Summary
このプロトコルの目的は、多細胞スフェロイドとして乳房上皮細胞を、薬物スクリーニング研究に使用できる3D乳房内皮共培養モデルを迅速に作成するために、多細胞性スフェロイドとして直接バイオプリントすることです。
Abstract
バイオプリンティングは、生体組織アーキテクチャの重要な特徴をより良く再現する3Dヒトがんモデルを製造するための有望なツールとして浮上しています。現在のレイヤーごとの押出バイオプリンティングでは、個々の細胞が複雑な空間的および一時的な手がかりと共にバイオインクで押し出され、階層組織の自己集合を促進します。しかし、このバイオファブリケーション技術は、細胞間の複雑な相互作用、バイオインク、生化学的および生物物理学的手掛かりに依存しています。したがって、自己組立には数日または数週間かかる場合があり、特定のバイオインキを必要とすることがあり、複数の細胞タイプが関与している場合には必ずしも起こらない場合がある。そこで、様々なバイオインクで形成された3D乳房上皮スフェロイドを直接バイオプリントする技術を開発しました。バイオプリントされたプレフォーム3D乳房上皮スフェロイドは、印刷後の生存率と偏光アーキテクチャを維持した。さらに、3Dスフェロイドを血管内皮細胞ネットワークに印刷し、共培養モデルを作成しました。したがって、新しいバイオプリンティング技術は、従来のバイオプリンティング技術よりも低コストで柔軟性を持って、より生理学的に関連する3Dヒト乳房モデルを迅速に作成します。この多目的なバイオプリンティング技術は、追加のバイオインクで他の組織の3Dモデルを作成するために外挿することができます。
Introduction
3D in vitro血管化腫瘍モデルは、がんの成長と転移の機械化研究に不可欠なツールです。特に乳癌の場合、マトリゲルで培養された乳房上皮細胞は、生体内乳腺アシヌスアーキテクチャ1、2、3、4、5、6、7、8に似た偏光スフェロイドに整理する。3D乳房上皮細胞培養も細胞機能に影響を与え、表皮成長因子(EGF)受容体変調8、9の違いを示す3D培養で、オンコジーン機能, ErbB210を含む;成長とアポトーシスシグナル11、12;と化学療法抵抗13,14.血管内皮細胞は、従来の2D培養15、16、17、18との3Dと同様に環境刺激に対して異なる反応を示す。しかし、血管内皮および乳房上皮相互作用の理解の多くは、2D培養に条件付き培地またはトランスウェル挿入物を用い、または2つの細胞タイプが物理的に19、20、21、22、23に分離された3Dモデルから来ている。これらの共培養モデルは、3D培養と細胞-細胞接触の両方が血管内皮に重要であるので、限られた生理学的洞察力を提供する – 乳房上皮細胞相互作用24,25,26.
3Dがんモデルは、ヒドロゲル内または設計された足場5、27、28、29の中で、吊り下げスフェロイド形成、バイオプリンティング、磁気アセンブリ、培養を含む様々な技術を用いて製造されている。最近では、3D腫瘍モデルが、それぞれの3D構造に配置された複数の細胞タイプで作成されました。腫瘍オンチッププラットフォームの一例では、癌、内皮細胞、および間質細胞をマトリックスに混合し、次いでポリジメチルシロキサン(PDMS)装置の中の3つの中央組織室に注入した。組織室は、動脈と静脈を表す2つの外側のチャネルで接していた。培養の5〜7日後、内皮細胞は血管系の近くに小さな腫瘍を形成するために増殖した微小血管網と癌細胞を形成した。このプラットフォームは、その後、スクリーニング薬と薬物の組み合わせ30に使用されました。特定の機械的刺激(例えば、肺の機械的緊張)31,32を有する転移および癌タイプを研究するために、追加の腫瘍オンチッププラットフォームが作成された。しかし、これらのプラットフォームは、一般的にそれぞれの3D構造に血管系と癌の両方を含みはありません。
バイオファブリケーションは、細胞の位置を厳密に空間制御できるため、3D in vitro血管化腫瘍モデルを進める上で大きな約束を示しています。過去10年間のバイオプリンティングの成長にもかかわらず、腫瘍33、34に特に焦点を当てた研究はほとんどありません。ある例では、ゼラチン/アルギン酸/フィブリノーゲンヒドロゲル中のHeLa細胞の3Dプリンティングを使用して、インビトロ子宮頸癌モデルを作成した。腫瘍細胞を個々の細胞としてバイオプリントし、次いでスフェロイドを形成させ、これはより高い増殖速度、マトリックスメタロプロテイナーゼ発現の増加、および2D培養35における細胞よりも高い化学抵抗性を示した。これらの研究では、他の多くの36,37と同様に、解ciaciaされた細胞懸濁液をバイオプリントし、次に細胞培養物に必要な機械的および生化学的手掛かりを与えて細胞が3D構造を形成することを可能にした。しかし、細胞自己集合は数日または数週間かかる場合があり、複雑な空間的および時間的環境的手掛かりを必要とすることがあり、または2つの細胞タイプが共同培養される場合には起こらない場合がある。例えば、2D共培養において内皮細胞における細胞死を誘導した乳房上皮細胞、および解約乳房上皮細胞は、アルギン酸/ゼラチンヒドロゲル38にバイオプリントした際に3Dスフェロイドを形成しなかった。解体乳房上皮または癌細胞は、円形PDMS型に包絡された場合にのみ、アルギン酸塩ベースのバイオインクでスフェロイドを形成した。他の場合には、スフェロイドは、超低添付着円状ウェルプレート中に懸濁液滴を使用して形成し、次いでアルギン酸系バイオインク39,40に混合した。
このプロトコルでは、代替3D組織バイオマニュファクチャリング法について説明します。解約細胞を播種してこれらの細胞が3D構造を形成するのを待つのではなく、血管管ネットワーク上に3D腫瘍回転楕円体を作成してバイオプリントし、ほぼ即座に使用できる腫瘍共培養モデルを作成する方法を説明する。腫瘍スフェロイドは、インビトロで成長させるか、またはヒト組織(オルガノイド)に由来する。同様に、血管管は、微小血管断片の脂肪組織に由来することができるか、または成長させることができる。バイオインクは、生物学的に不活性なアルギン酸から、生物学的に活性の高いマトリゲル41まで及ぶ。この3D腫瘍共培養モデルは、様々な細胞構造およびバイオインクを用いて作成することができるので、複数の細胞型、細胞外マトリックス、およびケモカイン勾配15、42を組み込むことができる。現在の製剤では、内皮ネットワークを浸透させることはできませんが、将来の反復は、この方法をマイクロ流体またはオンチップシステムと統合することができます。内皮ネットワーク上のバイオプリンティング3D乳房上皮スフェロイドは、薬物検査および個別の精密医療27のためのヒト乳房モデルの迅速なバイオファブリケーションを可能にする。
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Protocol
1. 乳房上皮細胞の増殖とアッセイ培地
- MCF10A乳房上皮細胞
