Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Visualisering af SARS-CoV-2 ved hjælp af Immuno RNA-fluorescens In Situ Hybridisering

Published: December 23, 2020 doi: 10.3791/62067
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,2, 1,2, 3,4, 3,4, 1
1Malopolska Centre of Biotechnology, Jagiellonian University, 2Microbiology Department Faculty of Biochemistry, Biophysics and Biotechnology, Jagiellonian University, 3Department of Cardiac, Vascular and Endovascular Surgery and Transplantology, The Medical University of Silesia in Katowice, 4Silesian Centre for Heart Diseases

Summary

Her beskriver vi en simpel metode, der kombinerer RNA-fluorescens in situ-hybridisering (RNA-FISH) med immunfluorescens for at visualisere svær akut respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA. Denne protokol kan øge forståelsen af de molekylære egenskaber ved SARS-CoV-2 RNA-værtsinteraktioner på et enkeltcellet niveau.

Abstract

Dette manuskript giver en protokol for in situ hybridisering kædereaktion (HCR) kombineret med immunfluorescens at visualisere svær akut luftvejssyndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA i celle linje og tre-dimensionelle (3D) kulturer af menneskelige luftveje epitel. Metoden tillader meget specifik og følsom visualisering af viral RNA ved at stole på HCR indledt af sonde lokalisering. Split-initiator sonder hjælpe med at forstærke signalet ved fluorescerende mærkede forstærkere, hvilket resulterer i ubetydelig baggrund fluorescens i konfokal mikroskopi. Mærkning af forstærkere med forskellige lysstofrør letter samtidig anerkendelse af forskellige mål. Dette gør det igen muligt at kortlægge infektionen i væv for bedre at forstå viral patogenese og replikation på enkeltcelleniveau. Kobling af denne metode med immunfluorescens kan gøre det lettere at forstå værtsvirusinteraktioner, herunder vekslen mellem værtseprægenom og immunresponsveje. På grund af følsom og specifik HCR-teknologi kan denne protokol også bruges som et diagnostisk værktøj. Det er også vigtigt at huske, at teknikken let kan ændres for at muliggøre påvisning af RNA, herunder ikke-kodende RNA'er og RNA-vira, der kan opstå i fremtiden.

Introduction

SARS-CoV-2 er en ny human betacoronavirus, der opstod i slutningen af 2019, hvilket forårsagede en hidtil uset pandemi et par måneder senere. Fordi virussen er ny i videnskaben, forbliver meget af dens biologi og dens indvirkning på værtsceller ukendt. Derfor er kortlægning af viruscelle- og vævstropismen under infektion vigtig, hvis dens grundlæggende biologiske egenskaber og dens virkninger på værten skal forstås. Flere teknikker bruges til at undersøge virus-host samspil, herunder biokemiske, biologiske og fysiske assays. In situ hybridisering er en almindelig metode, der anvender mærket komplementær DNA, RNA eller modificerede nukleinsyresonder, som lokaliseres til specifikke DNA- eller RNA-sekvenser i en celle eller et væv.

Der er udviklet en ny RNA-fluorescerende in situ-hybridiseringsmetode (RNA-FISH), som indeholder ændringer for at øge følsomheden ved at forstærke signal-til-støj-forholdet via en HCR1. HCR gør det muligt at studere RNA-lokalisering på et enkeltcelleniveau. På grund af dens høje specificitet, følsomhed og opløsning er denne metode nyttig ikke kun til grundlæggende videnskabelige undersøgelser, men også til anvendelsesprojekter, f.eks. For nylig blev gennemførligheden af denne metode påvist til påvisning af SARS-CoV-2 RNA lokaliseret til ciliated celler inden for fuldt differentierede 3D human luftveje epitel (HAE) kulturer2. HAE kulturer udgør en af de mest avancerede værktøjer, der anvendes til at studere virusinfektion i forbindelse med den "naturlige infektion" mikromiljø3,4.

Flere rapporter om humane coronavirus (HCoV), herunder SARS-CoV-2, fremhæver betydningen af epigenetiske modifikationer med hensyn til HCoV-infektion og patofysiologi [gennemgået i 5],f.eks. Interessant nok identificerede massespektrometrisk screening flere epigenetiske faktorer, der interagerer med SARS-CoV-2 proteome8. Mere specifikt binder nonstructural protein 5 (NSP5) sig til den epigenetiske regulator, histone deacetylase 2 og den katalytisk inaktive NSP5 (C145A) interagerer med tRNA methyltransferase 1 (24). Derudover er NSP16 methyltransferase aktivitet blokeret af methyltransferase hæmmer, sinefungin9. Den nøjagtige rolle, som disse epigenetiske faktorer spiller i COVID-19, er dog fortsat uklar. Replikering af HCoV finder sted i cytoplasmaet i den inficerede celle og udløser inflammatoriske reaktioner, der er reguleret af epigenetiske modifikationer10.

For eksempel, HCoV-229E finjustere nukleare faktor-kappa B signalering og dybt omprogrammerer værten cellulære chromatin landskab ved at øge acetylering af H3K36 og H4K5 i visse regioner11. Den mellemøstlige respiratorisk syndrom-relaterede coronavirus infektion øger niveauet af H3K27me3 og nedbryder H3K4me3 på initiativtageren regioner af delmængder af specifikke interferon-følsomme gener12. Derudover udløser viral RNA celle immunrespons, som det demonstreres for flavivirus13, retrovirus14,15og coronavirus16. De epigenetiske markører på viral RNA kan spille en rolle i anerkendelse af cellulære sensorer, som vist for m7A-methylering af human immundefektvirus-1 RNA17. Men der er stadig spørgsmål: Hvad er virkningen af SARS-CoV-2 RNA på immunresponset, og er epigenetiske mærker involveret?

