Summary
本报告描述了一个同时将原生棕色和白色预生细胞与新生小鼠隔离的协议。孤立的细胞可以在培养中生长，并诱导分化成完全成熟的白色和棕色脂肪细胞。该方法使培养中原脂肪细胞的遗传、分子和功能特征化。
Abstract
对脂肪细胞分化和功能背后的机制的理解大大受益于不朽的白色前体细胞系的使用。然而，这些培养的细胞系有局限性。它们不能完全捕获异质脂肪细胞种群的不同功能谱，这些细胞群现在已知存在于白色脂肪库中。为了提供一个更生理相关的模型来研究白脂肪组织的复杂性，已经开发和优化了一个协议，使原发性白细胞和棕色脂肪细胞祖先与新生小鼠同时隔离，它们在培养上迅速扩张，并在体外分化成成熟、功能齐全的脂肪细胞。将原细胞与新生儿而不是成年小鼠隔离开来的主要优点是脂肪库正在积极发育，因此是繁殖前细胞的丰富来源。使用此协议分离的主要预生细胞在达到汇合时迅速分化，并在 4-5 天内完全成熟，这是一个时间窗口，可准确反映新生小鼠发育的脂肪垫的外观。使用这种策略准备的主要培养物可以扩展和研究具有很高的可重复性，使其适合遗传和表型屏幕，并能够研究基因小鼠模型的细胞自主脂肪表型。此协议提供了一种简单、快速和廉价的方法，以研究体外脂肪组织的复杂性。
Introduction
肥胖症源于能量摄入和能量消耗之间的长期不平衡。随着肥胖的发展，白色脂肪细胞在细胞大小上经历了巨大的扩张，导致微环境缺氧，细胞死亡，炎症和胰岛素抵抗1。功能失调，肥大的脂肪细胞不能正确地储存多余的脂质，而积聚在其他组织中，它们抑制胰岛素作用2，3。改善脂肪细胞功能和恢复组织间正常脂质分区的制剂，预计对治疗以胰岛素抵抗（如2型糖尿病）为特征的肥胖相关疾病是有益的。使用不朽细胞系（如 3T3-L1、F442A 和 10T 1/2）在脂肪细胞中的表型屏幕已被证明有助于识别调节脂肪生成的遗传因素，并分离具有抗糖尿病特性的亲脂肪分子 4、5、6、7。然而，这些细胞系并不能完全反映脂肪库中细胞类型的异质性，包括具有独特特征的白色、棕色、米色和其他脂肪细胞亚型，所有这些都有助于系统性平衡8、9、10。此外，培养的细胞系通常显示对外部刺激的反应减弱。
相比之下，初级脂肪细胞培养更准确地概括了体内脂肪生成的复杂性，而原发性脂肪细胞则显示出强大的功能反应。主要的预生物细胞通常从成年小鼠11、12、13、14的脂肪库的频闪血管部分分离出来。然而，由于成年动物的脂肪库主要由完全成熟的脂肪细胞组成，其周转率非常缓慢，15、16、17，这种方法产生的预生细胞数量有限，增殖率低。因此，从新生小鼠身上分离出预生细胞比获得大量可在体外分化的快速生长细胞更可取。在这里，一个协议已经描述，灵感来自与卡恩等人的初级棕色脂肪细胞的初始工作，有效地隔离白色和棕色的预生细胞，可以在体外扩展和区分成功能齐全的初级脂肪细胞（图1A）。与成年小鼠相比，将原细胞与新生儿隔离开来的优点是脂肪库正在迅速生长，因此是积极增殖17预生细胞的丰富来源。使用此协议分离的细胞具有很高的扩散能力，能够快速扩展培养物。此外，新生幼崽的预生细胞比成年祖先具有更高的分化潜力，这降低了分化程度的变异性，从而增加了可重复性。
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Protocol
该协议遵循了斯克里普斯研究所和威斯康星大学麦迪逊医学院和公共卫生学院的所有 IACUC 指南。
1. 脂肪库的收集和消化（第1天）
- 为每只小狗准备两个 1.5 mL 管：一个用于棕色脂肪组织 （BAT），一个用于白色脂肪组织 （WAT）。添加 250 μL 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） + 200 μL 的 2 倍隔离缓冲（123 mM NaCl， 5 mM KCl， 1.3 mM CaCl2， 5 mM 葡萄糖， 100 mM 4-（2-羟基苯甲基） - 1-管道拉齐尼甲烷硫酸 （HEPES）， 青霉素链霉素， 和 4% 脂肪无酸牛血清白蛋白） 到每个管.保持溶液无菌和冰上。
