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Biology

नवजात चूहों से प्राथमिक सफेद और भूरे रंग के प्रीडिपोसाइट्स का अलगाव और भेदभाव

Published: January 25, 2021 doi: 10.3791/62005
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Department of Molecular Medicine, The Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA, 2Department of Medicine, University of Wisconsin-Madison, School of Medicine and Public Health, Madison, WI, USA

Summary

इस रिपोर्ट में नवजात चूहों से प्राथमिक भूरे और सफेद preadipocytes के एक साथ अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है । अलग कोशिकाओं को संस्कृति में उगाया जा सकता है और पूरी तरह से परिपक्व सफेद और भूरे रंग के एडीपोसाइट्स में अंतर करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है। विधि संस्कृति में प्राथमिक वसा कोशिकाओं के आनुवंशिक, आणविक और कार्यात्मक लक्षण वर्णन को सक्षम बनाती है।

Abstract

आदिपोसाइट भेदभाव और कार्य में अंतर्निहित तंत्र की समझ अमर सफेद प्रीडिपोसाइट सेल लाइनों के उपयोग से बहुत लाभान्वित हुई है। हालांकि, इन सुसंस्कृत सेल लाइनों की सीमाएं हैं। वे विषम आदिपोसाइट आबादी के विविध कार्यात्मक स्पेक्ट्रम को पूरी तरह से कैप्चर नहीं करते हैं जो अब सफेद आदिपोस डिपो के भीतर मौजूद होने के लिए जाने जाते हैं। सफेद एडीपोज ऊतक की जटिलता का अध्ययन करने के लिए एक अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक मॉडल प्रदान करने के लिए, नवजात चूहों से प्राथमिक सफेद और भूरे रंग के एडीपोसाइट जनकों के एक साथ अलगाव, संस्कृति में उनके तेजी से विस्तार और परिपक्व, पूरी तरह से कार्यात्मक आदिपोसाइट्स में उनके विट्रो में उनके भेदभाव को सक्षम करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित और अनुकूलित किया गया है। वयस्क चूहों के बजाय नवजात शिशु से प्राथमिक कोशिकाओं को अलग करने का प्राथमिक लाभ यह है कि एडिपोज डिपो सक्रिय रूप से विकसित हो रहे हैं और इसलिए, preadipocytes प्रसार का एक समृद्ध स्रोत हैं । इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके अलग किए गए प्राथमिक प्रीडिपोसाइट्स संगम तक पहुंचने पर तेजी से अंतर करते हैं और 4-5 दिनों में पूरी तरह से परिपक्व हो जाते हैं, एक अस्थायी खिड़की जो नवजात चूहों में विकसित वसा पैड की उपस्थिति को सही रूप से दर्शाती है। इस रणनीति का उपयोग करके तैयार प्राथमिक संस्कृतियों का विस्तार किया जा सकता है और उच्च प्रजनन क्षमता के साथ अध्ययन किया जा सकता है, जिससे उन्हें आनुवंशिक और फेनोटाइपिक स्क्रीन के लिए उपयुक्त बनाया जा सकता है और आनुवंशिक माउस मॉडल के सेल-स्वायत्त एडीपोसाइट फेनोटाइप के अध्ययन को सक्षम किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल विट्रो में एडीपोज ऊतक की जटिलता का अध्ययन करने के लिए एक सरल, तेजी से और सस्ता दृष्टिकोण प्रदान करता है।

Introduction

मोटापा ऊर्जा के सेवन और ऊर्जा व्यय के बीच एक पुरानी असंतुलन से परिणाम है । जैसे-जैसे मोटापा विकसित होता है, सफेद एडीपोसाइट्स कोशिका के आकार में बड़े पैमाने पर विस्तार से गुजरते हैं जिसके परिणामस्वरूप माइक्रोएनवायरमेंट, सेल डेथ, सूजन और इंसुलिन प्रतिरोध 1 में हाइपोक्सियाहोताहै। बेकार, हाइपरट्रोफिड एडिपोसाइट्स अतिरिक्त लिपिड को ठीक से स्टोर नहीं कर सकते हैं, जो इसके बजाय अन्य ऊतकों में जमा होते हैं जहां वे इंसुलिन कार्रवाई2,3को गीला करते हैं। एजेंट जो एडिपोसिट फ़ंक्शन में सुधार करते हैं और ऊतकों के बीच सामान्य लिपिड विभाजन को बहाल करते हैं, मोटापे से जुड़ी स्थितियों के उपचार के लिए फायदेमंद होने की भविष्यवाणी की जाती है जैसे कि टाइप 2 मधुमेह। अमर कोशिका रेखाओं का उपयोग करके एडिपोसाइट्स में फेनोटाइपिक स्क्रीन, जैसे 3T3-L1, F442A, और 10T 1/2, आनुवंशिक कारकों की पहचान करने के लिए उपयोगी साबित हुई है जो एडिपोजेनेसिस को विनियमित करते हैं और मधुमेह रोधी गुणों के साथ प्रो-एडिपोजेनिक अणुओं को अलग करने के लिए4,5,6,7। हालांकि, ये सेल लाइनें आदिपोज डिपो में मौजूद सेल प्रकारों की विषमता को पूरी तरह से प्रतिबिंबित नहीं करती हैं, जिसमें सफेद, भूरे, बेज और अद्वितीय विशेषताओं के साथ अन्य एडिपोसिट उपप्रकार शामिल हैं, जिनमें से सभी प्रणालीगत होमोस्टेसिस8,9,10में योगदान देते हैं। इसके अलावा, सुसंस्कृत सेल लाइनें अक्सर बाहरी उत्तेजनाओं के प्रति कम प्रतिक्रिया दिखाती हैं।