Her er der beskrevet en optimeret RNA-FISH-metode kombineret med immunfluorescensanalyse af cellelinjer og 3D-væv (fuldt differentieret HAE). Selv om cytologiske metoder, såsom FISH og immunfluorescens, anvendes bredt, har denne nye generation af in situ-hybridiseringsmetode baseret på HCR aldrig været anvendt til virusdetektion (undtagen i en nylig publikation)2. Generelt kræver immunostaining og FISH følgende trin: gennemtrængning for at muliggøre indtrængen af sonder eller antistoffer; fiksering, hvori cellulært materiale er fastgjort og konserveret påvisning, hvori der anvendes antistoffer eller nukleinsyresonder og endelig montering af prøverne til visualisering.

Selv om de eksisterende protokoller deler disse generelle træk, varierer de markant med hensyn til de involverede parametre. Her er en optimeret, enkel, immuno-RNA-FISH-protokol blevet beskrevet for at detektere SARS-CoV-2 RNA i HAE kulturer og Vero celler. Teknikken omfatter følgende trin: 1) fiksering af celler med paraformaldehyd; 2) permebilisering med vaske- og rengøringsmidler eller methanol (MeOH) 3) rehydrering gennem en gradueret serie af MeOH-opløsninger (kun HAE-kulturer) 4) påvisning 5) forstærkning ved hjælp af HCR-teknologi til påvisning af SARS-CoV-2 RNA 6) immunosang og (7) billeddannelse under et konfokalt mikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Bufferforberedelse

  1. For 500 mL 2x PHEM-buffer mejetærskere 18,14 g piperazin-N,N′-bis(2-ethanesulfonsyre) (PIPES), 6,5 g 4-(2-hydroxyethyl)-1 1-piperazin ethanesulfonsyre (HEPES), 3,8 g ethylenglycoltethyleddikesyre (EGTA) og 0,99 g magnesiumsulfat (MgSO4). Gør volumen op til ~ 400 mL med destilleret vand (dH2O), rør, og justere pH til 7,0 ved hjælp af 10 M kaliumhydroxid (KOH) eller natriumhydroxid (NaOH). Lav det endelige volumen op til 500 mL, og derefter opdeles i 50 mL aliquots. Opbevares ved -20 °C, indtil det er nødvendigt.
    BEMÆRK: Bufferen er ikke klar, før pH-vinduet når 7,0.
  2. Der fremstilles en stamopløsning på 37 % m/v paraformaldehyd (PFA). For 50 mL blandes 18,5 g PFA og 35 mL dH2O i en glasflaske. Sæt flasken på en magnetisk omrører med opvarmning. Der tilsættes 900 μL 1 M KOH eller NaOH, og der omrøres, indtil opløsningen bliver klar. Lad det køle af og overføre til et 50 mL konisk centrifugerør; top op til 50 mL med dH2O. Opløsningen kan opbevares ved -20 °C, indtil det er nødvendigt.
    BEMÆRK: Formaldehyd skal håndteres i en røghætte, mens du bærer beskyttelseshandsker og en laboratoriekittel.
  3. Forbered fikseringsbuffer (3,7 % PFA bufferet med PHEM). For 50 ml kombineres 5 ml 37% PFA-opløsning, 25 ml 2x PHEM buffer og 20 ml dH2O i et 50 ml konisk centrifugerør. Opbevares ved -20 °C, indtil det er nødvendigt.
    BEMÆRK: Efter optøning kan bufferen opbevares ved 4 °C i op til 3 måneder.
  4. Forbered PBST (0,1% Tween-20 i 1x fosfat-buffered saltvand [PBS]). For 50 mL tilsættes 50 μL på 100% Tween-20 til 50 mL 1x PBS og blandes godt.
    BEMÆRK: Opløsningen kan opbevares ved stuetemperatur (RT).
  5. Forbered rehydreringsbuffere ved at kombinere MeOH/PBST i forhold til 3:1, 1:1 og 1:3 (sidste volumen på 100 mL af hver; se tabel 1).
    BEMÆRK: MeOH er meget giftig og brandfarlig. Da det kan beskadige synsnerven, skal det håndteres i en røghætte for at undgå åben ild. Da blanding af MeOH og PBST genererer en exoterm reaktion, skal du kombinere opløsningerne på is.
  6. For 1000 mL 20x SSC kombineres 175,3 g natriumchlorid (NaCl) og 88,2 g natriumcitrat i et bægerglas, og fyldes op med 800 mL dH2O. Rør indtil opløst, og juster pH til 7,2 ved hjælp af NaOH. Der tilsættes dH2O til et samlet volumen på 1000 mL, og autoklave eller filtrere gennem et 0,22 μm filter i en autoklaveret flaske.
  7. For 50 mL 5x SSCT skal du kombinere 12,5 mL 20x SSC-buffer med 37,5 mL dH2O og tilføje 50 μL på 100% Tween-20. Bland godt.
  8. For 50 mL på 50% 5x SSCT/50% PBST, kombinere 25 mL af 5x SSCT med 25 mL PBST.
  9. For 50 mL 2x SSC skal du kombinere 5 mL 10x SSC-buffer med 45 mL dH2O. Bland godt.
    BEMÆRK: Alle SSC-buffere skal opbevares på RT i mørke.

