Summary
Utilizando vídeo simultâneo EEG-ECG-oximetria-capnografia, desenvolvemos uma metodologia para avaliar a suscetibilidade de modelos de coelhos para desenvolver arritmias provocadas e convulsões. Este novo sistema de gravação estabelece uma plataforma para testar a eficácia e a segurança da terapêutica e pode capturar a complexa cascata de eventos multi-sistemas que culminam em morte súbita.
Abstract
Pacientes com canalopatias de íons têm alto risco de desenvolver convulsões e arritmias cardíacas fatais. Há maior prevalência de doenças cardíacas e arritmias em pessoas com epilepsia (ou seja, coração epiléptico.) Além disso, distúrbios cardíacos e autônomos foram relatados em torno de convulsões. 1:1.000 pacientes com epilepsia/ano morrem de morte inesperada súbita na epilepsia (SUDEP). Os mecanismos para a SUDEP permanecem incompletamente compreendidos. Eletroencefalogramas (EEG) e eletrocardiogramas (ECG) são duas técnicas rotineiramente utilizadas no cenário clínico para detectar e estudar os substratos/gatilhos para convulsões e arritmias. Embora muitos estudos e descrições dessa metodologia estejam em roedores, sua atividade elétrica cardíaca difere significativamente dos humanos. Este artigo fornece uma descrição de um método não invasivo para gravação simultânea de vídeo-EEG-ECG-oximetria-capnografia em coelhos conscientes. Como a função elétrica cardíaca é semelhante em coelhos e humanos, os coelhos fornecem um excelente modelo de estudos diagnósticos e terapêuticos translacionais. Além de delinear a metodologia de aquisição de dados, discutimos as abordagens analíticas para o exame da função elétrica neuro-cardíaca e da patologia em coelhos. Isso inclui detecção de arritmia, análise espectral do EEG e uma escala de convulsão desenvolvida para coelhos contidos.
Introduction
A eletrocardiografia (ECG) é rotineiramente utilizada no cenário clínico para avaliar a dinâmica da condução elétrica cardíaca e o processo de ativação-recuperação elétrica. O ECG é importante para detectar, localizar e avaliar o risco de arritmias, isquemias e infartos. Normalmente, os eletrodos são afixados no peito, braços e pernas do paciente, a fim de fornecer uma visão tridimensional do coração. Uma deflexão positiva é produzida quando a direção da despolarização do miocárdio é para o eletrodo e uma deflexão negativa é produzida quando a direção da despolarização do miocárdio está longe do eletrodo. Os componentes eletrográficos do ciclo cardíaco incluem despolarização atrial (onda P), condução arrial-ventricular (intervalo P-R), excitação ventricular (complexo QRS) e repolarização ventricular (onda T). Há grandes semelhanças no ECG e medidas potenciais de ação em muitos mamíferos, incluindo humanos, coelhos, cães, cobaias, porcos, cabras e cavalos1,2,3.
Coelhos são um modelo ideal para pesquisa translacional cardíaca. O coração do coelho é semelhante ao coração humano em termos de composição do canal de íons, e propriedades potenciais de ação2,4,5. Coelhos têm sido usados para a geração de modelos genéticos, adquiridos e induzidos por drogas de doenças cardíacas2,4,6,7,8. Há grandes semelhanças no ECG cardíaco e resposta potencial de ação a drogas em humanos e coelhos7,10,11.
