Summary
Denne metode introducerer en simpel teknik til påvisning af endogene monoamin frigivelse ved hjælp af akutte hjerne skiver. Opsætningen bruger en 48-brønd plade, der indeholder en vævsholder til monoamin frigivelse. Frigivet monoamin analyseres af HPLC kombineret med elektrokemisk detektion. Derudover, denne teknik giver en screening metode til opdagelse af lægemidler.
Abstract
Monoamin neurotransmittere er forbundet med mange neurologiske og psykiatriske lidelser. Dyremodeller af sådanne forhold har vist ændringer i monoamin neurotransmitter frigivelse og optagelse dynamik. Teknisk komplekse metoder såsom elektrofysiologi, Hurtig ScanningCyclic Voltammetry (FSCV), billeddannelse, in vivo mikrodialyse, optogenetik, eller brug af radioaktivitet er påkrævet for at studere monoamin funktion. Metoden præsenteres her er en optimeret to-trins tilgang til påvisning af monoamin frigivelse i akutte hjerne skiver ved hjælp af en 48-brønd plade, der indeholder vævsholdere til undersøgelse af monoamin frigivelse, og højtydende flydende kromatografi kombineret med elektrokemisk detektion (HPLC-ECD) til monoamin frigivelse måling. Kort sagt blev rottehjerneafsnit, der indeholder områder af interesse, herunder præfrontal cortex, hippocampus og dorsal striatum opnået ved hjælp af en vævsudsnitsbehandler eller vibratom. Disse interesseområder blev dissekeret fra hele hjernen og inkuberet i en iltet fysiologisk buffer. Levedygtigheden blev undersøgt i løbet af forsøgstiden ved 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) analyse. De akut dissekerede hjerneområder blev inkuberet under forskellige lægemiddelforhold, der vides at fremkalde monoaminfrigivelse gennem transportøren (amfetamin) eller gennem aktivering af eksocytotisk køretøjsfrigivelse (KCl). Efter inkubation blev de frigivne produkter i supernatanten indsamlet og analyseret gennem et HPLC-ECD-system. Her, basal monoamin frigivelse detekteres af HPLC fra akutte hjerne skiver. Disse data understøtter tidligere in vivo- og in vitro-resultater, der viser, at AMPH og KCl fremkalder monoaminfrigivelse. Denne metode er især nyttig til at studere mekanismer forbundet med monoamin transporter-afhængige frigivelse og giver mulighed for at screene forbindelser, der påvirker monoamin frigivelse i en hurtig og billig måde.
Introduction
En overflod af neurologiske og psykiatriske sygdomme er forbundet med dysregulering eller utilstrækkelig vedligeholdelse af monoamin neurotransmitter (dopamin [DA], serotonin [5-HT], noradrenalin [NE]) homøostase1,2,3. Disse betingelser omfatter, men er ikke begrænset til, depression1,2, skizofreni2, angst2, afhængighed4, overgangsalderen5,6,7, pain8, og Parkinsons sygdom3. For eksempel har flere rottemodeller af overgangsalderen vist, at dysregulering eller reduktion af monoaminer inden for hippocampus, præfrontal cortex og striatum kan være forbundet med både depression og kognitiv tilbagegang, som ses hos kvinder, der oplever overgangsalderen. Dysreguleringen af monoaminer i disse modeller er blevet grundigt undersøgt ved hjælp af HPLC-ECD, selv om undersøgelserne ikke diskriminerede mellem målt neurotransmitterindhold versus neurotransmitter release5,6,7. Monoaminer er klassisk frigives i ekstracellulære rum gennem Ca2 +-afhængige køretøj frigivelse9, og genbruges tilbage gennem deres respektive plasmamembran re-optagelse system (dopamin transporter, DAT; serotonin transporter, SERT; noradrenalin transporter, NET)10,11. Omvendt tyder data på, at disse transportører er i stand til at frigive eller efflux monoaminer, da stoffer af misbrug såsom amfetamin (AMPH) og 3,4-Methylenedioxymethamfetamin (MDMA) er kendt for at frigive DA og 5-HT, henholdsvis gennem deres transportsystemer12,13,14,15,16,17 . Således er en ordentlig mekanistisk forståelse af monoaminfrigivelsesdynamik afgørende for at udvikle specifikke og målrettede farmakokterapier.
En bred vifte af teknikker er blevet anvendt til at studere monoamin frigivelse såsom Fast Scan Cyclic Voltammetry (FSCV)18, in vivo mikrodialyse13, imaging19, præincubation med radiolabeled monoaminer20, optogenetik, og for nylig, genetisk kodede fluorescerende sensorer og fotometri21,22 . FSCV og in vivo mikrodialyse er de primære teknikker, der anvendes til at studere monoamin frigivelse. FSCV bruges til at studere den stimulerede eksocytotiske frigivelse af primært DA i akutte hjerneskiver og in vivo23. Fordi FSCV bruger elektroder til at stimulere eller fremkalde frigivelse, den primære kilde til neurotransmitter frigivelse er Ca2 +-afhængige køretøj frigivelse18,24,25,26,27,28,29,30,31 . In vivo mikrodialyse kombineret med HPLC måler ændringer i ekstracellulære neurotransmitter niveauer ved hjælp af en sonde placeret i et hjerneområde af interesse13,32. Svarende til FSCV, en stor begrænsning for in vivo mikrodialyse er vanskeligheden ved at bestemme kilden til neurotransmitter frigivelse: Ca2 + afhængige køretøjsudløsning eller transporter afhængig. Bemærkelsesværdigt, begge metoder giver mulighed for direkte måling af monoamin frigivelse. Gennem den seneste udvikling af optogenetik, forskning viser påvisning af 5-HT og DA frigivelse i en kort tidshorisont med udsøgt celle-type specificitet21,22. Men, disse strategier kræver komplekse og dyre teknikker og udstyr, og indirekte måle monoamin frigivelse, specifikt gennem monoamin bindende for receptorer. Desuden bruges radiomærkede monoaminer også til at studere monoamindynamik. Radiomærkede monoaminer kan forudindlæses i forskellige modelsystemer såsom heterologe celler, der overekspresserer hver monoamintransporter20,33,34,35,36,37,38,39,40, primære neuroner20, synaptoomer33,39,41, 42, og akut hjerne skiver43,44. Men, radioaktivitet udgør potentiel skade for eksperimentatoren, og tritium-mærket analytter kan ikke trofast generobre endogene monoamin dynamik45,46. Superfusionssystemer kombineret med offlinedetekteringsmetoder som HPLC-ECD har gjort det muligt at påektionere monoaminer fra flere vævskilder. Her giver denne protokol som en optimeret og billig, enkel og præcis metode ved hjælp af akutte hjerneskiver til direkte at måle endogene basal og stimuleret monoaminfrigivelse.