注:非腫瘍化不死化乳房上皮細胞株は、線維嚢胞性疾患43を有する患者由来である。細胞はエストロゲン受容体を発現しません。- 20 μg/mL 表皮成長因子(EGF)を調製するために、凍結乾燥したEGFの100 μgを500 μLの無菌dH2Oに溶解し、200 μg/mL EGF を作ります。200 μg/mL EGF の 500 μL を dH2O の無菌 0.1% BSA の 4.5 mL に加えて、20 μg/mL EGF ストック溶液を作ります。ストアは20 μg/mL EGFアリコートを-20 °Cで12ヶ月まで調製しました。
- 500 μg/mL ヒドロコルチゾンを調製するには、1 mgのヒドロコルチゾンを1 mLの絶対エタノール (200 プルーフ) に希釈します。この混合物に滅菌DMEM F:12の1 mLを加え、500 μg/mLヒドロコルチゾンストック溶液を作ります。ヒドロコルチゾンストックアリコートを-80°Cで12ヶ月間保存してください。
- コレラ毒素10μg/mLを調製するために、1mgのコレラ毒素を溶解し、1mg/mLコレラ毒素ストック液を作るために1mLの無菌dH2Oの1mLにコレラ毒素凍結乾燥粉末を溶解する。コレラ毒素ストックアリコートを-80°Cで12ヶ月まで保管してください。
- 成長培地を調製するには、EGF(20μg/mL)500 μL、ヒドロコルチゾン500μL(500 μg/mL)、コレラ毒素5μL(1mg/mL)、500μLのウシインスリン(10mg/mL)、ペニシリンおよびストレプトマイシン10mLを加え、 25 mL の馬血清から DMEM F:12 の 500 mL、500 ng/mL ヒドロコルチゾン、10 ng/mL コレラ毒素、10 ng/mL ウシインスリン、2%v/v ペニシリンおよびストレプトマイシン、および 5% v/v/v/v抗生物質濃度は、バイオプリンティングプロセスにおける減らされた無菌性を考慮して2%に増加した。しかし、抗生物質濃度を1%に下げることが可能です。
- アッセイミディアムを調製するには、ヒドロコルチゾン500μL(500μg/mL)、コレラ毒素5μL(1mg/mL)、ウシインスリン500μL(10mg/mL)、ペニシリンおよびストレプトマイシン10mLを加え、 500 ng/mLヒドロコルチゾン、10 ng/mLコレラ毒素、10 ng/mLウシインスリン、2%v/vペニシリンおよびストレプトマイシン、および5%v/v馬血清の最終濃度のためのDMEM F:12の500 mLに馬血清の25 mL。
- MDA-MB-231
注:乳がん上皮細胞株は、転移性乳腺癌44を有する女性患者の胸膜滲出から、トリプルネガティブ(エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、および上皮成長因子受容体2が欠けている)から作成される。細胞は、攻撃的で侵襲的で、分化が不十分な乳癌を表す。- 成長とアッセイ培地を調製するには、50mLの胎児ウシ血清、10mLのペニシリンおよびストレプトマイシン、および25mLの馬の血清をDMEMの500 mLに加え、最終濃度10%対/vのウシウシ血清、2%のv/vペニシリンおよびストレプトマイシン、および5%v/v/v
2. 乳房上皮細胞培養
- 10 mLのMCF10AまたはMDA-MB-231成長培地を用いた10cm(P100)組織培養皿の500,000個のMCF10AまたはMDA-MB-231細胞をシードします。MCF10A および MDA-MB-231 細胞は、48 時間で > 合流率 90% に達します。
- 乳房上皮細胞を通過するには、まず10mLの温かいPBSで細胞を洗浄する。
- 0.05%トリプシン-EDTAの2 mLを皿に加えることによって乳房上皮細胞を取り外す。37°C、5%CO2インキュベーターに20〜25分間皿を入れます。
- トリプシンを中和するために、5 mLのMCF10AまたはMDA-MB-231成長培地をトリプシン化した細胞に加えます。細胞と培地の混合物を上下にピペットして細胞を再中断し、細胞クラスターを分解する。
- 細胞懸濁液を15 mLの円錐管に加え、遠心分離機を1,200 x g で3分間加えます。上清を慎重に吸引し、MCF10AまたはMDA-MB-231成長培地の5mLで細胞ペレットを再懸濁します。
- MCF10AまたはMDA-MB-231成長培地と共に5つの新しい10 cm組織培養皿の細胞懸濁液のプレート1 mL。37°C、5%CO2インキュベーターに皿を入れる。細胞は2-3日で再び通過する準備が整います。MCF10A細胞は、通過数35まで維持することができ、その後、形態学的変化を示す。MDA-MB-231細胞は、24番の通過まで維持することができ、その後形態学的変化を示す。
3. 乳房上皮球状形成
- 200 μL ピペットチップを30分間凍結してから、アッセイを開始します。成長因子還元マトリックス溶液(例えば、マトリゲル)(10mg/mL)を氷上に保ち、プロセス全体を維持します。
- 8ウェルチャンバースライドの各ウェルに氷冷200 μLピペットチップを使用した、30 μLの氷冷マトリックス溶液をゆっくりとピペットします。側面から開始し、コーナーに沿ってピペットチップをドラッグし、井戸の中心に最終的なドロップを追加して、各ウェルの均一なコーティングを確実にします。このステップでは気泡を避け、均一なマトリックス溶液層を確保します。各井戸のための新しいピペットのヒントを使用してください。
- インキュベートチャンバーは37°C、5%CO2インキュベーターで15〜20分間滑り、マトリックス溶液を重合した。
- MCF10Aアッセイ培地中のトリプシン化MCF10A細胞を200,000細胞/mLで再懸濁するか、MDA-MB-231増殖培地中のトリプシン化MDA-MB-231細胞を200,000細胞/mLで再懸濁させた。
- MCF10A細胞を使用する場合は、EGF(20 μg/mL)5 μL(20 μg/mL)および100 μLのマトリックス溶液をアッセイ培地5 mLに添加して、2%マトリックス溶液の最終濃度を求めて、新鮮なMCF10Aスフェロイド成長培地を調製します。
- インキュベーターからマトリックス溶液をあらかじめコーティングしたチャンバースライドを取り外します。MCF10AまたはMDA-MB-231細胞懸濁液(10,000細胞)を各ウェルに50μL加えます。MCF10A細胞を使用する場合は、450 μLのMCF10Aスフェロイド成長培地を添加します。MDA-MB-231セルを使用する場合は、MDA-MB-231成長培地450 μLを2%マトリックス溶液(9 μL)と混合して追加します。チャンバースライドを37°C、5%CO2インキュベーターに直接配置します。
- 4日ごとに培地を交換してください。200 μL ピペットチップを使用して、各ウェルの片隅から慎重に200 μLの古いメディアを取り出します。このプロセスの間に、回転楕円体が邪魔されないようにチャンバースライドを45°に傾けます。200 μL の新しく調製した MCF10A スフェロイド成長培地または MDA-MB-231 成長培地を、2% マトリックス溶液と混合して、2% マトリックス溶液をドロップでコーナーの各ウェルに加えて、スフェロイドがマトリクス層に取り付けられたままであることを確認します。スフェロイドによって産生されるすべてのサイトカインが完全に枯渇しないように、培地の50%だけが置き換えられる。