A frequência cardíaca e o processo de ativação elétrica cardíaca é muito diferente em roedores, em comparação com coelhos, humanos e outros mamíferos maiores12,13,14. O coração de roedor bate ~10 vezes mais rápido que os humanos. Em contrapartida, para o segmento ISO-elétrico ST em ECGs humanos e coelhos, não há segmento ST em roedores14,15,16. Além disso, os roedores têm uma forma de onda QRS-r com uma onda T invertida14,15,16. As medições do intervalo QT são muito diferentes em roedores vs. humanos e coelhos14,15,16. Além disso, os valores normais de ECG são muito diferentes em humanos vs. roedores12,15,16. Essas diferenças nas formas de onda do ECG podem ser atribuídas a diferenças na morfologia potencial de ação e nos canais de íons que impulsionam a repolarização cardíaca9,14. Enquanto a corrente transitória de potássio externo é a maior corrente de repolarização na morfologia potencial de ação cardíaca curta (não-cúpula) em roedores, em humanos e coelhos há uma grande cúpula fase-2 sobre o potencial de ação, e as correntes de potássio retificadora atrasadas (IKr e IKs) são as principais correntes repolarizantes em humanos e coelhos4,9,13,17. É importante ressaltar que a expressão de IKr e IKs é ausente/mínima em roedores, e devido à ativação temporal cinética de IKr e IKs não tem um papel na ação cardíaca potencial morfologia9,13. Assim, os coelhos fornecem um modelo mais translacional para avaliar os mecanismos de anormalidades e arritmias induzidas, adquiridas e herdadas de drogas4,7,13. Em seguida, como inúmeros estudos têm mostrado a presença de anormalidades elétricas neuronais e cardíacas em doenças cardíacas primárias (Síndrome de QT Longo18,19,20) ou doenças neuronais (epilepsia21,22,23,24), é importante estudar os mecanismos subjacentes em um modelo animal que reproduz de perto a fisiologia humana. Embora os roedores possam ser suficientes para modelar o cérebro humano, os roedores não são um modelo ideal de fisiologia cardíaca humana7.
A eletroencefalografia (EEG) utiliza eletrodos, geralmente colocados no couro cabeludo ou intracranianamente, para registrar a função elétrica cortical. Estes eletrodos podem detectar alterações na taxa de disparo e sincronicidade de grupos de neurônios piramida próximos no córtex cerebral25. Essas informações podem ser usadas para avaliar a função cerebral e o estado de despertar/sono. Além disso, os EEGs são úteis para localizar a atividade epiepiforme e distinguir convulsões epilépticas de eventos não epilépticos (por exemplo, atividade psicogênica não epiléptica e eventos cardiogênicos). Para diagnosticar o tipo de epilepsia, provocando fatores e a origem da convulsão, os pacientes com epilepsia são submetidos a diversas manobras que podem provocar uma convulsão. Vários métodos incluem hiperventilação, estimulação fótica e privação do sono. Este protocolo demonstra o uso de estimulação fótica para induzir aberrações e apreensões de EEG em coelhos26,27,28,29.
Gravações simultâneas de vídeo-EEG-ECG têm sido amplamente utilizadas em humanos e roedores para avaliar a atividade comportamental, neuronal e cardíaca durante os estados pré-ictal, ictal e pós-ictal30. Embora vários estudos tenham realizado gravações de EEG e ECG separadamente em coelhos4,31,32,33, um sistema para aquisição e análise de vídeo simultâneo-EEG-ECG no coelho consciente contido não está bem estabelecido34. Este artigo descreve o desenho e a implementação de um protocolo que pode gravar dados simultâneos de vídeo-EEG-ECG -capnografia-oximetria em coelhos conscientes, a fim de avaliar a função elétrica e respiratória neuro-cardíaca. Os resultados obtidos a partir deste método podem indicar a suscetibilidade, gatilhos, dinâmica e concordância entre arritmias, convulsões, distúrbios respiratórios e manifestações físicas. Uma vantagem do nosso sistema experimental é que adquirimos gravações conscientes sem a necessidade de um sedativo. Os coelhos permanecem nos contentores por ≥5 h, com movimento mínimo. Como anestésicos perturbam a função neuronal, cardíaca, respiratória e autônoma, as gravações durante o estado consciente fornecem os dados mais fisiológicos.