- 将幼崽放入小房间（例如，6井板的一口井），并把它们放在冰上，直到它们变得体温过低。确保幼崽和冰之间没有直接接触。用尖尖撬爪子，以确保失去知觉，并用锋利的剪刀斩首幼崽安乐死。
注意：如果使用不同的基因型，请准备一个额外的管子来收集尾部活检（3毫米切口）用于基因型化。如果立即进行基因化，将安乐死的幼崽留在冰上，直到解剖收集脂肪库。 - 计算并权衡消化所有仓库所需的拼贴酶量。在每个管中加入 50 微升 15 毫克/mL 拼贴酶 I 型 2 倍隔离缓冲器。在收集完所有组织之前，不要在隔离缓冲区中重新使用拼贴酶。
- 要收集皮下WAT，切开幼崽腹部周围的皮肤（避免腹膜破裂），并轻轻地将皮肤拉到腿部以下。在不取取皮肤的情况下，小心地收集脂肪库，脂肪库将显示为透明（P1 或更小）或白色（P2 及以上）、附着在四头肌内部或顶部的细长组织（图 1B）。冲洗 PBS 中的脂肪库，并将其放置在含有 250 μL PBS + 200 μL 2x 隔离缓冲区的管中。继续冰上
注：P0和P1小鼠的产量最高。在P0-1幼崽中，皮下WAT站几乎是透明的。在P2小鼠和更老的，仓库更容易识别，因为它已经变成白色，表明存在完全成熟，脂质加载，白色脂肪细胞。 - 要收集闭双面 BAT，将皮肤从肩部刀片上拉到头部。抬起 BAT - 肩部刀片之间的深红色组织 - 并小心地在它周围切开，将其从身体分离（图 1B）。检查一致性和颜色;用PBS冲洗;将其放置在另一个管中，其中含有 250 μL 的 PBS + 200 μL 的 2 倍隔离缓冲区;继续冰上
注意：从P2小鼠和年长者身上采集BAT时，小心地去除BAT周围的白色脂肪组织。它由位于皮肤和 BAT 之间的薄薄、柔软、白色的脂肪细胞片组成，后者位于肩部刀片之间较深。 - 收集完所有仓库后，使用直接在管内的小剪刀轻轻切碎每个仓库（4-6 次）。
- 在适当的2倍隔离缓冲器中重新插入拼贴酶I型，以15毫克/mL获得10倍的库存解决方案。在每个管中加入 50 μL 的 10 倍拼贴酶，将管子保持在冰上，直到拼贴酶被添加到所有管中。
- 快速倒置管子以混合，并转移到温度控制的搅拌机。在摇床 37 °C（1，400 rpm 频率，用于有效样品混合）下孵化样品 30 分钟。
2. 电镀预细胞（第1天）
- 消化组织后，将管子放回冰上。
注：从这一步开始，所有工作都在生物安全柜的无菌条件下进行。 - 将消化过的组织通过 100μm 细胞过滤器应变到新的 50 mL 管中。如果只与 WT 小鼠一起工作，或者已知基因型，则将相关分离的 BAT 汇集在一起：重复这一点的瓦特。为了最大限度地提高细胞产量，用1毫升的隔离介质（杜尔贝科的改良鹰介质（DMEM）+20%胎儿牛血清（FBS），10m HEPES，1%青霉素链霉素冲洗每个管子），并通过细胞过滤器过滤它。如果与未知的基因型一起工作，则转到步骤2.4
注：FBS 是预生细胞增殖和分化的基本决定因素。严格测试不同的 FBS 批次，以确保批次之间的高性能和一致性。 - 将 BAT 和 WAT 悬架稀释到每个 BAT 样本的 6 井板的 2-3 井和每个 WAT 样本的 6 井板的 4-6 井。例如，如果将 6 个 BAT 和 6 个 WAT 汇集在一起，则将 BAT 细胞悬架稀释至 24-36 mL，将 WAT 细胞悬架稀释至 48-72 mL。每口井的细胞悬架板2mL。
- 对于具有未知基因型的样品，请将每个样本分开：在6井板的每口井上放置一个100μm细胞过滤器，并过滤每口井的一个样品。用 1.5 mL 的隔离介质冲洗管子，并通过滤网，使最终体积达到每口井 2 mL。丢弃细胞过滤器，将盖子放在板上，并将板转移到孵化器。