2. Måldefinition, sonder og forstærkere

  1. Brug de værktøjer, der er tilgængelige på producentens hjemmeside, til at designe forstærkere og sonder. Sørg for, at sonderne supplerer sars-coV-2 N-genets omvendte DNA-streng (supplerende figur 1).
  2. Bestem den bedste sonde sæt størrelse (et sæt på 20 sonder er tilstrækkelig til visualisering).
  3. Indstil de forstærkere, der bruges til RNA-registrering af mål.
    1. Brug HCR forstærker B1 mærket med Alexa Fluor 647.
      BEMÆRK: En HCR forstærker består metastable HCR hårnåle h1 og h2. Multiplekserede eksperimenter kan designes ved hjælp af denne protokol. Hvis dette er planlagt, skal du vælge en anden HCR-forstærker (B1, B2, ...) for hvert mål-RNA, der skal afbildes i samme prøve (f.eks. forstærker B1 for mål 1, forstærker B2 for mål 2, ...).

3. Cellekultur og infektion med SARS-CoV-2

  1. Kultur Vero (abe nyre epitelceller) celler i Dulbecco modificerede Eagle medium indeholder 5% føtal kvæg serum.
    1. Frø 50.000 celler på coverslips (nr. 1, 15 × 15 mm) i en 12-brønds plade.
  2. Forbered fuldt differentierede HAE kulturer som beskrevet18 på gennemtrængelige Transwell skær støtter med en membran (diameter = 6,5 mm) og kultur i bronkial epitel vækst medium, indtil fuldt sammenløbet.
  3. Virusinfektion
    1. Pode celler med SARS-CoV-2 ved 1000x medianvævskultur infektiøs dosis (TCID50) pr. mL
    2. Inkuber celler i 2 timer ved 37 °C.
    3. Vask celler to gange med PBS for at fjerne ubundet virus.
    4. Kulturceller i 48 timer.

4. SARS-CoV-2 RNA-FISH i Vero celler dyrket på coverslips

DAG 1

  1. Rette og gennemtrænge celler
    1. Rettelse af inficerede celler med 3,7% w/v PFA-opløsning i 1 time ved RT.
    2. Indsug 3,7% PFA-opløsningen, og vask cellerne to gange ved hjælp af 1x PBS.
    3. Gennemtræng cellerne med PBST-opløsning i 10 minutter ved RT med omrøring.
    4. Indsug PBST, og vask cellerne to gange med 1x PBS.
  2. påvisning
    1. Aspirere 1x PBS-opløsningen og vaske cellerne to gange med 2x SSC på RT.
    2. 2x SSC-opløsningen aspireres, og prøverne præhybridiseres ved at tilsætte mindst 300 μL sondehybridiseringsbuffer. De brønde, der indeholder cellerne, skal dækkes og inkuberes ved 37 °C i 30 min.
    3. Forbered sondeopløsningen ved at tilføje 1,2 pmol sondeblanding til sondens hybridiseringsbuffer.
      1. 1,2 μL af 1 μM sondebestanden anvendes til at forberede 300 μL arbejdslager.
    4. Fjern præhybridiseringsopløsningen, og overfør coverlips til et befugtet kammer.
      1. Pipette 30-50 μL sondeopløsning på parafilm for at danne individuelle dråber.
    5. Prøverne inkuberes natten over (12-18 timer) ved 37 °C.

      DAG 2
    6. Dækslet overføres tilbage til en 12-brønds plade, og overskydende sondeopløsning fjernes ved vask i 4 x 5 min. med 400 μL sondevaskbuffer ved 37 °C.
      BEMÆRK: Som et alternativ til placering af 30-50 μl aliquots på parafilm og under coverlips til inkubation tilsættes 300 μL sondeopløsning direkte til coverslips i en 12-brønds plade. Denne procedure er enklere, men kræver betydelige mængder reagenser. Sondens vaskebuffer opvarmes til 37 °C før brug. Beregn den nødvendige buffermængde, og overfør den til et 15 mL konisk centrifugerør.
    7. Vask prøver i 2 x 5 min med 5x SSCT på RT.
    8. SSCT-opløsningen på 5x med 1x PBS, og opbevar prøverne ved 4 °C, indtil de forstærkes.
  3. forstærkning
    1. 1x PBS-opløsningen fjernes fra brøndene, og der tilsættes mindst 300 μL forstærkningsbuffer til hver brønd. Inkuber prøverne i 30 minutter ved RT.
    2. Forbered hver HCR hårnål (h1 og h2) ved at snap-køling det ønskede volumen i separate rør.
      1. Til fremstilling af 300 μL forstærkningsopløsning skal der anvendes 18 pmol af hver hårnål (f.eks. til 300 μL anvendes 6 μL af en hårnåleopløsning på 3 μM).
      2. Overfør hårnåleopløsningen til rør.
      3. Inkuber ved 95 °C i 90 s.
      4. Cool til RT i 30 minutter i mørke.
    3. Forbered en hårnål blanding ved at tilføje snap-afkølet "h1" og "h2" hårnåle til forstærkning buffer.
    4. Sæt dråber på 30-50 μL hårnåleblanding på parafilm.
    5. Inkuber prøverne natten over (12-18 timer) i mørke på RT.

      DAG 3
    6. Overfør coverslips tilbage i 12 godt plade, og fjerne overskydende hårnåle ved vask i 5 x 5 min med 5x SSCT på RT med omrøring.
    7. Aspirere 5x SSCT buffer, og erstatte den med 1x PBS.
      BEMÆRK: Brug om nødvendigt RNA-FISH-prøverne i en standard immunfluorescensanalyse efterfulgt af farvning af kerner (se afsnit 5).
  4. Nuklear farvning og glidemontering
    1. 1x PBS-opløsningen aspireres, og den erstattes med 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 0,2 μg/mL) i 1x PBS-opløsning.
    2. Inkuber prøverne i 10 minutter ved RT i mørke.
    3. Indsug DAPI-opløsningen, og vask cellerne to gange med 1x PBS.
    4. Der anbringes to dråber på hver 10 μL monteringsmedium; sikre, at dråberne er adskilt tilstrækkeligt til, at to coverlips kan placeres på et enkelt dias.
    5. Fjern overskydende væske ved at trykke på coverlips på et rent håndklæde, og læg dem derefter i antifade monteringsmedie med cellerne nedad.
    6. Placer de monterede prøver på en tør, flad overflade i mørke og lad dem helbrede.
    7. Efter hærdning forsegles kanterne af dækslet med VALAP-fugemasse eller neglelak for at forhindre, at prøverne tørrer ud.