Este sistema de gravação pode, em última análise, fornecer insights detalhados para avançar na compreensão dos mecanismos neurológicos, cardíacos e respiratórios para morte súbita inesperada em epilepsia (SUDEP). Além do monitoramento neurológico e cardíaco acima, evidências recentes também apoiaram o papel da insuficiência respiratória como potencial contribuição para a morte súbita após uma convulsão35,36. Para monitorar o estado respiratório dos coelhos, foram implementadas oximetria e capnografia para avaliar o estado do sistema respiratório antes, durante e depois de uma convulsão. O protocolo aqui apresentado foi concebido com o objetivo de avaliar o limiar para convulsões de coelhos induzidos por farmacologicamente e estímulos fóticos. Este protocolo pode detectar sutis anormalidades de EEG e ECG que podem não resultar em manifestações físicas. Além disso, este método pode ser usado para testes de segurança cardíaca e eficácia anti-arrítmica de novas drogas e dispositivos.
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Protocol
Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) e do Comitê de Uso e Uso Institucional de Animais (IACUC). Além disso, um esboço deste protocolo é fornecido na Figura 1.
1. Preparação de equipamentos de gravação
- Conecte o computador a um amplificador com uma caixa de cabeça de 64 pinos.
NOTA: Cada animal tem quatro eletrodos de pinos de couro cabeludo subdérmicos (7 ou 13 mm) para EEGs dos 4 quadrantes da cabeça, 3 eletrodos de pinos subdérmicos dobrados (ângulo de 13 mm, 35°) para ECG (triângulodeEinthoven), 1 eletrodo de pino subdérmico dobrado na perna direita e 1 eletrodo de couro cabeludo subdérmico reto no centro da cabeça serve como referência. - Para fazer de cada 8pinos na caixa de entrada uma referência, atualize as configurações de software de aquisição, a guia de aquisição, de modo que o Eletrodo de Referência seja "Independente" (ou seja, modo de pesquisa).
NOTA: Isso permite gravações de até 7 animais simultaneamente, cada um com 7 eletrodos mais um eletrodo de referência dedicado e um eletrodo de terra, tudo através de um amplificador, digitalizador e computador. Todos os eletrodos são adquiridos como canais unipolares e comparados com a referência (centro da cabeça.) Configurações/montagens adicionais de chumbo bipolar e aumentada podem ser configuradas durante ou após a gravação. Como a configuração tem a capacidade de gravar de vários animais simultaneamente, um eletrodo moído de cada animal é conectado em paralelo à entrada do solo no amplificador(Figura 2). - Remova coelhos de sua gaiola e pese-os para calcular a dose de droga apropriada para cada animal. Coloque os coelhos em um transportador e leve-os para uma sala separada, a fim de minimizar o estresse para animais não experimentais. Neste estudo, foram utilizados coelhos brancos da Nova Zelândia e seus descendentes subsequentes. Foram realizados experimentos em coelhos > de 1 mês de idade. No momento do experimento, esses coelhos pesavam entre 0,47 e 5,00 kg.
NOTA: Como os coelhos precisam estar na mesma sala e, à vista da câmera, não isole completamente os coelhos. Há o potencial de manifestações visuais e auditivas de um coelho estressando outro coelho. Portanto, é ideal ter um coelho na sala de cada vez, o que é feito para os experimentos de estimulação fótica. Para todos os outros experimentos, os coelhos são espaçados o máximo possível, mantendo todos eles dentro da visão da câmera de vídeo. Idealmente, as barreiras são usadas ou apenas um animal é estudado por vez. Este não foi um grande confundimento, pois as frequências cardíacasdos coelhos permaneceram bastante estáveis durante os experimentos e houve a presença frequente de fusos de sono. Gravações de vários animais simultaneamente garantem que os dados de controle e teste de animais sejam adquiridos sob as mesmas condições ambientais.
2. Implantação de eletrodos EEG-ECG e anexação de monitores respiratórios
- Remova um coelho do porta-transporte e coloque no colo de um investigador sentado.
- Segure o coelho verticalmente e mantenha-o pertodocorpo do investigador.
- Abaixe o coelho em uma posição supina, com a cabeçadocoelho nos joelhosdoinvestigador, e a cabeçadocoelho mais baixa que o resto de seu corpo.