注:MCF10A乳房上皮スフェロイドは、偏光し、中空の中心を形成するために最大8日かかります。MDA-MB-231乳房上皮スフェロイドは形成するのに5日までかかっており、中空の中心がない。
4. 内皮細胞ネットワーク形成
- ヒトアンビリカル静脈内皮細胞(HUVEC)培養
- インスリン増殖因子、線維芽細胞増殖因子、血管内皮成長因子を含む単一の内皮成長培地-2キットの内容物を追加し、 アスコルビン酸、表皮成長因子、ヘパリンおよびゲンタマイシン-アンホテリシンB、ウシ胎児血清50mL、ペニシリンストレプトマイシン5mL、200mMグルタミンの5mLから内皮基底培地-2(EBM-2)を完全に作成する。
- EGM-2の10 mLで10cmの組織培養皿に500,000個の内皮細胞をシード。細胞を37°C、5%CO2インキュベーターに入れ、合流率が80%(約48時間)に達するまで入れます。
- 細胞を通過させるために、10 mLの温かいPBSで内皮細胞を洗浄する。10 cmの組織培養皿に0.05%トリプシン-EDTAの2 mLを加えることによってHUVECを取り外します。位相差顕微鏡で細胞を注意深く監視します。細胞はボールアップされたときに準備ができていますが、皿に取り付けられたままです。
- 慎重に皿からトリプシンを吸引します。EGM-2の8mLを皿に加えます。EGM-2を皿表面全体に上下にピペットで洗い流します。
- あるいは、トリプシンを中和するために、5 mLのEGM-2をトリプシン化した細胞に加える。細胞と培地の混合物を上下にピペットして細胞を再中断し、細胞クラスターを分解する。細胞懸濁液を15 mLの円錐管に加え、遠心分離機を1,200 x g で3分間加えます。上清を慎重に吸引し、EGM-2の10mLで細胞ペレットを再懸濁する。
- 10cmの組織培養皿にEGM-2の9 mLに1mLの細胞懸濁液を加える。37°C、5%CO2インキュベーターに皿を入れる。2日ごとに新鮮なEGM-2と媒体の2/3を交換します。細胞は3-5日で通過する準備が整います。HUVECは、その後、彼らはネットワークを形成するために失敗した通路8まで維持することができます。
- 内皮細胞(HUVEC)ネットワーク形成
- 200 μL ピペットチップを30分間凍結してから、アッセイを開始します。成長因子の還元マトリックス溶液(10 mg/mL)を氷上でプロセス全体に保ちます。
- 8ウェルチャンバースライドの各ウェルに氷冷200 μLピペットチップを使用した、30 μLの氷冷マトリックス溶液をゆっくりとピペットします。側面から開始し、コーナーに沿ってピペットチップをドラッグし、井戸の中心に最終的なドロップを追加して、各ウェルの均一なコーティングを確実にします。このステップでは気泡を避け、均一なマトリックス溶液層を確保します。各井戸のための新しいピペットのヒントを使用してください。
- インキュベートチャンバーは、マトリゲルを重合するために37°C、5%CO2インキュベーターで15〜20分間スライドする。
- 37°C、5%CO2インキュベーターで30分間、10 μLの赤い細胞トラッカー(1:1000)とHUVECの10 cm皿を予め染色します。
- 10 mLの温かいPBSで内皮細胞を洗浄します。10 cmの組織培養皿に0.05%トリプシン-EDTAの2 mLを加えることによってHUVECを取り外します。37°C、5%CO2インキュベーターに5分間皿を入れ、細胞を完全に取り外します。
- 5 mLのEGM-2を皿に加えて、トリプシンを中和します。細胞懸濁液を25 mL円錐形チューブに移します。遠心分離機HUVEC 1,200 x g で5分間。上清を吸引し、細胞ペレットを5mLの無血清EBM-2で再懸濁した。
- Trypan ブルーを使用してセルをカウントし、生存可能なセルを決定します。1 x 106 セル/mL ソリューションを作成します。
- 200 μLの血清フリーEBM-2で各井戸に100,000 HUVECを加えます。セルを追加すると、チューブ ネットワークではなくサーフェスの単層が作成されます。
- HUVECを37°C、5%CO2インキュベーターでインキュベートします。6時間後、位相コントラスト顕微鏡による画像HUVECネットワーク。ネットワークは現在、乳房スフェロイドとの共培養の準備ができています。
5. 事前形成されたHUVECネットワーク上のバイオプリンティング乳房上皮上皮回転楕円体
注: 二重ノズルバイオ堆積システムは、バイオファブリケーションプロセスに使用する必要があります。この場合、システムには3つのモーションアームがあり、材料堆積のミクロンスケールの空間制御と、10 mLシリンジからバイオインクを堆積させる2つのスクリュー駆動モーターが可能でした。システムは、バイオプリンティング中に無菌環境を維持するために、高効率の微粒子空気ろ過システムとUV滅菌能力で機能する必要があります。バイオプリンターは、印刷プロセスの前に1時間UV殺菌されます。
- 前に説明したように乳房上皮スフェロイドおよびHUVECネットワークを作成します。代表的な位相コントラスト顕微鏡画像でスフェロイドを数えることによって、各ウェルの乳房上皮スフェロイドの数を推定する。
- 1000 μL ピペットチップの端から 0.5 cm 切ります。カットピペットチップを使用して、8ウェルチャンバースライドから50 mLチューブにすべてのスフェロイドを慎重にピペットします。選択したバイオインクのスフェロイドを100回転楕円体/100 μLで再懸濁します。
注: スフェロイド濃度が高いと、スフェロイドクラスタリングが発生し、スフェロイドと内皮ネットワーク間の相互作用の視覚化が妨げられます。 - 70 μmのセルストレーナーを通してスフェロイド混合物を渡して、大きいまたはクラスター化されたスフェロイドを取り除きます。
- プールされたスフェロイドを10 mLの滅菌シリンジに積み込み、25ゲージの滅菌針でキャップします。シリンジをバイオ堆積システムに取り付けます。
- 8ウェルチャンバースライドでHUVECネットワークから培地を吸引します。
- 1mL/minの流量でHUVECネットワークの6つの井戸に100 μLの乳房上皮スフェロイドを押し出す。HUVECネットワークの2つの井戸をコントロールとして維持します。
- HUVECネットワーク上で印刷されたMCF10Aスフェロイドを使用する場合はMCF10Aスフェロイド成長培地400μLを追加するか、以前に2%マトリックス溶液と混合した400 μL MDA-MB-231成長培地を追加して、HUVECネットワークに印刷されたMDA-MB-231スフェロイドを使用する場合。それぞれのスフェロイド成長培地は、HUVEC制御ウェルで使用されるべきである。
- 37°C、5%CO2インキュベーターでの共培養を、メディア交換なしで24~96時間培養します。共同培養は、最大4日間、元の媒体で実行可能なままになります。
6. 共焦点顕微鏡