5. SARS-CoV-2 RNA-FISK i HAE kulturer

DAG 1

  1. Fastsættelse og gennemtrængning af HAE-kulturen
    1. Indsug mediet, og fix de inficerede celler ved hjælp af 3,7% PFA opløsning til 1 time på RT.
    2. Indsug 3,7% PFA-opløsningen, og vask cellerne to gange med 1x PBS.
      1. Udskift 3,7% PFA-opløsningen med 1x PBS under et Transwell-skær.
    3. PBS kasseres, og prøverne dehydreres med 2 x 5 min. vaskes med 100% MeOH prechilled til -20 °C.
    4. Efter den anden vask skal bufferen udskiftes med frisk, kølet MeOH til permebilisering under Transwell-indsatsen. Opbevares natten over ved -20 °C.

DAG 2

  1. rehydrering
    Rehydrere prøverne gennem en gradueret serie af MeOH/PBST-opløsninger (hver i 5 min) på is: 75% MeOH/25% PBST, 50% MeOH/50% PBST, 25% MeOH/75% PBTS og 100% PBST (to gange).
    1. Vask cellerne i 5 minutter på is med 50% 5x SSCT/50% PBST.
    2. Vask celler i 5 minutter på is med 5x SSCT.
    3. Udskift 5x SSCT-bufferen med 1x PBS.
  2. påvisning
    1. Inkuber cellerne (inde i Transwell-indsatsen) i 5 minutter på is med 100 μL sondehybridiseringsbuffer. Derefter overføres pladen til inkubator i 30 minutter ved 37 °C (præhybridisering).
      BEMÆRK: Sondens hybridiseringsbuffer skal forvarmes til 37 °C inden brug. Beregn den krævede volumen: 100 μL er nødvendig for en enkelt Transwell-indsats.
    2. Gør sondeopløsningen klar. Da 1 ml sondeopløsning kræver 4 pmol sonde, tilsættes 4 μL 1 μM sondelageropløsning til 1 ml sondehybridiseringsbuffer og blandes godt.
      BEMÆRK: Til RNA-detektion skal du bruge 100 μL sondeopløsning pr. Transwell-skær. Lad sondeopløsningen stå på is indtil slutningen af præhybridiseringstrinnet.
    3. Fjern præhybridiseringsopløsningen, og tilsæt sondeopløsningen.
    4. Cellerne inkuberes natten over (12-18 timer) ved 37 °C.

      DAG 3
    5. Overskydende sonde fjernes ved vask i 4 x 15 min. med 100 μL sondevaskbuffer ved 37 °C.
    6. Prøverne vaskes i 2 x 5 minutter med 5x SSCT ved RT.
    7. 5x SSCT udskiftes med 1x PBS, og prøverne opbevares ved 4 °C, indtil de forstærkes.
  3. forstærkning
    1. Forforstærk prøverne ved at inkubere dem med forstærkningsbuffer i 30 minutter ved RT.
    2. Forbered hver hårnål ved at snapkøle de ønskede mængder i separate rør.
      1. Til fremstilling af 500 μL forstærkningsopløsning skal der anvendes 30 pmol af hver hårnål (f.eks. til 500 μL anvendes 10 μL af 3 μM hårnåleopløsning).
      2. Overfør hårnåleopløsningen til rørene.
      3. Inkuber ved 95 °C i 90 s.
      4. Cool til RT i 30 minutter i mørke.
    3. Forbered hårnåleopløsningen ved at tilføje alle snapkølede hårnåle til 500 μL forstærkningsbuffer ved RT.
    4. Fjern forforstærkningsopløsningen, og tilsæt den komplette hårnåleopløsning.
    5. Inkuber prøverne natten over (12-18 timer) ved RT i mørke.
    6. Fjern overskydende hårnåle ved vask med 5x SSCT på RT som følger: 2 x 5 min, 2 x 15 min, og 1 x 5 min.
    7. 5x SSCT-opløsningen udskiftes med 1x PBS, og den opbevares ved 4 °C i højst 2-3 dage eller fortsættes direkte til nuklear farvning.
      BEMÆRK: Hvis det er nødvendigt, skal RNA-FISH-prøverne anvendes i en standard immunfluorescensanalyse efterfulgt af nuklear farvning (se afsnit 6).
  4. Nuklear farvning og glidemontering
    1. 1x PBS-opløsningen indsuges, og den udskiftes med DAPI-opløsning (0,2 μg/mL) i 1x PBS.
    2. Inkuber prøverne i 10 minutter ved RT i mørke.
    3. Indsug DAPI-opløsningen, og vask cellerne to gange med 1x PBS.
    4. Læg udskæringsmembranen fra Transwell-indsatsen på 10 μL antifademonteringsmedie med cellerne vendt op, og tilsæt ekstra monteringsmedium (5 μL) til membranen.
    5. Dæk membranerne med coverslips.
    6. Hærd de monterede prøver på en tør, flad overflade i mørket.
    7. Efter hærdning forsegles kanterne af dækslet med VALAP-fugemasse eller neglelak for at forhindre, at prøverne tørrer ud.

6. Immunfluorescensanalyse af Vero-celler og HAE-kulturer

BEMÆRK: Udfør immunfluorescensanalysen på dag 3 for cellelinjer eller dag 4 for HAE-kulturer. Brug en anden tilgang til hver model. Alle forskelle er tydeligt angivet.

