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Summary

Este método introduce una técnica simple para la detección de la liberación endógena de monoamina utilizando cortes cerebrales agudos. La configuración utiliza una placa de 48 pocillos que contiene un soporte de tejido para la liberación de monoamina. La monoamina liberada se analiza mediante HPLC junto con la detección electroquímica. Además, esta técnica proporciona un método de detección para el descubrimiento de fármacos.

Abstract

Los neurotransmisores monoamina están asociados con numerosas dolencias neurológicas y psiquiátricas. Los modelos animales de tales condiciones han mostrado alteraciones en la dinámica de liberación y absorción de neurotransmisores monoamina. Se requieren métodos técnicamente complejos como la electrofisiología, la voltamperometría cíclica de escaneo rápido (FSCV), la obtención de imágenes, la microdiálisis in vivo, la optogenética o el uso de radiactividad para estudiar la función de la monoamina. El método presentado aquí es un enfoque optimizado de dos pasos para detectar la liberación de monoamina en cortes cerebrales agudos utilizando una placa de 48 pocillos que contiene soportes de tejido para examinar la liberación de monoamina, y cromatografía líquida de alto rendimiento junto con detección electroquímica (HPLC-ECD) para la medición de la liberación de monoamina. Brevemente, las secciones cerebrales de rata que contienen regiones de interés, incluida la corteza prefrontal, el hipocampo y el estriado dorsal, se obtuvieron utilizando una cortadora de tejido o vibrátomo. Estas regiones de interés fueron diseccionadas de todo el cerebro e incubadas en un tampón fisiológico oxigenado. La viabilidad se examinó a lo largo del curso de tiempo experimental, mediante un ensayo de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT). Las regiones cerebrales agudamente diseccionadas se incubaron en diferentes condiciones de drogas que se sabe que inducen la liberación de monoamina a través del transportador (anfetamina) o a través de la activación de la liberación vesicular exocitótica (KCl). Después de la incubación, los productos liberados en el sobrenadante se recolectaron y analizaron a través de un sistema HPLC-ECD. Aquí, la liberación basal de monoamina es detectada por HPLC a partir de cortes cerebrales agudos. Estos datos respaldan los resultados previos in vivo e in vitro que muestran que AMPH y KCl inducen la liberación de monoamina. Este método es particularmente útil para estudiar los mecanismos asociados con la liberación dependiente del transportador de monoamina y brinda la oportunidad de detectar compuestos que afectan la liberación de monoamina de una manera rápida y de bajo costo.

Introduction

Una gran cantidad de enfermedades neurológicas y psiquiátricas se asocian con la desregulación o el mantenimiento insuficiente de la homeostasis del neurotransmisor monoamina (dopamina [DA], serotonina [5-HT], norepinefrina [NE])^1,2,3. Estas afecciones incluyen, entre otras, ^{depresión1,2}, ^{esquizofrenia2}, ^ansiedad2, ^adicción4, menopausia5,6,7, ^dolor8 y enfermedad de ^Parkinson3. Por ejemplo, varios modelos de menopausia en ratas han demostrado que la desregulación o reducción de las monoaminas dentro del hipocampo, la corteza prefrontal y el cuerpo estriado puede estar asociada tanto con la depresión como con el deterioro cognitivo, que se observa en mujeres que experimentan la menopausia. La desregulación de las monoaminas en estos modelos ha sido ampliamente examinada utilizando HPLC-ECD, aunque los estudios no discriminaron entre el contenido medido de neurotransmisores versus la liberación de neurotransmisores5,6,7. Las monoaminas se liberan clásicamente en el espacio extracelular a través de la liberación vesicular dependiente de ^Ca2+9, y se reciclan de nuevo a través de su respectivo sistema de recaptación de la membrana plasmática (transportador de dopamina, DAT; transportador de serotonina, SERT; transportador de norepinefrina, NET)^10,11. Por el contrario, los datos sugieren que estos transportadores son capaces de liberar o efluir monoaminas, ya que se sabe que las drogas de abuso como la anfetamina (AMPH) y la 3,4-metilendioximetanfetamina (MDMA) liberan DA y 5-HT, respectivamente, a través de sus sistemas de transporte12,13,14,15,16,17 . Por lo tanto, una comprensión mecanicista adecuada de la dinámica de liberación de monoamina es crucial para desarrollar farmacoterapias específicas y específicas.

