentliche Werkzeuge für die mechanistische Untersuchung von Krebswachstum und Metastasen. Insbesondere bei Brustkrebs organisieren sich in Matrigel kultivierte Brustepithelzellen zu polarisierten Sphäroiden, die eher der in vivo-Mamma-Akuinusarchitektur1,2,3,4,5,6,7,8ähneln. 3D-Brustepithelzellkultur wirkt sich auch auf die Zellfunktion aus, wobei 3D-KulturenUnterschiede in der epidermalen Wachstumsfaktor-Modulation (EGF) zeigen 8,9; Onkogenfunktion, einschließlich ErbB210; Wachstum und Apoptose-Signalisierung11,12; und Chemotherapie-Resistenz13,14. Vaskuläre Endothelzellen reagieren ähnlich unterschiedlich auf Umweltreize in 3D im Vergleich zu traditioneller 2D-Kultur15,16,17,18. Ein Großteil des Verständnisses von vaskulären endotheliale und Brustepithel-Wechselwirkungen stammt jedoch aus der 2D-Kultur mit konditionierten Medium- oder Transwell-Einsätzen oder 3D-Modellen, bei denen die beiden Zelltypen physisch getrennt sind19,20,21,22,23. Diese Co-Kultur-Modelle bieten begrenzte physiologische Erkenntnisse, da sowohl 3D-Kultur als auch Zellzellkontakt entscheidend für vaskuläre endotheliale – Brustepithelzellinteraktionen24,25,26sind.
3D-Krebsmodelle wurden mit einer Vielzahl von Techniken hergestellt, einschließlich hängender Tropfensphäroidbildung, Bioprinting, magnetische Montage und Kultur in Hydrogelen oder auf technischen Gerüsten5,27,28,29. In jüngerer Zeit wurden 3D-Tumormodelle mit mehreren Zelltypen erstellt, die in ihren jeweiligen 3D-Strukturen angeordnet sind. In einem Beispiel einer Tumor-on-a-Chip-Plattform wurden Krebs-, Endothel- und Stromalzellen in eine Matrix gemischt und dann in die drei zentralen Gewebekammern in einem Polydimethylsiloxan (PDMS)-Gerät injiziert. Die Gewebekammern wurden von zwei äußeren Kanälen umrandet, die eine Arterie und Venule darstellten. Nach 5-7 Tagen Kultur bildeten Endothelzellen ein mikrovaskuläres Netzwerk und Krebszellen vermehrten sich zu kleinen Tumoren in der Nähe der Vaskulatur. Diese Plattform wurde dann verwendet, um Drogen und Drogenkombinationen zu überprüfen30. Zusätzliche Tumor-on-a-Chip-Plattformen wurden geschaffen, um Metastasen und Krebsarten mit spezifischen mechanischen Reizen (z.B. mechanische Dehnung in der Lunge) zu untersuchen31,32. Diese Plattformen enthalten jedoch in der Regel nicht sowohl Vaskulatur als auch Krebs in ihren jeweiligen 3D-Strukturen.
Die Biofertigung ist vielversprechend bei der Weiterentwicklung von 3D-in-vitro-vaskularisierten Tumormodellen, da sie eine enge räumliche Kontrolle über die Zelllage ermöglicht. Trotz des Wachstums des Bioprinting in den letzten zehn Jahren konzentrieren sich nur wenige Studien speziell auf Tumore33,34. In einem Beispiel wurde der 3D-Druck von HeLa-Zellen in einem Gelatine-/Alginat-/Fibrinogen-Hydrogel verwendet, um ein in vitro Gebärmutterhalskrebsmodell zu erstellen. Tumorzellen wurden als einzelne Zellen biogedruckt und dann erlaubt, Sphäroide zu bilden, die eine höhere Proliferationsrate, erhöhte Matrix-Metalloproteinase-Expression und eine höhere Chemoresistenz als Zellen in 2D-Kultur35zeigten. In diesen Studien wurden, wie in vielen anderen36,37, dissoziierte Zellsuspensionen biogedruckt, und dann wurden die Zellkulturen mit den erforderlichen mechanischen und biochemischen Hinweisen versehen, um den Zellen eine 3D-Struktur zu ermöglichen. Die zelluläre Selbstmontage kann jedoch Tage oder Wochen dauern, komplexe räumliche und zeitliche Umwelthinweise erfordern oder nicht auftreten, wenn zwei Zelltypen mitkultiviert werden. Zum Beispiel induzierten Brustepithelzellen den Zelltod in Endothelzellen in 2D-Kokultur, und dissoziierte Brustepithelzellen bildeten keine 3D-Spheroide, wenn sie in Alginat/Gelatine-Hydrogelen38bioprinted wurden. Dissoziierte Brustepithel- oder Krebszellen bildeten Sphäroide in Alginat-basierten Bioinks nur, wenn sie in kreisförmigen PDMS-Formen eingeschlossen waren. In anderen Fällen wurden Sphäroide mit hängenden Tröpfchen in ultraniedrigen Befestigungskreisplatten gebildet und dann in Alginat-basierte Bioinks39,40gemischt.