注意：由于流血细胞、细胞碎片和来自被解流细胞的脂质，井中的介质看起来应该浑浊。 - 电镀后1-1.5小时，吸气介质和洗涤2 mL的DMEM没有血清。轻轻搅拌板，将血细胞从井底分离。洗涤3次后，加入2mL的新鲜隔离介质，并将细胞转移到孵化器（37°C，5%CO2）。
注：检查显微镜下的细胞。漂浮物（血细胞、细胞碎片）应为极小。棕色预生细胞将作为小型非半透明细胞出现，而白色预生细胞将显示更拉长的形式。棕色和白色的预制细胞应紧密附着在盘子上。
3. 扩大预科文化（第2天至第5天）
- 第二天，吸气介质，用2mL的DMEM清洗细胞，没有血清，并添加回2mL的隔离介质。
- 每 2 天重复一次步骤 3.1，直到细胞达到 80-90% 的汇合。
注意：对于原棕色预编，达到80-90%的汇合可能需要4-5天。对于初级白色预细胞，通常需要2-3天。一旦前体达到60%的汇合，它们可以有效地感染病毒颗粒进行击倒或过度表达实验。感染具有适当病毒载荷长达 8 小时的县立细胞。劝阻使用阳酸聚合物以提高感染效率，因为它往往导致毒性，并显著降低受感染的预生细胞的脂肪潜力。 - 要拆分细胞，请使用 0.1% w/v 明胶的无菌溶液涂抹新的目标板（溶解在蒸馏水中;不使用任何热量）。使用足够的体积来覆盖井/盘的底部。在 37 °C 孵化板，直到细胞准备好播种（至少 10 分钟）。
注：此步骤是可选的。细胞培养板的涂层不影响产量或分化潜力，但大大简化了分化脂肪细胞的维护和处理。 - 当细胞达到亚汇合密度（85-95%）时，吸气介质，用PBS清洗，并加入三分肌素3分钟分离细胞。通过添加 2.5 倍的分离介质的三氯辛体积来阻止 trypsin 活动。将细胞上下悬架，以最大限度地恢复细胞，并转移到新的管中。用 1 mL 的隔离介质清洗油井，并将其添加到第一个集合中。
- 在800-1200× 克时将细胞离心5分钟，吸气超自然，并在隔离介质的3-5 mL中恢复细胞。数一数细胞，稀释到所需的最终密度。
注：例如，50，000-80，000个电池/mL（2.5，1和0.5 mL，分别为6，12和24井板）将导致72-96小时内完全汇合井。 - 在第 3.3 步中吸气涂层溶液，然后用 PBS 洗掉多余的明胶。播种细胞，并将板返回到孵化器，直到完全汇聚。
4. 区分白色和棕色预产细胞（第7天至第12天）
- 当预合成细胞变得相容时，吸气介质，代之以DMEM中包含10%FBS的分化介质，其中含有170nM胰岛素、1 μm德萨梅松和0.5 mM 3-异丙基-1-甲基辛汀。如果区分 BAT 预科细胞，也添加 1 nM 三聚二甲酸酯 （T3）。将诱导脂肪分化的日数标记为分化的第 0 天。
注意：白色和棕色预生细胞在达到汇合时可以自发分化。然而，为了最大限度地提高脂肪分化，应使用上述传统亲脂肪鸡尾酒（加上 BAT 预生细胞的 T3）。 - 48 小时后（分化的第 2 天），刷新介质，维护介质包括 DMEM 中的 10% FBS 和 170 nM 胰岛素（外加 BAT 的 1 nM T3）。
注：在第2天，使用标准明亮场观察显微镜下细胞中积累的小脂质液滴。 - 每2天重复一次步骤4.2，直到细胞用于实验。
注意：在分化的第4天或第5天，大多数细胞会出现含有脂质。最终分化的脂肪细胞可以在培养中保存更长的时间或在现阶段用于实验。
5. 生物能学实验的重新镀电
注：如果打算以96井格式对成熟的脂肪细胞进行生物电动研究，需要采取以下步骤。理想情况下，应使用刚刚完全分化的细胞（第 4 天或第 5 天）。下面描述的程序从 6 井板的 1 口井开始。
- 在尝试消化之前，准备96井板涂层。在每口井中加入 50 μL 的 0.1% 明胶。将盘子留在组织培养孵化器中，直到细胞准备好播种。
- 在分化的第 4 天或第 5 天，吸气介质，用 1 mL 的 PBS 清洗，并加入 300 μL 的 0.25% trypsin-乙烯地胺四乙酸（6 井板的 1 口井）。轻轻倾斜板，以确保肌素完全覆盖井底：在室温下孵育2分钟。用 700μL 的维护介质阻断 trypsin 的功能，上下移动移液器以最大限度地提高细胞恢复，并将细胞悬架转移到新的 1.5 mL 管中。