Akutte hjerneskive giver mulighed for at teste mekanistiske hypoteser, primært når de bevarer in vivo anatomiske mikromiljø, og opretholder intakte synapser47,48,49,50,51,52. I nogle få undersøgelser er akutte hjerneskiver eller hakket hjernevæv blevet brugt sammen med en superfusionsteknik ved hjælp af KCl til at stimulere Ca2+ medieret frigivelse53,54,55,56. Superfusion systemer har været afgørende for at fremme feltets forståelse af neurotransmitter frigivelse mekanismer, herunder monoaminer. Disse systemer er imidlertid relativt dyre, og antallet af kamre til rådighed til vævsanalyse varierer fra 4-12. Til sammenligning er den metode, der præsenteres her, billig, tillader måling af 48 vævsprøver og kan raffineres til at bruge op til 96 vævsprøver. Hver brønd i 48-brøndspladen indeholder vævsholdere, der bruger filtre til at adskille det frigivne produkt fra vævet, og frigivne monoaminer indsamles og analyseres derefter af HPLC-ECD. Vigtigere er det, at denne metode giver mulighed for samtidig måling af 5-HT, DA og NE-frigivelse fra forskellige hjerneområder som den præfrontale cortex, hippocampus og dorsale striatum efter behandling med farmakologiske midler, der modulerer monoaminfrigivelse. Således kan forsøgspersonen besvare flere spørgsmål ved hjælp af et billigt multi-brønd-system, der øger antallet af testede prøver og dermed reducerer antallet af anvendte dyr.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg, herunder håndtering af dyr og vævsindsamling, blev udført i overensstemmelse med University of Florida og City College of New York Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) efter den godkendte protokol 201508873 (UF) og 1071 (CCNY). For reagenser og buffer henvises til den supplerende fil.
1. Forbered akutte rotte hjerne skiver
BEMÆRK: I dette forsøg blev der anvendt voksne hanrotter (250-350 g). Denne opsætning er imidlertid funktionel for forskellige udviklingspunkter, hunrotter og andre arter. Hvis du bruger et mindre dyr, såsom mus, kan eksperimentatoren justere for at optimere protokollen ved hjælp af et andet antal hjerneskiver eller slag pr. Tilstand. Dissektionsbufferen kaldes Buffer 1. efflux buffer vil blive omtalt som Buffer 2.
- Forbered buffer 1 som nævnt i den supplerende fil. Mætte Buffer 1 med ilt ved at boble med 95%/5% (O2/CO2) i 20 min på is. Fjern 50 mL buffer 1, og chill på is i et lille bæger eller en petriskål. Denne buffer bruges til at holde den akut høstede hele hjernen.
- Bedøve en eller to voksne rotter (250-350 g) med 1%-2% isoflurane, halshugge dem ved hjælp af en guillotin, og hurtigt fjerne deres hjerner. Placer straks hjernen i iskold iltet Buffer 1 i beholderen fra trin 1.1.
BEMÆRK: Sørg for, at isofluran og guillotin anvendes sikkert. Åben isoflurane under en røghætte. - Ved hjælp af en vibratom eller kompresstom skæres 300 μm koronar hjerne sektioner fra hver region af interesse (figur 1). Boblende buffer 1 skal være til stede, mens sektionerne oprettes. Brug en spatel i rustfrit stål, omhyggeligt og straks overføre hjerne skiver i en ny Petri parabol fyldt med iskold iltet Buffer 1 (Figur 2).
- Yderligere dissekere hjerne skiver (f.eks slag, skåret ud) ved omhyggeligt at flytte skiver til glas dias (Figur 1G) ved hjælp af rotte hjerne atlas57. For eksempel identificere dorsal striatum baseret på sin mørke, striated struktur, og identificere hippocampus baseret på sin nærhed til cortex og unikke spiral struktur. Højre og venstre halvkugle kan adskilles til brug som kontrol og eksperimentelle skiver (Tal 2G - H). Her blev dorsal striatum yderligere dissekeret i 2 mm slag (Figur 1G).
- Brug en plastikoverførselspipette med spidsen afskåret, overfør skiver eller hjerneslag i små beholdere nedsænket i iltet iskold Buffer 1 med ilt boblende. Disse beholdere kan være mesh i rustfrit stål eller små petriskåle fyldt med buffer (Figur 1H).
2. Ex-vivo endogen monoamin frigivelse fra hjerne skiver eller slag
BEMÆRK: Den enhed, der anvendes til dette afsnit, består af en 48-brøndsplade og en vævsholder bestående af seks mikrocentrifugefilterenheder uden de indsatte filtre, der er tilsluttet en carbogen-linje (figur 2). For at gøre indehaveren, skal du bruge en robust plaststang (f.eks fra en celle scrapper) og super lim mikrocentrifuge filterenheder uden indsat-filtre til det. Lad det tørre i 1-2 dage. Den tid, der kræves til det endogene monoaminfrigivelseseksperiment og koncentrationer af amfetamin, fluoxetin og kokain, er baseret på den aktuelle litteratur og tidligere protokoller13,20,58.
-
Aktivering af væv
- Hjernevævet overføres fra trin 1.1.5 til hver brønd i effluxkammeret, og der kan kommes igen i 30-50 min ved 37 °C på en glidevarmer i 0,5-1 mL iltet buffer 2 med konstant, skånsom boble (figur 2B1).
- Under denne inkubation fortyndes stofferne til den ønskede koncentration for eksperimentet. Alle lægemidler skal opløses i Buffer 2, og koncentrationer er baseret på den aktuelle litteratur.
-
Første inkubation
- Træk vævsholderen med hjernevæv til brønde, der indeholder 500 μL iltet buffer 2, og inkuber i 20 min ved 37 °C. Sørg for, at minimal til ingen buffer transporteres over ved at trykke på holderen på kanten af brønden, indtil der ikke er overskydende buffer i holderen.
- I forsøg med farmakologiske agenser såsom monoamintransporterhæmmere inkuberes vævsprøverne med de stoffer, der er fortyndet i iltet buffer 2 (f.eks. 10 μM fluoxetin, 40 μM kokain; se figur 2B2). Det endelige volumen i hver brønd vil være 500 μL.