Wir beschreiben nun eine alternative 3D-Gewebebiomanufacturing-Methode in diesem Protokoll. Anstatt entfernt von Samen dissoziierte Zellen und warten, bis diese Zellen die 3D-Strukturen bilden, beschreiben wir, wie man 3D-Tumorsphäride in einem Gefäßröhrennetzwerk erstellt und bioprintt, um ein Tumor-Kokulturmodell zu erstellen, das fast sofort verwendet werden kann. Tumorsphäride können in vitro angebaut oder aus menschlichen Geweben (Organoiden) gewonnen werden. Ebenso können Gefäßröhren angebaut oder aus mikrovaskulären Fragmenten des Fettgewebes abgeleitet werden. Bioinks können von biologisch inaktivem Alginat bis zum hochbiologisch aktiven Matrigel41reichen. Da dieses 3D-Tumor-Cokulturmodell mit einer Vielzahl von Zellstrukturen und Bioinks erstellt werden kann, kann es mehrere Zelltypen, extrazelluläre Matrizen und Chemokin-Gradienten15,42integrieren. Während in ihrer aktuellen Formulierung die Endothelnetzwerke nicht durchdrungen werden können, könnten zukünftige Iterationen diese Methode mit Mikrofluiden oder -on-Chip-Systemen integrieren. Bioprinting 3D Brust epitheliale Sphäroide auf endotheliale Netzwerke ermöglicht eine schnelle Biofertigung von menschlichen Brustmodellen für Arzneimitteltests und personalisierte Präzisionsmedizin27.
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Protocol
1. Brustepithelzellwachstum und Assay-Medien
- MCF10A Brustepithelzellen
HINWEIS: Die nicht-tumorigenic verewigte Brustepithelzelllinie wird von einem Patienten mit fibrozystischer Erkrankungabgeleitet 43. Zellen drücken keinen Östrogenrezeptor aus.- Um den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) von 20 g/ml vorzubereiten, lösen Sie 100 g lyophilisierten EGF in 500 l sterilen dH2O auf, um 200 g/ml EGF zu bilden. Fügen Sie 500 l von 200 g/ml EGF in 4,5 ml sterile 0,1% BSA in dH2O hinzu, um eine EGF-Lagerlösung mit 20 sg/ml herzustellen. Vorbereitete 20 g/ml EGF-Aliquots bei -20 °C für bis zu 12 Monate lagern.
- Zur Zubereitung von 500 g/ml Hydrocortison 1 mg Hydrocortison in 1 ml absolutem Ethanol (200 Nachweis) verdünnen. Fügen Sie 1 ml steriles DMEM F:12 zu dieser Mischung hinzu, um eine 500 g/ml Hydrocortison-Stammlösung herzustellen. Hydrocortison-Lager-Aliquots bei -80 °C für bis zu 12 Monate lagern.
- Um 10 g/ml Choleratoxin vorzubereiten, lösen Sie 1 mg Choleratoxin lyophilisiertes Pulver in 1 ml sterilem dH2O auf, um eine 1 mg/ml Choleratoxin-Stammlösung herzustellen. Speichern Sie Cholera-Toxin-Lager Aliquots bei -80 °C für bis zu 12 Monate.
- Zur Vorbereitung des Wachstumsmediums werden 500 l EGF (20 g/ml), 500 l Hydrocortison (500 g/ml), 5 l Choleratoxin (1 mg/ml), 500 l Rinderinsulin (10 mg/ml), 10 ml Penicillin und Streptomycin, und 25 ml Pferdeserum bis 500 ml DMEM F:12 für eine Endkonzentration von 20 ng/ml EGF, 500 ng/ml Hydrocortison, 10 ng/ml Choleratoxin, 10 ng/ml Rinderinsulin, 2% v/v Penicillin und Streptomycin und 5% v/v Pferdeserum. Die Antibiotikakonzentration wurde auf 2 % erhöht, um die verminderte Sterilität im Bioprinting-Prozess zu berücksichtigen; die Antibiotikakonzentration kann jedoch auf 1% gesenkt werden.
- Zur Vorbereitung von Assay Medium 500 l Hydrocortison (500 g/ml), 5 l Choleratoxin (1 mg/ml), 500 l Rinderinsulin (10 mg/ml), 10 ml Penicillin und Streptomycin, und 25 ml Pferdeserum bis 500 ml DMEM F:12 für eine Endkonzentration von 500 ng/ml Hydrocortison, 10 ng/ml Choleratoxin, 10 ng/ml Rinderinsulin, 2% v/v Penicillin und Streptomycin und 5% v/v Pferdeserum.
- MDA-MB-231
HINWEIS: Die dreifach-negative (fehlende Östrogen-Rezeptor, Progesteron-Rezeptor, und epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor 2) Brustkrebs-Epithel-Zelllinie wird aus Pleuraerguss einer weiblichen Patientin mit metastasierendem Mamma-Adenokarzinom44erstellt. Zellen stellen einen aggressiven, invasiven und schlecht differenzierten Brustkrebs dar.- Zur Vorbereitung von Growth and Assay Medium 50 ml fetales Rinderserum, 10 ml Penicillin und Streptomycin und 25 ml Pferdeserum zu 500 ml DMEM für eine Endkonzentration 10% v/v fetales Rinderserum, 2% v/v Penicillin und Streptomycin und 5% v/v Pferdeserum.
2. Brustepithelzellkultur
- Samen 500.000 MCF10A oder MDA-MB-231 Zellen in einer 10 cm (P100) Gewebekulturschale mit 10 ml MCF10A oder MDA-MB-231 Wachstumsmedien. MCF10A- und MDA-MB-231-Zellen erreichen >90% Zusammenfluss in 48 Stunden.
- Um Brustepithelzellen zu durchziehen, waschen Sie zuerst Zellen mit 10 ml warmem PBS.
- Lösen Sie Brustepithelzellen, indem Sie 2 ml 0,05% Trypsin-EDTA in die Schale geben. Legen Sie das Gericht in einem 37 °C, 5%CO2-Inkubator für 20-25 Minuten.