- 免疫蛍光およびPBSグリシン洗浄緩衝製剤
- 免疫蛍光(IF)バッファー10xストック溶液を2.5gのアジドナトリウム、5gのウシ血清アルブミン、トリトンX-100の10mL、および2.05 mLのTween-20を10x PBSLの500 mLで加えて調製した。pH を 7.4 に調整します。沈積を避けるために4°Cで最大1年間在庫液を保管してください。
- 滅菌脱イオン水の450 mLに10x IFバッファーの50 mLを希釈することによって働くIFバッファーを作成します。作業溶液を室温で1週間まで保管してください。
- 10x PBSの500 mLにグリシン37.5 gを加えて、10x PBS-グリシンバッファー液を調製します。pH を 7.4 に調整します。沈み込みを避けるために、4°Cで最大6ヶ月間ストックソリューションを保管してください。
- 滅菌脱イオン水の450 mLに10xPBS-グリシンバッファーの50 mLを希釈することによって働くPBS-グリシン溶液を作成します。作業ソリューションを4°Cで1週間保存します。
- 共焦点顕微鏡によるバイオプリントサンプルと画像のラベル
- バイオプリント3D共培養から吸気培地を吸い上げ、温かいPBSで3回リンスする。バイオプリントされた3D共同培養物を、4%パラホルムアルデヒドを室温で1時間固定します。1x PBS-グリシンで20分間、サンプルを3回リンスします。
- IFバッファーと10%のヤギ血清を90分間混合したブロックサンプル(一次ブロック)、IFバッファーに10%ヤギ血清とアフィニピューレFabフラグメント(1:100、セカンダリブロック)を加えた40分が続きます。
- MCF10Aスフェロイドを使用する場合、インテグリンα6(1:100)の一次抗体を4°Cで一晩の二次遮断緩衝液に標識し、続いてアレクサフルオール488二次抗体(1:200)とHoescht 33342(1:1000)を室温で1時間点灯します。MCF10A細胞株は、スフェロイド分極と形態を示すのに不可欠な高レベルのインテグリンα6を発現する。
- 低レベルのインテグリンα6を発現するMDA-MB-231スフェロイドを使用する場合、アレクサフルオール488ファロイジン(1:100)とHoescht 33342(1:1000)を2次ブロッキングバッファに、光から保護された室温で4時間ラベル付けします。ファロイジンはアクチンフィラメントの可視化を可能にし、スフェロイド非晶質および侵襲的形態を評価することができる。
- 1X PBS-グリシンを3回20分間洗浄します。
- メーカーのツールを使用してチャンバースライドを取り外して、取り付け用のサンプルを準備します。各ウェルにアンチフェード溶液の小さなドロップを追加します。各チャンバースライドに22mm x 60mmのカバースリップを置き、エッジを透明なマニキュアで慎重に密封します。
- ZのZスタックとして共焦点顕微鏡を使用した画像サンプルは、5μmのステップで〜10個のスライスを積み重ねる。必要に応じて、セル イメージング ソフトウェアの拡張フォーカス コマンドを使用して Z 平面を 1 つの平面に圧縮します。
- 画像Jを用いて内皮ネットワークへのスフェロイド接着を定量する。付着したスフェロイドの数は、適切な粒子サイズと円形性を持つ分析プラグインを使用して定量化することができます。イメージ領域にアタッチされた回転楕円体の数を正規化します。
- 再現性を確保するために、同一培養物の4 x 4枚のタイル画像で接着されたスフェロイドの数を定量化します。スフェロイド数が他の実験よりも統計的に有意に低い場合は、実験を繰り返す必要があります。
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Representative Results
乳房上皮細胞は、マトリックス溶液上および2%マトリックス溶液を有する培養培地で5〜8日後に3Dスフェロイドに自己組織化すべきである。非腫瘍性MCF10A乳房上皮スフェロイドは円形に見え、中空中心を有し、インテグリンα6はスフェロイドの外縁に偏光している(図1、差し込みは中空の中心を示す)。高侵襲性MDA-MB-231乳癌上皮細胞は不規則なスフェロイドを形成する。回転楕円体は直径が100~300μm程度の場合に使用してください。回転楕円体が大きくなりすぎて近くに入ると、スフェロイドが結合してメガスフェロイドを形成します。さらに、MDA-MB-231乳房上皮スフェロイドは、マトリゲル培養で長期間維持された場合、スフェロイドから移行する細胞を示し得る。
HUVECは、6〜8時間のまばらで無血清培養の後、チューブのようなネットワークに自己組織化する必要があります。サンプルは、1〜3細胞のラインを並行して形成する接続を持つ多細胞ノードを有する。HUVEC ネットワークは、位相コントラスト顕微鏡で画像化することも、セルトラッカーと Hoescht でラベル付けされている場合は共焦点顕微鏡で画像化することもできます (図 2)。ImageJ血管新生分析装置は、ネットワークジャンクション、セグメント、および分岐を定量化するために使用できます。HUVECネットワークは、16時間以上無血清培地に放置すると死んでしまいます。
乳房上皮スフェロイドがHUVECネットワークにバイオプリントされる場合、スフェロイドとネットワークの両方が少なくとも24時間元の形態を維持する必要があります。MCF10A乳房上皮上面スフェロイドは、内皮ネットワークに直接付着する丸い物体として現れ、MDA-MB-231乳房上皮球体は、まだ付着しているか、内皮ネットワークに近接して、より非晶質に見える(図3)。HUVECネットワークは、乳房上皮スフェロイドと共培養する際に維持される。24時間を超える共培養の場合、乳房上皮細胞は、スフェロイドから、そして内皮ネットワークに沿って移行する可能性があります。我々の経験では、これは非腫瘍性乳房上皮細胞38ではなく腫瘍性で早期に起こる。我々は、以前に、スフェロイドバイオプリンティングの早い時期に、例えば内皮ネットワーク45上にスフェロイド付着をテストするために、薬物検査を早くも2時間開始できることをバイオプリント共同培養を用いて実証した。我々はまた、3D乳房スフェロイドは、個々の細胞として、または共培養41、45で印刷される場合よりも、パクリタキセルのような抗癌薬に対してより耐性があることを示した。バイオプリントスフェロイドがない場合、HUVECネットワーク制御井戸は、ネットワーク形態を保持できず、16時間後に死ぬ。
