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Artículo de método

Hi-C en el núcleo en células de Drosophila

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DOI:

10.3791/62106

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15 de septiembre de 2021

 ,  ,  , 
1Departamento de Genética Molecular, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México

En este artículo

Resumen

El genoma está organizado en el espacio nuclear en diferentes estructuras que pueden revelarse a través de tecnologías de captura de conformación cromosómica. El método Hi-C en el núcleo proporciona una colección de interacciones de cromatina en líneas celulares de Drosophila en todo el genoma, que genera mapas de contacto que se pueden explorar a resolución de megabase a nivel de fragmento de restricción.

Resumen

El genoma está organizado en dominios topológicamente asociativos (TADs) delimitados por límites que aíslan las interacciones entre dominios. En Drosophila, los mecanismos subyacentes a la formación y los límites de TAD aún están bajo investigación. La aplicación del método Hi-C en el núcleo descrito aquí ayudó a diseccionar la función de los sitios de unión a proteínas arquitectónicas (AP) en los límites de TAD aislando el gen Notch. La modificación genética de los límites del dominio que causan la pérdida de AP da como resultado la fusión de TAD, defectos transcripcionales y alteraciones topológicas de largo alcance. Estos resultados proporcionaron evidencia que demuestra la contribución de los elementos genéticos a la formación de límites de dominio y al control de la expresión génica en Drosophila. Aquí, se ha descrito en detalle el método Hi-C en el núcleo, que proporciona puntos de control importantes para evaluar la calidad del experimento junto con el protocolo. También se muestran los números requeridos de lecturas de secuenciación y pares Hi-C válidos para analizar las interacciones genómicas a diferentes escalas genómicas. La edición genética mediada por CRISPR/Cas9 de elementos reguladores y el perfil de alta resolución de las interacciones genómicas utilizando este protocolo Hi-C en el núcleo podrían ser una combinación poderosa para la investigación de la función estructural de los elementos genéticos.

Introducción

En los eucariotas, el genoma se divide en cromosomas que ocupan territorios específicos en el espacio nuclear durante la interfase1. La cromatina que forma los cromosomas se puede dividir en dos estados principales: uno de cromatina accesible que es transcripcionalmente permisiva, y el otro de cromatina compacta que es transcripcionalmente represiva. Estos estados de cromatina segregan y rara vez se mezclan en el espacio nuclear, formando dos compartimentos distintos en el núcleo2. En la escala sub-megabase, los límites separan los dominios de las interacciones de cromatina de alta frecuencia, llamadas TADs, que marcan la organización cromosómica3,4,5. En los mamíferos, los límites tad están ocupados por la cohesina y el factor de unión a CCCTC (CTCF)6,7,8. El complejo de cohesina extruye la cromatina y se detiene en los sitios de unión a CTCF que se disponen en una orientación convergente en la secuencia genómica para formar bucles de cromatina estables9,10,13,14. La alteración genética del sitio de unión al ADN de CTCF en los límites o la reducción de la abundancia de CTCF y proteína de cohesina da como resultado interacciones anormales entre los elementos reguladores, la pérdida de la formación de TAD y la desregulación de la expresión génica9,10,11,13,14.

En Drosophila, los límites entre los TADs están ocupados por varios AP, incluyendo el factor asociado al elemento límite 32 kDa (BEAF-32), la proteína de unión al Motivo 1 (M1BP), la proteína centrosómica 190 (CP190), el supresor del ala peluda (SuHW) y el CTCF, y están enriquecidos en modificaciones activas de histonas y polimerasa II16,17,18. Se ha sugerido que en Drosophila, los TADs aparecen como consecuencia de la transcripción13, 17,19,y el papel exacto de los AP independientes en la formación de límites y las propiedades de aislamiento aún está bajo investigación. Por lo tanto, queda por caracterizar completamente si los dominios en Drosophila son una consecuencia exclusiva de la agregación de regiones de estados transcripcionales similares o si los AP, incluido el CTCF, contribuyen a la formación de límites. La exploración de contactos genómicos a alta resolución ha sido posible a través del desarrollo de tecnologías de captura de conformación cromosómica junto con la secuenciación de próxima generación. El protocolo Hi-C se describió por primera vez con la etapa de ligadura realizada "en solución"2 en un intento de evitar productos de ligadura espurios entre fragmentos de cromatina. Sin embargo, varios estudios apuntaron a la comprensión de que la señal útil en los datos provenía de productos de ligadura formados en núcleos parcialmente lisados que no estaban en la solución20,21.