NOTA: Esta manobra relaxa o animal e minimiza a probabilidade de ele tentar se mover ou escapar enquanto coloca os eletrodos. - Agora que o coelho está preso em uma posição supina, peça a um segundo investigador para espalhar a pele até que a pele possa ser identificada e isolada do tecido subjacente.
- Insira eletrodos dobrados de 35° subderme em cada axilla(Figura 3A).
NOTA: Os eletrodos devem ser empurrados para que estejam firmemente ligados à pele, mas não penetrem em estruturas mais profundas. Ter o eletrodo entrar e sair da pele (através e através) reduz a chance de os leads serem desalojados ao colocar o coelho no conterr condutor ou se ele se move durante o experimento(Figura 3B). Todos os eletrodos são esterilizados com 70% de etanol antes da colocação. - Coloque as pistas no tórax posterior para a direita e membros dianteiros esquerdos e no abdômen anterior ao membro traseiro esquerdo. Coloque um pino-eletrodo de terra anterior ao membro traseiro direito no abdômen(Figura 4A).
- Uma vez que todos os leads de ECG são devidamente colocados, devolva o coelho a uma posição propensa, com as pistas correndo por um lado do abdômen do coelho, e transfira o coelho para um conterrâneo de tamanho apropriado (por exemplo, 6" x 18" x 6"). Ao colocar o coelho no contento, puxe o fio solto para cima para minimizar o coelho de puxar os eletrodos com as pernas. Tape os fios para o lado do conterreiro para que eles não sejam pegos sob o coelho durante o experimento(Figura 4B).
- Fixar o coelho no contenção baixando a contenção ao redor do pescoço e trancando-o no lugar. Além disso, mova os membros traseiros para cima sob o animal e proteja a contenção traseira.
NOTA: Deve-se ser capaz de encaixar 1-2 dedos dentro do espaço sob o pescoço para garantir que não está muito apertado. Particularmente durante experimentos onde pode haver movimento motor, é importante apertar a contenção para minimizar o movimento, possíveis lesões na coluna vertebral, luxação do membro e a capacidade de chutar a contenção traseira(Figura 4B). Coelhos foram mantidos no contenção por ~5 h sem quaisquer problemas relacionados ao aumento do movimento ou sinais de desidratação.- Para coelhos pequenos (por exemplo, menos de 2 meses) coloque uma almofada de reforço de borracha sob o animal para levantar o coelho, o que impede o coelho de descansar o pescoço na parte inferior da contenção da cabeça(Figura 4C).
NOTA: Uma queda repentina na frequência respiratória e cardíaca pode ser secundária ao impacto do pescoço. Se isso ocorrer, solte o conterr mais do pescoço e levante a cabeçadocoelho para aliviar qualquer compressão do pescoço. - Quando a contenção traseira não rastrear de perto a parte traseira/coluna do coelho, coloque um espaçador de PVC para evitar qualquer movimento que possa causar lesões na coluna vertebral.
NOTA: Por exemplo, ~14 cm de comprimento x 4" tubo de PVC de diâmetro interno, com a parte inferior 25-33% removida pode ser colocado sobre o coelho com espuma para fornecer contenção adequada(Figura 4C).
- Para coelhos pequenos (por exemplo, menos de 2 meses) coloque uma almofada de reforço de borracha sob o animal para levantar o coelho, o que impede o coelho de descansar o pescoço na parte inferior da contenção da cabeça(Figura 4C).
- Agora que o coelho está firmemente colocado no contento, insira os eletrodos subdérmicos de pinos retos de 7-13 mm no couro cabeludo(Figura 3A). Usando uma aproximação de ângulo de 45° de entrada, execute os fios entre as orelhas e amarre os fios ao conterr falante da cabeça para manter a colocação do chumbo. O EEG coloca 5 nas seguintes posições: anterior direito, anterior esquerdo, occipital direito, occipital esquerdo e uma referência central (Cz) no ponto entre as outras 4 pistas(Figura 4D).