इसके विपरीत, प्राथमिक एडिपोसाइट्स की संस्कृतियां वीवो एडिपोजेनेसिस में जटिलता को अधिक सटीकता से पुनः कृत करती हैं, और प्राथमिक एडीपोसाइट्स मजबूत कार्यात्मक प्रतिक्रियाएं दिखाते हैं। प्राथमिक प्रीडिपोसाइट्स आमतौर पर वयस्क चूहों के आदिपोज डिपो के स्ट्रोमल संवहनी अंश से अलग होते हैं11,12,13,14. हालांकि, वयस्क जानवरों के एडिपोस डिपो में मुख्य रूप से पूरी तरह से परिपक्व एडिपोसाइट्स होते हैं जिनमें बहुत धीमी गति से कारोबार की दर15,16,17होती है, इस दृष्टिकोण से कम प्रसार दर के साथ सीमित मात्रा में प्रीडिपोसाइट्स होते हैं। इसलिए, नवजात चूहों से प्रीडिपोसाइट्स का अलगाव तेजी से बढ़ती कोशिकाओं की बड़ी मात्रा प्राप्त करने के लिए बेहतर है जिसे विट्रो में विभेदित किया जा सकता है। यहां, एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है, जो क्हान एट अल के प्राथमिक भूरे रंग के एडीपोसाइट्स के साथ प्रारंभिक कार्य से प्रेरित है।18 सफेद और भूरे रंग के प्रीडिपोसाइट्स दोनों को कुशलतापूर्वक अलग करने के लिए जिसे पूरी तरह से कार्यात्मक प्राथमिक एडीपोसाइट्स(चित्रा 1 ए)में विस्तारित और विभेदित किया जा सकता है। वयस्क चूहों के विपरीत नवजात शिशु से प्राथमिक कोशिकाओं को अलग करने का लाभ यह है कि एडिपोज डिपो तेजी से बढ़ रहे हैं और इस प्रकार सक्रिय रूप से पूर्वाधिकारियों17का प्रसार करने का एक समृद्ध स्रोत हैं। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके अलग कोशिकाओं में उच्च प्रसार क्षमता होती है, जो संस्कृतियों के तेजी से पैमाने पर सक्षम होती है। इसके अलावा, नवजात पिल्ले से प्रीडिपोसाइट्स वयस्क जनकों की तुलना में उच्च भेदभाव क्षमता प्रदर्शित करते हैं, जो भेदभाव की सीमा में अच्छी तरह से परिवर्तनशीलता को कम करता है और इस प्रकार प्रजनन क्षमता को बढ़ाता है।

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Protocol

यह प्रोटोकॉल स्क्रिप्स रिसर्च इंस्टीट्यूट और यूनिवर्सिटी ऑफ विस्कॉन्सिन - मैडिसन स्कूल ऑफ मेडिसिन एंड पब्लिक हेल्थ के सभी आईएसीयूसी दिशानिर्देशों का पालन करता है।

1. आदिपोज डिपो का संग्रह और पाचन (दिन 1)

  1. प्रत्येक पिल्ला के लिए दो 1.5 एमएल ट्यूब तैयार करें: एक भूरे रंग के एडीपोज ऊतक (बैट) के लिए और एक सफेद एडीपोस ऊतक (वाट) के लिए। फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) + 2x आइसोलेशन बफर (123 mm NaCl) के 250 माइक्रोन जोड़ें, 5 एमएमएम केसीएल, 1.3 एमएमएम सीएसीएल2,5 एमएम ग्लूकोज, 100 एमएम 4- (2-हाइड्रोक्सीथिल) - 1- पिपरेजिएथानसुल्फोनिक एसिड (एचईपीईएस), पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 4% फैटी एसिड-फ्री बोविन सीरम एल्बुमिन) प्रत्येक ट्यूब पर। समाधान बाँझ और बर्फ पर रखें।
  2. पिल्ले को छोटे कक्षों में रखें (उदाहरण के लिए, 6-अच्छी प्लेट का एक अच्छा), और उन्हें बर्फ पर तब तक सेट करें जब तक कि वे हाइपोथर्मिक न हो जाएं। सुनिश्चित करें कि पिल्ले और बर्फ के बीच कोई सीधा संपर्क नहीं है। चेतना के नुकसान को आश्वस्त करने के लिए एक टिप के साथ एक पंजा चुभन, और तेज कैंची का उपयोग कर decapitation द्वारा पिल्ले इच्छामृत्यु ।
    नोट: यदि विभिन्न जीनोटाइप के साथ काम कर रहे हैं, तो जेनोटीपिंग के लिए पूंछ बायोप्सी (3 मिमी कट) एकत्र करने के लिए एक अतिरिक्त ट्यूब तैयार करें। यदि जीनोटाइपिंग तुरंत की जाती है, तो इच्छामृत्यु वाले पिल्ले को बर्फ पर तब तक रखें जब तक कि विच्छेदन आदिपोस डिपो एकत्र न कर सके।
  3. सभी डिपो को पचाने के लिए आवश्यक कोलेजनेस की मात्रा की गणना करें और उसका वजन करें। प्रत्येक ट्यूब के लिए 2x आइसोलेशन बफर में 15 मिलीग्राम/एमएल कोलेजनेस प्रकार I के 50 माइक्रोन जोड़ें। जब तक सभी ऊतकों को एकत्र नहीं किया गया है तब तक कोलाजने को आइसोलेशन बफर में फिर से खर्च न करें।
  4. चमड़े के नीचे वाट इकट्ठा करने के लिए, पिल्ला के पेट के चारों ओर त्वचा में कटौती (पेरिटोनियल टूटना से बचें), और धीरे से त्वचा को पैरों के नीचे नीचे खींचें। त्वचा लेने के बिना, ध्यान से वसा डिपो है, जो एक स्पष्ट (P1 या छोटे) या सफेद (P2 और पुराने), पतली, विस्तारित ऊतक अंदर या क्वाड्रिसेप्स(चित्रा 1B)के शीर्ष पर संलग्न के रूप में दिखाई देगा इकट्ठा । पीबीएस में वसा डिपो कुल्ला, और यह PBS + 200 μL के 2x आइसोलेशन बफर के 250 μL युक्त ट्यूबों में से एक में जगह है। बर्फ पर रखें।
    नोट: P0 और P1 चूहों सबसे अच्छा उपज दे । पी0-1 पिल्ले में, चमड़े के नीचे वाट डिपो लगभग पारदर्शी है। P2 चूहों और पुराने में, डिपो की पहचान करना आसान है क्योंकि यह पहले से ही सफेद हो रहा है, जो पूरी तरह से परिपक्व, लिपिड-लोडेड, सफेद एडीपोसाइट्स की उपस्थिति का संकेत देता है।
  5. इंटरकैप्युलर बैट इकट्ठा करने के लिए, त्वचा को कंधे के ब्लेड से सिर के ऊपर खींचें। बैट उठाएं - कंधे के ब्लेड के बीच गहरे लाल ऊतक - और ध्यान से यह शरीर(चित्रा 1B)से अलग करने के लिए चारों ओर चीरों बनाने के लिए । स्थिरता और रंग की जांच करें; पीबीएस के साथ कुल्ला; इसे अन्य ट्यूब में रखें जिसमें पीबीएस + 200 माइक्रोन ऑफ 2x आइसोलेशन बफर के 250 माइक्रोन होते हैं; और बर्फ पर रहते हैं।
    नोट: जब P2 चूहों और पुराने से बैट की कटाई, ध्यान से चमगादड़ के आसपास सफेद adipose ऊतक हटा दें । इसमें त्वचा और बैट के बीच स्थित एडिपोसाइट्स की एक पतली, नरम, सफेद चादर होती है, जो कंधे के ब्लेड के बीच गहरी होती है।
  6. एक बार सभी डिपो एकत्र किया गया है, धीरे से ट्यूबों के अंदर सीधे छोटी कैंची का उपयोग कर प्रत्येक डिपो (4-6 बार) कीमा ।
  7. 15 मिलीग्राम/एमएल पर 10x स्टॉक समाधान प्राप्त करने के लिए 2x आइसोलेशन बफर की उचित मात्रा में कोलेजनेस प्रकार I को फिर से 15 लदना। प्रत्येक ट्यूब में 10x कोलेजन के 50 माइक्रोन जोड़ें, ट्यूबों को बर्फ पर रखते हुए जब तक कोलेजनास सभी ट्यूबों में जोड़ दिया गया है।
  8. ट्यूबों को जल्दी से मिश्रण करने के लिए उलटा करें, और तापमान नियंत्रित मिक्सर में स्थानांतरित करें। एक शेकर पर 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए नमूनों को इनक्यूबेट (प्रभावी नमूना मिश्रण के लिए 1,400 आरपीएम आवृत्ति)।

