Summary
עוברים/זחלים של דגי זברה מתפתחים חיצונית והם שקופים אופטית. הביואקומולציה של מיקרופלסטיק בדגים בשלבי חיים מוקדמים מוערכת בקלות עם מיקרוביאדות בעלות תווית פלואורסצנטית.
Abstract
כסוג חדש של מזהם סביבתי, מיקרופלסטיק נמצא באופן נרחב בסביבה הימית ומהווה איום גבוה על אורגניזמים ימיים. הביואקומולציה של מיקרופלסטיק ממלאת תפקיד מרכזי בהשפעות הרעילות שלהם; עם זאת, כחלקיקים, הביואקומולציות שלהם שונות ממזהמים רבים אחרים. המתוארת כאן היא שיטה אפשרית כדי לקבוע חזותית את הצטברות והפצה של מיקרופלסטיק בעוברים זברה או זחלים באמצעות מיקרופלסטיק פלואורסצנטי. עוברים נחשפים לריכוזים שונים (0.1, 1 ו-10 מ"ג/ליטר) של מיקרופלסטיק פלואורסצנטי בקוטר של 500 ננומטר ל-120 שעות. זה מוצג בתוצאות כי מיקרופלסטיק יכול bioaccumulate בעוברים זברה / זחלים באופן תלוי ריכוז. לפני הבקיעה, פלואורסצנטיות חזקה נמצא סביב chorion עוברי; בעוד בזחלים זברה, שק החלמון, קרום הלב, ומערכת העיכול הם האתרים המצטברים העיקריים של מיקרופלסטיק. התוצאות ממחישות את ספיגת והפנמה של מיקרופלסטיק בזברה בשלבי חיים מוקדמים, אשר יספקו בסיס להבנה טובה יותר של ההשפעה של מיקרופלסטיק על בעלי חיים ימיים.
Introduction
מאז מסונתז לראשונה בשנת 1900, פלסטיק נמצאים בשימוש נרחב בתחומים שונים, וכתוצאה מכך צמיחה מהירה של הייצור העולמי1. בשנת 2018 יוצרו ברחבי העולם כ-360 מיליוןטוןפלסטיק. הפלסטיק בסביבה הטבעית יתפרק לחלקיקים עדינים עקב תהליכים כימיים, פיזיקליים או ביולוגיים3. בדרך כלל, חלקיקי פלסטיק עדינים <5 מ"מ בגודל מוגדרים מיקרופלסטיק4. מיקרופלסטיק מתוכנן גם עבור יישומים ספציפיים, כגון microbeads ממוצרי קוסמטיקה5. כמזהמים כמעט קבועים, מיקרופלסטיק מצטבר בסביבה, ומשכו תשומת לב גוברת ממדענים, קובעי מדיניות והציבור1,6. מחקרים קודמים תיעדו כי מיקרופלסטיק עלול לגרום לתופעות לוואי בדגים, כגון נזק למערכת העיכול7, neurotoxicity8, הפרעה אנדוקרינית9, מתח חמצוני10 ונזק DNA11. עם זאת, הרעילות של מיקרופלסטיק לא נחשפה במלואה עד כה12,13.
עוברי זברה מציעים יתרונות ניסיוניים רבים, כולל גודל קטן, הפריה חיצונית, שקיפות אופטית ומצמדים גדולים, ונחשבים כאורגניזם מודל אידיאלי לחקר ההשפעות של מזהמים על דגים בשלבי חיים מוקדמים. בנוסף, רק כמויות מוגבלות של חומרי בדיקה נדרשים להערכת תגובות ביולוגיות. כאן, עוברי זברה נחשפים לריכוזים שונים של מיקרופלסטיק (0.1, 1, 10 מ"ג / ליטר) במשך 5 ימים, ואת ביואקומולציה והפצה של מיקרופלסטיק בעוברים / זחלים זברה מוערכים. תוצאה זו תקדם את הבנתנו לגבי הרעילות של מיקרופלסטיק לדגים, ואת השיטה המתוארת כאן ניתן להכליל באופן פוטנציאלי כדי לקבוע את הצטברות והפצה של סוגים אחרים של חומרים פלואורסצנטיים בשלבי החיים המוקדמים של זברה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
דגי זברה בוגרים מקורם במרכז המשאבים של דגי הזברה בסין (ווהאן, סין). הניסויים נערכו בהתאם למדריך הלאומי "הנחיות לבעלי חיים במעבדה לבדיקה אתית של רווחת בעלי חיים (GB/T35892-2018).
1. אוסף עוברים
- לשמור על דגים 20 L מיכלי זכוכית עם מערכת מי ברז מסונן פחם (pH 7.0 ± 0.2) בטמפרטורה קבועה (28 ± 0 °C (60 °F) על photoperiod של 14:10 שעות אור: כהה.