- Fügen Sie den Trypsinisierten Zellen 5 ml MCF10A oder MDA-MB-231 Growth Medium hinzu, um das Trypsin zu neutralisieren. Pipette die Zell-Medien-Mischung nach oben und unten, um Zellen wieder zu suspendieren und Zellcluster aufzubrechen.
- Fügen Sie die Zellsuspension 3 Minuten lang einem 15 ml konischen Rohr und einer Zentrifuge bei 1.200 x g hinzu. Den Überstand vorsichtig ansaugen und das Zellpellet in 5 ml MCF10A oder MDA-MB-231 Growth Medium wieder aufsetzen.
- Platte 1 ml Zellsuspension in 5 neuen 10 cm Gewebekulturschalen zusammen mit MCF10A oder MDA-MB-231 Growth Medium. Legen Sie das Geschirr in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator. Die Zellen können in 2-3 Tagen wieder durchgesieben werden. MCF10A-Zellen können bis zu Durchgang s 35 beibehalten werden, danach zeigen sie morphologische Veränderungen. MDA-MB-231-Zellen können bis Durchgang S24 beibehalten werden, danach zeigen sie morphologische Veränderungen.
3. Brust epitheliale Sphäroid-Formation
- Einfrieren Sie die 200 L Pipettenspitzen 30 Minuten vor Beginn des Testes. Halten Sie die wachstumsfaktorreduzierte Matrixlösung (z. B. Matrigel) (10 mg/ml) während des gesamten Prozesses auf Eis.
- Langsam Pipette 30 l eiskalte Matrixlösung mit eiskalten 200 l Pipettenspitzen in jeden Brunnen eines 8-Well-Kammerschlittens. Beginnen Sie von den Seiten und ziehen Sie die Pipettenspitze entlang der Ecken, hinzufügen einen letzten Tropfen in der Mitte des Brunnens, um eine gleichmäßige Beschichtung jedes Brunnens zu gewährleisten. Vermeiden Sie Luftblasen während dieses Schritts, um eine gleichmäßige Matrixlösungsschicht zu gewährleisten. Verwenden Sie neue Pipettenspitzen für jeden Brunnen.
- Inkubationskammergleitet in einem 37 °C, 5%CO2-Inkubator für 15-20 Minuten, um die Matrixlösung zu polymerisieren.
- Setzen Sie trypsinisierte MCF10A-Zellen in MCF10A Assay Medium bei 200.000 Zellen/ml aus oder setzen Sie trypsinisierte MDA-MB-231-Zellen in MDA-MB-231 Growth Medium bei 200.000 Zellen/ml wieder aus.
- Bei Verwendung von MCF10A-Zellen bereiten Sie frisches MCF10A Spheroid Growth Medium vor, indem Sie 5 l EGF (20 g/ml) und 100 l Matrixlösung zu 5 ml Assay Medium für eine Endkonzentration von 2% Matrixlösung hinzufügen.
- Entfernen Sie den mit Matrixlösung vorbeschichteten Kammerschlitten aus dem Inkubator. Fügen Sie jedem Brunnen 50 L MCF10A oder MDA-MB-231 Zellsuspension (10.000 Zellen) hinzu. Wenn Sie MCF10A-Zellen verwenden, fügen Sie 450 L MCF10A Spheroid Growth Medium hinzu. Wenn Sie MDA-MB-231-Zellen verwenden, fügen Sie 450 L MDA-MB-231 Growth Medium vorgemischt mit 2% Matrixlösung (9 l) hinzu. Stellen Sie die Kammerrutsche sofort in einen 37 °C, 5% CO2-Inkubator.
- Ersetzen Sie das Medium alle 4 vier Tage. Mit einer 200-L-Pipettenspitze aus einer Ecke jedes Brunnens heraus pipette 200 l alte Medien. Kippen Sie dabei den Kammerschlitten um 45°, um sicherzustellen, dass die Sphäroide nicht gestört werden. Fügen Sie 200 L frisch zubereitetes MCF10A Spheroid Growth Medium oder MDA-MB-231 Growth Medium, das zuvor mit 2% Matrixlösung gemischt wurde, zu jedem Brunnen an der Ecke in Tropfen hinzu, um sicherzustellen, dass Sphäroide an der Matrixschicht befestigt bleiben. Nur 50 % der Medien werden ersetzt, so dass alle zytokinen, die von den Sphäroiden produziert werden, nicht vollständig erschöpft sind.
HINWEIS: MCF10A Brustepithelialsphäride brauchen bis zu 8 Tage, um zu polarisieren und Hohlzentren zu bilden. MDA-MB-231 Brustepithelialsphäride brauchen bis zu 5 Tage, um sich zu bilden und haben keine Hohlzentren.
4. Endotheliale Zellnetzbildung
- Human Umbilical Venin Endothelzelle (HUVEC) Kultur
- Fügen Sie den Inhalt eines einzigen Endotheliale Wachstums Medium-2-Kits hinzu, das Insulinwachstumsfaktor, Fibroblastenwachstumsfaktor, vaskulären endotheliaalen Wachstumsfaktor enthält, Ascorbinsäure, epidermaler Wachstumsfaktor, Heparin und Gentamicin-Amphotericin B, zusammen mit 50 ml fetalem Rinderserum, 5 ml Penicillin-Streptomycin und 5 ml 200 mM Glutamin bis 500 ml Endothelialebasal Medium-2 (EBM-2) zu einem vollständigen Endothel-Wachstumsmedium (EGM-2).