-
Anden inkubation
- Flyt holderen med vævet til et nyt sæt brønde, der indeholder 500 μL total Buffer 2 med eller uden den ønskede koncentration af hvert lægemiddel. Sørg for, at der ikke er overskydende bufferrester. Hver brønd repræsenterer en n = 1 for eksperimentelle forhold. Hver eksperimentel tilstand udføres i tredobling.
- En brønd omfatter en iltet Buffer 2, den næste 10-30 μM AMPH, og den endelige brønd omfatter 10-30 μM AMPH plus monoamin transporter hæmmere. Hvert lægemiddel opløses i iltet Buffer 2.
- Inkuberes vævet i 20 min ved 37 °C med 500 μL af lægemidlet tilstand.
BEMÆRK: Yderligere brønde kan omfatte en iltet høj K+ Buffer 2 med eller uden monoamintransporterhæmmere. Opløs hvert lægemiddel i den iltede buffer 2 (500 μL). - I løbet af denne anden inkubation på 20 min opsamles opløsningen fra brøndene fra den første inkubation i trin 2.2.1, og der overføres til mikrocentrifugerør, der indeholder 50 μL 1 N perchlorsyre eller fosforsyre (afhængig af typen af HPLC, endelig koncentration 0,1 N). Det sidste volumen af prøven vil være 550 μL. Vedligehold mikrocentrifugrør på is, og mærk rørene #1.
- Efter den anden inkubation på 20 min skal vævsholderen flyttes med hjernesektioner eller slag til en tom brønd og opretholde pladen på is. Supernatanten overføres til mikrocentrifugrør, der indeholder 50 μL 1 N perchlorsyre eller fosforsyre. Det sidste volumen af prøven vil være 550 μL. Vedligehold mikrocentrifugrør på is, og mærk rørene #2.
- Tilsæt 1 mL iskold Buffer 1 til hver brønd indeholdende væv. Saml alt vævet ved hjælp af små pincet, og overfør til rene mikrocentrifugerør.
- Rør med hjernevæv ved -80 °C. Kassér buffer 1 mL (figur 2B4).
- Filteropløsninger fremstillet ved hver inkubation ved hjælp af mikrocentrifugfilterrør (0,22 μm) ved 2.500 x g i 2min. Brug filtratet til at bestemme monoaminindhold ved hjælp af HPLC med elektrokemisk detektion (Figur 2B5).
3. Væv levedygtighed
- MTT-analyse
BEMÆRK: En betydelig bekymring med hensyn til denne eksperimentelle opsætning er væv levedygtighed som vævet kan anvendes i op til flere timer59. En MTT assay60,61 bruges til at bestemme væv levedygtighed ved udgangen af eksperimenterne. Denne analyse er baseret på konvertering af det gule tetrazoliumsalt MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) til lilla formazankrystaller af levedygtige celler med tilstrækkelig metabolisme.- Post eksperiment opretholde en separat gruppe af vævsprøver og adskille dem i to grupper.
- Inkuber en gruppe i 20 min ved 37 °C i Triton X-100 (1%) opløst i Buffer 2 som kontrol. Triton X-100 behandling resulterer i celledød. Bevar den anden gruppe i Buffer 2, og inkuber ikke i Triton X-100 (vævs levedygtighedskontrol).
- Tilsættes MTT (lageropløsning 5 mg/mL i PBS, pH 7.4) til begge grupper i den iltede buffer 2 til en endelig koncentration på 0,5 mg/mL.
- Vævsprøverne inkuberes i 20 min ved 37 °C, vaskes med PBS og overføres til mikrocentrifugrør, der indeholder 250 μL af en blanding af SDS (10%, w/v), DMF (25%, v/v) og vand til opløsning af formazankrystallerne.
- Inkuber prøverne i 24 timer.
- Centrifuge rørene ved 10.000 x g i 10 min og måle absorbansen af supernatanten (200 μL) ved 562 nm og 690 nm ved hjælp af en mikropladelæser. Vævs levedygtighed beregnes på følgende måde: (A562-A690)/vævsvægt.
4. HPLC-analyse af monoaminer
- Kvantificer monoaminfrigivelse fra hver eksperimentel tilstand ved hjælp af HPLC-ECD i henhold til tidligere protokoller13,44 ved hjælp af en omvendt fase kolonne.
- Forbered den mobile fase, der kræves til registrering. Den består af 100 mM fosforsyre, 100 mM citronsyre, 0,1 mM EDTA-Na2, 600 mg/L oktanulfonsyre, 8% v/v acetonitril (endelig pH 6.0). Sammensætningen af den mobile fase afhænger af den type HPLC og kolonne, der anvendes.
- Indstil potentialet i den elektrokemiske detektor (2 mm glasagtig carbonelektrode) til 0,46 V, og indstil strømningshastigheden til 0,05 mL/min.
- Indlæs 5 μL af hver prøve, herunder neurotransmitterstandarder, i HPLC til autoinjektion og detektion. Mængden af hver tilsat prøve afhænger af den anvendte type HPLC.
- Når HPLC har gennemført kørslen, skal du bruge den givne HPLC-analysesoftware til at erhverve og analysere kromatografidataene.
- Analysere monoamin indhold ved hjælp af en standard kurve består af hver monoamin (Dopamin: DA, Noradrenalin: NE, og Serotonin: 5-HT; Figur 2C). Brug de resulterende kromatrammer til at opnå området under kurven (AUC) baseret på producentens retningslinjer.
5. Forberedelse af vævslytter til proteinkvantificering
-
Proteinanalyse
- Der tilsættes iskold lysisbuffer plus proteasehæmmere (0,1 g/1 mL) til hvert mikrocentrifugerør, der indeholder hjernesektioner/slag, og homogeniseres ved hjælp af en støder homogenisator. Mikrocentrifugrørene skal vedligeholdes på is, samtidig med at de homogeniseres for at forhindre proteinforringelse.
- Inkuberes vævs homogenater i 1 time ved 4 °C med let rotation.
- Centrifugevæv homogenerer ved 16.000 x g i 15 min ved 4 °C og genvinder supernatanten.
- Bestem proteinkoncentrationen i supernatanterne med kvægserumalbumin (BSA) som standard.
- Normalisere monoaminindholdet i hver hjerneprøve til det samlede indhold af protein (μg), der måles i 250 μL hjernevævslys. Brug nedenstående formel til at bestemme nmol monoamin/g protein. df = fortyndingsfaktor.
6. Statistisk analyse
- Analyser monoaminfrigivelse (nmol/g) ved hjælp af envejs ANOVA efterfulgt af Sidaks multiple comparisons-test for post hoc-sammenligninger.
- Analysere væv levedygtighed ved hjælp af en uparret studerendes t-test for uafhængige grupper (Control vs 1% Triton X-100).