- להאכיל דגים פעמיים ביום עם ארטמיה נאופלי. מומלץ כי האוכל ניתן לכל היותר 3% משקל דגים ליום ויש לאכול בתוך 5 דקות בכל פעם14.
- מעבירים דג זברה בוגר מפותח (עם אורך גוף של 3-4 ס"מ) למיכל ההשרצה ביחס של זכר אחד לשתי נקבות בלילה שלפני הרבייה.
הערה: למחרת בבוקר, הדגים מתחילים להשריץ לאחר תחילת מחזור האור. - לאסוף ביצים באמצעות פיפטה פסטר. יש לשטוף עם 10% מהתמיסה של האנק מספר פעמים, ולאחר מכן לבדוק אם יש הפריה באמצעות מיקרוסקופ. ביצים מופרות לעבור את תקופת המחשוף לאחר כ 2 שעות לאחר הפריה (hpf) והוא יכול להיות מזוהה בבירור15.
- דגירה העוברים מופרית 500 מל המכיל 200 מל של 10% הפתרון של האנק עם 1% כחול מתילן לחיטוי ב 28 °C (69 °F). אין לחרוג מקצב הטעינה של פתרון עובר אחד/2 מ"ל.
הערה: 10% הפתרון של האנק מורכב 137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0.25 mMNa 2HPO4, 0.44 מ"מ KH2PO4, 1.3 mM CaCl2, 1.0 mM MgSO4 ו 4.2 mM NaHCO3.
2. הכנת מתלים מיקרופלסטיק
- Sonicate את פתרון המלאי של חרוזי פוליסטירן פלואורסצנטיים ירוקים שכותרתו (10 מ"ג / מ"ל) בקוטר נומינלי של 500 ננומטר (עירור / פליטה: 460/500 ננומטר) במשך 10 דקות.
- לדלל את פתרון המניה עם 10% הפתרון של האנק לייצר את פתרונות החשיפה הרצויים (0.1, 1, ו 10 מ"ג / ליטר).
- תמיד להכין את פתרונות החשיפה של מיקרופלסטיק לפני החשיפה.
הערה: יש לנקוט זהירות בעת הערכת ההשפעות הרעילות של מיקרופלסטיק, כי נוכחותם של חומרים משמרים, כגון נתרן אזיד, בניסוחים החלקיקים המסחריים, יכולה להיות רעילה לאורגניזמים שונים 16. לכן, תוספים אלה יש להסיר או בחשבון את הפקדים לפני ביצוע ניסוי רעילות.
3. חשיפה מיקרופלסטיק
- בחר באופן אקראי 6 עוברים מופרים טריים (4 כ"ס), ולאחר מכן העברה לכל באר של צלחת 6 באר המכילה 5 מ"ל של פתרונות מיקרופלסטיק עם ריכוזים שונים. כלול את קבוצות הבקרה המכילות 10% מהפתרון של האנק.
- השתמש בארות משולשות (עם סך של 18 עוברים) עבור כל טיפול.
- דגירה העוברים תחת אותו אור: מחזור כהה וטמפרטורה כמבוגרים (ראה 1.2) ולהתבונן כל 12 שעות. הסר את המתים מיד.
- לחדש את הפתרונות מיקרופלסטיק 90% כל 24 שעות. במהלך תקופת החשיפה, הדגים אינם ניזונים.
הערה: בדרך כלל, הבקיעה של העובר מתחילה ב 48 hpf ומשלימה על 72 hpf.
4. הערכת התפלגות מיקרופלסטיק
- ב 24, 48, 72, 96, ו 120 שעות לאחר ההפריה, לבחור באופן אקראי את העוברים / הזחלים (אחד מכל אחד משלושת השכפולים) ולשטוף עם 10% הפתרון של האנק.
- מעבירים את הזחלים לצלחת פטרי וחושפים ל-0.016% טריקאין להרדמה.
- הכינו את פתרון המלאי של הטריקאין: 4 מ"ג אבקת טריקאין מומסים ב-100 מ"ל של מים מזוקקים כפולים, ומתאימים את ה-pH ל-7.0 עם Tris-HCl (pH 9.0). אחסן את תמיסת המלאי במקפיא.
- הכן את פתרון העבודה. לדלל את פתרון המניה לריכוז הרצוי (0.016%) עם 10% הפתרון של האנק בטמפרטורת החדר14.
- מסדרים את העוברים/הזחלים ומתכוננים לתצפית.
- שימו לב לדגים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי ותמונה עם תוכנת הדמיה.