- Samen 500.000 Endothelzellen in einer 10 cm Gewebekulturschale in 10 ml EGM-2. Legen Sie Zellen in einen 37 °C, 5% CO2-Inkubator, bis sie >80% Konfluenz erreichen (ca. 48 Stunden).
- Um Zellen zu durchziehen, waschen Sie Endothelzellen mit 10 ml warmem PBS. Lösen Sie HUVEC, indem Sie der 10 cm Gewebekulturschale 2 ml 0,05% Trypsin-EDTA hinzufügen. Überwachen Sie die Zellen durch Phasenkontrastmikroskopie. Die Zellen sind bereit, wenn sie aufgeballt werden, bleiben aber an der Schale befestigt.
- Das Trypsin vorsichtig aus der Schale saugen. Fügen Sie 8 ml EGM-2 in das Gericht. Waschen Sie zellenvon der Schale, indem Sie den EGM-2 über die gesamte Telleroberfläche nach oben und unten pfeifen.
- Alternativ können Sie den Trypsin-Zellen 5 ml EGM-2 hinzufügen, um das Trypsin zu neutralisieren. Pipette die Zell-Medien-Mischung nach oben und unten, um Zellen wieder zu suspendieren und Zellcluster aufzubrechen. Fügen Sie die Zellsuspension 3 Minuten lang einem 15 ml konischen Rohr und einer Zentrifuge bei 1.200 x g hinzu. Den Überstand vorsichtig ansaugen und das Zellpellet in 10 ml EGM-2 wieder aufhängen.
- Fügen Sie 1 ml Zellsuspension zu 9 ml EGM-2 in einer 10 cm Gewebekulturschale hinzu. Legen Sie das Geschirr in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator. Tauschen Sie 2/3 des Mediums alle 2 Tage mit frischem EGM-2 um. Die Zellen können in 3-5 Tagen durchforsst werden. HUVEC kann bis Zugänge 8 aufrechterhalten werden, nach denen sie keine Netzwerke bilden.
- Endothelzelle (HUVEC) Netzwerkbildung
- Einfrieren Sie die 200 L Pipettenspitzen 30 Minuten vor Beginn des Testes. Halten Sie die wachstumsfaktorreduzierte Matrixlösung (10 mg/ml) während des gesamten Prozesses auf Eis.
- Langsam Pipette 30 l eiskalte Matrixlösung mit eiskalten 200 l Pipettenspitzen in jeden Brunnen eines 8-Well-Kammerschlittens. Beginnen Sie von den Seiten und ziehen Sie die Pipettenspitze entlang der Ecken, hinzufügen einen letzten Tropfen in der Mitte des Brunnens, um eine gleichmäßige Beschichtung jedes Brunnens zu gewährleisten. Vermeiden Sie Luftblasen während dieses Schritts, um eine gleichmäßige Matrixlösungsschicht zu gewährleisten. Verwenden Sie neue Pipettenspitzen für jeden Brunnen.
- Inkubationskammer gleitet in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator für 15-20 Minuten, um Matrigel zu polymerisieren.
- Eine 10 cm große Schale HUVEC mit 10 l Rote-Zell-Tracker (1:1000) 30 Minuten in 37 °C, 5% CO2-Inkubator vorfärben.
- Endothelzellen mit 10 ml warmem PBS waschen. Lösen Sie HUVEC, indem Sie der 10 cm Gewebekulturschale 2 ml 0,05% Trypsin-EDTA hinzufügen. Legen Sie die Schale in einen 37 °C, 5%CO2-Inkubator für 5 Minuten, um die Zellen vollständig zu lösen.
- Fügen Sie 5 ml EGM-2 in die Schale, um das Trypsin zu neutralisieren. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 25 ml konisches Rohr. Zentrifuge HUVEC bei 1.200 x g für 5 Minuten. Den Überstand ansaugen und das Zellpellet in 5 ml serumfreiem EBM-2 wieder aufhängen.
- Zählen Sie Zellen mit Trypan blue, um lebensfähige Zellen zu bestimmen. Erstellen Sie eine 1 x 10 6-Zellen/ml-Lösung.
- Fügen Sie 100.000 HUVEC zu jedem Brunnen mit 200 L serumfreien EBM-2 hinzu. Wenn mehr Zellen hinzugefügt werden, erstellen sie eine Oberflächenmonolayer anstelle eines Rohrnetzwerks.
- HUVEC in einem 37 °C, 5%CO2-Inkubator inkubieren. Nach 6 Stunden, Bild HUVEC Netzwerke durch Phasenkontrastmikroskopie. Netzwerke sind jetzt bereit für die Kokultur mit Brustsphäroiden.
5. Bioprinting Brustepithelial sphäroide auf vorgeformten HUVEC-Netzwerken
HINWEIS: Für den Bioherstellungsprozess sollte ein Bio-Abscheidungssystem mit zwei Düsen verwendet werden. In diesem Fall verfügte das System über drei Bewegungsarme, um eine räumliche Kontrolle der Materialabscheidung im Mikronmaßstab zu ermöglichen, sowie über zwei schraubengetriebene Motoren, um Bioink aus 10 ml Spritzen abzulagern. Das System sollte mit einem hocheffizienten Partikelluftfiltrationssystem sowie UV-Sterilisationsfunktionen funktionalisiert werden, um eine sterile Umgebung während des Bioprintings zu erhalten. Der Bioprinter wird vor dem Druckvorgang eine Stunde lang UV-sterilisiert.