NOTA: Os eletrodos são colocados corretamente quando estão posicionados em tecido subcutâneo contra o crânio. Esta colocação minimiza o artefato do nariz, orelhas e outros músculos circundantes. Algum artefato do movimento rítmico do nariz é inevitável. As pistas anteriores do EEG devem ser colocadas medial aos olhosdocoelho e apontar anteriormente. As pistas occipitais devem ser colocadas anteriormente aos ouvidos e apontarão na direção medial. Cz é colocado no centro da parte superior da cabeça em um ponto que está entre todos os 4 eletrodos (meio caminho entre Lambda e Bregma, ao longo da linha de sutura). O pino do eletrodo Cz aponta anteriormente.- Passe os fios EEG entre as orelhas, para evitar que o coelho tentando morder os fios.
- Conecte o pletimógrafo do oxímetro de pulso à orelha do coelho sobre a veia marginal da orelha.
NOTA: Pode ser necessário raspar o excesso de cabelo da orelha para melhorar o sinal ou usar alguma gaze para manter o sensor no lugar.- Certifique-se de que a frequência cardíaca na plethysmografia se correlaciona com a frequência cardíaca do ECG e que a saturação de oxigênio seja exibida(Figura 5C).
- Coloque suavemente a máscara facial com tubos de capnografia sobre a boca e o nariz do coelho(Figura 4H). Fixar a máscara facial com corda enrolada ao redor da máscara e anexar as duas extremidades da corda ao conterrâneo. Conecte a outra extremidade da tubulação de capnografia ao monitor de sinais vitais.
NOTA: É importante evitar que a corda deita sobre os olhos do coelho durante o experimento. Para fazer isso, amarre a corda no meio do cabrheiro entre as orelhas do coelho. Para melhorar o sinal de capnografia, crie uma válvula unidirecional usando fita adesiva e um fino pedaço de nitrito que permitirá a entrada de oxigênio na peça T, e direcionará co2 expirado para a tubulação de capnografia(Figura 4I).
3. Gravação de vídeo-EEG-ECG
- Execute a gravação de vídeo-EEG-ECG usando um software EEG comercialmente disponível.
NOTA: Os leads e o vídeo biopotenciais são bloqueados para mais tarde correlacionar os sinais elétricos e de vídeo (por exemplo, espeto de EEG com um empurrão mioclônico). - Confirme a conectividade ideal, sem deriva de linha de base, sem ruído elétrico de 60 Hz e alta relação sinal-ruído. Especificamente, certifique-se de que cada fase da forma de onda cardíaca possa ser visualizada no ECG e que as ondas delta, e alfa não sejam obscurecidas visualmente pelo ruído de alta frequência no EEG.
- Se todos os eletrodos estiverem produzindo quantidades excessivas de ruído, ajuste o chumbo de referência central. Se apenas um eletrodo for excessivamente barulhento, então empurre esse eletrodo mais fundo na pele ou reposicione-o até que não haja metal exposto.
- Ajuste o vídeo para que todos os coelhos possam ser vistos simultaneamente, o que permite a correlação da atividade motora com os achados de EEG(Figura 5A).
NOTA: O sistema acomoda gravações simultâneas de EEG/ECG/oximetria/capnografia de até 7 coelhos. - Inicie a gravação da linha de base de cada animal por um mínimo de 10-20 min ou até que a frequência cardíaca se estabilize para um estado calmo e relaxado (200-250 bpm) e os coelhos não apresentam grandes movimentos por pelo menos 5 minutos. Adquira dados eletrográficos de largura de banda completa sem filtros. Para melhor visualizar os dados, defina o filtro de baixa frequência (=filtro de passagem alta) a 1 Hz e o filtro de alta frequência (=filtro de passagem baixa) a 59 Hz.
NOTA: Outro sinal de que o coelho está relaxado é o aparecimento de fusos de sono EEG (discutidos posteriormente). - Adicione notas bloqueadas durante o experimento em tempo real para indicar o tempo de intervenções (por exemplo, entrega de drogas) e eventos neuro-cardíacos (por exemplo, pico de EEG, convulsões motoras, batida ectópica e arritmias) e artefatos motor/investigador.