- כימתו את עוצמת הפלואורסצנטיות בדגים באמצעות ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ההתפלגות וההצטברות של מיקרופלסטיק פלואורסצנטי מוצגות באיור 1 ובטבלה 1. לא נצפתה פלואורסצנטיות גלויה בקבוצה (פקד) שלא נחשפו. עם זאת, הצטברות של פלואורסצנטיות נמצא סביב chorion לאחר חשיפה לריכוזים שונים של מיקרופלסטיק (24 hpf). פלואורסצנטיות ירוקה מזוהה גם בזחלים, ונראה כי רמות הפלואורסצנטיות עולות באופן תלוי ריכוז וזמן. שק החלמון, קרום הלב ומערכת העיכול הם האתרים המצטברים העיקריים של מיקרופלסטיק(איור 2).
איור 1: התפלגות של מיקרופלסטיק פוליסטירן פלואורסצנטי בעוברים/זחלים של דג זברה (40×). הדגים נדגמים מקבוצת הביקורת, או הקבוצות שנחשפו מיקרופלסטיק 500 ננומטר ב 0.1, 1 ו 10 מ"ג / L. סרגל סולם 100 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: אתרי הצטברות המיקרופלסטיק בזחלי זברה (40×). זחל זה נדגם מהקבוצה חשופה מיקרופלסטיק 500 ננומטר ב 10 מ"ג / ליטר במשך 120 שעות. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| ריכוז | העובר | זחל | ||||
| (מ"ג/ל) | 24 כ"ס | 48 כ"ס | 48 כ"ס b | 72 כ"ס | 96 כ"ס | 120 כ"ס |
| קונט, קונט, קונט. | 1.2±0.1 | 2.6±0.3 | 2.2 | 3.0±0.2 | 2.6±0.7 | 3.3±0.3 |
| 1 | 1.2±0.2 | 5.0±0.1 | 5.3 | 7.5±0.5 | 8.7±0.5 | 10.0±1.9 |
| 0.1 | 7.0±0.9 | 26.1±2.9 | 8.9 | 18.4±0.7 | 16.3±2.8 | 25.7±2.7 |
| 10 | 9.1±1.1 | 82.3±5.3 | 30.4 | 32.7±3.2 | 41.6±0.4 | 44.1±0.9 |
| a: רק שני עוברים הוערכו; ב:רק זחל אחד הוערך. | ||||||
טבלה 1: שינוי רמת הפלואורסצנטיות בזברה לאחר חשיפה למיקרופלסטיק פלואורסצנטי (n=3). בשל השפעת המקהלה על ספיגת המיקרופלסטיק הפלואורסצנטי, הנתונים מחולקים לשני חלקים, זה של העוברים (לפני הבקיעה) והזחלים (לאחר הבקיעה).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
על פי ההנחיה להגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות מדעיות, כגון הנחיית האיחוד האירופי 2010/63/EU, אישור אתיקה של בעלי חיים אינו חובה לניסוי בשלבי חיים מוקדמים של דגי זברה עד לשלב היכולת להאכיל באופן עצמאי (5 ימים לאחר ההפריה)17. עם זאת, שיטת הרווחה הטובה ביותר חשובה לאופטימיזציה של השימוש בזברה, למשל, השיטות ההומניות של הרדמה והמתת חסד צריכות להדאיג. אתיל 3-אמינובנזואט מתנסולפט (MS-222, או tricaine), הסוכן בשימוש שגרתי ברוב המעבדות, מועסק כאן להרדמה והמתת חסד.
לפני התצפית מתחת למיקרוסקופ, יש לשטוף את העוברים והזחלים מכיוון שהמיקרופלסטיק נספג על המשטח החיצוני עלול להפריע לתוצאות. בנוסף, שפעת אוטומטית בעוברים / זחלים, במיוחד סביב שק החלמון, אשר דווח מדי פעם, עלול להיות בעייתי. נוכחותם של ביומקרומולקולים רבים, כגון פלווינים, ניקוטינאמיד-אדנין דינוקלאוטיד (NAD), חומצות אמינו ארומטיות, ליפופוצינים, מוצרי קצה גליקציה מתקדמים וקולאז', ת פלט אור כאשר הם מתרגשים מאורך הגל המתאים.
חשוב לציין כי כמזהם החלקיקים, גודל המיקרופלסטיק נחשב לאחד הגורמים הקובעים של זמינות ביולוגית, ורעילות18. הקוטר הנומינלי של מיקרופלסטיק המשמש כאן הוא 500 ננומטר, אשר השוואתי לגודל הנקבוביות של chorion העובר (בטווח של 300 ננומטר עד 1 מיקרומטר)19. לכן, מיקרופלסטיק אלה אינם צפויים לעבור בקלות דרך chorion זברה. באופן עקבי, יש פלואורסצנטיות מועטה הנראית בעוברים לפני הבקיעה (איור 1). מאז chorion ישמש מחסום יעיל נגד חלקיקים עם גודל גדול, תהליך dechorionation לפני החשיפה עשויה להיות נחוצה. Chorion ניתן להסיר בקלות באמצעות מלקחיים, אבל dechorionation אנזימטי עם פרונה הוא המועדף כאשר העוברים מטופלים בכמויות גדולות. עם זאת, למרות dechorionation יגדיל את הזמינות הביולוגית להקל על הקרנת תפוקה גבוהה עבור רעילות של חומרים, העובר עם chorion שלם מומלץ יותר להעריך את ecotoxicity של מזהמים כאשר בוחנים את מצב החשיפה בעולם "האמיתי".
למרות מאמצים ניכרים הוקדשו לחקור את ההשפעות השליליות של מיקרופלסטיק על דגים, הידע הנוכחי, כולל זה של bioaccumulation, להישאר מוגבל או אפילו סותר. חוסר עקביות זה מיוחס בעיקר להבדלים במאפיינים של חלקיקים, כולל מאפייני גודל, צפיפות ומשטח (לדוגמה, מטען פני השטח). ההתנהגות של מיקרופלסטיק בתמיסה היא קריטית גם הזמינות הביולוגית. יש לעקוב אחר המאפיינים הפיזיוכימיים של המיקרופלסטיק לאורך משך החשיפה, ויש לתעד את תופעת הצבירה שעלולה להתרחש. למעשה, עבור החשיפות הדורשות את microplastics להיות מושעה לתקופה ממושכת, sonication או ערבוב עם מוט מגנטי מומלץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחבר אינו מצהיר על אינטרסים מתחרים או כספיים.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (21777145, 22076170), והתוכנית לחוקרי צ'אנגג'יאנג וצוות מחקר חדשני באוניברסיטה (IRT_17R97).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent microscope | Nikon, Japan | Eclipse Ti-S | |
| Green fluorescently labeled polystyrene beads | Phosphorex, USA | 2103A | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich, USA | A5040 |
References
- SAPEA (Science Advice for Policy by European Academies). A Scientific Perspective on Microplastics in Nature and Society. , SAPEA. Berlin. (2019).
- Plastics Europe. Plastics-the facts 2019. , Plastics Europe. Brussels. (2019).
- Andrady, A. L.
- Arthur, C., Baker, J., Bamford, H. Proceedings of the International Research Workshop on the Occurrence, Effects and Fate of Microplastic Marine Debris. National Oceanic and Atmospheric Administration Technical Memorandum. , (2009).
- Ivleva, N. P., Wiesheu, A. C., Niessner, R.
- Lu, T., et al. Pollutant toxicology with respect to microalgae and cyanobacteria. Journal of Environmental Sciences. 99, 175-186 (2021).
- Huang, J. N., et al. Exposure to microplastics impairs digestive performance, stimulates immune response and induces microbiota dysbiosis in the gut of juvenile guppy (Poecilia reticulata). Science of the Total Environment. 733, 138929 (2020).
- Prüst, M., Meijer, J., Westerink, R. H. S. The plastic brain: neurotoxicity of micro- and nanoplastics. Particle and Fibre Toxicology. 17, 24 (2020).
- Jakubowska, M., et al. Effects of chronic exposure to microplastics of different polymer types on early life stages of sea trout Salmo trutta. Science of the Total Environment. 740, 139922 (2020).
- Qiang, L., Cheng, J. Exposure to polystyrene microplastics impairs gonads of zebrafish (Danio rerio). Chemosphere. 263, 128161 (2021).
- Hamed, M., Soliman, H. A. M., Osman, A. G. M., Sayed, A. E. H. Antioxidants and molecular damage in Nile Tilapia (Oreochromis niloticus) after exposure to microplastics. Environmental Science and Pollution Research. 27, 14581-14588 (2020).
- Burns, E. E., Boxall, A. B. A. Microplastics in the aquatic environment: Evidence for or against adverse impacts and major knowledge gaps. Environmental Toxicology and Chemistry. 37, 2776-2796 (2018).
- Ma, H., Pu, S., Liu, S., Bai, Y., Mandal, S., Xing, B. Microplastics in aquatic environments: Toxicity to trigger ecological consequences. Environmental Pollution. 261, 114089 (2020).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio reio). 4th ed. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Pikuda, O., Xu, E. G., Berk, D., Tufenkji, N. Toxicity assessments of micro- and nanoplastics can be confounded by preservatives in commercial formulations. Environmental Science & Technology Letters. 6, 21-25 (2019).
- Lidster, K., Readman, G. D., Prescott, M. J., Owen, S. F. International survey on the use and welfare of zebrafish Danio rerio in research. Journal of Fish Biology. 90, 1891-1905 (2017).
- Pitt, J. A., et al. Uptake, tissue distribution, and toxicity of polystyrene nanoparticles in developing zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 194, 185-194 (2018).
- Lin, S. J., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies. Small. 9, 1608-1618 (2013).