- Erstellen Sie Brustepithelisaleroiide und HUVEC-Netzwerke, wie zuvor beschrieben. Schätzen Sie die Anzahl der Brustepithelialsphäroide in jedem Brunnen, indem Sie Sphäroide in repräsentativen Phasenkontrastmikroskopiebildern zählen.
- 0,5 cm vom Ende einer 1000 L Pipettespitze abschneiden. Verwenden Sie die geschnittene Pipettenspitze, um alle Sphäroide aus dem 8-Well-Kammerschlitten und in ein 50 ml-Rohr sorgfältig zu pipette. Resuspend Sphäroide in der ausgewählten Bioink bei 100 Sphäroide/100 l.
HINWEIS: Höhere Sphäroidkonzentrationen können zu Sphäroidclustering führen und die Visualisierung von Wechselwirkungen zwischen den Sphäroiden und den Endothelnetzwerken verhindern. - Übergeben Sie die Sphäroidmischung durch ein 70-m-Zellsieb, um große oder gruppierte Sphäroide zu entfernen.
- Die gepoolten Sphäroide in eine 10 ml sterile Spritze geben und mit einer 25-Spur-Sterilnadel verschließen. Befestigen Sie die Spritze am Bio-Abscheidungssystem.
- Saugen Sie das Medium aus den HUVEC-Netzwerken in der 8-Well-Kammerrutsche.
- Extrudieren Sie 100 l Brustepithelialsphäride auf 6 Brunnen von HUVEC-Netzwerken mit einer Durchflussrate von 1 ml/min. Verwalten Sie 2 Brunnen von HUVEC-Netzwerken als Steuerungen.
- Fügen Sie 400 L MCF10A Spheroid Growth Medium hinzu, wenn Sie MCF10A Sphäroide verwenden, die auf HUVEC-Netzwerken gedruckt werden, oder 400 L MDA-MB-231 Growth Medium hinzufügen, das zuvor mit einer Matrixlösung von 2% gemischt wurde, wenn MDA-MB-231 Sphäroide verwendet werden, die auf HUVEC-Netzwerken gedruckt wurden. Das jeweilige Sphäroid-Wachstumsmedium sollte in HUVEC-Kontrollbrunnen eingesetzt werden.
- Inkubieren Sie Kokulturen in einem 37 °C, 5% CO2-Inkubator für 24 – 96 Stunden ohne Medienwechsel. Die Kokulturen werden im ursprünglichen Medium bis zu vier Tage lebensfähig bleiben.
6. Konfokale Mikroskopie
- Immunfluoreszenz und PBS-Glycin-Waschpuffer-Vorbereitung
- Vorbereiten Sie Immunofluoreszenz (IF) Puffer 10x Stammlösung durch Zugabe von 2,5 g Natriumazid, 5 g Rinderserumalbumin, 10 ml Triton X-100 und 2,05 ml Tween-20 in 500 ml 10x PBS. PH auf 7,4 einstellen. Lagern Sie die Lagerlösung bis zu einem Jahr bei 4 °C, um Sedimentation zu vermeiden.
- Erstellen Sie einen funktionierenden IF-Puffer, indem Sie 50 ml 10x IF-Puffer in 450 ml sterilen entionisiertem Wasser verdünnen. Bewahren Sie die Arbeitslösung bis zu einer Woche bei Raumtemperatur auf.
- Bereiten Sie 10x PBS-Glycin-Puffer-Lagerlösung vor, indem Sie 37,5 g Glycin zu 500 ml 10x PBS hinzufügen. PH auf 7,4 einstellen. Lagern Sie die Lagerlösung bis zu 6 Monate bei 4 °C, um Sedimentation zu vermeiden.
- Erstellen Sie eine funktionierende PBS-Glycin-Lösung, indem Sie 50 ml 10x PBS-Glycin-Puffer in 450 ml sterilen entionisierten Wassers verdünnen. Bewahren Sie die Arbeitslösung bis zu einer Woche bei 4 °C auf.
- Label Bioprinted Samples and Image by Confocal Microscopy
- Aspirieren Sie Medium aus bioprinted 3D-Kokulturen und spülen Sie 3 mal mit warmen PBS. Fix bioprinted 3D Kokulturen mit 4% Paraformaldehyd für 1 h bei Raumtemperatur. Proben 3 mal für 20 Minuten mit 1x PBS-Glycin emiten.
- Blockproben mit IF-Puffer gemischt mit 10% Ziegenserum für 90 Minuten (Primärblock), gefolgt von 40 Minuten mit IF-Puffer plus 10% Ziegenserum und Affinipure Fab Fragment (1:100, Sekundärblock).
- Bei Verwendung von MCF10A-Sphäroiden proben mit einem Primärantikörper für Integrin 6 (1:100) im sekundären Sperrpuffer über Nacht bei 4 °C, gefolgt von einem Alexa Fluor 488 Sekundärantikörper (1:200) und Hoescht 33342 (1:1000) für 1 h bei lichtgeschützter Raumtemperatur. MCF10A-Zelllinien drücken hohe Integrin-Konzentrationen aus 6, die für die Darstellung der Sphäroidpolarisation und Morphologie unerlässlich sind.
- Bei Verwendung von MDA-MB-231 Sphäroiden, die niedrige Integrin-Konzentrationen ausdrücken, beschriften Sie Proben mit Alexa Fluor 488 phalloidin (1:100) und Hoescht 33342 (1:1000) im sekundären Sperrpuffer für 4 Stunden bei Lichtschutz. Phalloidin ermöglicht die Visualisierung von Actin-Filamenten, so dass die amorphe und invasive Morphologie des Sphäroids beurteilt werden kann.