  1. 1x PBS-opløsningen fra brøndene indsugning.
  2. Prøverne blokeres ved inkubation med 1% w/v kvægserumalbumin i PBST-opløsning i 30 minutter ved 37 °C.
  3. Forbered primære antistoffer ved at forberede passende fortyndinger i blokeringsopløsningen og inkubere.
    1. For Vero-celler på coverslips:
      1. Dråber (30-50 μL) af antistofopløsning anbringes på parafilm i et fugtighedskammer.
      2. Placer coverslips på antistof dråber med cellerne vender nedad.
    2. For HAE skal det blokerende middel i indsatsen udskiftes med antistofopløsning (100 μL), og prøverne inkuberes i et befugtet kammer.
      BEMÆRK: Juster tid og temperatur for hver inkubation med primært antistof. Typiske parametre er 2 timer ved RT eller natten over ved 4 °C.
  4. Prøverne vaskes i 3 x 5 minutter med PBST.
    1. For celler på coverslips overføres til en 12-brønds plade og tilsættes PBST-opløsning.
    2. For HAE kulturer skal antistofopløsningen erstattes med PBST-opløsning.
  5. Kontroller de tilgængelige lyskilder og filtre til konfokalt mikroskop.
  6. Vælg sekundære antistoffer i henhold til værtsarten. Vælg fluorophoreparametrene (excitation og emissionsbølgelængder, spektrumbredde og excitationseffektivitet i henhold til den tilgængelige lyskilde).
    BEMÆRK: Spektralparametre kan modelleres ved hjælp af onlineværktøjer (se Materialeoversigt).
  7. Forbered passende sekundære antistofopløsninger ved at fortynde dem med blokeringsopløsning.
  8. Inkuber med sekundære antistoffer (som i 6.3), men inkuberes i 1 time ved 37 °C.
  9. Prøverne vaskes som i trin 6.4.
  10. Nuklear farvning og glidemontering
    1. For celler på coverlips
      1. PBST suges ud, og den udskiftes med DAPI (0,2 μg/mL) i 1x PBS-opløsning.
      2. Inkuber prøverne i 10 minutter ved RT i mørke.
      3. Indsug DAPI-opløsningen, og vask cellerne to gange med 1x PBS.
      4. Dækslet anbringes på dråber på 10 μL monteringsmedium med cellerne nedad.
      5. Forsegl coverlips med neglelak.
    2. For HAE kulturer
      1. 1x PBST suges ud, og den udskiftes med DAPI (0,2 μg/mL) i 1x PBS-opløsning.
      2. Inkuber prøverne i 10 minutter ved RT i mørke.
      3. Indsug DAPI-opløsningen, og vask cellerne to gange med 1x PBS.
      4. Læg udskæringsmembranerne på dråber på 10 μL monteringsmedium med cellerne vendt mod, og tilsæt ekstra (5 μL) monteringsmedium til membranen.
      5. Dæk membranerne med coverslips.
      6. Forsegl coverlips med neglelak.

7. Confocal mikroskopi

  1. Definer sporene ved at angive de anvendte fluorophorer.
  2. Vælg scanningstilstand og hastighed.
  3. Juster lasereffekt-, forstærknings- og forskydningsværdierne for hver fluorophore ved at sammenligne dem med de respektive negative kontroller: for virus, mock-inficerede celler; for cellulære proteiner, prøver, der er farves med isotypekontrolantistoffer fra en passende vært.
  4. Hvis du vil hente et 3D-billede, skal du aktivere z-stack-tilstand og angive de øverste og nederste grænser. Angiv trinstørrelsen/-tallet.
    BEMÆRK: Du kan finde flere oplysninger om coronavirus-billeddannelse under19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den immuno-RNA-FISH-protokol, der er beskrevet i dette manuskript, blev udført ved hjælp af to cellulære systemer: en Vero-cellelinje og en 3D HAE-kultur. De vigtigste trin for begge mobilmodeller er vist i tabel 2. RNA-FISH-protokollen til visualisering af SARS-CoV-2 i HAE-kulturer omfatter trin, der er typiske for vævsprøver, dvs. gennemtrængning med 100% MeOH og rehydrering gennem en gradueret serie af MeOH-PBS og 0,1% Tween-opløsninger. Immunfluorescens blev udført efter RNA-FISH var færdig. Zstack billeder blev erhvervet og behandlet.

Figur 1 viser immuno RNA FISH i mock-inokuleret kontrol Vero celler eller celler inficeret med SARS-CoV-2. Figur 2 viser immuno RNA FISH i mock-podet kontrol HAE kulturer eller kulturer inficeret med SARS-CoV-2. Figur 3 viser optimering af permeabiliseringsprotokollen i Vero-celler: 70% ethanol natten over ved -20 °C eller 0,1% Tween-20 i PBS i 5 minutter ved RT. Permeabilisering med vaskemiddel resulterer i et klart, specifikt signal for SARS-CoV-2 subgenomisk RNA, mens brug af ethanol resulterer i et sløret ufokuseret billede.