Se ha empleado una amplia gama de técnicas para estudiar la liberación de monoaminas, como la voltamperometría cíclica de barrido rápido (FSCV)¹⁸, la microdiálisis in ^vivo13, la ^imagen19, la preincubación con monoaminas radiomarcadas20, la optogenética y, más recientemente, los sensores fluorescentes y la fotometría codificados ^{genéticamente21,22} . FSCV y la microdiálisis in vivo son las principales técnicas utilizadas para estudiar la liberación de monoamina. FSCV se utiliza para estudiar la liberación exocitótica estimulada de, principalmente, DA en cortes cerebrales agudos e in ^vivo23. Debido a que FSCV utiliza electrodos para estimular o evocar la liberación, la fuente principal de liberación de neurotransmisores es la liberación vesicular dependiente de ^Ca2+18,24,25,26,27,28,29,30,31 . La microdiálisis in vivo junto con la HPLC mide los cambios en los niveles de neurotransmisores extracelulares utilizando una sonda colocada en un área cerebral de ^{interés13,32}. Al igual que el FSCV, una limitación importante de la microdiálisis in vivo es la dificultad para determinar la fuente de liberación de neurotransmisores: liberación vesicular dependiente de ^Ca2+ o dependiente del transportador. Cabe destacar que ambos métodos permiten la medición directa de la liberación de monoamina. A través del reciente avance de la optogenética, la investigación demuestra la detección de la liberación de 5-HT y DA en un corto período de tiempo con una exquisita especificidad de tipo ^celular21,22. Sin embargo, estas estrategias requieren técnicas y equipos complejos y costosos, e indirectamente miden la liberación de monoamina, específicamente a través de la unión de monoamina a los receptores. Además, las monoaminas radiomarcadas también se utilizan para estudiar la dinámica de la monoamina. Las monoaminas radiomarcadas pueden estar precargadas en varios sistemas modelo, como células heterólogas que sobreexpresan cada transportador de monoamina20,33,34,35,36,37,38,39,40, neuronas ^primarias20, sinaptosomas33,39,41^{, 42}, y cortes cerebrales ^agudos43,44. Sin embargo, la radiactividad supone un daño potencial para el experimentador, y los analitos marcados con tritio pueden no recapitular fielmente la dinámica endógena de la ^{monoamina45,46}. Los sistemas de superfusión combinados con métodos de detección fuera de línea como HPLC-ECD han permitido la detección de monoaminas de múltiples fuentes tisulares. Aquí, este protocolo proporciona como un método optimizado y de bajo costo, simple y preciso que utiliza cortes cerebrales agudos para medir directamente la liberación de monoamina basal endógena y estimulada.

Las rebanadas cerebrales agudas permiten probar hipótesis mecanicistas, principalmente porque preservan el microambiente anatómico in vivo y mantienen intactas las sinapsis47,48,49,50,51,52. En algunos estudios, se han utilizado cortes cerebrales agudos o tejido cerebral picado junto con una técnica de superfusión utilizando KCl para estimular la liberación mediada por ^Ca2+53,54,55,56. Los sistemas de superfusión han sido fundamentales para avanzar en la comprensión del campo de los mecanismos de liberación de neurotransmisores, incluidas las monoaminas. Sin embargo, estos sistemas son relativamente caros, y el número de cámaras disponibles para el análisis de tejidos oscila entre 4 y 12. En comparación, el método presentado aquí es económico, permite la medición de 48 muestras de tejido y puede refinarse para usar hasta 96 muestras de tejido. Cada pozo dentro de la placa de 48 pocillos contiene soportes de tejido que utilizan filtros para separar el producto liberado del tejido, y las monoaminas liberadas son recolectadas y analizadas por HPLC-ECD. Es importante destacar que este método permite la medición simultánea de la liberación de 5-HT, DA y NE de diferentes áreas del cerebro, como la corteza prefrontal, el hipocampo y el estriado dorsal después del tratamiento con agentes farmacológicos que modulan la liberación de monoamina. Por lo tanto, el experimentador puede responder a múltiples preguntas utilizando un sistema económico de múltiples pocillos que aumenta el número de muestras analizadas y, por lo tanto, reduce el número de animales utilizados.

Protocol

Todos los experimentos, incluido el manejo de animales y la recolección de tejidos, se llevaron a cabo de acuerdo con la Universidad de Florida y el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del City College of New York, siguiendo el protocolo aprobado 201508873 (UF) y 1071 (CCNY). Para reactivos y tampón, consulte el Archivo complementario.

1. Prepara rebanadas agudas de cerebro de rata

NOTA: En este experimento se utilizaron ratas macho adultas (250-350 g). Sin embargo, esta configuración es funcional para diferentes puntos de desarrollo, ratas hembra y otras especies. Si usa un animal más pequeño, como ratones, el experimentador puede ajustarse para optimizar el protocolo mediante el uso de un número diferente de cortes de cerebro o golpes por condición. El búfer de disección se denominará tampón 1; El búfer de eflujo se denominará búfer 2.

1. Prepare el búfer 1 como se menciona en el archivo complementario. Saturar Buffer 1 con oxígeno burbujeando con 95%/5% (_O2/_CO2) durante 20 min sobre hielo. Retire 50 ml de Buffer 1 y enfríe sobre hielo en un vaso de precipitados pequeño o una placa de Petri. Este amortiguador se utiliza para mantener todo el cerebro agudamente cosechado.
2. Anestesiar una o dos ratas adultas (250-350 g) con 1%-2% de isoflurano, decapitarlas con una guillotina y extirpar rápidamente sus cerebros. Coloque inmediatamente el cerebro en el Buffer 1 oxigenado helado en el recipiente del paso 1.1.
   NOTA: Asegúrese de que isoflurane and guillotine se usa de manera segura. Ábrelo bajo una campana extractora de humos.
3. Usando un vibratomo o un comprimido, corte secciones cerebrales coronales de 300 μm de cada región de interés (Figura 1). Bubbling Buffer 1 debe estar presente mientras se hacen las secciones. Usando una espátula de acero inoxidable, transfiera cuidadosa e inmediatamente las rodajas de cerebro a una nueva placa de Petri llena de Buffer 1 oxigenado helado (Figura 2).
4. Diseccionar aún más las rebanadas cerebrales (por ejemplo, punzones, cortar) moviendo cuidadosamente las rebanadas a portaobjetos de vidrio (Figura 1G) utilizando el atlas cerebral de ^rata57. Por ejemplo, identifique el estriado dorsal basado en su estructura oscura y estriada, e identifique el hipocampo en función de su proximidad a la corteza y la estructura espiral única. Los hemisferios derecho e izquierdo pueden separarse para usarlos como cortes de control y experimentales (Figuras 2G – H). Aquí, el estriado dorsal se diseccionó aún más en punzones de 2 mm (Figura 1G).
5. Usando una pipeta de transferencia de plástico con la punta cortada, transfiera rodajas o golpes cerebrales en recipientes pequeños sumergidos en Buffer 1 helado oxigenado con burbujeo de oxígeno. Estos recipientes pueden ser de malla de acero inoxidable o pequeñas placas de Petri llenas de tampón (Figura 1H).

2. Liberación de monoamina endógena ex-vivo de cortes o punzones cerebrales

NOTA: El dispositivo utilizado para esta sección consiste en una placa de 48 pocillos y un soporte de tejido hecho de seis unidades de filtro de microcentrífuga sin los filtros insertados conectados a una línea de carbógeno (Figura 2). Para hacer el soporte, use una varilla de plástico resistente (por ejemplo, de un raspador de celdas) y pegue las unidades de filtro de microcentrífuga sin los filtros insertados. Déjalo secar durante 1-2 días. El tiempo requerido para el experimento de liberación endógena de monoamina y las concentraciones de anfetamina, fluoxetina y cocaína se basan en la literatura actual y los protocolos anteriores13,20,58.

1. Activación tisular
   1. Transfiera el tejido cerebral del paso 1.1.5 a cada pocillo de la cámara de eflujo y permita la recuperación durante 30-50 min a 37 °C en un calentador de deslizamiento en 0.5-1 mL de Buffer 2 oxigenado, con burbujeo constante y suave (Figura 2B1).
   2. Durante esta incubación, diluya los medicamentos a la concentración deseada para el experimento. Todos los medicamentos deben disolverse en Buffer 2, y las concentraciones se basan en la literatura actual.
2. Primera incubación
   1. Mueva el soporte de tejido con tejido cerebral a los pocillos que contengan 500 μL de Buffer 2 oxigenado e incube durante 20 min a 37 °C. Asegúrese de que se transporte un búfer mínimo o nulo tocando el soporte en el borde del pozo hasta que no haya exceso de amortiguador en el soporte.
   2. En experimentos con agentes farmacológicos como los inhibidores de los transportadores de monoamina, incubar las muestras de tejido con los fármacos diluidos en Buffer 2 oxigenado (por ejemplo, 10 μM de fluoxetina, 40 μM de cocaína; ver Figura 2B2). El volumen final en cada pozo será de 500 μL.
3. Segunda incubación
   1. Mueva el soporte con el tejido a un nuevo conjunto de pocillos que contengan 500 μL de Buffer 2 total con o sin la concentración deseada de cada medicamento. Asegúrese de que no sobra un exceso de búfer. Cada pozo representa un n = 1 para condiciones experimentales. Cada condición experimental se realiza por triplicado.
   2. Un pozo incluye un Buffer 2 oxigenado, el siguiente AMPH de 10-30 μM, y el pozo final incluye 10-30 μM de AMPH más inhibidores del transportador de monoamina. Cada fármaco se disuelve en Buffer 2 oxigenado.
   3. Incubar el tejido durante 20 min a 37 °C con 500 μL de la condición del fármaco.
      NOTA: Los pozos adicionales pueden incluir un K+ Buffer 2 alto oxigenado con o sin los inhibidores del transportador de monoamina. Disolver cada fármaco en el tampón oxigenado 2 (500 μL).
   4. Durante esta segunda incubación de 20 min, recoger la solución de los pocillos de la primera incubación en la etapa 2.2.1 y transferirla a tubos de microcentrífuga que contengan 50 μL de ácido perclórico 1 N o ácido fosfórico (dependiendo del tipo de HPLC, concentración final 0,1 N). El volumen final de la muestra será de 550 μL. Mantenga los tubos de microcentrífuga en hielo y etiquete los tubos # 1.
   5. Después de la segunda incubación de 20 min, mueva el soporte de tejido con secciones cerebrales o punzones a un pozo vacío y mantenga la placa en hielo. Transfiera el sobrenadante a tubos de microcentrífuga que contengan 50 μL de ácido perclórico 1 N o ácido fosfórico. El volumen final de la muestra será de 550 μL. Mantenga los tubos de microcentrífuga en hielo y etiquete los tubos # 2.
   6. Agregue 1 ml de tampón helado 1 a cada pozo que contenga tejido. Recolecte todo el tejido con pinzas pequeñas y transfiéralo a tubos de microcentrífuga limpios.
   7. Mantenga los tubos con tejido cerebral a -80 °C. Descarte el 1 ml del búfer 1 (Figura 2B4).
   8. Soluciones filtrantes obtenidas de cada incubación mediante tubos filtrantes de microcentrífugas (0,22 μm) a 2.500 x g durante 2min. Utilice el filtrado para determinar el contenido de monoamina utilizando HPLC con detección electroquímica (Figura 2B5).

3. Viabilidad tisular

1. Ensayo MTT
   NOTA: Una preocupación importante con respecto a esta configuración experimental es la viabilidad del tejido, ya que el tejido puede usarse hasta por varias ^horas59. Se utiliza un ensayo ^MTT60,61 para determinar la viabilidad tisular al final de la experimentación. Este ensayo se basa en la conversión de la sal amarilla de tetrazolio MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-bromuro de difeniltetrazolio) en cristales de formazan púrpura por células viables con metabolismo adecuado.
   1. Después del experimento, mantenga un grupo separado de muestras de tejido y sepárelas en dos grupos.
   2. Incubar un grupo durante 20 min a 37 °C en Tritón X-100 (1%) disuelto en Buffer 2 como control. El tratamiento con Tritón X-100 produce la muerte celular. Mantener el segundo grupo en Buffer 2, y no incubar en Triton X-100 (control de viabilidad tisular).
   3. Añadir MTT (solución madre 5 mg/mL en PBS, pH 7.4) a ambos grupos en el Buffer 2 oxigenado a una concentración final de 0,5 mg/mL.
   4. Incubar las muestras de tejido durante 20 min a 37 °C, lavar con PBS y transferir a tubos de microcentrífuga que contengan 250 μL de una mezcla de SDS (10%, p/v), DMF (25%, v/v) y agua para disolver los cristales de formazan.
   5. Incubar las muestras durante 24 h.
   6. Centrifugar los tubos a 10.000 x g durante 10 min y medir la absorbancia del sobrenadante (200 μL) a 562 nm y 690 nm utilizando un lector de microplacas. La viabilidad tisular se calcula de la siguiente manera: (_A562-A690)/peso tisular.

4. Análisis HPLC de monoaminas

1. Cuantificar la liberación de monoamina de cada condición experimental utilizando HPLC-ECD según protocolos ^{anteriores13,44}, utilizando una columna de fase inversa.
   1. Prepare la fase móvil necesaria para la detección. Consiste en ácido fosfórico de 100 mM, ácido cítrico de 100 mM, EDTA-Na2 de 0,1 mM, ácido octanosulfónico de 600 mg/L, acetonitrilo al 8% v/v (pH final 6.0). La composición de la fase móvil depende del tipo de HPLC y de la columna utilizada.
   2. Ajuste el potencial del detector electroquímico (electrodo de carbono vítreo de 2 mm) a 0,46 V y ajuste el caudal a 0,05 ml/min.
   3. Cargue 5 μL de cada muestra, incluidos los estándares de neurotransmisores en el HPLC para la autoinyección y detección. La cantidad de cada muestra añadida depende del tipo de HPLC utilizado.
   4. Una vez que el HPLC haya completado la ejecución, utilice el software de análisis de HPLC dado para adquirir y analizar los datos del cromatógrafo.
   5. Analizar el contenido de monoamina utilizando una curva estándar compuesta por cada monoamina (dopamina: DA, norepinefrina: NE y serotonina: 5-HT; Figura 2C). Utilice los cromatogramas resultantes para obtener el área bajo la curva (AUC) según las directrices del fabricante.

5. Preparación de lisados tisulares para la cuantificación de proteínas

1. Ensayo de proteínas
   1. Agregue tampón de lisis helado más inhibidores de la proteasa (0,1 g / 1 ml) a cada tubo de microcentrífuga que contenga secciones / punzones cerebrales y homogeneice con un homogeneizador de mortero. Los tubos de la microcentrífuga deben mantenerse en hielo mientras se homogeneizan para evitar la degradación de las proteínas.
   2. Incubar tejidos homogeneizados durante 1 h a 4 °C con rotación ligera.
   3. El tejido de la centrífuga homogeneiza a 16.000 x g durante 15 min a 4 °C y recupera el sobrenadante.
   4. Determinar la concentración de proteínas en los sobrenadantes, con albúmina sérica bovina (BSA) como estándar.
   5. Normalizar el contenido de monoamina en cada muestra de cerebro al contenido total de proteína (μg) medido en 250 μL de tejido cerebral lisado. Use la siguiente fórmula para determinar la proteína nmol monoamina/g. df = factor de dilución.

6. Análisis estadístico

1. Analice la liberación de monoamina (nmol / g) utilizando ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Sidak para comparaciones post-hoc.
2. Analice la viabilidad del tejido utilizando una prueba t de Student no emparejada para grupos independientes (Control vs. 1% Tritón X-100).
3. Para todos los análisis estadísticos, establezca el nivel alfa en ≤ 0,05.

Representative Results

Discussion

Las mediciones de liberación de monoamina se han realizado durante años en varios sistemas como células heterólogas, cultivos neuronales, sinaptosomas cerebrales, cortes cerebrales agudos ex vivo y animales enteros13,20,41,42,58,64,65,66,67,68 . Tales preparaciones han permitido al campo de la neurociencia explorar mecanismos básicos de liberación de neurotransmisores que pueden conducir al descubrimiento de nuevos agentes farmacológicos para trastornos neurológicos y psiquiátricos donde las monoaminas desempeñan un papel. A pesar del amplio uso de tales métodos, existen ciertas limitaciones con respecto a la fuente y / o la cantidad de liberación endógena de monoamina, particularmente en procedimientos radiactivos. Además, las preparaciones de rebanadas cerebrales agudas ex vivo se han utilizado ampliamente junto con enfoques electrofisiológicos, farmacológicos, genéticos, moleculares, inmunocitoquímicos y otros18,24,25,47,50,51,59,69,70 , ya que preservan la arquitectura del tejido y conservan tanto la actividad neuronal como las conexiones sinápticas. Por lo tanto, las rebanadas cerebrales ofrecen ventajas excepcionales en comparación con otros modelos in vitro, como los sistemas heterólogos, las neuronas cultivadas primarias y los sinaptosomas. En gran medida, su ventaja es que estos sistemas pueden reproducir muchos aspectos del entorno in vivo.

Los sensores electrofisiológicos, optogenéticos, fluorescentes y voltamétricos ofrecen una resolución temporal y espacial exquisita para examinar los mecanismos asociados con la liberación de monoamina, particularmente DA. Sin embargo, la premisa básica para el uso de estos enfoques es que la estimulación eléctrica o inducida por la luz de las neuronas induce la clásica y bien documentada liberación vesicular exocitótica dependiente de calcio de neurotransmisores18,21,22,24,27,30. Una de las limitaciones más discernibles de estos enfoques es que las monoaminas liberadas a través de mecanismos alternativos (es decir, la liberación no vesicular) no son detectadas por estas técnicas. Las moléculas de neurotransmisores radiomarcadas también se han utilizado para estudiar la liberación de monoamina, pero este enfoque tiene limitaciones significativas. Las células o muestras de tejido están cargadas con concentraciones no fisiológicas de neurotransmisores marcados que no recapitulan fielmente el entorno nativo20,42,46. Curiosamente, algunos estudios documentan el uso de cortes cerebrales en sistemas de superfusión para examinar la liberación endógena de monoamina53,54,56. Sin embargo, estos estudios utilizan neurotransmisores radiactivos, y los que examinan el neurotransmisor endógeno se centran solo en K ⁺ y las condiciones no fisiológicas para inducir la liberación de neurotransmisores.

El método presentado actualmente se puede utilizar para examinar la liberación de monoamina mediada por transportadores del tejido nativo. Esto permite al experimentador superar las limitaciones de los neurotransmisores tritiados. Además, este enfoque proporciona una configuración simple para medir la liberación endógena de monoamina con mayor precisión a través de una detección directa de monoaminas en lugar de la medición indirecta cuando se utilizan sensores fluorescentes o monoamina radiomarcada. Está bien establecido que la anfetamina actúa como agente liberador de monoaminas en las regiones cerebrales de la corteza ^prefrontal71, el estriado ^dorsal56,72 y el hipocampo39. Estos hallazgos se confirmaron utilizando este sistema de placas de 48 pocillos. Además, este método puede resultar ser un complemento de los métodos utilizados actualmente que miden el contenido total de monoamina utilizando HPLC-ECD pero no han examinado la liberación de monoamina5,6,7. Este método proporciona un nuevo aireador diseñado para medir la liberación endógena de monoaminas de cortes cerebrales agudos utilizando HPLC junto con la detección electroquímica.

Mientras se utiliza este método, es fundamental que los tejidos cerebrales se mantengan fríos en un tampón oxigenado durante el experimento para evitar el deterioro. Además, es crucial que los tejidos utilizados se activen en un tampón que contenga pargilina para prevenir la degradación de la monoamina. Además, el experimentador puede tener que solucionar problemas de varios aspectos de este método. Primero, dependiendo del punto de tiempo de desarrollo o la especie del animal, uno puede necesitar crear secciones más pequeñas o más grandes o usar más o menos secciones, rebanadas o punzones por condición. En segundo lugar, dependiendo de la región cerebral de interés, habrá cantidades variables de cada neurotransmisor. En tercer lugar, si bien es fundamental garantizar un burbujeo constante de oxígeno cuando se observa, el experimentador debe tener cuidado de no proporcionar un exceso de oxigenación, ya que esto puede conducir a la eliminación accidental del tejido del pozo. Finalmente, como hay varios tipos de dispositivos HPLC y diferentes columnas de separación, el experimentador tendrá que determinar, en función de la literatura, qué dispositivo o columna funcionaría mejor para su experimento.

Aunque este método proporciona al experimentador la capacidad de obtener de forma rápida y precisa datos ex vivo sobre la liberación de monoaminas endógenas, existen limitaciones que deben tenerse en cuenta. Como este es un enfoque ex vivo, las redes y conexiones se cortan, por lo que las rebanadas o golpes no son representativos de un sistema intacto. Otra limitación importante de este enfoque es la falta de resolución temporal y espacial, ya que la liberación de monoamina se mide en una escala de tiempo de minutos y a partir de una población de sitios de liberación. El refinamiento futuro del enfoque podría permitir una optimización de la resolución del tiempo y el espacio. Experimentos adicionales también examinarán los mecanismos asociados con los eventos de liberación. Habiendo demostrado la validez del método actual, los experimentos futuros requerirán diseccionar los eventos moleculares que conducen a la liberación de monoamina. Los experimentos adicionales incluirán un tampón de eflujo libre de ^{Ca2 +} e inhibidores selectivos de la liberación vesicular como controles adicionales. Como la distribución regional de las monoaminas y sus transportadores son tres eventos independientes, los experimentos futuros deben incorporar una farmacología más extensa y un estudio de curso de tiempo, ya que las diferentes condiciones del fármaco pueden requerir tiempos de incubación más cortos o más largos. Por ejemplo, según la distribución regional o el tipo de tejido utilizado, otros experimentos pueden usar bloqueadores farmacológicos más específicos para NET, SERT o DAT, como desipramina, fluoxetina y GBR12909, respectivamente. Además, aunque el tejido permaneció viable durante todo el experimento, el experimentador no puede descartar la posibilidad de que la función del transportador de monoamina pueda haberse visto afectada durante la duración de todo el proceso. El equipo requerido para este método es de bajo costo, sin embargo, existe la necesidad de tener acceso a un costoso HPLC-ECD. Esto puede ser mitigado por las instalaciones básicas, ya que muchos actualmente tienen acceso a HPLC-ECD para uso comunitario. A pesar de tales limitaciones, el método actual proporciona un procedimiento fundamental, que puede ser manipulado aún más para investigar la liberación de monoamina.

En general, este método proporciona un procedimiento de dos pasos simple, de alto rendimiento y bajo costo para evaluar la liberación simultánea de monoaminas de neuronas de roedores adultos utilizando cortes cerebrales agudos ex vivo de diferentes regiones cerebrales. Idealmente, este método puede combinarse con protocolos in vivo, y proporciona datos preliminares, lo que permite al experimentador disminuir el número de animales requeridos en modelos in vivo, como se recomienda en las “tres R” (Reemplazo, Reducción y Refinamiento) de bienestar animal. Por lo tanto, es factible implementar esta plataforma ex vivo para el cribado de moléculas potencialmente terapéuticas con el objetivo de descubrir nuevos agentes farmacológicos para el tratamiento de afecciones asociadas con desregulaciones en la homeostasis de monoaminas.

Materials

48 Well plate	NA	NA	Assay
Acetonitrile	Fischer Scientific	A998-1	Mobile Phase
Calcium Chloride Ahydrous	Sigma Aldrich	C1016	Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer
Clarity Software	Anetc
Citric Acid	Sigma Aldrich		Mobile Phase
D-(+)-Glucose	Sigma	1002608421	Dissection Buffer
DMF	Sigma Aldrich	D4551	MTT Assay
EDTA-Na2	Sigma Aldrich		Mobile Phase
GraphPad Software	Graphpad Software, Inc		Statistical Analysis
Glycerol	Sigma Aldrich	G5516	Lysis buffer
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	Lysis buffer
HPLC, Decade Amperometric	Anetc		HPLC, LC-EC system
HPLC	Amuza		HPLC HTEC-510.
L-Asrobic Acid	Sigma Aldrich	A5960	Dissection Buffer
Magnesium Sulfate	Sigma	7487-88-9	KH Buffer
Microcentrifuge Filter Units UltraFree	Millipore	C7554	Assay – 6 to fit in 48 well plate
MTT	Thermo Fisher	M6494	MTT Assay
Nanosep	VWR	29300-606	Assay; protein assay
Octanesulfonic acid	Sigma Aldrich	V800010	Mobile Phase
Pargyline Clorohydrate	Sigma Aldrich	P8013	Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer
Phosphoric Acid	Sigma Aldrich		Mobile Phase
Potassium Chloride	Sigma	12636	KH Buffer
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma	1001655559	KH Buffer
Precisonary VF-21-0Z	Precissonary		Compresstome
Protease Inhibitor Cocktail	Sigma Aldrich	P2714	Lysis buffer.
Sodium Bicarbonate	Sigma	S5761	Dissection Buffer
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761	Dissection Buffer
Sodium Chloride	Sigma	S3014	KH Buffer
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma Aldrich	L3771	Lysis buffer
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787	MTT Assay / Lysis buffer