- Proben mit 1X PBS-Glycin 3 mal für 20 Minuten waschen.
- Bereiten Sie Proben für die Montage vor, indem Sie den Kammerschlitten mit dem Werkzeug des Herstellers entfernen. Fügen Sie jedem Brunnen einen kleinen Tropfen Antifade-Lösung hinzu. Legen Sie einen 22 mm x 60 mm Abdeckzettel auf jeden Kammerschlitten und versiegeln Sie die Kanten sorgfältig mit klarem Nagellack.
- Bildproben mit einem konfokalen Mikroskop als Z-Stacks von 10 Scheiben in 5'm Schritten. Komprimieren Sie zkomprimiert z.B. mit dem Befehl Extended Focus in der Zellbildsoftware in eine einzelne Ebene.
- Quantify spheroid adheoid ad image J. Die Anzahl der haftenden Sphäroide kann mit dem Analyse-Plugin mit der entsprechenden Partikelgröße und Zirkularität quantifiziert werden. Normalisieren Sie die Anzahl der angefügten Sphäroide im Bildbereich.
- Um die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten, quantifizieren Sie die Anzahl der haftenden Sphäroide in 4 x 4 gefliesten Bildern von Kokulturen. Wenn die Sphäroidzahl statistisch signifikant niedriger ist als bei anderen Experimenten, sollte das Experiment wiederholt werden.
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Representative Results
Brustepithelzellen sollten sich nach 5-8 Tagen Kultur auf Matrixlösung und im Kulturmedium mit 2% Matrixlösung selbst in 3D-Sphäroide organisieren. Nicht-tumorigene MCF10A Brustepithelialsphäride sollten rund erscheinen und ein hohles Zentrum haben, mit Integrin 6 polarisiert bis zum äußeren Rand des Sphäroids(Abbildung 1, Einschub zeigt Hohlzentren). Hochinvasive MDA-MB-231 Brustkrebs-Epithelzellen bilden unregelmäßige Sphäroide. Sphäroide sollten verwendet werden, wenn sie einen Durchmesser von etwa 100 – 300 m haben. Wenn Sphäroide zu groß werden und in unmittelbarer Nähe kommen, schließen sich die Sphäroide zu Megasphäroiden zusammen. Darüber hinaus können MDA-MB-231 Brustepithelisalepitoide Zellen zeigen, die aus den Sphäroiden wandern, wenn sie zu lange in der Matrigel-Kultur gepflegt werden.
HUVEC sollte sich nach 6-8 Stunden spärlicher, serumfreier Kultur selbst in röhrenartige Netzwerke organisieren. Proben haben mehrzellige Knoten mit Verbindungen, die aus Linien von 1-3 Zellen parallel gebildet werden. Die HUVEC-Netzwerke können durch Phasenkontrastmikroskopie oder durch konfokale Mikroskopie abgebildet werden, wenn sie mit Cell Tracker und Hoescht beschriftet sind (Abbildung 2). Der ImageJ-Angiogenese-Analysator kann verwendet werden, um Netzwerkknoten, Segmente und Verzweigungen zu quantifizieren. HUVEC-Netzwerke sterben ab, wenn sie länger als 16 Stunden im serumfreien Medium gelassen werden.
Wenn Brustepithelisaleaufoide auf die HUVEC-Netzwerke bioprinted werden, sollten sowohl Sphäroide als auch Netzwerke ihre ursprüngliche Morphologie mindestens 24 Stunden lang beibehalten. MCF10A Brustepithelisalesphäroide erscheinen als runde Objekte, die direkt an den endotheliaalen Netzwerken haften, während MDA-MB-231 Brustepithelialsphäroide amorpher erscheinen, aber immer noch verbunden oder in unmittelbarer Nähe zu den endotheliaalen Netzwerken sind (Abbildung 3). HUVEC-Netzwerke werden aufrechterhalten, wenn sie mit Brustepithelialsphäroiden kokultiviert werden. Bei Kokulturen, die länger als 24 Stunden sind, können die Epithelzellen der Brust aus den Sphäroiden und entlang der Endothelnetzwerke wandern. Unserer Erfahrung nach geschieht dies früher in tumorigenen statt nicht-tumorogenen Brustepithelzellen38. Wir haben zuvor anhand biogedruckter Kokulturen gezeigt, dass Bereits 2 Stunden nach dem Sphäroid-Bioprinting Mitdrogentests eingeleitet werden können, zum Beispiel um die Sphäroidhaftung auf endotheliale Netzwerke zu testen45. Wir haben auch gezeigt, dass 3D-Brustsphäroide resistenter gegen Anti-Krebs-Medikamente wie Paclitaxel sind als als Einzelne Zellen oder in Co-Kultur41,45. In Ermangelung biobedruckter Sphäroide können HUVEC-Netzwerkkontrollbrunnen ihre Netzwerkmorphologie nicht halten und sterben nach 16 h.