NOTA: Devido à frequência que o investigador precisa para aplicar uma intervenção (por exemplo, estimulação fótica, entrega de medicamentos), para minimizar o estresse de um investigador entrando e saindo da sala e abrindo/fechando a porta, o investigador permanece no lado oposto da sala durante todo o experimento. O investigador fica o mais longe possível do animal, e permanece quieto e quieto para minimizar potencialmente perturbando os animais.
4. Protocolos experimentais
NOTA: Cada um dos seguintes experimentos são realizados em dias separados se forem realizados no mesmo animal. Há um atraso de duas semanas entre os testes orais compostos estudos de drogas, e o estudo de drogas terminais agudas pró-convulsiva. Quando necessário, o experimento de estimulação fótica é realizado, seguido por uma espera de 30 minutos, e depois o estudo de drogas PTZ.
- Para permitir que os coelhos se aclimatam nos contentores e que o pesquisador confirme objetivamente a estabilização das taxas cardiorrespiratórias, instrumentalize todos os coelhos com os sensores cardiorrespiratórios e neuronais e realize o monitoramento contínuo por > 1 hora, 1 - 3 vezes por animal.
- Experimento de estimulação fótica
- Além do método descrito acima, coloque uma fonte de luz com um refletor circular de 30 cm na frente do coelho ao nível dos olhos, com a intensidade de flash definida ao máximo (16 candela)29. A fonte de luz é indicada por um ponto branco na Figura 4E.
NOTA: Uma sala mal iluminada deve ser usada para provocar a resposta fotossensível37. - Como os olhosdocoelho estão do lado da cabeça em vez da frente de sua cabeça (como em humanos), coloque 2 espelhos em ambos os lados do coelho, e um atrásdocoelho para que a luz entre nos olhos do coelho.
NOTA: Um espelho plano que tem ≥ 20 cm de altura, por ≥ 120 cm de comprimento cria um gabinete triangular ao redor do coelho para garantir que a luz piscando entre nos olhosdocoelho, como visto na Figura 4E. - Conecte a fonte de luz a um controlador que tenha uma taxa, intensidade e duração ajustáveis.
- Grave vídeo usando uma câmera com luz vermelha e capacidades de gravação infravermelha.
- Exponha os coelhos a cada frequência por 30 s com os olhos abertos e, em seguida, outros 30 s com uma máscara cirúrgica cobrindo seu rosto para simular ou causar fechamento ocular em cada frequência.
NOTA: Estudos anteriores mostraram que o fechamento dos olhos é a manobra mais provocativa para provocar fotosensibilidade à convulsão29. Além disso, 10% dos pacientes fotosensíveis só apresentam sinais eletroencefalográficos enquanto seus olhos estão fechados29. Uma convulsão pode ser identificada clinicamente observando a presença de mioclônicos da cabeça e do corpo inteiro, clonus ou um estado tônico. O registro do EEG é mais aprofundado para correlação eletroencefalográfica (por exemplo, picos, poli-picos e descargas rítmicas) com manifestações motoras para um diagnóstico definitivo da atividade convulsiva. Os movimentos em que o EEG é obscurecido por artefato muscular ou ondas de epieptogenicidade indeterminante devem ser revistos por um epitético para confirmação. - Aumente a frequência do estimulador fótico de 1 Hz para 25 Hz em incrementos de 2 Hz. Em seguida, realize o mesmo protocolo de foto-estimulação, mas desta vez diminua a frequência de 60 Hz para 25 Hz em incrementos de 5 Hz.
NOTA: Se um coelho tiver uma convulsão, o experimento deve ser interrompido. Continue monitorando o coelho por 30 minutos. Em seguida, devolva o coelho para a sala de habitação e monitore a cada 1h por 3h para recuperação completa. No entanto, se a estimulação fótica induz uma resposta fotoparoxística, então o restante das frequências ascendentes são pulados e a série é iniciada novamente descendo de 60 Hz até que outra resposta fotoparoxística ocorra. Isso permitirá a determinação dos limiares de estimulação fótica superior e inferior. Não é necessário atraso, pois a resposta fotoparoxística cessará após a estimulação fótica ser interrompida. Se não está claro se ocorreu uma resposta fotoparoxissmal, a frequência é repetida após um atraso de 10 s38. - Após a conclusão do experimento, remova os condutores de EEG e ECG do coelho e devolva-os à sua gaiola doméstica para cuidados de rotina por parte da equipe de criação.