Figure 1
Figur 1: Immuno-RNA-FISH til påvisning af SARS-CoV-2 RNA og β-tubulin i Vero-celler. Lokalisering af SARS-CoV-2 subgenomisk RNA i (A) inficerede og (B) mock-podet Vero celler. Viral RNA blev visualiseret af FISH (rød). β-tubulin er plettet med antistoffer mod mus β5tubulin (1:100, natten inkubation ved 4 °C) og med Alexa fluorophore 488-konjugerede sekundære antistoffer (1:400, 1 h inkubation på RT). Nuclei blev plettet med DAPI (blå). Hvert billede er et enkelt konfokalt plan. Skalastang = 20 μm. Forkortelser: SARS-CoV-2 = alvorligt akut luftvejssyndrom coronavirus 2; FISK = fluorescens in situ hybridisering; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2:Humane luftvejs epitelceller inficeret med SARS-CoV-2. Lokalisering af SARS-CoV-2 subgenomisk RNA i (A) inficerede og (B) mock-podet HAE kulturer. Viral RNA blev visualiseret af FISH (rød). Ciliated celler visualiseres ved hjælp af antistoffer mod mus β5-tubulin (1:100, natten inkubation ved 4 °C) og med Alexa fluorophore 488-konjugerede sekundære antistoffer (1:400, 1 h inkubation på RT). Nuclei blev plettet med DAPI (blå). Hvert billede repræsenterer en maks. Skalastang = 10 μm. Forkortelser: SARS-CoV-2 = alvorligt akut luftvejssyndrom coronavirus 2; FISK = fluorescens in situ hybridisering; HAE = human luftvejsepitelet; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3:Optimering af gennemtrængningsbetingelser for Vero-celler. Permeabilisering af Vero-celler med (A) 70% ethanol og (B) med 0,1% Tween-20 i PBS. Gennemtrængning med vaskemiddel resulterer i et klart specifikt signal til SARS-CoV-2 subgenomisk RNA, mens ethanol resulterer i et sløret billede. Viral RNA vises med rødt. Nuclei blev plettet med DAPI (blå). Hvert billede repræsenterer en maks. Skalastang = 10 μm. Forkortelser: SARS-CoV-2 = alvorligt akut luftvejssyndrom coronavirus 2; PBS = fosfat-bufferet saltvand; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole. Klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende figur 1: SARS-CoV-2 N gensekvens (5'-3')   Klik her for at hente denne fil.

buffer Mængden af methanol [mL] Mængden af PBST [mL]
75% MeOH/25% PBST 75 25
50% MeOH/50% PBST 50 50
25% MeOH/75% PBST 25 75
100% PBST 0 100
total 100 mL

Tabel 1: Fremstilling af gradientmethanol/PBST-opløsninger til rehydrering. For at rehydrere humane luftvejsepiteletprøver efter inkubation natten over i absolut methanol (MeOH) er det nødvendigt med en langsom udveksling af miljøet. For at gøre dette skal langsom udveksling ske ved inkubation med buffere, hvor andelen af MeOH og PBST (0,1% Tween-20 i 1x fosfat-buffered saltvand) ændres gradvist. Reagensmængder, der er tilstrækkelige til at forberede 100 ml af hver opløsning, nok til at udføre flere eksperimenter, er opført.

Modul skridt Vero-celler HAE kulturer
RNA Fluorescens in situ hybridisering (RNA FISK) fiksation (3,7% PFA) 10-40 min ved stuetemperatur eller natten over ved stuetemperatur
Gennemtrængning (PBST: 0,1% Tween-20 i 1x PBS) 10 min ved stuetemperatur (0,1% Tween-20 i 1x PBS) 2 × 5 min ved stuetemperatur
(100% MeOH) natten over ved -20 °C
rehydrering (Graded methanol (MeOH)/PBST) 5 x 5 min, 50% 5x SSCT/PBST vask 5 min, 5x SSCT vask 5 min på is
Registrering (præ-hybridisering) (Probe hybridiseringsbuffer) 30 min ved 37 °C, 200-300 μL (Sondehybridiseringsbuffer) 5 min på is, derefter 30 min ved 37 °C, 100 μL
påvisning (Sondeopløsning) 12-18 timer ved 37 °C, 30 - 50 μL (Sondeopløsning) 12-18 timer ved 37 °C, 100 μL
Sonde vask (Sonde vask buffer) 4 x 5 min (Sonde vaskebuffer) 4 x 15 min
(5 × SSCT) 2 x 5 min.
Forstærkning (forforstærkning) (Forstærkningsbuffer) 30 minutter ved stuetemperatur, 200-300 μL (Forstærkningsbuffer) 30 minutter ved stuetemperatur, 100 μL
forstærkning (Forstærkeropløsning) 12-18 timer ved stuetemperatur på mørkt sted, 30-50 μL (Forstærkeropløsning) 12-18 timer ved stuetemperatur på mørkt sted, 100 μL
Forstærkere vask (5x SSCT) 5 x 5 min. (5x SSCT) 2 x 5 min, 2 x 15 min, 1 x 5 min
Immunfluorescens (IF) Blokering (1% BSA i PBST) 30 min ved 37 °C
Primær kuvøsning af antistoffer (Antistofopløsning af apropriatkoncentration i blokeringsopløsning) 2 timer ved stuetemperatur/overnatning ved 4 °C, 30-50 μL (Antistofopløsning af apropriatkoncentration i blokeringsopløsning) 2 timer ved stuetemperatur/overnatning ved 4 °C, 100 μL
Primær antistofvask (PBST) 3 x 5 min ved stuetemperatur
Sekundær inkubation af antistoffer (Antistofopløsning af apropriatkoncentration i blokeringsopløsning) 1 h ved 37 °C, 30-50 μL (Antistofopløsning med passende koncentration i blokeringsopløsning) 1 h ved 37 °C, 100 μL
Sekundær antistofvask (PBST) 3 x 5 min ved stuetemperatur
Nuklear farvning (DAPI opløsning) 10 min ved stuetemperatur, derefter 2 x 5 min med 1x PBS