2. चढ़ाना preadipocytes (दिन 1)

  1. ऊतकों को पचाने के बाद, ट्यूबों को बर्फ पर वापस रखें।
    नोट: इस कदम के बाद से, सभी काम एक जैवसेफ्टी कैबिनेट में बाँझ परिस्थितियों में किया जाता है ।
  2. 100 माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से पचा ऊतकों को नए 50 एमएल ट्यूबों में तनाव दें। यदि केवल डब्ल्यूटी चूहों के साथ काम करना है, या यदि जीनोटाइप ज्ञात हैं, तो प्रासंगिक, अलग-अलग बीएटी को एक साथ पूल करें; WATs के लिए इसे दोहराएं। सेल यील्ड को अधिकतम करने के लिए, प्रत्येक ट्यूब को 1 एमएल आइसोलेशन मीडियम (दुल्बेको का संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) + 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 10 एमएम एचईपीई, 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ कुल्लाएं, और इसे सेल छलनी के माध्यम से फ़िल्टर करें। यदि अज्ञात जीनोटाइप के साथ काम कर रहे हैं, तो चरण 2.4 पर जाएं
    नोट: एफबीएस पूर्वाधिकार प्रसार और भेदभाव दोनों का एक आवश्यक निर्धारक है। बहुत सारे लोगों के बीच उच्च प्रदर्शन और स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए एफबीएस के विभिन्न लॉट का कड़ाई से परीक्षण करें।
  3. तनु चमगादड़ और वाट निलंबन प्रत्येक चमगादड़ नमूना के लिए एक 6 अच्छी तरह से थाली के 2-3 कुओं और प्रत्येक वाट नमूने के लिए एक 6 अच्छी तरह से थाली के 4-6 कुओं के लिए । उदाहरण के लिए, यदि 6 बीएटी और 6 डब्ल्यूएटी को एक साथ एकत्र किया गया था, तो बैट सेल निलंबन को 24-36 एमएल तक पतला करें और वाट सेल निलंबन 48-72 एमएल तक। कक्ष के प्लेट 2 एमएल अच्छी तरह से निलंबन।
  4. अज्ञात जीनोटाइप वाले नमूनों के लिए, प्रत्येक नमूने को अलग रखें; एक 6-अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं के शीर्ष पर 100 माइक्रोन सेल छन्नी रखें, और प्रति अच्छी तरह से एक नमूना फ़िल्टर करें। आइसोलेशन माध्यम के 1.5 एमएल के साथ ट्यूब कुल्ला, और इसे छलनी के माध्यम से पारित करें, जिससे अंतिम मात्रा को 2 एमएल प्रति अच्छी तरह से बना दिया जाए। सेल छन्नी को छोड़ दें, प्लेट पर ढक्कन रखें, और प्लेट को इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें।
    नोट: कुओं में माध्यम तैरते रक्त कोशिकाओं, कोशिका मलबे, और लाइसेड कोशिकाओं से लिपिड के कारण टर्बिड दिखना चाहिए।
  5. चढ़ाना के बाद 1-1.5 घंटे, मीडिया को एस्पिरेट करें और सीरम के बिना डीएमईएम के 2 एमएल से धोएं। धीरे-धीरे प्लेट को कुओं के नीचे से रक्त कोशिकाओं को अलग करने के लिए उत्तेजित करें। 3 वॉश के बाद, ताजा आइसोलेशन माध्यम के 2 एमएल जोड़ें, और कोशिकाओं को इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2)में स्थानांतरित करें।
    नोट: माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं की जांच करें । फ्लोटिंग सामग्री (रक्त कोशिकाएं, सेलुलर मलबे) न्यूनतम होनी चाहिए। ब्राउन प्रीडिपोसाइट्स छोटे गैर-पारदर्शी कोशिकाओं के रूप में दिखाई देंगे, जबकि सफेद प्रीडिपोसाइट्स अधिक लम्बी रूप प्रदर्शित करेंगे। भूरे और सफेद प्रीडिपोसाइट्स दोनों को प्लेट से कसकर जोड़ा जाना चाहिए।