図1:乳房上皮スフェロイドの代表的な共焦点顕微鏡画像。MCF10Aスフェロイドは、インテグリンα6(緑色)および核(青)について標識した。細胞表現型は、スプフェロイドが中空中心(差し込み)で丸く現れ、外縁でインテグリンα6が偏光している場合、バイオプリンティング後に確認することができます。MDA-MB-231スフェロイドはアクチン(緑色)および核(青)について標識した。細胞表現型は、スフェロイドが中空中心なしで不規則に形状され、周囲のマトリックスに侵入する細胞プロセスを有する場合に確認することができる。スケールバー= 50 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:相コントラストと共焦点顕微鏡によるHUVECネットワークの代表的な画像。HUVECネットワークは、ノードを接続する細胞のラインを持つ小さな多細胞ノードとして表示されます。共焦点顕微鏡では、細胞は細胞トラッカーレッドと核用Hoescht(青)で標識した。スケールバー= 100 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:HUVECネットワークと共培養した乳房上皮スフェロイドの代表的な画像。MCF10Aスフェロイドは、インテグリンα6(緑色)および核(青)に対して標識され、丸いままで、内皮ネットワークに直接付着して現れる。MDA-MB-231スフェロイドは、アクチン(緑色)および核(青色)に対して標識され、非晶質でありながら、内皮ネットワークの近くまたは上に残っている。共培養は、バイオプリンティング後少なくとも24時間この形態を維持し、その後乳房細胞が内皮管に沿って移動する可能性がある。スケールバー= 50 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、3Dアーキテクチャにおいても内皮細胞との共培養のための3Dアーキテクチャにおけるバイオプリントスフェロイドの初のプロトコルです。重要なプロトコルステップには、乳房上皮スフェロイドおよびHUVECネットワークの初期形成が含まれる。乳房上皮スフェロイドはマトリックス溶液から容易に破壊されるため、授乳中には細心の注意が必要です。同様に、乳房上皮スフェロイドは、マトリックス溶液からピレットされ、ネットワークに混合されたときに注意して治療する必要があります。HUVECネットワークは、それぞれ単層または死を形成するため、密度が高すぎる状態でメッキを行ったり、16時間以上放置したりしてはならない。最後に、すべてのバイオプリンティングは、細胞の生存率を最大化するために37°Cの無菌環境で発生する必要があります。
乳房上皮スフェロイドは、アルギン酸およびアルギン酸コラーゲンブレンドを含むマトリゲル以外の様々なバイオインクでバイオプリントすることができる。我々は、スフェロイドが実行可能であり、アルギン酸塩ベースのバイオインク41に印刷された際にその形態を維持することを実証した。したがって、マトリックス溶液ベースのバイオインクでバイオプリンティングをここに提示する一方で、他の安価で使いやすいバイオインクも可能です。我々はさらに、MCF-7および遺伝子組み換えMCF10A-NeuN細胞を含む他の乳癌細胞株を同様の成功を有する38、41、45を使用した。代替手段はまた、乳房上皮回転楕円体を作成するために使用することができる。例えば、Leeらは、PDMSスタンプを用いて生成されたヒドロゲルマイクロウェルアレイを使用して、制御サイズ46の均一なサイズのスフェロイドを作成した。最後に、腫瘍由来の内皮細胞などの代替内皮細胞を用いることができ、また、HUVECネットワークを形成するのではなく、脂肪組織由来のマイクロ血管を3D血管構造47として直接バイオプリントすることができる。
この方法の主な制限は、バイオプリントされたスフェロイドの位置と数を制御する上での課題でした。回転楕円体は、回転楕円体の損傷を防ぐために、比較的大きなノズルとインビシッド流体で印刷する必要がありました。急速にゲル化するバイオインクは、より良いスフェロイドの位置を制御する可能性があります。スフェロイドは、細胞カウンターには大きすぎるため、バイオインクでもカウントできませんでした。代わりに、マトリゲル表面からスフェロイドをピペット化する前に撮影された位相コントラスト画像から得られたスフェロイド数に依存していました。スフェロイドを形成する代替手段は、その数とサイズをより良く制御することができます。毎回同様に細胞ストレーナーを用い、スフェロイドを培養することで、スフェロイド数とサイズを適度な精度で制御することができました。最終的な制限は、乳房上皮細胞が時間の経過とともにスフェロイドから、そして内皮ネットワークに沿って移動することです。代替バイオインが、この制限を取り込む可能性があります。
乳房上皮スフェロイドを事前に形成されたHUVECネットワーク上で直接バイオプリンティングすることにより、3Dインビトロ腫瘍共培養モデルを短時間で作成することができます。その後、研究者は、より高いスループットでスフェロイドと血管系の相互作用を迅速に調べることができます。将来的には、乳房上皮スフェロイドは、流れの効果の研究を可能にする浸透血管系にバイオプリントすることができます。さらに、腫瘍由来のオルガノイドおよび内皮細胞は、患者固有のモデルにおける薬物有効性の試験を通じて精密医療を可能にするためにバイオプリントすることができる。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、NIH 1R01HL140239-01によってAMCに資金提供されました。ドレクセル大学の細胞イメージングセンターに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 37°C incubator, 5% CO2 and 95% humidity | Sanyo | MCO-20AIC | Cell incubation |
| 3D Bio printer | custom-made | None | Used for bioprinting |
| 8-well chamber slides | VWR, Radnor, PA | 53106-306 | for seeding spheroids |
| 25-gauge needle | Sigma, St. Louis, MO | Z192406-100EA | bioprinting syringe needle |
| Absolute ethanol (200 proof ) | Sigma, St.Louis, MO | E7023-500ML | reconsitution of media components |
| Affinipure F(ab′)2 fragment goat anti-mouse IgG | Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA | 115006020 | secondary block - Immunofluorescence |
| Alexa Fluor 488 (1:200) | Thermo Fisher, Waltham, MA | A-11006 | Seconday antibody-Immunofluorescence |
| Bovine insulin | Sigma, St.Louis, MO | I-035-0.5ML | MCF10A Media additive |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma, St.Louis, MO | A2153-500G | Blocking agent -Immunofluorescence |
| Falcon 70 µm Cell Strainer | Corning, Corning, NY | 352350 | Remove large or clustered spheroids |
| CellTracker™ Red CMTPX Dye | Thermo Fisher, Waltham, MA | C34552 | pre-stain for HUVEC tubes |
| Compact Centrifuge | Hermle- Labnet, Edison ,NJ | Z206A | For cell centrifugations |
| Cholera Toxin | Sigma, St.Louis, MO | C8052-.5MG | MCF10A Media additive |
| Conical tubes 15 mL | VWR, Radnor, PA | 62406-200 | Collecting and resuspending cells |
| Countess II-FL Cell counter | Thermo Fisher, Waltham, MA | AMQAF1000 | counting cells |
| Glass pipettes (10 mL) | VWR, Radnor, PA | 76184-746 | cell resuspension |
| DMEM F:12 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 11320033 | MCF10A basal media |
| DMEM 1X | VWR, Radnor, PA | 10-014-CV | MDA-MB-231 basal media |
| Endothelial Basal Medium-2 (EBM-2) | Lonza, Durham, NC | CC-3156 | HUVEC basal media |
| Endothelial Growth Medium-2 (EGM-2) | Lonza, Durham, NC | CC-3162 | Accompanied with a Bulletkit (containing growth factors) |
| Alexa Fluor™ 488 Phalloidin | Thermo Fisher, Waltham, MA | Labelling MDA-MB-231 spheroids | |
| Fetal Bovine serum | Cytiva, Logan, UT | SH30071.03 | HUVEC/MDA-MB-231 media additive |
| Goat serum | Thermo Fisher, Waltham, MA | 16210064 | Immunofluorescence labelling component |
| Glycine | Sigma, St.Louis, MO | G8898-500G | immunofluorescence buffer component |
| Hoescht 33342 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 62249 | Nuclei stain immunofluorescence |
| Horse Serum | Thermo Fisher, Waltham, MA | 16050130 | MCF10A Media additive |
| Hydrocortisone | Sigma, St.Louis, MO | H0888-5G | MCF10A Media additive |
| Human Umblical Vein Endothelial cells (HUVECs) | Cell applications, San Diego , CA | 200-05f | Endothelial cell lines |
| Integrin α6 | Millipore, Billerica, MA | MAB1378 | Immunofluorescence spheroid labelling component |
| Live Dead assay | Thermo Fisher, Waltham, MA | L3224 | Live and dead cell stain assay for cell viability |
| LSM 700 Confocal microscope | Zeiss, Thornwood, NY | Used to visualize cells | |
| Matrigel - growth factor reduced 10 mg/ml | VWR, Radnor, PA | 354230 | Spheroid formation |
| MCF10A cells | ATCC | CRL-10317 | Breast cell line |
| MDA-MB-231 cells | ATCC | HTB-26 | Breast cell line |
| Paraformaldehyde | Sigma, St.Louis, MO | 158127-500G | cell fixative |
| Penicillin and streptomycin | Thermo Fisher, Waltham, MA | 15140122 | MCF10A / MDA-MB-231/HUVEC Media additive |
| Phosphate Buffered Saline 1X (PBS) | Thermo Fisher, Waltham, MA | 7001106 | Wash buffer for cells before trypsinization |
| Phosphate buffer saline 10X | Thermo Fisher, Waltham, MA | AM9625 | immunofluorescence buffer component |
| Prolong gold antifade | Thermo Fisher, Waltham, MA | P36934 | immunofluorescence mountant medium |
| Recombinant Human Epidermal Growth Factor, EGF | Peprotech, Rocky Hill, NJ | AF-100-15 | MCF10A/ assay media component |
| Sodium Azide | Sigma, St.Louis, MO | S2002-25G | immunofluorescence buffer component |
| Sterile syringe (10 mL) | VWR, Radnor, PA | 75846-757 | bioprinting process |
| Tissue culture dish (10cm) | VWR, Radnor, PA | 25382-166 | monolayer cell culture |
| Triton X-100 | Sigma, St.Louis, MO | T8787-250ML | immunofluorescence buffer component |
| Trypan blue 0.4% | Thermo Fisher, Waltham, MA | 15250061 | cell counter additive |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fisher, Waltham, MA | 25300054 | cell detachment |
| Tween -20 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 85113 | immunofluorescence buffer component |
| Vascular Endothelial Growth factor (VEGF165) | Peprotech, Rocky Hill, NJ | 100-20 | HUVEC tube additive |
| Volocity 6.3 cell imaging software | PerkinElmer, Hopkinton, MA | Z stack compresser |
References
- Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. Journal of Cell Biology. 137 (1), 231-245 (1997).
- Sokol, E. S., et al. Growth of human breast tissues from patient cells in 3D hydrogel scaffolds. Breast Cancer Research. 18 (1), 19 (2016).
- Howlett, A. R., Bailey, N., Damsky, C., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Cellular growth and survival are mediated by beta 1 integrins in normal human breast epithelium but not in breast carcinoma. Journal of Cell Science. 108, Pt 5 1945-1957 (1995).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89 (19), 9064-9068 (1992).
- Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. Journal of Cell Biology. 137 (1), 231-245 (1997).
- Wang, F., et al. Reciprocal interactions between beta1-integrin and epidermal growth factor receptor in three-dimensional basement membrane breast cultures: a different perspective in epithelial biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (25), 14821-14826 (1998).
- Muthuswamy, S. K., Li, D., Lelievre, S., Bissell, M. J., Brugge, J. S. ErbB2, but not ErbB1, reinitiates proliferation and induces luminal repopulation in epithelial acini. Nature Cell Biology. 3 (9), 785-792 (2001).
- Kirshner, J., Chen, C. J., Liu, P., Huang, J., Shively, J. E. CEACAM1-4S, a cell-cell adhesion molecule, mediates apoptosis and reverts mammary carcinoma cells to a normal morphogenic phenotype in a 3D culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (2), 521-526 (2003).
- Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111 (1), 29-40 (2002).
- Weaver, V. M., et al. beta4 integrin-dependent formation of polarized three-dimensional architecture confers resistance to apoptosis in normal and malignant mammary epithelium. Cancer Cell. 2 (3), 205-216 (2002).
- Yamada, K. M., Clark, K. Cell biology: survival in three dimensions. Nature. 419 (6909), 790-791 (2002).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. Journal of Cell Science. 116, Pt 12 2377-2388 (2003).
- Weigelt, B., Ghajar, C. M., Bissell, M. J. The need for complex 3D culture models to unravel novel pathways and identify accurate biomarkers in breast cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 69-70, 42-51 (2014).
- Koh, W., Stratman, A. N., Sacharidou, A., Davis, G. E. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods in Enzymology. 443, 83-101 (2008).
- Sacharidou, A., et al. Endothelial lumen signaling complexes control 3D matrix-specific tubulogenesis through interdependent Cdc42- and MT1-MMP-mediated events. Blood. 115 (25), 5259-5269 (2010).
- Buchanan, C. F., et al. Cross-talk between endothelial and breast cancer cells regulates reciprocal expression of angiogenic factors in vitro. Journal of Cellular Biochemistry. 113 (4), 1142-1151 (2012).
- Szot, C. S., Buchanan, C. F., Freeman, J. W., Rylander, M. N. In vitro angiogenesis induced by tumor-endothelial cell co-culture in bilayered, collagen I hydrogel bioengineered tumors. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (11), 864-874 (2013).
- Franses, J. W., Baker, A. B., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. Stromal endothelial cells directly influence cancer progression. Science Translational Medicine. 3 (66), 66 (2011).
- Franses, J. W., Drosu, N. C., Gibson, W. J., Chitalia, V. C., Edelman, E. R. Dysfunctional endothelial cells directly stimulate cancer inflammation and metastasis. International Journal of Cancer. 133 (6), 1334-1344 (2013).
- Phamduy, T. B., et al. Printing cancer cells into intact microvascular networks: a model for investigating cancer cell dynamics during angiogenesis. Integrative Biology. 7 (9), Cambridge. 1068-1078 (2015).
- Connor, Y., et al. Physical nanoscale conduit-mediated communication between tumour cells and the endothelium modulates endothelial phenotype. Nature Communications. 6, 8671 (2015).
- Ghajar, C. M., et al. The perivascular niche regulates breast tumour dormancy. Nature Cell Biology. 15 (7), 807-817 (2013).
- Strilic, B., et al. Tumour-cell-induced endothelial cell necroptosis via death receptor 6 promotes metastasis. Nature. 536 (7615), 215-218 (2016).
- Asghar, W., et al. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Materials Today. 18 (10), Kidlington. 539-553 (2015).
- Belgodere, J. A., et al. Engineering Breast Cancer Microenvironments and 3D Bioprinting. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 6, 66 (2018).
- Jang, J., Yi, H. G., Cho, D. W. 3D Printed Tissue Models: Present and Future. ACS Biomaterials Science & Engineering. 2 (10), 1722-1731 (2016).
- Sobrino, A., et al. 3D microtumors in vitro supported by perfused vascular networks. Scientific Reports. 6, 31589 (2016).
- Chen, M. B., Whisler, J. A., Jeon, J. S., Kamm, R. D. Mechanisms of tumor cell extravasation in an in vitro microvascular network platform. Integrative Biology. 5 (10), Cambridge. 1262-1271 (2013).
- Hassell, B. A., et al. Human Organ Chip Models Recapitulate Orthotopic Lung Cancer Growth, Therapeutic Responses, and Tumor Dormancy In vitro. Cell Reports. 21 (2), 508-516 (2017).
- Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S.
- Asghar, W., et al. Engineering cancer microenvironments for in vitro 3-D tumor models. Materials Today. 18 (10), 539-553 (2015).
- Zhao, Y., et al. Three-dimensional printing of Hela cells for cervical tumor model in vitro. Biofabrication. 6 (3), 035001 (2014).
- Zhang, Y. S., et al.
- Ouyang, L., et al. Three-dimensional bioprinting of embryonic stem cells directs highly uniform embryoid body formation. Biofabrication. 7 (4), 044101 (2015).
- Swaminathan, S., Ngo, O., Basehore, S., Clyne, A. M. Vascular Endothelial-Breast Epithelial Cell Coculture Model Created from 3D Cell Structures. ACS Biomaterials Science & Engineering. 3 (11), 2999-3006 (2017).
- Vorwald, C. E., Ho, S. S., Whitehead, J., Leach, J. K. High-Throughput Formation of Mesenchymal Stem Cell Spheroids and Entrapment in Alginate Hydrogels. Methods in Molecular Biology. 1758, 139-149 (2018).
- Chaji, S., Al-Saleh, J., Gomillion, C. T. Bioprinted Three-Dimensional Cell-Laden Hydrogels to Evaluate Adipocyte-Breast Cancer Cell Interactions. Gels. 6 (1), (2020).
- Swaminathan, S., Hamid, Q., Sun, W., Clyne, A. M. Bioprinting of 3D breast epithelial spheroids for human cancer models. Biofabrication. 11 (2), 025003 (2019).
- Radisky, D., Muschler, J., Bissell, M. J. Order and disorder: the role of extracellular matrix in epithelial cancer. Cancer Investigation. 20 (1), 139-153 (2002).
- Qu, Y., et al. Evaluation of MCF10A as a Reliable Model for Normal Human Mammary Epithelial Cells. PLoS One. 10 (7), 0131285 (2015).
- Chavez, K. J., Garimella, S. V., Lipkowitz, S. Triple negative breast cancer cell lines: one tool in the search for better treatment of triple negative breast cancer. Breast Disease. 32 (1-2), 35-48 (2010).
- Swaminathan, S., Cranston, A. N., Clyne, A. M. A Three-Dimensional In vitro Coculture Model to Quantify Breast Epithelial Cell Adhesion to Endothelial Cells. Tissue Engineering Part C: Methods. 25 (10), 609-618 (2019).
- Lee, J. M., et al. Generation of uniform-sized multicellular tumor spheroids using hydrogel microwells for advanced drug screening. Scientific Reports. 8 (1), 17145 (2018).
- Frueh, F. S., Spater, T., Scheuer, C., Menger, M. D., Laschke, M. W. Isolation of Murine Adipose Tissue-derived Microvascular Fragments as Vascularization Units for Tissue Engineering. Journal of Visualized Experiments. (122), e55721 (2017).