Tabel 2: Arbejdsgang for Immuno-RNA-FISH-protokollen i cellelinjer og HAE-kulturer. Immuno-RNA-FISH er mulig i begge cellulære modeller, men kræver forskellige tilgange. De vigtigste trin vises sammen med de anvendte buffere (i parentes) efterfulgt af inkubationsvarighedens varighed og temperatur. I flere trin gives der kritiske forskelle i mængden af inkubationsreagens pr. prøve for at forenkle beregningerne. Hvis volumenet ikke er specificeret, vælges det vilkårligt, så det helt dækker prøven (normalt 200 μL) med omrøring. Forkortelser: FISH = fluorescens in situ hybridisering; HAE = human luftvejsepitelet; PFA = paraformaldehyd; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole; BSA = bovin serumalbumin; PBS = fosfat-bufferet saltvand; MeOH = methanol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Immuno-RNA-FISH er en pålidelig metode til dobbelt farvning af RNA og cellulære proteiner. Her er der beskrevet en modificeret immuno-RNA-FISH-protokol, der gør det muligt at detektere SARS-CoV-2 RNA og cellulære proteiner i cellelinjer og HAE-kulturer. Denne protokol kan tilpasses til brug i forskellige cellemodeller, herunder cellemonomerer eller specifikke væv. Metoden bygger på begrebet en HCR indledt af passende sonde lokalisering. Dernæst resulterer brugen af split-initiator sonder til at begynde forstærkning af signalet af fluorescerende mærkede forstærkere i minimal-til-ingen baggrund fluorescens, når observeret ved hjælp af et konfokalt mikroskop. Forstærkere kan mærkes med forskellige fluorescerende farvestoffer og er kompatible med forskellige sonder designet til at genkende forskellige mål; derfor kan de anvendes samtidigt. De procedurer, der er beskrevet i denne protokol, er enkle, men tidskrævende (3-4 dage). Ikke desto mindre er resultaterne kendetegnet ved et lavt støj-til-signal-forhold, i modsætning til andre protokoller, der bruger direkte mærkede fluorescerende sonder.

Vero celler og HAE kulturer blev brugt her. Der kræves forskellige protokoller for celler på en coverlip og celler i vævskultur. De fleste af forskellene opstår ved håndtering af cellerne (hvad enten det er på coverslip eller en membran) og mængden af anvendt materiale. Generelle RNA-FISH-protokoller kræver gennemtrængning ved hjælp af ethanol- eller methanolopløsninger samt en inkubation natten over ved -20 °C. Det er vigtigt, at brug af vaskemiddel til permeabilisering er mere gavnligt for immunfluorescens, forkorter proceduren med 1 dag og giver mulighed for mere effektiv planlægning af eksperimentet. Den primære fremgangsmåde var at følge generelle protokoller, der omfattede gennemtrængning med alkohol eller vaskemiddel for at se, om der var uønskede virkninger. Det er vigtigt, at permeabilisering af Vero-celler fra den ene dag til den anden med 70 % ethanolopløsning resulterede i et uspecifikt, sløret signal. I modsætning hertil muliggjorde permeabilisering med Tween20 klar og specifik visualisering af SARS-CoV-2 RNA og forkortede protokollen med 1 dag (figur 3).

Den samme fremgangsmåde blev afprøvet på HAE-kulturer efter inkubation natten over med absolut methanol ved -20 °C (i henhold til generelle RNA-FISH-protokoller for vævsprøver) og 0,1% Tween20 i 5 minutter ved RT. Inkubation med Tween20 resulterede i et ikke-specifikt signal, som diskvalificerer dette reagens (data ikke vist). Overnight inkubation med methanol førte til et meget specifikt signal uden artefakter. Det er vigtigt, at løsrivelsen af Transwell-membranen blev observeret, fordi methanol opløste limen. Dette problem blev håndteret ved at løsne membranen og fortsætte med coverslip-protokollen. Klassiske RNA-FISH-procedurer bruger proteinase K til at forbedre følsomheden, da dette fjerner proteiner og rydder RNA-proteinkomplekser, hvilket gør cellerne gennemtrængelige af kemikalier og farvestoffer. Denne protokol udeladt dette trin som proteinase K forhindrer protein farvning. Der blev ikke observeret nogen forskelle i RNA-FISH's følsomhed, når proteinase K var fraværende (data blev ikke vist).