El protocolo se modificó para realizar la ligadura dentro del núcleo como parte del experimento Hi-C unicelular22. El protocolo Hi-C en el núcleo se incorporó posteriormente a la población celular Hi-C para producir una cobertura más consistente en todo el rango de distancias genómicas y producir datos con menos ruido técnico23,24. El protocolo, descrito en detalle aquí, se basa en el protocolo Hi-C de la población en el núcleo23,24 y se utilizó para investigar las consecuencias de eliminar genéticamente los motivos de unión al ADN para CTCF y M1BP de un límite de dominio en el locus del gen Notch en Drosophila25. Los resultados muestran que la alteración de los motivos de unión al ADN para los AP en el límite tiene consecuencias drásticas para la formación del dominio Notch, defectos topológicos más grandes en las regiones que rodean el locus Notch y la desregulación de la expresión génica. Esto indica que los elementos genéticos en los límites del dominio son importantes para el mantenimiento de la topología del genoma y la expresión génica en Drosophila25.

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Protocolo

1. Fijación

  1. Comience con 10 millones de células de la línea 2 plus (S2R+) de Schneider para preparar 17,5 ml de suspensión celular en medio Schneider que contenga un 10% de suero fetal bovino (FBS) a temperatura ambiente (RT).
  2. Añadir formaldehído libre de metanol para obtener una concentración final del 2%. Mezclar e incubar durante 10 min en RT, teniendo cuidado de mezclar cada minuto.
    NOTA: El formaldehído es un producto químico peligroso. Siga las normas de salud y seguridad apropiadas, y trabaje en la campana de humos.
  3. Apaga la reacción añadiendo glicina para conseguir una concentración final de 0,125 M y mezclar. Incubar durante 5 min en RT, seguido de 15 min en hielo.
  4. Centrifugadora durante 400 × g a RT durante 5 min y luego durante 10 min a 4 °C; deseche el sobrenadante. Resuspenda el pellet cuidadosamente en 25 ml de solución salina fría tamponada con fosfato 1x.
  5. Centrifugar a 400 × g durante 10 min a 4 °C, luego desechar el sobrenadante.
    NOTA: Si continúa con el protocolo, vaya al paso 2.1 para la lisis; de lo contrario, congele el pellet en líquido N2 y guárdelo a -80 °C.

2. Lisis

  1. Resuspend las células en 1 mL de tampón de lisis helado-frío (10 mM Tris-HCl, pH 8; 0,2% de surfactante no iónico (ver la Tabla de Materiales);10 mM NaCl; 1x inhibidores de la proteasa), y ajustar el volumen a 10 mL con tampón de lisis helado. Ajustar el volumen para obtener una concentración de 1 × 106 células/ml. Incubar en hielo durante 30 min, mezclando cada 2 min invirtiendo los tubos.
  2. Centrifugar los núcleos a 300 × g durante 5 min a 4 °C, y luego desechar cuidadosamente el sobrenadante. Lave el pellet 1x con 1 ml de tampón de lisis en frío y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga. Lave el pellet 1x con 1 mL de tampón de restricción frío de 1.25x, y vuelva a gastar cada pellet de célula en 360 μL de tampón de restricción de 1.25x.
  3. Añadir 11 μL de dodecil sulfato de sodio (SDS) al 10% por tubo (concentración final del 0,3%), mezclar cuidadosamente mediante pipeteo e incubar a 37 °C durante 45 min, agitando a 700-950 rpm. Pipetee hacia arriba y hacia abajo para interrumpir los grumos varias veces durante la incubación.
  4. Snchs el SDS añadiendo 75 μL de surfactante no iónico (solución al 10%, véase la Tabla de Materiales)por tubo (concentración final del 1,6%) e incubar a 37 °C durante 45 min, agitando a 950 rpm. Pipetee hacia arriba y hacia abajo varias veces para interrumpir los grupos durante la incubación.
    NOTA: Si los grupos son grandes y difíciles de interrumpir, disminuya la velocidad de rotación a 400 rpm durante los tratamientos con SDS y surfactante. Si los grupos son difíciles de desagregar mediante pipeteo, divida la muestra en dos; ajustar los volúmenes de tampón de restricción, SDS y surfactante; y proceder a la permeabilización. A continuación, gire los núcleos a una velocidad mínima (200 × g),deseche cuidadosamente el sobrenadante, aglutina las muestras en un tampón de restricción 1X y proceda con la digestión. Tome una alícuota de 10 μL como muestra no digerída (UD).

3. Digestión enzimática

  1. Digiera la cromatina añadiendo 200 unidades (U) de Mbo I por tubo, e incube a 37 °C durante un período que va desde 4 h hasta durante la noche mientras gira (950 rpm).
  2. Al día siguiente, agregue 50 U adicionales de Mbo I por tubo e incube a 37 ° C durante 2 h mientras gira (950 rpm).
  3. Inactivar la enzima incubando los tubos a 60 °C durante 20 min. Coloque los tubos sobre hielo.
    NOTA: Tome una alícuota de 10 μL como muestra digerida (D).

4. Biotinilación de los extremos del ADN

  1. Para rellenar los voladizos de fragmentos de restricción y etiquetar los extremos de ADN con biotina, agregue 1.5 μL cada uno de 10 mM dCTP, dGTP, dTTP, 20 μL de 0.4 mM de biotina dATP, 17.5 μL de tampón Tris low-EDTA (TLE) [10 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, pH 8.0] y 10 μL de 5 U / μL de Klenow (fragmento grande de ADN polimerasa I) a todos los tubos. Mezclar cuidadosamente e incubar durante 75 min a 37 °C. Agitar a 700 rpm cada 10 s durante 30 s. Coloque todos los tubos sobre hielo mientras prepara la mezcla de ligadura.

5. Ligadura

  1. Transfiera cada mezcla de cromatina digerida a un tubo separado de 1 ml con mezcla de ligadura (100 μL de tampón de ligadura 10x, 10 μL de albúmina sérica bovina de 10 mg/ml, 15 U de ligasa de ADN T4 y 425 μL de agua de doble destilación [ddH2O]). Mezclar bien mediante pipeteo suave e incubar durante la noche a 16 °C.

6. Reversión de reticulación y purificación de ADN

  1. Degradar las proteínas añadiendo 50 μL de 10 mg/ml de proteinasa K por tubo, e incubar a 37 °C durante 2 h. Reticula los enlaces cruzados aumentando la temperatura a 65 °C e incuba durante la noche.
  2. Degradar el ARN añadiendo 20 μL de 10 mg/ml de RNasa A, e incubar a 37 °C durante 1 h.
  3. Realizar extracción de fenol:cloroformo seguida de precipitación de etanol.
    1. Añadir 1 volumen de fenol-cloroformo, y mezclar bien por inversión para obtener una fase blanca homogénea.
      NOTA: El fenol es un químico peligroso. Siga las normas de salud y seguridad apropiadas. Trabajar en la campana de humos.
    2. Centrifugadora a 15.000 × g durante 15 min. Transfiera la fase acuosa a un tubo de microcentrífuga fresco de 2 ml. Realice una extracción posterior de la capa inferior con 100 μL de tampón TLE y transfiera la fase acuosa al mismo tubo de 2 ml.
    3. Precipitar el ADN añadiendo 2 volúmenes de alcohol etílico al 100% (EtOH), 0,1 volúmenes de acetato de sodio 3 M y 2 μL de glucógeno de 20 mg/ml. Incubar a -20 °C durante un período que va desde 2 h hasta la noche.
    4. Girar a 15.000 × g durante 30 min a 4 °C, y lavar los pellets 2x con 70% etOH helado. Seque los gránulos en RT y vuelva a sususpend en 100 μL de tampón TLE. Cuantificar el ADN utilizando un colorante fluorogénico que se une selectivamente al ADN y un fluorómetro de acuerdo con las instrucciones del fabricante(Tabla de materiales).
      NOTA: El protocolo se puede pausar aquí. Almacene los productos de ligadura a 4 °C a corto plazo o a -20 °C a largo plazo. Utilice una alícuota (100 ng) del material como muestra ligada (L) para el control de calidad.

7. Evalúe la calidad de la plantilla Hi-C

  1. Controles cualitativos de digestión y ligadura
    1. Purificar el ADN de las alícuotas UD y D invirtiendo los enlaces cruzados, y realizar la extracción de fenol:cloroformo y precipitación de etanol como se describió anteriormente.
    2. Cargue 100 ng de muestras de UD, D y L en un gel de agarosa al 1,5%. Busque un frotis centrado alrededor de 500 pb en la muestra D frente a una banda de alto peso molecular para la muestra L (ver resultados representativos).
  2. Control cuantitativo de la eficiencia de la digestión
    NOTA: Para evaluar la eficiencia de la digestión con mayor precisión, utilice las muestras UD y D como plantillas para realizar reacciones en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) utilizando cebadores diseñados de la siguiente manera.
    1. Diseñe un par de cebadores que amplifiquen un fragmento de ADN que contenga el sitio de restricción de ADN para la enzima utilizada para la digestión (Mbo I en el presente protocolo), llamado R en la fórmula del paso 7.2.3.
    2. Diseñe un par de cebadores que amplifiquen un fragmento de ADN de control que no contenga el sitio de restricción para la enzima utilizada para la digestión (Mbo I para el presente protocolo), llamado C en la fórmula del paso 7.2.3.
    3. Utilice los valores umbral de ciclo (valores ct) de la amplificación para calcular la eficiencia de restricción de acuerdo con la fórmula que se muestra a continuación:
      % restricción = 100 - 100/2{(CtR - CtC)D - (CtR - CtC)UD}
      Donde CtR se refiere al valor Ct del fragmento R, y CtC se refiere al valor Ct del fragmento C para la muestra D y la muestra UD.
      NOTA: El porcentaje de restricción refleja la eficiencia de la enzima de restricción que escinde el fragmento de ADN restringido (R) en comparación con un fragmento de ADN de control (C) que no contiene el sitio de ADN de restricción. Se recomienda una eficiencia de restricción de ≥ 80%.
  3. Detección de interacciones conocidas
    1. Realizar PCR para amplificar un control de ligadura interna para examinar interacciones de corto y/o medio o largo alcance (ver resultados representativos).
    2. Alternativamente, diseñe cebadores para amplificar un producto de ligadura en el que los cebadores estén en orientación hacia adelante-adelante o hacia atrás-hacia atrás en fragmentos de restricción adyacentes.
  4. Control de relleno y etiquetado de biotina
    1. Verificar el marcado Hi-C y la eficiencia de la ligadura mediante la amplificación y digestión de una interacción conocida o un producto de ligadura entre fragmentos de restricción adyacentes en el genoma, como se describió anteriormente.
      NOTA: El relleno y la ligadura exitosos del sitio Mbo I (GATC) generan un nuevo sitio para la enzima de restricción Cla I (ATCGAT) en la unión de ligadura y regeneran el sitio Mbo I.
    2. Digiera el producto de PCR con Mbo I, Cla I o ambos. Después de ejecutar las muestras en un gel al 1,5-2%, estimar el número relativo de uniones de ligadura 3C y Hi-C cuantificando la intensidad de las bandas cortadas y sin cortar26.
      NOTA: Se desea una eficiencia de > 70% (ver resultados representativos).

8. Sonicación

  1. Sonicar las muestras para obtener fragmentos de ADN de 200-500 pb. Para el instrumento utilizado en este protocolo (véase la Tabla de materiales),diluya la muestra (de 5 a 10 μg) en 130 μL de ddH2O por tubo, y ajuste el instrumento a sonicar a 400 pb: nivel de llenado: 10; factor de derecho: 10%; potencia máxima incidente (w): 140; ciclos por ráfaga: 200; tiempo(s): 80.

9. Eliminación de biotina / reparación final

NOTA: Los pasos que se muestran a continuación se ajustan para 5 μg de ADN Hi-C.

  1. Para realizar la eliminación de biotina, transfiera la muestra (130 μL) a un tubo de microcentrífuga fresco. Añadir 16 μL de tampón de ligadura 10x, 2 μL de dATP de 10 mM, 5 μL de ADN polimerasa T4 (15U) y 7 μL de ddH2O (160 μL de volumen total). Incubar a 20 °C durante 30 min.
  2. Añadir 5 μL de 10 mM dNTP, 4 μL de tampón de ligadura 10x, 5 μL de polinucleótido quinasa T4 (10 U/μL), 1 μL de Klenow y 25 μL de ddH2O (200 μL de volumen total). Incubar a 20 °C durante 30 min.

10. Selección de tamaño

  1. Para seleccionar fragmentos principalmente en el rango de tamaño de 250-550 pb, realice primero la selección secuencial de tamaño de inmovilización reversible en fase sólida (SPRI) con 0.6x, seguida de 0.90x de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y eluye el ADN usando 100 μL de TLE.

11. Ligadura de biotina pulldown/A-tailing/adapter

NOTA: Realice los lavados resuspensando las perlas magnéticas mediante vórtice, gire las muestras durante 3 minutos en una rueda giratoria y luego gire brevemente hacia abajo la muestra y colóquela en el soporte magnético. Deje que las cuentas se peguen al imán, deseche el sobrenadante y continúe con el siguiente paso de lavado. Realice los lavados a 55 °C en un termobloque con rotación en lugar de la rueda giratoria.

  1. Ensanar el volumen final a 300 μL por muestra con TLE para pull-down. Prepare los tampones de lavado de cuentas: 1x Tween Buffer (TB) (TB: 5 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl, 0.05% Tween), 0.5x TB, 1x No-Tween buffer (NTB) (5 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mM EDTA, 1 M NaCl), 2x NTB.
  2. Utilice 150 μL de perlas magnéticas ligadas a la estreptavidina (consulte la Tabla de materiales)por biblioteca. Lavar las perlas 2x con 400 μL de 1x TB. Luego resuspenda las perlas en 300 μL 2x NTB.
  3. Mezcle las perlas con el material Hi-C de 300 μL e incube en RT durante 30 minutos en una rueda giratoria para permitir que la biotina se una a las perlas de estreptavidina.
  4. Lavar las perlas con 400 μL de 0,5x TB, e incubar a 55 °C durante 3 min, girando a 750 rpm. Lave las perlas en 200 μL de tampón de restricción 1x.
  5. Resuspend las perlas en 100 μL de mezcla de relaves dATP (5 μL de 10 mM dATP, 10 μL de tampón de restricción 10x, 5 μL de klenow exo-, y 80 μL de ddH2O). Incubar a 37 °C durante 30 min.
  6. Retire el sobrenadante, lave las perlas 2x con 400 μL de 0,5x TB incubando a 55 °C durante 3 min y girando a 750 rpm.
  7. Lavar las perlas con 400 μL de 1x NTB y luego con 100 μL de 1x tampón de ligadura.
  8. Resuspend las perlas en 50 μL de tampón de ligadura 1x, y transfiera la suspensión a un nuevo tubo. Añadir 4 μL de adaptadores de PE precocidos (15 μM de stock) y 2 μL de ligasa T4 (400 U/μL, es decir, 800 U/tubo); incubar en RT durante 2 h.
    NOTA: Pre-anneal los adaptadores añadiendo volúmenes iguales de adaptadores PE 1.0 y PE 2.0 (stock de 30 μM) e incubando durante 10 min en RT (ver la Tabla de Materiales).
  9. Vuelva a capturar las perlas quitando el sobrenadante y lavando las perlas 2x con 400 μL de TB. Lave las perlas con 200 μL de 1x NTB, luego con 100 μL de tampón de restricción 1x, y resuspenda las perlas en 40 μL de 1x buffer de restricción.

12. Amplificación por PCR

  1. Configure PCR de 25 μL de volumen con 5, 6, 7 y 8 ciclos. Para cada PCR, utilice:
    Receta de reacción
    Cuentas Hi-C2,5 μL
    Imprimación PCR PE 10 μM 1 (Tabla de materiales)0,75 μL
    Imprimación PCR PE 10 μM 2 (Tabla de materiales)0,75 μL
    10 mM dNTP0,6 μL
    Búfer de reacción 5x5 μL
    ADN polimerasa0,3 μL
    ddH2O14,65 μL
    Total25 μL
    CiclosTemperaturaHora
    198 °C30 s
    n ciclos98 °C10 s
    65 °C30 s
    72 °C30 s
    172 °C7 minutos