Abbildung 1: Repräsentative konfokale Mikroskopiebilder von Brustepithelialsphäroiden. MCF10A Sphäroide wurden für Integrin 6 (grün) und Kerne (blau) beschriftet. Der Zellphänotyp kann nach dem Bioprinting bestätigt werden, wenn Sphäroide rund mit einem Hohlzentrum (Einset) erscheinen und integrin 6 an den äußeren Rändern polarisiert sind. MDA-MB-231 Sphäroide wurden für Actin (grün) und Kerne (blau) gekennzeichnet. Zellphänotyp kann bestätigt werden, wenn Sphäroide unregelmäßig ohne Hohlzentren geformt sind und Zellprozesse in die umgebende Matrix eindringen. Maßstabsleiste = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Repräsentative Bilder von HUVEC-Netzwerken durch Phasenkontrast und konfokale Mikroskopie. HUVEC-Netzwerke werden als kleine mehrzellige Knoten mit Zelllinien angezeigt, die die Knoten verbinden. Für die konfokale Mikroskopie wurden die Zellen mit Cell Tracker Red und Hoescht für Kerne (blau) beschriftet. Maßstabsleiste = 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Repräsentative Bilder von Brustepithelialsphäroiden, die mit HUVEC-Netzwerken kokultiviert werden. MCF10A Sphäroide, beschriftet für Integrin 6 (grün) und Kerne (blau), bleiben rund und erscheinen direkt an den Endothelnetzwerken haften. MDA-MB-231 Sphäroide, beschriftet für Actin (grün) und Kerne (blau), erscheinen amorph und bleiben in der Nähe oder auf endotheliale Netzwerke. Kokulturen pflegen diese Morphologie mindestens 24 Stunden nach dem Bioprinting, danach können Brustzellen entlang der Endothelröhren auswandern. Maßstabsleiste = 50 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Dieses Protokoll ist das erste seiner Art, das Sphäroide in ihrer 3D-Architektur für die Co-Kultur mit Endothelzellen auch in ihrer 3D-Architektur bioprintiert. Kritische Protokollschritte umfassen die Erstbildung von Brustepithelialsphäroiden und HUVEC-Netzwerken. Bei der Fütterung von Epithelsphäroiden ist äußerste Vorsicht geboten, da sie leicht von der Matrixlösung gestört werden können. Ebenso müssen Brustepithelilesphäroide mit Vorsicht behandelt werden, wenn sie von der Matrixlösung abgeführt und in die Netzwerke gemischt werden. HUVEC-Netze sollten nicht mit einer zu hohen Dichte plattiert oder länger als 16 Stunden verlassen werden, da sie eine Monoschicht bzw. Diebilden bilden. Schließlich sollte der gesamte Biodruck in einer sterilen Umgebung bei 37 °C erfolgen, um die Zelllebensfähigkeit zu maximieren.
Brustepithelialsphäroide können in einer Vielzahl von Bioinks neben Matrigel bioprinted werden, einschließlich Alginat- und Alginat-Kollagen-Mischungen. Wir zeigten, dass Sphäroide lebensfähig waren und ihre Morphologie bei behielten, wenn sie in Alginat-basierten Bioinks gedruckt wurden41. Während wir hier Bioprinting in Matrixlösungsbioink präsentieren, sind auch andere kostengünstigere und einfacher zu verwendende Bioinks möglich. Zusätzlich haben wir andere Brustkrebszelllinien verwendet, darunter MCF-7 und gentechnisch veränderte MCF10A-NeuN-Zellen mit ähnlichem Erfolg38,41,45. Alternative Mittel könnten auch verwendet werden, um die Brustepithelial sphäroide zu erstellen. Zum Beispiel verwendeten Lee et al. Hydrogel-Mikrowell-Arrays, die mit PDMS-Stempeln hergestellt wurden, um einheitlich große Sphäroide der kontrollierten Größe46zu erstellen. Schließlich könnten alternative Endothelzellen wie tumorabgeleitete Endothelzellen verwendet werden, und anstatt HUVEC-Netzwerke zu bilden, könnten fettgewebeabgeleitete Mikrogefäße direkt als 3D-Gefäßstrukturen bioprinted werden47.
Eine primäre Einschränkung dieser Methode war die Herausforderung bei der Kontrolle der biogedruckten Sphäroid-Position und -Zahl. Sphäroide mussten mit relativ großen Düsen und in invisziden Flüssigkeiten bedruckt werden, um Sphäroidschäden zu verhindern. Schnell gegelnende Bioinks könnten sphäroide Position besser kontrollieren. Sphäroide konnten auch nicht im Bioink gezählt werden, da sie zu groß für unseren Zellzähler waren. Stattdessen verließen wir uns auf Sphäroid-Zahlen, die von Phasenkontrastbildern abgeleitet wurden, die vor dem Pipetieren von Sphäroiden von der Matrigel-Oberfläche aufgenommen wurden. Alternative Mittel zur Bildung der Sphäroide könnten ihre Anzahl und Größe besser kontrollieren. Wir waren in der Lage, Sphäroid-Zahl und -Größe mit mäßiger Genauigkeit zu kontrollieren, indem wir jedes Mal Zellsiebe und Kultivierungssphäride auf die gleiche Weise verwenden. Eine letzte Einschränkung ist, dass Brustepithelzellen im Laufe der Zeit aus den Sphäroiden und entlang der endotheliale Netzwerke wandern. Es ist möglich, dass alternative Bioinks diese Einschränkung aufheben würden.