3. प्रीडिपोसाइट संस्कृति का विस्तार (दूसरा दिन 5 दिन)

  1. अगले दिन, माध्यम को एस्पिरेट करें, कोशिकाओं को सीरम के बिना डीएमईएम के 2 एमएल से धोएं, और आइसोलेशन माध्यम के 2 एमएल को वापस जोड़ें।
  2. हर 2 दिनों में एक बार चरण 3.1 दोहराएं जब तक कि कोशिकाएं 80-90% संगम तक न पहुंच जाएं।
    नोट: प्राथमिक भूरे रंग के प्रीडिपोसाइट्स के लिए, 80-90% संगम तक पहुंचने में 4-5 दिन लग सकते हैं। प्राथमिक सफेद प्रीडिपोसाइट्स के लिए, आमतौर पर 2-3 दिन लगते हैं। एक बार जब प्रीडिपोसाइट्स 60% संगम तक पहुंच जाते हैं, तो वे नॉकआउट या अतिव्यक्त प्रयोगों के लिए वायरल कणों से कुशलतापूर्वक संक्रमित हो सकते हैं। 8 घंटे तक के लिए एक उपयुक्त वायरल लोड के साथ preadipocytes संक्रमित। संक्रमण दक्षता बढ़ाने के लिए cationic बहुलक का उपयोग हतोत्साहित किया जाता है, क्योंकि इसके परिणामस्वरूप अक्सर विषाक्तता होती है और संक्रमित प्रीडिपोसाइट्स की एडिपोजेनिक क्षमता में काफी कमी आती है।
  3. कोशिकाओं को विभाजित करने के लिए, 0.1% w/v जिलेटिन (आसुत पानी में भंग; किसी भी गर्मी का उपयोग न करें) के बाँझ समाधान का उपयोग करके नए गंतव्य प्लेटों को कोट करें। अच्छी तरह से/ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट प्लेटें जब तक कोशिकाओं को वरीयता प्राप्त करने के लिए तैयार कर रहे हैं (कम से कम 10 मिनट).
    नोट: यह कदम वैकल्पिक है। सेल कल्चर प्लेटों की कोटिंग उपज या भेदभाव क्षमता को प्रभावित नहीं करती है, लेकिन यह आदिपोसाइट्स को अलग करने के रखरखाव और हैंडलिंग को काफी हद तक सरल बनाता है।
  4. जब कोशिकाएं उप-कॉन्फ्लूंट घनत्व (85-95%) तक पहुंचती हैं, तो माध्यम को एस्पिरेट करें, पीबीएस के साथ धोएं, और कोशिकाओं को अलग करने के लिए 3 मिनट के लिए ट्राइपसिन जोड़ें। आइसोलेशन माध्यम की 2.5x ट्राइपसिन मात्रा जोड़कर ट्राइपसिन गतिविधि को ब्लॉक करें। सेल रिकवरी को अधिकतम करने के लिए सेल सस्पेंशन को ऊपर और नीचे पिपेट करें, और एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें। कुओं को आइसोलेशन माध्यम के 1 एमएल से धोएं, और इसे पहले संग्रह में जोड़ें।
  5. 800-1200 × जीपर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें, सुपरनेट को एस्पिरेट करें, और आइसोलेशन माध्यम के 3-5 एमएल में कोशिकाओं को फिर से खर्च करें। कोशिकाओं की गणना करें, और उन्हें वांछित अंतिम घनत्व में पतला करें।
    नोट: उदाहरण के लिए, 50,000-80,000 कोशिकाओं/एमएल (२.५, 1, और ०.५ एमएल के लिए क्रमशः 6-, 12-और 24-अच्छी प्लेटों के लिए) 72-96 एच के भीतर पूरी तरह से ढुलमुल कुओं में परिणाम होगा ।
  6. चरण 3.3 में कोटिंग समाधान को बढ़ाएं, और पीबीएस के साथ अतिरिक्त जिलेटिन को धो लें। कोशिकाओं को बीज करें, और प्लेटों को पूरी तरह से ढुलमुल होने तक इनक्यूबेटर में वापस कर दें।

4. सफेद और भूरे रंग के प्रीडिपोसाइट्स का भेदभाव (दिन 7 - 12)