- For alle statistiske analyser skal alfaniveauet indstilles til ≤ 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne teknik beskriver brugen af hjerneskiver til at måle frigivelsen af endogene monoaminer ved hjælp af HPLC med elektrokemisk detektion baseret i en 48-brønds plade med en indvendig vævsholder. Eksperimentel opsætning er afbildet i figur 1 og figur 2. For at sikre vævs levedygtighed ved forsøgets afslutning blev der i første omgang udført en MTT-analyse (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid. Efter funktionelle eksperimenter er de akutte hjerneskiver metabolisk aktive og forbliver levedygtige sammenlignet med dem, der inkuberes med 1% Triton X-100, en tilstand af celledød (figur 3).
Akut, 20 min, behandling af hippocampale og præfrontale cortex hjerne sektioner med AMPH fremkalder en betydelig stigning i de ekstracellulære niveauer af hver monoamin (Figur 4A,B). AMPH (30 μM) øgede niveauet af ekstracellulære 5-HT fra hippocampale skiver og præfrontale cortex skiver med 220-fold og 64-fold, ekstracellulær NE med 19-fold og 8-fold, og ekstracellulære DA med 8-fold og 7-fold, henholdsvis. Lignende forsøg blev udført i nærvær af fluoxetin (10 μM), en selektiv-serotonin reuptake hæmmer. Hæmning af SERT med fluoxetin forhindrer stigningen af ekstracellulær 5-HT induceret af AMPH i både hippocampus og den præfrontale cortex. I modsætning hertil påvirker fluoxetin ikke AMPH's indvirkning på ekstracellulære DA eller NE i de samme hjerneområder i overensstemmelse med dens selektivitet for SERT (Figur 4A,B). Alle eksperimentelle tilstande blev udført i tredotel.
Frigivelsen af monoaminer fra 2 mm dorsale striatum slag blev derefter målt. Akut, 20 min, behandling af dorsale striatum slag med AMPH (10 μM) fremkalder en 35-dobling i de ekstracellulære niveauer af DA (Figur 4C) over basal niveauer. DA detektion var fokuseret i dorsal striatum på grund af de lavere basale niveauer af 5-HT og NE tidligere rapporteret i denne region62,63. AMPH fremkalder således en mindre dosisafhængig stigning i ekstracellulære 5-HT sammenlignet med ekstracellulære DA-niveauer induceret af AMPH (data, der ikke er vist). Inkubation af dorsale striatumslag med kokain (40 μM), en monoamintransporterblokker, resulterede i en betydelig hæmning af AMPH-induceret ekstracellulær DA sammenlignet med slag inkuberet udelukkende med AMPH (Figur 4C). Disse data understøtter yderligere tidligere resultater, der tyder på, at AMPH inducerede DA efflux gennem DAT16.
Endelig blev hjernesektioner inkuberet med KCl (40 mM) for at demonstrere eksocytotisk frigivelse af monoaminer. Det er tilstrækkeligt at øge koncentrationen af ekstracellulær KCl for at fremkalde membrandepolarisering via inkubation med 40 mM KCl til at fremkalde eksocytotisk frigivelse af monoaminer sammenlignet med kontrolbetingelser (figur 5). Hverken fluoxetin eller kokain blokerer stigningen i de ekstracellulære niveauer af monoaminer induceret af KCl membran depolarisering.
Figur 1: Akut rottehjerneskive og sektionsforberedelse. (A) En rottehjerne placeres i en hjernematrix. Et overlegent snit betegner toppen af den optiske chiasm; det ringere snit er 3 mm posterior af bunden af hypothalamus. Nedskæringer blev foretaget for at fjerne hippocampus og striatum, og for at sikre en vandret base for at lime prøven til kompresstomen eller vibrere sikkert før udskæring. (B-D) Superlim blev spredt rundt i bunden af scenen, hjerner blev limet på, straks dækket af agarose, og agarose blev størknet ved hjælp af den frosne klemme i (D). (E-F) En kompresstom blev brugt til at lave 300 μm skiver til rottehjernen, og skiver blev placeret i iltet buffer indtil brug. (G) Sektioner blev placeret på en rutsjebane og 2 mm slag af dorsal striatum blev foretaget. (G) Slag i ryg striatum (top), udskæringer af hippocampus (midten) og udskæringer af cortex (nederst) opretholdes ved 4 °C i iltet dissektionsbuffer, før der indledes funktionelle eksperimenter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Eksperimentel opsætning til efflux-eksperiment. (A) Efflux-kammeret består af en 48-brøndvævskulturplade og en vævsholderbakke, der er forbundet med carbogen-linjen. B) Et diagram, der viser forsøgsdesignet for det endogene monoamin efflux-eksperiment, hvor vævsaktiveringen (B1), præinkubationen med/uden monoamintransportholdere (B2), efflux-eksperimentet (B3) og den endelige prøvebehandling præsenteres (B4-B5). (C) Panelet til venstre viser en eksperimentator, der indlæser perfusatet i HPLC som forberedelse til automatisk injektion. Højre panel viser en repræsentativ kromatogram betegner monoamin standard toppe. Området under kurven (AUC) måles for hver monoaminstandard og hjerneprøver. Efter kalibrering konverteres AUC målt for hver hjerneprøve til nM-koncentration. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Akutte hjerneskive var levedygtige ved forsøgets afslutning. En MTT-analyse blev udført for at bestemme vævs levedygtighed og sammenlignet med Triton X-100 1%, hvilket fremkalder celledød. Resultatet af MTT-analysen viste, at vævsprøverne ved udgangen af 6 timer stadig var levedygtige. Resultaterne udtrykkes som gennemsnittet ± SEM (N = 6). P < 0,0001, uparret t test. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Amfetamin fremkalder monoaminfrigivelse i akutte hjerneskiver fra hippocampus, præfrontale cortex og slag i dorsal striatum. (A-B) Hippocampal og præfrontale cortex skiver inkuberet i 30 μM AMPH resulterer i en betydelig stigning i 5-HT, DA og NE frigivelse. Fluoxetin hæmmer signifikant 5-HT-frigivelse, men har ingen indvirkning på DA- eller NE-frigivelsen i disse regioner. (C) der blev inkuberet 2 mm striatumslag i kokain (40 μM) eller AMPH (30 μM). AMPH stimuleret DA frigivelse og forbehandling med kokain førte til en betydelig reduktion af AMPH induceret DA frigivelse. Alle målinger er i nmol/g protein. Statistik repræsenterer en envejs ANOVA efterfulgt af Sidaks multiple comparison test. Resultaterne udtrykkes som gennemsnittet ± SEM (N = 6). Statistik repræsenterer en envejs ANOVA med Sidaks multiple sammenligningstest (** p = 0,01, *** p = 0,001, **** p = 0,0001). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Høj ekstracellulær K+ resulterer i monoaminfrigivelse gennem membrandepolarisering. (A-B) KCl (40 mM) fremkalder membrandepolarisering og frigivelse af alle tre monoaminer i HPC og PFC. I begge hjerneområder påvirker forbehandling med fluoxetin (10 μM) ikke KCl's effekt på ekstracellulær monoaminfrigivelse. (C) KCl (40 mM) fremkalder membrandepolarisering og frigivelse af DA i dorsal striatum, og forbehandling med kokain (40 μM) påvirker ikke KCl's virkning på DA-frigivelsen. Statistik repræsenterer en envejs ANOVA efterfulgt af Sidaks multiple comparison test. Resultaterne udtrykkes som gennemsnittet ± SEM (N = 6). Statistik repræsenterer en envejs ANOVA med Sidak's multiple sammenligning test (*** p < 0,001, **** p < 0,0001). Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende fil: Opskrifter på buffere og løsninger. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Monoamin frigivelse målinger er blevet udført i årevis i en række systemer såsom heterologe celler, neuronale kulturer, hjernesynaptosomes, ex vivo akutte hjerne skiver, og hele dyr13,20,41,42,58,64,65,66,67,68 . Sådanne præparater har gjort det muligt for området neurovidenskab at udforske grundlæggende neurotransmitter frigivelse mekanismer, der kan føre til opdagelsen af nye farmakologiske midler til neurologiske og psykiatriske lidelser, hvor monoaminer spiller en rolle. På trods af den brede anvendelse af sådanne metoder er der visse begrænsninger med hensyn til kilden og/eller mængden af endogene monoaminudslip, især i radioaktive procedurer. Derudover har ex vivo akutte hjerneskærpræparater været meget udbredt i forbindelse med elektrofysiologiske, farmakologiske, genetiske, molekylære, immunocytokemiske og andre tilgange18,24,25,47,50,51,59,69,70 , da de bevarer vævsarkitekturen og bevarer både neuronal aktivitet og synaptiske forbindelser. Således giver hjerneskiver ekstraordinære fordele sammenlignet med andre in vitro-modeller som heterologe systemer, primære dyrkede neuroner og synaptoomer. I vid udstrækning er deres fordel, at disse systemer kan reproducere mange aspekter af in vivo-miljøet.
Elektrofysiologiske, optogenetiske, fluorescerende sensorer og voltametric tilgange tilbyder udsøgt tidsmæssig og rumlig opløsning til at undersøge mekanismer forbundet med monoamin frigivelse, især DA. Men, den grundlæggende forudsætning for brugen af disse tilgange er, at den elektriske eller lys-induceret stimulation af neuroner fremkalder den klassiske, og veldokumenterede calcium-afhængige eksocytotiske vesikulær frigivelse af neurotransmittere18,21,22,24,27,30. En af de mere mærkbare begrænsninger ved disse tilgange er, at monoaminer, der frigives via alternative mekanismer (dvs. ikke-køretøjsfrigivelse), ikke opdages af disse teknikker. Radiolabeled neurotransmitter molekyler er også blevet brugt til at studere monoamin frigivelse, men denne tilgang har betydelige begrænsninger. Celler eller vævsprøver er fyldt med ikke-fysiologiske koncentrationer af mærkede neurotransmittere, der ikke trofast generobre det oprindelige miljø20,42,46. Interessant nok dokumenterer nogle få undersøgelser brugen af hjerneskiver i superfusionssystemer til at undersøge endogene monoaminfrigivelser53,54,56. Men, disse undersøgelser bruger radioaktive neurotransmittere, og dem, der undersøger den endogene neurotransmitter fokuserer kun på K + og ikke-fysiologiske betingelser for at fremkalde neurotransmitter frigivelse.
Den nuværende metode kan bruges til at undersøge transporter-medieret monoamin frigivelse fra indfødte væv. Dette gør det muligt for eksperimentatoren at overvinde begrænsningerne af tritierede neurotransmittere. Derudover giver denne tilgang en simpel opsætning til at måle endogene monoaminfrigivelse mere præcist gennem en direkte påvisning af monoaminer snarere end den indirekte måling ved brug af fluorescerende sensorer eller radiolabeled monoamin. Det er veletableret, at amfetamin fungerer som en monoamin transporter release agent i præfrontale cortex71, dorsal striatum56,72, og hippocampal39 hjerne regioner. Disse resultater blev bekræftet ved hjælp af denne 48-brønd plade system. Derudover, denne metode kan vise sig at være et supplement til aktuelt anvendte metoder, som måler samlede monoamin indhold ved hjælp af HPLC-ECD, men har ikke undersøgt monoamin release5,6,7. Denne metode giver en ny belufter designet til at måle den endogene frigivelse af monoaminer fra akutte hjerneskiver ved hjælp af HPLC kombineret med elektrokemisk detektion.
Mens du bruger denne metode, Er det afgørende, at hjernevæv holdes koldt i iltet buffer under eksperimentet for at forhindre forringelse. Derudover er det afgørende, at det anvendte væv aktiveres i en buffer, der indeholder pargylin for at forhindre monoaminforringelse. Desuden kan forsøgspersonen være nødt til at foretage fejlfinding af flere aspekter af denne metode. For det første, afhængigt af dyrets udviklingstidspunkt eller arter, kan det være nødvendigt at oprette mindre eller større sektioner eller bruge mere eller mindre sektioner, skiver eller slag pr. Tilstand. For det andet, afhængigt af hjernen region af interesse, der vil være varierende mængder af hver neurotransmitter. For det tredje, mens det er afgørende at sikre konsekvent boblende af ilt, når det bemærkes, skal eksperimentatoren være omhyggelig med ikke at give overskydende iltning, da dette kan føre til utilsigtet fjernelse af væv fra brønden. Endelig, da der er forskellige typer HPLC-enheder og forskellige separationskolonner, skal eksperimentatoren bestemme, baseret på litteraturen, hvilken enhed eller kolonne der ville fungere bedst for deres eksperiment.