Udførelse af immunfluorescensanalyser efter RNA-FISH påvirkede ikke RNA-signalet og resulterede i en vellykket kombination af begge metoder. Derfor repræsenterer den komplette protokol en bekvem måde at visualisere RNA og dets interaktioner med proteiner på enkeltcelleniveau. Det skal bemærkes, at fiksering af celler (der kræves til immuno-RNA-FISH) ikke tillader time-lapse-eksperimenter at undersøge dynamiske hændelser på enkeltcelleniveau. Visualisering af SARS-CoV-2 RNA gør det muligt at analysere SARS-CoV-2-replikation i en celle og, når det kombineres med immunfluorescens, gør det muligt at studere intracellulær SARS-CoV-2 RNA/host proteininteraktioner, herunder samspil med epigenomet. Endelig har denne protokol en bred vifte af applikationer, herunder påvisning af SARS-CoV-2 og andre nye vira ved enkeltcelleopløsning. Takket være følsom og specifik HCR-teknologi kan den også bruges som et diagnostisk værktøj.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af Ministeriet for Videnskab og Videregående Uddannelse for forskning i SARS-CoV-2 og af tilskud fra National Science Center (tilskud UMO2017/27/B/NZ6/02488 til K.P. og UMO-2018/30/E/NZ1/00874 til A.K.-P.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Confocal Microscope LSM 880 ZEISS
Grant Bio, Mini Rocker- Shaker Fisher Scientific 12965501
Incubator Galaxy170R New Brunswick CO170R-230-1000
Thermomixer Comfort Eppendorf 5355 000 011
Materials
15 mm x 15 mm NO. 1 coverslips LabSolute 7695022
1.5 mL tubes FL-MEDICAL 5.350.023.053
12-well plate TTP 92412
Conical centrifuge tube Sarstedt 5.332.547.254
parafilm Sigma P7793-1EA
serological pipets VWR Collection 612-5523P, 612-5827P
slide glass PTH CHEMLAND 04-296.202.03
Transwell ThinCerts Grainer bio-one 665641
Reagents
Alexa fluorophore 488-conjugated secondary antibodies Invitrogen
β5-tubulin Santa Cruz Biotechnology sc-134234
DAPI Thermo Scientific D1306
Disodium phosphate Sigma S51136-500G
EGTA BioShop EGT101.25
HCR Amplification Buffer Molecular Instruments, Inc. BAM01522 Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information
HCR amplifier B1-h1 Alexa Fluor 647 Molecular Instruments, Inc. S013922
HCR amplifier B1-h2 Alexa Fluor 647 Molecular Instruments, Inc. S012522
HCR Probe Hybridization Buffer Molecular Instruments, Inc. BPH03821 Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information
HCR probe set for SARS-CoV-2 Ncapsid Molecular Instruments, Inc. PRE134
HCR Probe Wash Buffer Molecular Instruments, Inc. BPW01522 Buffer can be also prepared doi:10.1242/dev.165753: Supplementary information
HEPES BioShop HEP001.100
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma 63138-250G
Methanol Sigma 32213-1L-M
Monopotassium phosphate Sigma P5655-100G
Paraformaldehyde Sigma P6148-1KG
PIPES BioShop PIP666.100
Potassium Chloride Sigma P5405-250G
Prolong Diamond Antifade Mounting Medium Invitrogen P36970
Sodium Chloride BioShop SOD001.5
Trisodium Citrate 2-hydrate POCH 6132-04-3
Tween-20 BioShop TWN580.500
Software
Fluorescence Spectraviewer Modeling spectral parameters
ImageJ Fiji Acquiring and processing z-stack images

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Choi, H. M. T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145, (2018).
  2. Milewska, A., et al. Replication of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 in human respiratory epithelium. Journal of Virology. 94, (2020).
  3. Banach, B. S., et al. Human airway epithelial cell culture to identify new respiratory viruses: coronavirus NL63 as a model. Journal of Virological Methods. 156 (1-2), 19-26 (2009).
  4. Milewska, A., et al. Entry of human coronavirus NL63 into the cell. Journal of Virology. 92, (2018).
  5. El Baba, R., Herbein, G. Management of epigenomic networks entailed in coronavirus infections and COVID-19. Clinical Epigenetics. 12, 118 (2020).
  6. Pinto, B. G. G., et al. ACE2 expression is increased in the lungs of patients with comorbidities associated with severe COVID-19. Journal of Infectious Diseases. 222 (4), 556-563 (2020).
  7. Verdecchia, P., Cavallini, C., Spanevello, A., Angeli, F. The pivotal link between ACE2 deficiency and SARS-CoV-2 infection. European Journal of Internal Medicine. 76, 14-20 (2020).
  8. Gordon, D. E., et al. A SARS-CoV-2 protein interaction map reveals targets for drug repurposing. Nature. 583, 459-468 (2020).
  9. Ferron, F., Decroly, E., Selisko, B., Canard, B. The viral RNA capping machinery as a target for antiviral drugs. Antiviral Research. 96 (1), 21-31 (2012).
  10. Mehta, S., Jeffrey, K. L. Beyond receptors and signaling: epigenetic factors in the regulation of innate immunity. Immunology and Cell Biology. 93 (3), 233-244 (2015).
  11. Poppe, M., et al. The NF-kappaB-dependent and -independent transcriptome and chromatin landscapes of human coronavirus 229E-infected cells. PLoS Pathogens. 13, 1006286 (2017).
  12. Schafer, A., Baric, R. S. Epigenetic landscape during coronavirus infection. Pathogens. 6 (1), 8 (2017).
  13. Carletti, T., et al. Viral priming of cell intrinsic innate antiviral signaling by the unfolded protein response. Nature Communications. 10, 3889 (2019).
  14. Heil, F., et al. Species-specific recognition of single-stranded RNA via toll-like receptor 7 and 8. Science. 303 (5663), 1526-1529 (2004).
  15. Sze, A., et al. Host restriction factor SAMHD1 limits human T cell leukemia virus type 1 infection of monocytes via STING-mediated apoptosis. Cell Host and Microbe. 14 (4), 422-434 (2013).
  16. Kikkert, M. Innate immune evasion by human respiratory RNA viruses. Journal of Innate Immunity. 12, 4-20 (2020).
  17. Kennedy, E. M., et al. Posttranscriptional m(6)A editing of HIV-1 mRNAs enhances viral gene expression. Cell Host and Microbe. 22 (6), 830 (2017).
  18. Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Human Cell Culture Protocols in Methods in Molecular Medicine. 107, 183-206 (2005).
  19. Milewska, A., Owczarek, K., Szczepanski, A., Pyrc, K. Visualizing coronavirus entry into cells. Methods in Molecular Biology. 2203, 241-261 (2020).

Tags

Immunologi og infektion Problem 166 SARS-CoV-2 RNA-FISH Hybridisering kædereaktion Immunofluorescens Human Airway Epithelium (HAE) Permeabilization Konfokal mikroskopi
Visualisering af SARS-CoV-2 ved hjælp af Immuno RNA-fluorescens In Situ Hybridisering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kula-Pacurar, A., Wadas, J., Suder,… More

Kula-Pacurar, A., Wadas, J., Suder, A., Szczepanski, A., Milewska, A., Ochman, M., Stacel, T., Pyrc, K. Visualization of SARS-CoV-2 using Immuno RNA-Fluorescence In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (166), e62067, doi:10.3791/62067 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter