El genoma está organizado en el espacio nuclear en diferentes estructuras que pueden revelarse a través de tecnologías de captura de conformación cromosómica. El método Hi-C en el núcleo proporciona una colección de interacciones de cromatina en líneas celulares de Drosophila en todo el genoma, que genera mapas de contacto que se pueden explorar a resolución de megabase a nivel de fragmento de restricción.
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Artículo de método
Hi-C en el núcleo en células de Drosophila
En este artículo
Resumen
Resumen
El genoma está organizado en dominios topológicamente asociativos (TADs) delimitados por límites que aíslan las interacciones entre dominios. En Drosophila, los mecanismos subyacentes a la formación y los límites de TAD aún están bajo investigación. La aplicación del método Hi-C en el núcleo descrito aquí ayudó a diseccionar la función de los sitios de unión a proteínas arquitectónicas (AP) en los límites de TAD aislando el gen Notch. La modificación genética de los límites del dominio que causan la pérdida de AP da como resultado la fusión de TAD, defectos transcripcionales y alteraciones topológicas de largo alcance. Estos resultados proporcionaron evidencia que demuestra la contribución de los elementos genéticos a la formación de límites de dominio y al control de la expresión génica en Drosophila. Aquí, se ha descrito en detalle el método Hi-C en el núcleo, que proporciona puntos de control importantes para evaluar la calidad del experimento junto con el protocolo. También se muestran los números requeridos de lecturas de secuenciación y pares Hi-C válidos para analizar las interacciones genómicas a diferentes escalas genómicas. La edición genética mediada por CRISPR/Cas9 de elementos reguladores y el perfil de alta resolución de las interacciones genómicas utilizando este protocolo Hi-C en el núcleo podrían ser una combinación poderosa para la investigación de la función estructural de los elementos genéticos.
Introducción
En los eucariotas, el genoma se divide en cromosomas que ocupan territorios específicos en el espacio nuclear durante la interfase1. La cromatina que forma los cromosomas se puede dividir en dos estados principales: uno de cromatina accesible que es transcripcionalmente permisiva, y el otro de cromatina compacta que es transcripcionalmente represiva. Estos estados de cromatina segregan y rara vez se mezclan en el espacio nuclear, formando dos compartimentos distintos en el núcleo2. En la escala sub-megabase, los límites separan los dominios de las interacciones de cromatina de alta frecuencia, llamadas TADs, que marcan l....
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Protocolo
1. Fijación
- Comience con 10 millones de células de la línea 2 plus (S2R+) de Schneider para preparar 17,5 ml de suspensión celular en medio Schneider que contenga un 10% de suero fetal bovino (FBS) a temperatura ambiente (RT).
- Añadir formaldehído libre de metanol para obtener una concentración final del 2%. Mezclar e incubar durante 10 min en RT, teniendo cuidado de mezclar cada minuto.
NOTA: El formaldehído es un producto químico peligroso. Siga las normas de salud y seguridad apropiadas, y trabaje en la campana de humos. - Apaga la reacción añadiendo glicina para conseguir una concentración final de 0,125 M y mezclar. Incubar durante 5....
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Resultados
A continuación se describen los resultados de un protocolo Hi-C exitoso (consulte un resumen del flujo de trabajo del protocolo Hi-C en la Figura 1A). Hay varios puntos de control de calidad durante el experimento Hi-C en el núcleo. Las alícuotas de muestra se recogieron antes (UD) y después (D) del paso de restricción de cromatina, así como después de la ligadura (L). Los enlaces cruzados se invirtieron, y el ADN se purificó y se ejecutó en un gel de agarosa. Se observó un frotis de 200-100.......
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Discusión
El método Hi-C en núcleo que aquí se presenta ha permitido una exploración detallada de la topología del genoma de Drosophila a alta resolución, proporcionando una visión de las interacciones genómicas a diferentes escalas genómicas, desde bucles de cromatina entre elementos reguladores como promotores y potenciadores hasta TADs e identificación de grandes compartimentos25. La misma tecnología también se ha aplicado eficientemente a los tejidos de mamíferos con algunas modificaciones
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Divulgaciones
Los autores no declaran intereses contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la subvención número IN207319 del Programa de Apoyo a la Innovación Tecnológica y la Investigación (PAPIIT) de la UNAM y la beca número 303068 del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT-FORDECyT). A.E.-L. es un estudiante de maestría apoyado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) CVU número 968128.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Solución de paraformaldehído al 16% (vol/vol) | Agar Scientific | R1026 | |
| Biotina-14-dATP | Invitrogen | CA1524-016 | |
| Enzima ClaI | NEB | R0197S | |
| COVARIS Ultrasonicador Covaris | LE220-M220 | ||
| Cut Smart | NEB | B72002S | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 1x | Life Technologies | 41965-039 | |
| Dynabeads MyOne Streptabidin C1 | Invitrogen | 65002 | |
| Suero fetal bovino (FBS) estéril filtrado | Sigma | F9665 | |
| Klenow Dna PolI fragmento grande | NEB | M0210L | |
| Klenow exo(-) | NEB | M0210S | |
| Tampón de ligadura | NEB | B020S | |
| Enzima MboI | NEB | R0147M | |
| NP40-Igepal | SIGMA | CA-420 | Tensioactivo no iónico para adición en tampón de lisis |
| Adaptador de PE 1.0 | Illumina | 5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG GAATGCCGAG-3'PE | |
| adaptador 2.0 | Illumina | 5'-ACACTCTCTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT-3'PE | |
| PCR cebador 1.0 | Illumina | 5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACACTCTTTCCCTACACGACG CTCTTCCGATCT-3'PE | |
| cebador de PCR 2.0 | Illumina | 5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG ATCGGTCTCGGCATCTCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCT-3'Fenol | |
| : Cloroformo:Alcohol isoamílico 25:24:1 | SIGMA | P2069 | |
| Cebador 1 (interacción conocida, Figura 2A) | Sigma | 5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3'Primer | |
| 2 (interacciones conocidas, Figura 2A) | Sigma | 5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3'Tableta de cóctel de | |
| proteasa | Roche | 4693132001 | |
| Proteinasa K | Roche | 3115879001 | |
| Qubit | ThermoFisher | Q33327 | |
| RNAse | Roche | 10109142001 | |
| SPRI Beads | Beckman | B23318 | |
| T4 ADN ligasa | Invitrogen | 15224-025 | |
| T4 ADN polimerasa | NEB | M0203S | |
| T4 polinucleótido quinasa (PNK) | NEB | M0201L | |
| TaqPhusion | NEB | M0530S | ADN polimerasa |
| Triton X-100 | Surfactante no iónico para el enfriamiento de SDS |
Referencias
- Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Review Genetics. 2, 292-301 (2001).
- Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interact....
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Reimpresiones y permisos