- 以1200× 克 的速度将细胞离心5分钟。取出超自然物，在 1 mL 的维护介质中重新喷射颗粒，并计算细胞。
注：6井板中的一口井应产生约150-180万个细胞。 - 稀释细胞，最终浓度为60，000至80，000个细胞/mL，用于棕色脂肪细胞，100，000至120，000个细胞/mL用于白色脂肪细胞。在明胶涂层的 96 井板中，每口井的细胞悬架板为 100 μL。
注：6井板中的一口井为多达两个96井板提供了足够的细胞。对于生物能学实验，需要低密度电镀（30-40%的汇合），以便准确测量氧气消耗，避免在测定过程中井中缺氧。 - 允许细胞在板底部粘附至少 48 小时。如果细胞在盘子中保持超过48小时，在2天后刷新介质。
- 在检测当天，吸气介质，并替换为检测介质。在非 CO 2 控制的孵化器中在 37 °C 下孵化1小时，并按照制造商的说明执行检测。
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Representative Results
协议第1节将产生在标准光显微镜下可见的细胞的异质悬浮。用细胞过滤器过滤消化的组织（第2节）将去除未消化的组织。然而，一些细胞碎片，血细胞和成熟的脂肪细胞将通过（图1C）。电镀后轻轻洗涤1小时将去除非相关细胞，因为预编细胞会迅速附着在井底（图1C）。在第3节中，脂肪细胞前体被扩展，以获得实验计划所需的细胞数量。虽然从新生幼崽身上分离出的白色和棕色预生细胞具有很高的扩散能力，但白预生细胞的产量一般是每座棕色预生细胞产量的两倍（图2A）。因此，如果需要同步培养，则必须相应地计算白色预星体的启动密度。第4节提供获取完全成熟的脂肪细胞的指南。
在分化结束时，细胞会出现加载脂质液滴和表达白色和棕色脂肪细胞的经典标记，分别（图2B，C）。白色和棕色脂肪细胞可用于第5节所述的生物动力学研究。图2D显示了基底条件下初级白色和棕色脂肪细胞线粒体应激测试中氧气消耗的比较分析，以及对线粒体功能（如去甲肾上腺素）已知刺激器的反应。隔离后，还可以区分板上的原白和棕色脂肪细胞，这些脂肪细胞将直接用于生物能源实验19。在这种情况下，预成细胞被隔离并镀上第 1 节和第 2 节中描述的。当细胞变得汇合时，它们被诱导分化，如第4节所述，直到它们达到末期分化，并准备好进行生物能学分析。此程序对于 24 井板格式很常见，但 96 井板则不那么常见。
图1：脂肪垫的收集和处理。 （A） 初级白色（顶部）和棕色（底部）脂肪细胞分离的示意图表示。（B） 皮下白色（顶部）和棕色（底部）脂肪库。在P0小鼠中，皮下WAT几乎不可见，但在出生后的第2天就变得可区分。相比之下，BAT 即使在 P0 中也有明显的深色。在较老的幼崽中，BAT 被薄薄的 WAT 表面层包围，这需要在解剖组织时切除。（C） 通过 100 μm 细胞过滤器过滤后、初始洗涤后和隔离后 24 h 的原白细胞和棕色前体细胞的代表图像。比例杆 = 100 μm。缩写：WAT = 白色脂肪组织;BAT=棕色脂肪组织。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2：区分脂肪细胞祖先。 （A） 每个新生儿（P0）幼崽获得的皮下WAT和BAT预生细胞的平均数量。（B） 具有代表性的图像，即最终分化的白色和棕色脂肪细胞。对于荧光成像，细胞分别用尼罗河红和霍奇斯特33342孵育成污渍中性脂质和核。比例杆 = 100 μm.（C） 经典脂肪细胞标记、白米色标记和原始白色和棕色脂肪细胞中的棕色特异性标记的基因表达分析，分化6天（n=3）。对于每个基因，BAT 表达与 WAT 水平相对（设置为 1）。