13. Amplificación final por PCR

  1. Realizar la amplificación final por PCR utilizando las mismas condiciones descritas anteriormente y el número de ciclos seleccionados. Divida la muestra usando 5 μL de perlas Hi-C como plantilla en reacciones de 50 μL.
  2. Recoja todas las reacciones de PCR y transfiéralas a un tubo nuevo. Use el imán para eliminar las perlas de estreptavidina y recuperar el sobrenadante (productos de PCR). Transfiera las perlas a un tubo nuevo, lave las perlas como se indica en el paso 11.2.9 y guárdelas en un búfer de restricción 1x a 4 °C como respaldo.
  3. Purifique los productos de PCR utilizando 0,85 veces el volumen de las perlas SPRI de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Elute con 30 μL de tampón TLE.
  4. Cuantificar la biblioteca Hi-C utilizando un instrumento fluorométrico y confirmar la calidad de la biblioteca mediante electroforesis capilar basada en chip.
  5. Como último punto de control de calidad, utilice 1 μL de la biblioteca Hi-C como plantilla para realizar una reacción de PCR utilizando 10 ciclos utilizando las mismas condiciones descritas en el paso 12.1. Divida el producto de PCR en dos tubos de microcentrífuga: digiera uno con Cla I y deje el otro sin digerir como control. Ejecute los productos en un gel de agarosa al 1.5-2% (ver resultados representativos).
  6. Proceda a la secuenciación de extremo pareado de 50 pb o 75 pb en una plataforma de secuenciación adecuada.

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Resultados

A continuación se describen los resultados de un protocolo Hi-C exitoso (consulte un resumen del flujo de trabajo del protocolo Hi-C en la Figura 1A). Hay varios puntos de control de calidad durante el experimento Hi-C en el núcleo. Las alícuotas de muestra se recogieron antes (UD) y después (D) del paso de restricción de cromatina, así como después de la ligadura (L). Los enlaces cruzados se invirtieron, y el ADN se purificó y se ejecutó en un gel de agarosa. Se observó un frotis de 200-100...

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Discusión

El método Hi-C en núcleo que aquí se presenta ha permitido una exploración detallada de la topología del genoma de Drosophila a alta resolución, proporcionando una visión de las interacciones genómicas a diferentes escalas genómicas, desde bucles de cromatina entre elementos reguladores como promotores y potenciadores hasta TADs e identificación de grandes compartimentos25. La misma tecnología también se ha aplicado eficientemente a los tejidos de mamíferos con algunas modificaciones

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Divulgaciones

Los autores no declaran intereses contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la subvención número IN207319 del Programa de Apoyo a la Innovación Tecnológica y la Investigación (PAPIIT) de la UNAM y la beca número 303068 del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-FORDECyT). A.E.-L. es un estudiante de maestría apoyado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) CVU número 968128.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Solución de paraformaldehído al 16% (vol/vol)Agar ScientificR1026
Biotina-14-dATPInvitrogenCA1524-016
Enzima ClaINEBR0197S
COVARIS Ultrasonicador CovarisLE220-M220
Cut SmartNEBB72002S
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1xLife Technologies41965-039
Dynabeads MyOne Streptabidin C1Invitrogen65002
Suero fetal bovino (FBS) estéril filtradoSigmaF9665
Klenow Dna PolI fragmento grandeNEBM0210L
Klenow exo(-)NEBM0210S
Tampón de ligaduraNEBB020S
Enzima MboINEBR0147M
NP40-IgepalSIGMACA-420Tensioactivo no iónico para adición en tampón de lisis
Adaptador de PE 1.0Illumina5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG
GAATGCCGAG-3'PE
adaptador 2.0Illumina5'-ACACTCTCTCCCTACACGACGCT
CTTCCGATCT-3'PE
PCR cebador 1.0Illumina5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT
CTACACTCTTTCCCTACACGACG
CTCTTCCGATCT-3'PE
cebador de PCR 2.0Illumina5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
ATCGGTCTCGGCATCTCTGCTGA
ACCGCTCTTCCGATCT-3'Fenol
: Cloroformo:Alcohol isoamílico 25:24:1SIGMAP2069
Cebador 1 (interacción conocida, Figura 2A)Sigma5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3'Primer
2 (interacciones conocidas, Figura 2A)Sigma5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3'Tableta de cóctel de
proteasaRoche4693132001
Proteinasa KRoche3115879001
QubitThermoFisherQ33327
RNAseRoche10109142001
SPRI BeadsBeckmanB23318
T4 ADN ligasaInvitrogen15224-025
T4 ADN polimerasaNEBM0203S
T4 polinucleótido quinasa (PNK) NEBM0201L
TaqPhusionNEBM0530SADN polimerasa
Triton X-100Surfactante no iónico para el enfriamiento de SDS
inhibidores de

Referencias

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