Der direkte Bioprinting von Brustepithelialsphäriden auf vorgeformten HUVEC-Netzwerken ermöglicht die Erstellung eines 3D-In-vitro-Tumor-Cokulturmodells in kurzer Zeit. Die Forscher können dann schnell Wechselwirkungen zwischen Sphäroiden und Vaskulatur mit höherem Durchsatz untersuchen. In Zukunft könnten Brustepithelisalepitoide auf durchdrungene Vaskulaturen bioprinted werden, was eine Untersuchung der Strömungseffekte ermöglichen würde. Darüber hinaus könnten tumorabgeleitete Organoide und Endothelzellen biogedruckt werden, um eine Präzisionsmedizin durch Tests der Arzneimittelwirksamkeit in einem patientenspezifischen Modell zu ermöglichen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde von NIH 1R01HL140239-01 an AMC finanziert. Wir bedanken uns beim Cell Imaging Center der Drexel University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37°C incubator, 5% CO2 and 95% humidity | Sanyo | MCO-20AIC | Cell incubation |
| 3D Bio printer | custom-made | None | Used for bioprinting |
| 8-well chamber slides | VWR, Radnor, PA | 53106-306 | for seeding spheroids |
| 25-gauge needle | Sigma, St. Louis, MO | Z192406-100EA | bioprinting syringe needle |
| Absolute ethanol (200 proof ) | Sigma, St.Louis, MO | E7023-500ML | reconsitution of media components |
| Affinipure F(ab′)2 fragment goat anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA | 115006020 | secondary block - Immunofluorescence |
| Alexa Fluor 488 (1:200) | Thermo Fisher, Waltham, MA | A-11006 | Seconday antibody-Immunofluorescence |
| Bovine insulin | Sigma, St.Louis, MO | I-035-0.5ML | MCF10A Media additive |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma, St.Louis, MO | A2153-500G | Blocking agent -Immunofluorescence |
| Falcon 70 µm Cell Strainer | Corning, Corning, NY | 352350 | Remove large or clustered spheroids |
| CellTracker™ Red CMTPX Dye | Thermo Fisher, Waltham, MA | C34552 | pre-stain for HUVEC tubes |
| Compact Centrifuge | Hermle- Labnet, Edison ,NJ | Z206A | For cell centrifugations |
| Cholera Toxin | Sigma, St.Louis, MO | C8052-.5MG | MCF10A Media additive |
| Conical tubes 15 mL | VWR, Radnor, PA | 62406-200 | Collecting and resuspending cells |
| Countess II-FL Cell counter | Thermo Fisher, Waltham, MA | AMQAF1000 | counting cells |
| Glass pipettes (10 mL) | VWR, Radnor, PA | 76184-746 | cell resuspension |
| DMEM F:12 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 11320033 | MCF10A basal media |
| DMEM 1X | VWR, Radnor, PA | 10-014-CV | MDA-MB-231 basal media |
| Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2) | Lonza, Durham, NC | CC-3156 | HUVEC basal media |
| Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2) | Lonza, Durham, NC | CC-3162 | Accompanied with a Bulletkit (containing growth factors) |
| Alexa Fluor™ 488 Phalloidin | Thermo Fisher, Waltham, MA | Labelling MDA-MB-231 spheroids | |
| Fetal Bovine serum | Cytiva, Logan, UT | SH30071.03 | HUVEC/MDA-MB-231 media additive |
| Goat serum | Thermo Fisher, Waltham, MA | 16210064 | Immunofluorescence labelling component |
| Glycine | Sigma, St.Louis, MO | G8898-500G | immunofluorescence buffer component |
| Hoescht 33342 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 62249 | Nuclei stain immunofluorescence |
| Horse Serum | Thermo Fisher, Waltham, MA | 16050130 | MCF10A Media additive |
| Hydrocortisone | Sigma, St.Louis, MO | H0888-5G | MCF10A Media additive |
| Human Umblical Vein Endothelial cells (HUVECs) | Cell applications, San Diego , CA | 200-05f | Endothelial cell lines |
| Integrin α6 | Millipore, Billerica, MA | MAB1378 | Immunofluorescence spheroid labelling component |
| Live Dead assay | Thermo Fisher, Waltham, MA | L3224 | Live and dead cell stain assay for cell viability |
| LSM 700 Confocal microscope | Zeiss, Thornwood, NY | Used to visualize cells | |
| Matrigel - growth factor reduced 10 mg/ml | VWR, Radnor, PA | 354230 | Spheroid formation |
| MCF10A cells | ATCC | CRL-10317 | Breast cell line |
| MDA-MB-231 cells | ATCC | HTB-26 | Breast cell line |
| Paraformaldehyde | Sigma, St.Louis, MO | 158127-500G | cell fixative |
| Penicillin and streptomycin | Thermo Fisher, Waltham, MA | 15140122 | MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Media additive |
| Phosphate Buffered Saline 1X (PBS) | Thermo Fisher, Waltham, MA | 7001106 | Wash buffer for cells before trypsinization |
| Phosphate buffer saline 10X | Thermo Fisher, Waltham, MA | AM9625 | immunofluorescence buffer component |
| Prolong gold antifade | Thermo Fisher, Waltham, MA | P36934 | immunofluorescence mountant medium |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor, EGF | Peprotech, Rocky Hill, NJ | AF-100-15 | MCF10A/ assay media component |
| Sodium Azide | Sigma, St.Louis, MO | S2002-25G | immunofluorescence buffer component |
| Sterile syringe (10 mL) | VWR, Radnor, PA | 75846-757 | bioprinting process |
| Tissue culture dish (10cm) | VWR, Radnor, PA | 25382-166 | monolayer cell culture |
| Triton X-100 | Sigma, St.Louis, MO | T8787-250ML | immunofluorescence buffer component |
| Trypan blue 0.4% | Thermo Fisher, Waltham, MA | 15250061 | cell counter additive |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fisher, Waltham, MA | 25300054 | cell detachment |
| Tween -20 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 85113 | immunofluorescence buffer component |
| Vascular Endothelial Growth factor (VEGF165) | Peprotech, Rocky Hill, NJ | 100-20 | HUVEC tube additive |
| Volocity 6.3 cell imaging software | PerkinElmer, Hopkinton, MA | Z stack compresser |
References
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