（D） 线粒体应激测试中白色和棕色脂肪细胞的 OCR，以及对去甲肾上腺素 （n=3） 的反应。棕色脂肪细胞表现出脱钩呼吸和对去甲肾上腺素的强效反应，而白色脂肪细胞显示很少脱钩呼吸，对肾上腺刺激没有显著反应。*p<0.05;**p<0.01，由双尾学生 t测试决定。缩写：WAT = 白色脂肪组织;BAT = 棕色脂肪组织;OCR=耗氧率;寡头=寡头肌素;FCCP = 碳基氰化物-4-（三氟甲基苯丙胺）苯丙酮;RAA=罗特酮，抗霉素A： PPARγ =腹产体扩散器激活受体伽马; Acrp30 = 30 kDa 的脂肪细胞补充相关蛋白质; 法布4 = 脂肪酸结合蛋白 4; 谷类4= 葡萄糖运输机4： Cd36 =分化聚类36： 雷顿 =抵抗： Slc27a1= 溶解载体家族27成员1： 耳2= 与嗜血杆菌相关，核糖核糖核糖酶A家庭2; Pgc1a =PPARγ共生器1alpha; Prdm16 = 正调控域 I 结合因子 1 （PRDI-BF1） 和视网膜母细胞瘤蛋白相互作用锌指基因 1 （RIZ1） 同源域包含 16; Eva1= 上皮V型抗原1： Cidea = 细胞死亡诱导 DNA 碎片因子 - 阿尔法样效应器 A; Ucp1= 脱钩蛋白1： 迪奥 2 = 类型 2 德奥迪纳塞。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
脂肪组织对全身胰岛素敏感性和葡萄糖平衡20至关重要。肥胖相关脂肪细胞功能障碍与2型糖尿病的发病密切相关。因此，对脂肪组织的基本生物学和生理学的更深入的了解，可能有助于设计代谢紊乱的新疗法。作为对从脂肪库分离出来的成熟脂肪细胞的直接功能和转录分析的补充，培养的原发性脂肪细胞已被证明可以概括脂肪组织病理生理学的许多方面，包括脂肪素分泌、对胰岛素的抗刺激反应以及热原程序23、24、25的诱导。虽然以前的协议已经描述了从成年小鼠11，12分离脂肪细胞前体，但该协议提供了一种方法，有效地隔离细胞从新生幼崽。这一战略产生大量具有较高分化潜力的白色和棕色脂肪细胞祖先，因为与成年小鼠26的脂肪库相比，产后脂肪库仍然相对没有差别。此外，使用这种方法分离的细胞已经投入并产生功能齐全的分化脂肪细胞，这些脂肪细胞表示成熟细胞的标记，并表现出其独特的生理特征，包括脂质储存和热能。
主细胞不能在体外无限期扩张。此外，在文化中的几个段落之后，主要的预生细胞开始失去其脂肪潜力。这可能是因为持续的细胞培养导致内在丰富较少承诺，更多的增殖细胞。因此，此协议的一个限制是使用预星体的时间窗口。如果细胞在隔离后7-8天内被诱导分化，则完全保留致电潜力。脂肪细胞祖细胞对酶消化特别有抵抗力，但正确时间进行拼贴酶治疗仍然很重要。组织消化过度可能导致细胞存活率降低，细胞粘附板的能力下降。在整个扩展阶段，白色和棕色的预生细胞都强烈坚持，可以容忍剧烈的洗涤和频繁的媒体交流。但是，当诱导预生细胞进行分化时，建议使用涂层板。成熟、脂质充斥的脂肪细胞减少了表面粘附和细胞-细胞相互作用，导致除非轻轻处理，否则在分化过程中会分离。协议最微妙的步骤是分化的诱导。必须测试 FBS、胰岛素、T3 和其他药物，并优化其最终浓度，以获得最高的分化程度。也可以添加PPARγ激动剂（如罗西格利酮），以进一步刺激脂肪生成。
需要注意的是，差异化条件可以适应实验需要。例如，在带有遗传或化学库的屏幕上，可以识别增强白色和/或棕色脂肪细胞分化的蛋白质/化合物，可以诱导预生细胞使用最小的允许介质进行分化，该介质仅包括 DMEM 中的 10% FBS 和 170 nM 胰岛素。建议评估分化鸡尾酒的每个成分，以确定区分检测的理想检测窗口。T3 和脱氧酮可用于初级白色和棕色脂肪细胞分化。这些条件将确保控制细胞的分化率较低，从而增加检测窗口，并最大限度地提高检测亲脂肪因子的能力。原发性棕色和白色脂肪细胞培养是一种强大的工具，可以对脂肪细胞自主功能进行质问，以响应遗传操纵和代谢应力，以补充体内棕色和白色脂肪组织的研究。因此，需要制定主要预编细胞的隔离和文化协议，以便对体外脂肪功能进行可重复的高通量调查。此处描述的策略允许研究原发性白色和棕色预星体，这些细胞可以分化成完全成熟的脂肪细胞，并在各种实验操作下进行测试。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢西班牙马德里国家生物技术中心的克里斯蒂娜·戈迪奥、斯克里普斯研究所的玛丽·甘特纳、巴尔的摩约翰霍普金斯大学的阿纳斯塔西娅·克拉利在卡恩等人的最初工作基础上帮助优化了这一协议。这项工作由NIH向E.S.提供DK114785和DK121196资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) | Sigma-Aldrich | I7018 | |
| 6-well plates | Corning | 353046 | |
| AdipoRed (Nile Red) | Lonza | PT-7009 | |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| BenchMark Fetal Bovine Serum | Gemini Bioproducts LLC | 100-106 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell strainer | Fisher Scientific | 22363549 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington Biochemical Corp | LS004196 | |
| ddH2O | Sigma-Aldrich | 6442 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5030 | For Bioenergetics studies |
| DMEM, High Glucose, Glutamax | Gibco | 10569010 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Fatty Acid-Free BSA | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Norepinephrine | Cayman Chemical | 16673 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | 75351 | |
| Pen/Strep | Gibco | 15140122 | |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | 557368 | |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent Technologies | 102416-100 | For Bioenergetics studies |
| Surgical forceps | ROBOZ Surgical Instrument Co | RS-5158 | |
| Surgical Scissors | ROBOZ Surgical Instrument Co | RS-5880 | |
| ThermoMixer | Eppendorf | T1317 | |
| triiodothyronine (T3) | Sigma-Aldrich | 642511 |
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