Selvom denne metode giver eksperimentatoren evnen til hurtigt og præcist at få ex-vivo-data om frigivelse af endogene monoaminer, er der begrænsninger, der skal huskes. Da dette er en ex vivo-tilgang, afbrydes netværk og forbindelser, således er skiverne eller slagene ikke repræsentative for et intakt system. En anden vigtig begrænsning af denne tilgang er manglen på tidsmæssig, og rumlig opløsning som monoamin frigivelse måles i en tidsskala af minutter, og fra en population af frigivelse steder. Fremtidig raffinement af tilgangen kan tillade en optimering af tid og rumopløsning. Yderligere eksperimenter vil også undersøge de mekanismer, der er forbundet med frigivelse begivenheder. Efter at have demonstreret gyldigheden af den nuværende metode, fremtidige eksperimenter vil kræve at dissekere de molekylære begivenheder, der fører til monoamin frigivelse. Yderligere eksperimenter vil omfatte Ca2 +-fri efflux buffer, og selektive hæmmere af køretøjsfrigivelse som yderligere kontroller. Da den regionale fordeling af monoaminerne og deres transportører er tre uafhængige begivenheder, skal fremtidige eksperimenter omfatte mere omfattende farmakologi og en tidsforløbsundersøgelse, da forskellige lægemiddelforhold kan kræve kortere eller længere inkubationstider. For eksempel, baseret på regional distribution eller type væv, der anvendes, yderligere eksperimenter kan bruge mere specifikke farmakologiske blokkere for NET, SERT, eller DAT såsom desipramin, fluoxetin, og GBR12909, henholdsvis. Selv om vævet forblev levedygtigt under hele eksperimentet, er forsøgspersonen desuden ikke i stand til at udelukke muligheden for, at monoamintransportfunktionen kan være blevet påvirket under hele processen. Det udstyr, der kræves til denne metode, er billigt, men der er behov for at have adgang til en dyr HPLC-ECD. Dette kan afbødes af centrale faciliteter, da mange i øjeblikket har adgang til HPLC-ECD'er til kommunal brug. På trods af sådanne begrænsninger giver den nuværende metode en grundlæggende procedure, som kan yderligere manipuleres for at undersøge monoaminfrigivelse.
Generelt giver denne metode en enkel, høj gennemløb og billig to-trins procedure til at evaluere den samtidige frigivelse af monoaminer fra voksne gnaver neuroner ved hjælp af ex vivo akutte hjerneskiver fra forskellige hjerneområder. Ideelt set kan denne metode kombineres med in vivo-protokoller, og den indeholder foreløbige data, der gør det muligt for forsøgspersonen at reducere antallet af dyr, der kræves i in vivo-modeller, som anbefalet i de "tre R'er" (udskiftning, reduktion og raffinement) af dyrevelfærd. Det er således muligt at gennemføre denne ex vivo platform til screening af potentielt terapeutiske molekyler med det formål at opdage nye farmakologiske midler til behandling af tilstande forbundet med deregulering i monoamin homøostase.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen oplysninger.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud Fondecyt Initiation Fund N 11191049 til J.A.P. og NIH tilskud DA038598 til G.E.T.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 48 Well plate | NA | NA | Assay |
| Acetonitrile | Fischer Scientific | A998-1 | Mobile Phase |
| Calcium Chloride Ahydrous | Sigma Aldrich | C1016 | Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer |
| Clarity Software | Anetc | ||
| Citric Acid | Sigma Aldrich | Mobile Phase | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | 1002608421 | Dissection Buffer |
| DMF | Sigma Aldrich | D4551 | MTT Assay |
| EDTA-Na2 | Sigma Aldrich | Mobile Phase | |
| GraphPad Software | Graphpad Software, Inc | Statistical Analysis | |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | Lysis buffer |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | Lysis buffer |
| HPLC, Decade Amperometric | Anetc | HPLC, LC-EC system | |
| HPLC | Amuza | HPLC HTEC-510. | |
| L-Asrobic Acid | Sigma Aldrich | A5960 | Dissection Buffer |
| Magnesium Sulfate | Sigma | 7487-88-9 | KH Buffer |
| Microcentrifuge Filter Units UltraFree | Millipore | C7554 | Assay - 6 to fit in 48 well plate |
| MTT | Thermo Fisher | M6494 | MTT Assay |
| Nanosep | VWR | 29300-606 | Assay; protein assay |
| Octanesulfonic acid | Sigma Aldrich | V800010 | Mobile Phase |
| Pargyline Clorohydrate | Sigma Aldrich | P8013 | Modified Artifical Cerebrospinal Fluid OR Efflux Buffer |
| Phosphoric Acid | Sigma Aldrich | Mobile Phase | |
| Potassium Chloride | Sigma | 12636 | KH Buffer |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma | 1001655559 | KH Buffer |
| Precisonary VF-21-0Z | Precissonary | Compresstome | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma Aldrich | P2714 | Lysis buffer. |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | Dissection Buffer |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S5761 | Dissection Buffer |
| Sodium Chloride | Sigma | S3014 | KH Buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma Aldrich | L3771 | Lysis buffer |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | MTT Assay / Lysis buffer |
References
- Jesulola, E., Micalos, P., Baguley, I. J. Understanding the pathophysiology of depression: From monoamines to the neurogenesis hypothesis model - are we there yet. Behavioural Brain Research. 341, 79-90 (2018).
- Krystal, J. H., D'Souza, D. C., Sanacora, G., Goddard, A. W., Charney, D. S. Current perspectives on the pathophysiology of schizophrenia, depression, and anxiety disorders. Medical Clinics of North America. 85 (3), 559-577 (2001).
- Barone, P. Neurotransmission in Parkinson's disease: beyond dopamine. European Journal of Neurology. 17 (3), 364-376 (2010).
- Howell, L. L., Kimmel, H. L. Monoamine transporters and psychostimulant addiction. Biochemical Pharmacology. 75 (1), 196-217 (2008).
- Kirshner, Z. Z., et al. Impact of estrogen receptor agonists and model of menopause on enzymes involved in brain metabolism, acetyl-CoA production and cholinergic function. Life Sciences. 256, 117975 (2020).
- Long, T., et al. Comparison of transitional vs surgical menopause on monoamine and amino acid levels in the rat brain. Molecular and Cellular Endocrinology. 476, 139-147 (2018).
- Long, T., et al. Estradiol and selective estrogen receptor agonists differentially affect brain monoamines and amino acids levels in transitional and surgical menopausal rat models. Molecular and Cellular Endocrinology. 496, 110533 (2019).
- Burke, N. N., et al. Enhanced nociceptive responding in two rat models of depression is associated with alterations in monoamine levels in discrete brain regions. Neuroscience. 171 (4), 1300-1313 (2010).
- Lane, J. D., Aprison, M. H. Calciumm-dependent release of endogenous serotonin, dopamine and norepinephrine from nerve endings. Life Sciences. 20 (4), 665-671 (1977).
- Ramamoorthy, S., Shippenberg, T. S., Jayanthi, L. D. Regulation of monoamine transporters: Role of transporter phosphorylation. Pharmacology and Therapeutics. 129 (2), 220-238 (2011).
- Torres, G. E., Gainetdinov, R. R., Caron, M. G. Plasma membrane monoamine transporters: structure, regulation and function. Nature Reviews. Neuroscience. 4 (1), 13-25 (2003).
- Hilber, B., et al. Serotonin-transporter mediated efflux: A pharmacological analysis of amphetamines and non-amphetamines. Neuropharmacology. 49 (6), 811-819 (2005).
- Mauna, J. C., et al. G protein βγ subunits play a critical role in the actions of amphetamine. Translational Psychiatry. 9 (1), 81 (2019).
- Sitte, H. H., Freissmuth, M. Amphetamines, new psychoactive drugs and the monoamine transporter cycle. Trends in Pharmacological Sciences. 36 (1), 41-50 (2015).
- Johnson, L. A., Guptaroy, B., Lund, D., Shamban, S., Gnegy, M. E. Regulation of amphetamine-stimulated dopamine efflux by protein kinase C β. Journal of Biological Chemistry. 280 (12), 10914-10919 (2005).
- Kahlig, K. M., et al. Amphetamine induces dopamine efflux through a dopamine transporter channel. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (9), 3495-3500 (2005).
- Kantor, L., Hewlett, G. H. K., Gnegy, M. E. Enhanced amphetamine- and K+ -mediated dopamine release in rat striatum after repeated amphetamine: differential requirements for Ca 2+ - and calmodulin-dependent phosphorylation and synaptic vesicles. The Journal of Neuroscience. 19 (10), 3801-3808 (2018).
- Brodnik, Z. D., et al. Susceptibility to traumatic stress sensitizes the dopaminergic response to cocaine and increases motivation for cocaine. Neuropharmacology. 125, 295-307 (2017).
- Henke, A., et al. Toward serotonin fluorescent false neurotransmitters: development of fluorescent dual serotonin and vesicular monoamine transporter substrates for visualizing serotonin neurons. ACS Chemical Neuroscience. 9 (5), 925-934 (2018).
- Garcia-Olivares, J., et al. Gβγ subunit activation promotes dopamine efflux through the dopamine transporter. Molecular Psychiatry. 22 (12), 1673-1679 (2017).
- Xiao, N., Privman, E., Venton, B. J. Optogenetic control of serotonin and dopamine release in Drosophila larvae. ACS Chemical Neuroscience. 5 (8), 666-673 (2014).
- Bass, C. E., et al. Optogenetic control of striatal dopamine release in rats. Journal of Neurochemistry. 114 (5), 1344-1352 (2010).
- Stamford, J. A. Fast cyclic voltammetry: measuring transmitter release in "real time". Journal of Neuroscience Methods. 34 (1-3), 67-72 (1990).
- Brodnik, Z. D., Ferris, M. J., Jones, S. R., España, R. A. Reinforcing doses of intravenous cocaine produce only modest dopamine uptake inhibition. ACS Chemical Neuroscience. 8 (2), 281-289 (2017).
- Brodnik, Z. D., España, R. A. Dopamine uptake dynamics are preserved under isoflurane anesthesia. Neuroscience Letters. 606, 129-134 (2015).
- Ferris, M. J., Calipari, E. S., Yorgason, J. T., Jones, S. R. Examining the complex regulation and drug-induced plasticity of dopamine release and uptake using voltammetry in brain slices. ACS Chemical Neuroscience. 4 (5), 693-703 (2013).
- Siciliano, C. A., Calipari, E. S., Ferris, M. J., Jones, S. R. Biphasic mechanisms of amphetamine action at the dopamine terminal. The Journal of Neuroscience The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (16), 5575-5582 (2014).
- Rice, M. E., et al. Direct monitoring of dopamine and 5-HT release in substantia nigra and ventral tegmental area in vitro. Experimental Brain Research. 100 (3), 395-406 (1994).
- Bunin, M. A., Prioleau, C., Mailman, R. B., Wightman, R. M. Release and uptake rates of 5-hydroxytryptamine in the dorsal raphe and substantia nigra reticulata of the rat brain. Journal of Neurochemistry. 70 (3), 1077-1087 (1998).
- Park, J., Takmakov, P., Wightman, R. M. In vivo comparison of norepinephrine and dopamine release in rat brain by simultaneous measurements with fast-scan cyclic voltammetry. Journal of Neurochemistry. 119 (5), 932-944 (2011).
- Park, J., Bhimani, R. V., Bass, C. E. In vivo electrochemical measurements of norepinephrine in the brain: current status and remaining challenges. Journal of the Electrochemical Society. 165 (12), 3051-3056 (2018).
- Butcher, S. P., Fairbrother, I. S., Kelly, J. S., Arbuthnott, G. W. Amphetamine-induced dopamine release in the rat striatum: an in vivo microdialysis study. Journal of Neurochemistry. 50 (2), 346-355 (1988).
- Garcia-Olivares, J., et al. Inhibition of dopamine transporter activity by G protein βγ subunits. PLoS One. 8 (3), 1-9 (2013).
- Carneiro, A. M. D., Blakely, R. D. Serotonin-, protein kinase C-, and Hic-5-associated redistribution of the platelet serotonin transporter. Journal of Biological Chemistry. 281 (34), 24769-24780 (2006).
- Rajamanickam, J., et al. Akt-mediated regulation of antidepressant-sensitive serotonin transporter function, cell-surface expression and phosphorylation. The Biochemical Journal. 468 (1), 177-190 (2015).
- Egaña, L. A., et al. Physical and functional interaction between the dopamine transporter and the synaptic vesicle protein synaptogyrin-3. The Journal of Neuroscience The Official Journal of the Society for Neuroscience. 29 (14), 4592-4604 (2009).
- Guptaroy, B., Fraser, R., Desai, A., Zhang, M., Gnegy, M. E. Site-directed mutations near transmembrane domain 1 alter conformation and function of norepinephrine and dopamine transporters. Molecular Pharmacology. 79 (3), 520-532 (2011).
- Ordway, G. A., et al. Norepinephrine transporter function and desipramine: Residual drug effects versus short-term regulation. Journal of Neuroscience Methods. 143 (2), 217-225 (2005).
- Steinkellner, T., et al. Amphetamine action at the cocaine- and antidepressant-sensitive serotonin transporter is modulated by CaMKII. Journal of Neuroscience. 35 (21), 8258-8271 (2015).
- Guptaroy, B., et al. A juxtamembrane mutation in the N terminus of the dopamine transporter induces preference for an inward-facing conformation. Molecular Pharmacology. 75 (3), 514-524 (2009).
- Carpenter, C., et al. Direct and systemic administration of a CNS-permeant tamoxifen analog reduces amphetamine-induced dopamine release and reinforcing effects. Neuropsychopharmacology. 42 (10), 1940-1949 (2017).
- Aquino-Miranda, G., Escamilla-Sánchez, J., González-Pantoja, R., Bueno-Nava, A., Arias-Montaño, J. -A. Histamine H3 receptor activation inhibits dopamine synthesis but not release or uptake in rat nucleus accumbens. Neuropharmacology. 106, 91-101 (2016).
- Reddy, I. A., et al. Glucagon-like peptide 1 receptor activation regulates cocaine actions and dopamine homeostasis in the lateral septum by decreasing arachidonic acid levels. Translational Psychiatry. 6 (5), 809 (2016).
- Koutzoumis, D. N., et al. Alterations of the gut microbiota with antibiotics protects dopamine neuron loss and improve motor deficits in a pharmacological rodent model of Parkinson's disease. Experimental Neurology. 325, 113159 (2020).
- Herdon, H., Strupish, J., Nahorski, S. R. Differences between the release of radiolabelled and endogenous dopamine from superfused rat brain slices: Effects of depolarizing stimuli, amphetamine and synthesis inhibition. Brain Research. 348 (2), 309-320 (1985).
- Thongsaard, W., Kendall, D. A., Bennett, G. W., Marsden, C. A. A simple method for measuring dopamine release from rat brain slices. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 37 (3), 143-148 (1997).
- Dorris, D. M., Hauser, C. A., Minnehan, C. E., Meitzen, J. An aerator for brain slice experiments in individual cell culture plate wells. Journal of Neuroscience Methods. 238, 1-10 (2014).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: a review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Papouin, T., Haydon, P.
- Collingridge, G. L. The brain slice preparation: a tribute to the pioneer Henry McIlwain. Journal of Neuroscience Methods. 59 (1), 5-9 (1995).
- Yamamoto, C., McIlwain, H. Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro. Journal of Neurochemistry. 13 (12), 1333-1343 (1966).
- Buskila, Y., et al.
- Kako, H., Fukumoto, S., Kobayashi, Y., Yokogoshi, H. Effects of direct exposure of green odour components on dopamine release from rat brain striatal slices and PC12 cells. Brain Research Bulletin. 75 (5), 706-712 (2008).
- McBride, W. J., Murphy, J. M., Lumeng, L., Li, T. -K. Effects of ethanol on monoamine and amino acid release from cerebral cortical slices of the alcohol-preferring P line of rats. Alcoholism: Clinical and Experimental Research. 10 (2), 205-208 (1986).
- Chen, J. C., Turiak, G., Galler, J., Volicer, L. Effect of prenatal malnutrition on release of monoamines from hippocampal slices. Life Sciences. 57 (16), 1467-1475 (1995).
- Becker, J. B., Castañeda, E., Robinson, T. E., Beer, M. E. A simple in vitro technique to measure the release of endogenous dopamine and dihydroxyphenylacetic acid from striatal tissue using high performance liquid chromatography with electrochemical detection. Journal of Neuroscience Methods. 11 (1), 19-28 (1984).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. London. (2007).
- Dailey, J. W., Reith, M. E. A., Steidley, K. R., Milbrandt, J. C., Jobe, P. C. Carbamazepine-induced release of serotonin from rat hippocampus in vitro. Epilepsia. 39 (10), 1054-1063 (1998).
- Buskila, Y., et al.
- Mewes, A., Franke, H., Singer, D. Organotypic brain slice cultures of adult transgenic P301S mice-A model for tauopathy studies. PLoS One. 7 (9), (2012).
- Rönicke, R., et al. AB mediated diminution of MTT reduction - An artefact of single cell culture. PLoS One. 3 (9), (2008).
- Ihalainen, J. A., Riekkinen, P., Feenstra, M. G. P. Comparison of dopamine and noradrenaline release in mouse prefrontal cortex, striatum and hippocampus using microdialysis. Neuroscience Letters. 277 (2), 71-74 (1999).
- Richards, D. A., Obrenovitch, T. P., Symon, L., Curzon, G. Extracellular dopamine and serotonin in the rat striatum during transient ischaemia of different severities: a microdialysis study. Journal of Neurochemistry. 60 (1), 128-136 (1993).
- Fog, J. U., et al. Calmodulin kinase II interacts with the dopamine transporter C terminus to regulate amphetamine-induced reverse transport. Neuron. 51 (4), 417-429 (2006).
- Balázsa, T., Bíró, J., Gullai, N., Ledent, C., Sperlágh, B. CB1-cannabinoid receptors are involved in the modulation of non-synaptic [3H]serotonin release from the rat hippocampus. Neurochemistry International. 52 (1), 95-102 (2008).
- Schechter, L. E. The potassium channel blockers 4-aminopyridine and tetraethylammonium increase the spontaneous basal release of [3H]5-hydroxytryptamine in rat hippocampal slices. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 282 (1), 262-270 (1997).
- Boudanova, E., Navaroli, D. M., Stevens, Z., Melikian, H. E. Dopamine transporter endocytic determinants: carboxy terminal residues critical for basal and PKC-stimulated internalization. Molecular and Cellular Neuroscience. 39 (2), 211-217 (2008).
- Bowyer, J. F., et al. Interactions of MK-801 with glutamate-, glutamine- and methamphetamine-evoked release of [3H]dopamine from striatal slices. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 257 (1), 262-270 (1991).
- Perszyk, R. E., et al. GluN2D-containing N-methyl-D-aspartate receptors mediate synaptic transmission in hippocampal interneurons and regulate interneuron activity. Molecular Pharmacology. 90 (6), 689-702 (2016).
- Jones, S. R., et al. Profound neuronal plasticity in response to inactivation of the dopamine transporter. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (7), 4029-4034 (1998).
- Jedema, H. P., Narendran, R., Bradberry, C. W. Amphetamine-induced release of dopamine in primate prefrontal cortex and striatum: striking differences in magnitude and timecourse. Journal of Neurochemistry. 130, 490-497 (2014).
- Buchmayer, F., et al. Amphetamine actions at the serotonin transporter rely on the availability of phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11642-11647 (2013).