  1. जब प्रीडिपोसाइट्स शांत हो जाते हैं, माध्यम को बढ़ाते हैं, और इसे 170 एनएम इंसुलिन, 1 माइक्रोएम डेक्सामेथासोन, और 0.5 एमएएम 3-आइसोबुथाइल-1-मिथाइलक्सेंटिन युक्त डीएमईएम में 10% एफबीएस से मिलकर भेदभाव माध्यम से प्रतिस्थापित करते हैं। यदि बैट प्रीडिपोसाइट्स में अंतर करते हैं, तो 1 एनएम ट्राइयोडोथाइरोनिन (T3) भी जोड़ें। उस दिन को चिह्नित करें जिस दिन आदिपोजेनिक भेदभाव को विभेदन के दिन 0 के रूप में प्रेरित किया जाता है।
    नोट: सफेद और भूरे रंग के दोनों preadipocytes अनायास संगम तक पहुंचने पर अंतर कर सकते हैं । हालांकि, एडिपोसिट भेदभाव को अधिकतम करने के लिए, ऊपर वर्णित पारंपरिक समर्थक-एडिपोजेनिक कॉकटेल (बैट प्रीडिपोाइट्स के लिए प्लस टी 3) का उपयोग किया जाना चाहिए।
  2. 48 घंटे (भेदभाव के दिन 2) के बाद, डीएमईएम में 10% एफबीएस और 170 एनएम इंसुलिन (बैट के लिए प्लस 1 एनएम टी 3) से मिलकर रखरखाव माध्यम के साथ माध्यम को ताज़ा करें।
    नोट: दूसरे दिन, माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं में जमने वाली छोटी लिपिड बूंदों को मानक उज्ज्वल क्षेत्र का उपयोग करके देखा जा सकता है।
  3. प्रयोगों के लिए कोशिकाओं का उपयोग किए जाने तक हर 2 दिनों में एक बार चरण 4.2 दोहराएं।
    नोट: भेदभाव के 4 या 5 दिन पर, कोशिकाओं के बहुमत लिपिड के साथ भरी हुई दिखाई देगा । मरणासन्न अंतर आदिपोसाइट्स को संस्कृति में लंबे समय तक रखा जा सकता है या प्रयोगों के लिए इस स्तर पर उपयोग किया जा सकता है।

5. बायोएनर्जेटिक्स प्रयोगों के लिए फिर से चढ़ाना

नोट: यदि इरादा 96-वेल प्रारूप में परिपक्व एडिपोसाइट्स में बायोएनर्जेटिक्स अध्ययन करने का है, तो निम्नलिखित कदम उठाए जाने की आवश्यकता है। आदर्श रूप से, जिन कोशिकाओं में अभी पूरी तरह से अंतर है (दिन 4 या 5) का उपयोग किया जाना चाहिए। नीचे वर्णित प्रक्रिया 6-अच्छी प्लेट के 1 अच्छी तरह से शुरू होती है।

  1. ट्राइप्सिन पाचन से पहले, 96-अच्छी प्लेटों के लिए कोटिंग तैयार करें। प्रत्येक कुएं में 0.1% जिलेटिन का 50 माइक्रोल जोड़ें। प्लेट को एक ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में तब तक छोड़ दें जब तक कि कोशिकाएं वरीयता प्राप्त होने के लिए तैयार न हों।
  2. भेदभाव के दिन 4 या 5 पर, माध्यम को एस्पिरेट करें, पीबीएस के 1 मिलील से धोएं, और 0.25% ट्राइप्सिन-एथिलेंडाइमाइन टेट्राएस्केटिक एसिड (6-वेल प्लेट के 1 कुएं के लिए) के 300 माइक्रोल जोड़ें। धीरे से प्लेट झुकाव सुनिश्चित करने के लिए ट्रिप्सिन पूरी तरह से अच्छी तरह से नीचे शामिल हैं; कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट। रखरखाव माध्यम के 700 माइक्रोन के साथ ट्राइपसिन की कार्रवाई को अवरुद्ध करें, सेल रिकवरी को अधिकतम करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट करें, और सेल निलंबन को एक नए 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  3. 5 मिनट के लिए 1200 × जी पर कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र करें। सुपरनैक्टेंट निकालें, मेंटेनेंस मीडियम के 1 एमसीएल में गोली को फिर से खर्च करें और कोशिकाओं को गिनें।
    नोट: एक 6 अच्छी तरह से थाली के एक अच्छी तरह से लगभग 1.5-1.8 लाख कोशिकाओं उपज चाहिए ।
  4. कोशिकाओं को पतला करने के लिए ६०,००० से ८०,० कोशिकाओं/एमएल की अंतिम एकाग्रता भूरे रंग के adipocytes के लिए और १००,००० से १२०,००० कोशिकाओं/एमएल सफेद adipocytes के लिए । प्लेट 100 सेल निलंबन के 100 μL जिलेटिन में अच्छी तरह से लेपित 96-अच्छी तरह से प्लेटों में प्रति अच्छी तरह से।
    नोट: एक 6 अच्छी तरह से थाली का एक अच्छी तरह से दो ९६ अच्छी तरह से प्लेटों के लिए पर्याप्त कोशिकाओं प्रदान करता है । जैव-घनत्व वाले प्रयोगों के लिए, ऑक्सीजन की खपत की सटीक माप को सक्षम करने और परख के दौरान कुओं में ऑक्सीजन की कमी से बचने के लिए कम घनत्व चढ़ाना (30-40% संगम) की आवश्यकता होती है।
  5. कोशिकाओं को कम से कम 48 घंटे के लिए प्लेट के नीचे का पालन करने की अनुमति दें। यदि कोशिकाओं को 48 घंटे से अधिक समय तक प्लेट में रखा जाए तो 2 दिन बाद माध्यम को ताज़ा करें।
  6. परख के दिन, माध्यम को आकांक्षी करें, और इसे परख माध्यम से बदलें। गैर-सीओ 2-नियंत्रित इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर1घंटे के लिए इनक्यूबेट, और निर्माता के निर्देशों के अनुसार परख करते हैं।

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Representative Results

प्रोटोकॉल की धारा 1 कोशिकाओं का एक विषम निलंबन निकलेगा जो एक मानक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत दिखाई देता है। कोशिका छलनी (धारा 2) के साथ पचा ऊतकों को छानने से पचा ऊतक दूर हो जाएंगे। हालांकि, कुछ सेलुलर मलबे, रक्त कोशिकाओं, और परिपक्व adipocytes के माध्यम से पारित होगा(चित्रा 1C)। प्लेटिंग के बाद कोमल वॉश 1 एच गैर-प्रासंगिक कोशिकाओं को हटा देगा क्योंकि प्रीडिपोसाइट्स कुएं के नीचे(चित्रा 1C)में तेजी से संलग्न होते हैं। धारा 3 में, प्रायोगिक योजना के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या प्राप्त करने के लिए एडिपोसाइट अग्रदूतों का विस्तार किया जाता है। यद्यपि नवजात पिल्ले से अलग सफेद और भूरे रंग के दोनों प्रीडिपोसाइट्स में उच्च प्रसार क्षमता होती है, लेकिन सफेद प्रीडिपोसाइट्स की उपज आम तौर पर प्रति-डिपो आधार(चित्रा 2 ए)पर भूरे रंग के प्रीडिपोसाइट्स की दो बार होती है। इसलिए, यदि सिंक्रोनाइज्ड संस्कृतियों की इच्छा है, तो सफेद प्रीडिपोसाइट्स के शुरुआती घनत्व की गणना तदनुसार की जानी चाहिए। धारा 4 पूरी तरह से परिपक्व आदिपोसाइट्स प्राप्त करने के लिए दिशानिर्देश प्रदान करता है।

भेदभाव के अंत में, कोशिकाएं लिपिड बूंदों से भरी हुई दिखाई देंगी और क्रमशः सफेद और भूरे रंग के आदिपोसाइट्स(चित्र 2 B,सी)के शास्त्रीय मार्कर व्यक्त करेंगी। धारा 5 में वर्णित बायोनेरेरेटिक्स अध्ययन के लिए सफेद और भूरे रंग दोनों आदिपोसाइट्स का उपयोग किया जा सकता है। बेसल स्थितियों के तहत प्राथमिक सफेद और भूरे रंग के एडिपोसाइट्स के माइटोकॉन्ड्रियल तनाव परीक्षण में ऑक्सीजन की खपत का तुलनात्मक विश्लेषण, साथ ही माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन (जैसे, नोरेपाइनफ्रीन) के ज्ञात उत्तेजकों के जवाब में चित्र 2 डीमें दिखाया गया है। अलगाव पर, प्लेटों पर प्राथमिक सफेद और भूरे रंग के आदिपोसाइट्स में अंतर करना भी संभव है जिसका उपयोग सीधे बायोएनर्जेटिक प्रयोगों के लिए किया जाएगा19। इस मामले में, प्रीडिपोसाइट्स को अलग-थलग किया जाता है और धारा 1 और 2 में वर्णित के रूप में चढ़ाया जाता है। जब कोशिकाएं संकुचित हो जाती हैं, तो उन्हें धारा 4 में वर्णित अंतर करने के लिए प्रेरित किया जाता है जब तक कि वे टर्मिनल भेदभाव तक नहीं पहुंच जाते हैं और बायोनेरेगेटिक्स विश्लेषण के लिए तैयार होते हैं। यह प्रक्रिया 24-अच्छी प्लेट प्रारूप के लिए आम है, लेकिन 96-अच्छी प्लेटों के लिए कम है।

Figure 1
चित्रा 1:वसा पैड का संग्रह और प्रसंस्करण। (ए)प्राथमिक सफेद (ऊपर) और भूरे (नीचे) आदिपोसाइट अलगाव का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (ख)चमड़े के नीचे सफेद (ऊपर) और भूरे (नीचे) आदिपोज डिपो । पी0 चूहों में, चमड़े के नीचे वाट लगभग अदृश्य है, लेकिन जन्म के बाद ~ दिन 2 पर अलग हो जाता है। इसके विपरीत, बैट का पी0 में भी एक अलग गहरा रंग है। पुराने पिल्ले में, बैट वाट की एक पतली सतही परत से घिरा हुआ है, जिसे ऊतक विच्छेदन होने पर हटाने की आवश्यकता होती है। (ग)प्रारंभिक वॉश के बाद, 100 माइक्रोन सेल छलनी के माध्यम से छानने के बाद प्राथमिक सफेद और भूरे रंग की अग्रदूत कोशिकाओं की प्रतिनिधि छवियां, और अलगाव के बाद 24 घंटे। स्केल बार = 100 माइक्रोन। संक्षिप्त रूप: वाट = सफेद आदिपोज ऊतक; बैट = भूरे रंग के एडीपोज ऊतक। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2-एडिपोसाइट जनकों का अंतर। (ए)प्रति नवजात (पी0) पिल्ला प्राप्त चमड़े के नीचे वाट और बैट प्रीडिपोाइट्स की औसत संख्या । (ख)मरणासन्न विभेदित सफेद और भूरे रंग के आदिपोसाइट्स की प्रतिनिधि छवियां । फ्लोरेसेंस इमेजिंग के लिए, कोशिकाओं को नील लाल और Hoechst ३४२ के साथ क्रमशः बेअसर लिपिड और नाभिक दाग के साथ इनक्यूबेटेड किया गया । स्केल बार = 100माइक्रोन(सी)शास्त्रीय एडीपोसाइट मार्कर, सफेद-बेज मार्कर, और प्राथमिक सफेद और भूरे रंग के एडीपोसाइट्स में भूरे रंग के विशिष्ट मार्कर का जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण 6 दिनों (एन = 3) के लिए विभेदित है। प्रत्येक जीन के लिए, बैट अभिव्यक्ति वाट के स्तर के सापेक्ष है (1 सेट) । (D)एक माइटोकॉन्ड्रियल तनाव परीक्षण में सफेद और भूरे रंग के एडिपोसाइट्स के ओसीआर और नोरेपाइनफ्रीन (एन = 3) के जवाब में । ब्राउन एडिपोसाइट्स अपूर्ण श्वसन और नोरेपाइनफ्रीन के लिए एक मजबूत प्रतिक्रिया दिखाते हैं, जबकि सफेद एडिपोसाइट्स थोड़ा अनकपल्ड श्वसन दिखाते हैं और एड्रेनेर्गिक उत्तेजना के लिए कोई महत्वपूर्ण प्रतिक्रिया नहीं देते हैं। * पी<0.05; **p<0.01, दो पूंछ वाले छात्र के टी-टेस्टद्वारा निर्धारित किया गया है। संक्षिप्त रूप: वाट = सफेद आदिपोज ऊतक; बैट = भूरे रंग के एडीपोज ऊतक; ओसीआर = ऑक्सीजन खपत दर; ओलिगो = ओलिगोमाइसिन; एफसीसीपी = कार्बोनिल सायनाइड-4-(ट्राइफ्लोरोमेथॉक्सी) फिनिलहाइड्राजोन; RAA = रोटेनोन, एंटीमाइसिन ए; PPARγ = पेरोक्सीसोम प्रोलिफरेटर-सक्रिय रिसेप्टर गामा; Acrp30 = 30 केडीए के पूरक से संबंधित प्रोटीन; Fabp4 = फैटी एसिड बाइंडिंग प्रोटीन 4; भरमार 4 = ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर 4; Cd36 = भेदभाव 36 के क्लस्टर; Retn = प्रतिरोधी; Slc27a1 = सोल्यूट कैरियर परिवार 27 सदस्य 1; Ear2 = eosinophil-संबद्ध, रिबोन्यूलेज ए परिवार 2; Pgc1a = PPARγ कोएक्टिवेटर 1alpha; Prdm16 = सकारात्मक नियामक डोमेन आई-बाइंडिंग फैक्टर 1 (पीआरडीआई-बीएफ 1) और रेटिनोब्लास्टोमा प्रोटीन-इंटरैक्टिंग जिंक फिंगर जीन 1 (आरआई1) समरूप डोमेन जिसमें 16; Eva1 = एपिथेलियल वी-जैसे एंटीजन 1; Cidea = सेल मौत-उत्प्रेरण डीएनए विखंडन कारक-अल्फा की तरह प्रभावक एक; Ucp1 = अनकपलिंग प्रोटीन 1; डियो2 = टाइप 2 डिओडिनेस। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

प्रणालीगत इंसुलिन संवेदनशीलता और ग्लूकोज हो्योस्टेसिस20के लिए एडीपोज ऊतक महत्वपूर्ण है । मोटापा से जुड़े एडिपोसाइट डिसफंक्शन टाइप 2 डायबिटीज की शुरुआत से कसकर जुड़ा हुआ है । इसलिए, एडीपोज ऊतक के बुनियादी जीव विज्ञान और शरीर विज्ञान की अधिक समझ मेटाबोलिक विकारों के लिए नए उपचार के डिजाइन को सक्षम कर सकती है। वसा डिपो21, 22से अलग परिपक्व एडिपोसाइट्स के प्रत्यक्ष कार्यात्मक और प्रतिलेखन विश्लेषण के पूरक के रूपमें,सुसंस्कृत प्राथमिक एडिपोसाइट्स को आदिपोकीन के स्राव, प्रो-भड़काऊ उत्तेजनाओं के जवाब में इंसुलिन के प्रतिरोध और थर्मोजेनिक कार्यक्रम23, 24,25को शामिल करने सहित एडिपोस ऊतक रोगविज्ञान के कई पहलुओं को फिर से काटना दिखाया गया है। यद्यपि पिछले प्रोटोकॉलों ने वयस्क चूहों11, 12से एडिपोसाइट अग्रदूतों के अलगाव का वर्णन किया है, यह प्रोटोकॉल नवजात पिल्ले से कोशिकाओं के कुशल अलगाव के लिए एक विधि प्रदान करता है। यह रणनीति उच्च भेदभाव क्षमता के साथ सफेद और भूरे रंग के एडिपोसिट प्रोजेनिटर की काफी बड़ी आबादी पैदा करती है, क्योंकि प्रसवोत्तर एडीपोज डिपो अभी भी वयस्क चूहों26के आदिपोज डिपो की तुलना में अपेक्षाकृत अविभेदित हैं। इसके अलावा, इस विधि का उपयोग करके अलग की गई कोशिकाएं पहले से ही प्रतिबद्ध हैं और पूरी तरह से कार्यात्मक विभेदित एडिपोसाइट्स उत्पीड होती हैं जो परिपक्व कोशिकाओं के मार्कर व्यक्त करती हैं और लिपिड भंडारण और थर्मोजेनिक क्षमता सहित अपनी अनूठी शारीरिक विशेषताओं का प्रदर्शन करती हैं।

प्राथमिक कोशिकाओं को विट्रो में अनिश्चित काल के लिए विस्तारित नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, प्राथमिक प्रीडिपोसाइट्स संस्कृति में कई मार्गों के बाद अपनी आदिपोजेनिक क्षमता खोना शुरू कर देते हैं। यह संभावना है क्योंकि नित्य कोशिका संस्कृति के परिणामस्वरूप कम प्रतिबद्ध, अधिक प्रसारित कोशिकाओं का आंतरिक संवर्धन होता है। इस प्रकार, इस प्रोटोकॉल की एक सीमा समय की खिड़की है जिसके दौरान प्रीडिपोसाइट्स का उपयोग किया जा सकता है। यदि कोशिकाओं को अलगाव के समय से 7-8 दिनों के भीतर अंतर करने के लिए प्रेरित किया जाता है तो एडिपोजेनिक क्षमता पूरी तरह से संरक्षित है। Adipocyte जनक विशेष रूप से एंजाइमेटिक पाचन के लिए प्रतिरोधी हैं, लेकिन फिर भी कोलेजन उपचार को सही ढंग से समय देना महत्वपूर्ण है। ऊतकों के अतिचिकित्सा के परिणामस्वरूप कोशिका अस्तित्व कम हो सकता है और प्लेट का पालन करने के लिए कोशिकाओं की क्षमता में कमी आ सकती है। विस्तार चरण के दौरान, सफेद और भूरे रंग के प्रीडिपोसाइट्स दोनों दृढ़ता से पालन कर रहे हैं और जोरदार वॉश और लगातार मीडिया एक्सचेंज बर्दाश्त कर सकते हैं। हालांकि, लेपित प्लेटों के उपयोग की सिफारिश की जाती है जब प्रीडिपोसाइट्स को अलग करने के लिए प्रेरित किया जाता है। परिपक्व, लिपिड से लदे एडिपोसाइट्स ने सतह आसंजन और सेल-सेल इंटरैक्शन में कमी की है, जिसके परिणामस्वरूप भेदभाव के दौरान अलग होने की प्रवृत्ति होती है जब तक कि धीरे-धीरे संभाला न जाए। प्रोटोकॉल का सबसे नाजुक कदम भेदभाव का शामिल करना है । एफबीएस, इंसुलिन, टी 3, और अन्य दवाओं का परीक्षण किया जाना चाहिए, और उनकी अंतिम सांद्रता अनुकूलित, भेदभाव की उच्चतम सीमा प्राप्त करने के लिए। एक PPARγ एगोनिस्ट (जैसे, रोसिग्लिटाज़ोन) को भी एडीपोजेनेसिस को और प्रोत्साहित करने के लिए जोड़ा जा सकता है।

यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि भेदभाव की स्थिति को प्रायोगिक जरूरतों के अनुकूल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, आनुवंशिक या रासायनिक पुस्तकालयों के साथ स्क्रीन में प्रोटीन/यौगिकों की पहचान करने के लिए डिज़ाइन किया गया है जो सफेद और/या भूरे रंग के आदिपोसाइट भेदभाव को बढ़ाते हैं, प्रीडिपोसाइट्स को न्यूनतम अनुमेय माध्यम का उपयोग करके अंतर करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है जिसमें डीएमईएम में 10% एफबीएस और केवल १७० एनएम इंसुलिन शामिल हैं । भेदभाव कॉकटेल के प्रत्येक घटक का आकलन भेदभाव परख के लिए आदर्श परख खिड़कियों का निर्धारण करने की सिफारिश की है। टी 3 और डेक्सामेथासोन प्राथमिक सफेद और भूरे रंग के एडीपोसाइट भेदभाव के लिए अपरिहार्य हैं। ये स्थितियां नियंत्रण कोशिकाओं में भेदभाव की कम दर सुनिश्चित करेंगी, इस प्रकार परख की खिड़की में वृद्धि करेंगी और प्रो-एडिपोजेनिक कारकों का पता लगाने की क्षमता को अधिकतम करेंगी । प्राथमिक भूरे और सफेद एडीपोसाइट्स की संस्कृतियां आनुवंशिक हेरफेर और मेटाबोलिक तनाव के जवाब में एडीपोसाइट सेल-स्वायत्त कार्य से पूछताछ करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हैं जो वीवो में भूरे और सफेद एडीपोज ऊतक के अध्ययन को पूरक करने के लिए जोर देती है। इसलिए, विट्रो में एडिपोसाइट फ़ंक्शन की प्रजनन योग्य, उच्च थ्रूपुट जांच को सक्षम करने के लिए प्राथमिक प्रीडिपोसाइट्स के अलगाव और संस्कृति के लिए प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है। यहां वर्णित रणनीति प्राथमिक सफेद और भूरे रंग के प्रीडिपोसाइट्स के अध्ययन की अनुमति देती है जिसे पूरी तरह से परिपक्व एडीपोसाइट्स में विभेदित किया जा सकता है और विभिन्न प्रकार के प्रयोगात्मक जोड़तोड़ के तहत परीक्षण किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक मैड्रिड, स्पेन में सेंट्रो नैसिनल डी बायोटेक्नोलोगिया में क्रिस्टीना गोडियो, स्क्रिप्स रिसर्च इंस्टीट्यूट, ला जोला में मारी गैंटर और जॉन्स हॉपकिंस विश्वविद्यालय, बाल्टीमोर में अनास्तासिया क्राली के आभारी हैं, जो क्हान एट अल अल18के प्रारंभिक कार्य के आधार पर इस प्रोटोकॉल को अनुकूलित करने में सहायता के लिए हैं । इस काम के लिए NIH अनुदान DK1114785 और DK121196 द्वारा वित्त पोषित किया गया था ईएस

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-Isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) Sigma-Aldrich I7018
6-well plates Corning 353046
AdipoRed (Nile Red) Lonza PT-7009
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674
BenchMark Fetal Bovine Serum Gemini Bioproducts LLC 100-106
CaCl2 Sigma-Aldrich C4901
Cell strainer Fisher Scientific 22363549
Collagenase, Type 1   Worthington Biochemical Corp LS004196
ddH2O Sigma-Aldrich 6442
Dexamethasone Sigma-Aldrich D4902
DMEM Sigma-Aldrich D5030 For Bioenergetics studies
DMEM, High Glucose, Glutamax Gibco 10569010
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190144
Fatty Acid-Free BSA Sigma-Aldrich A8806
FCCP Sigma-Aldrich C2920
Gelatin Sigma-Aldrich G1890
Glucose Sigma-Aldrich G7021
HEPES Sigma-Aldrich H3375
Hoechst 33342 Invitrogen H1399
Insulin Sigma-Aldrich I6634
KCl Sigma-Aldrich P9333
NaCl Sigma-Aldrich S7653
Norepinephrine Cayman Chemical 16673
Oligomycin Sigma-Aldrich 75351
Pen/Strep Gibco 15140122
Rosiglitazone Sigma-Aldrich R2408
Rotenone Sigma-Aldrich 557368
Seahorse XFe96 FluxPak Agilent Technologies 102416-100 For Bioenergetics studies
Surgical forceps ROBOZ Surgical Instrument Co RS-5158
Surgical Scissors ROBOZ Surgical Instrument Co RS-5880
ThermoMixer Eppendorf T1317
triiodothyronine (T3) Sigma-Aldrich 642511

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References

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Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E.… More

Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. Isolation and Differentiation of Primary White and Brown Preadipocytes from Newborn Mice. J. Vis. Exp. (167), e62005, doi:10.3791/62005 (2021).

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