- Além do método descrito acima, coloque uma fonte de luz com um refletor circular de 30 cm na frente do coelho ao nível dos olhos, com a intensidade de flash definida ao máximo (16 candela)29. A fonte de luz é indicada por um ponto branco na Figura 4E.
- Administração oral de medicamentos
- Como muitas drogas são tomadas oralmente, prepare compostos orais misturando-se com molho de maçã de grau alimentar. Misture 0,3 mg/kg de E-4031 em 3 mL de molho de maçã e carregue em uma seringa oral/irrigação de 3 mL sem agulha.
NOTA: Vários medicamentos podem ser administrados desta forma, incluindo, compostos de teste, drogas que são conhecidas por alterar a duração do QT (moxifloxacina ou E-4031), e um controle negativo ou veículo. Algumas drogas não estão disponíveis em uma formulação intravenosa. Além disso, muitos medicamentos são prescritos em uma formulação oral e, portanto, uma administração intravenosa pode ter menor relevância clínica. - Levante os lábios superiores e deslize a ponta da seringa oral para o ladodaboca do coelho, que é desobstruída pelos dentesdocoelho, e injete toda a medicação e molho de maçã na bocadocoelho.
- Continue a gravação de vídeo-EEG-ECG por 2h e depois devolva o animal para sua gaiola doméstica para cuidados de rotina.
- Nos dias experimentais 2 e 3, conecte o coelho ao vídeo-EEG-ECG, grave 10-20 minutos de linha de base, depois injete a mesma medicação e grave por 2h.
- Após 1 semana de lavagem, realize 10-20 min de linha de base, e, em seguida, dar a cada coelho uma única dose de placebo por 3 dias consecutivos e recorde de 2h.
NOTA: A administração de medicamentos orais pode ser projetada como um estudo crossover, no qual o placebo é dado durante a semana 1 e a medicação na semana 2.
- Como muitas drogas são tomadas oralmente, prepare compostos orais misturando-se com molho de maçã de grau alimentar. Misture 0,3 mg/kg de E-4031 em 3 mL de molho de maçã e carregue em uma seringa oral/irrigação de 3 mL sem agulha.
- Experimento de medicação intravenosa (Pentilenotrazol, PTZ)
- Para visualizar a veia marginal da orelha, raspe a superfície posteriordaorelha do coelho. Use uma limpeza de 70% de etanol para desinfetar o local e dilatar a veia marginal do ouvido. Isso é indicado pelo oval tracejado preto na Figura 4F.
- Neste ponto, um experimentador cubra o rostodocoelho com a mão, a fim de diminuir o estresse do procedimento para o coelho. Um segundo experimentador cuidadosamente cannula a veia auditiva marginal com um angiocateter 25 G estéril.
- Uma vez que o cateter esteja na veia, coloque um plugue de injeção estéril na extremidade do cateter para que uma agulha possa introduzir a medicação por via intravenosa. A localização do plugue de injeção é indicada por um círculo azul na Figura 4G.
- Faça uma tala embrulhando gaze de 4 x 4 polegadas com fita para formar uma forma de tubo e colocá-la dentrodaorelha do coelho. Em seguida, coloque a tala na orelha para que o cateter fique no lugar e permaneça ereto, semelhante ao ouvido não cateterizado.
- Injete 1 mL de 10 unidades usp por mL de soro fisiológico heparinizado.
NOTA: O cateter e o vaso devem ser visivelmente limpos do ar e permanecer patenteados. Se o cateter não estiver no vaso, a seringa não empurrará facilmente e haverá acúmulo de soro fisiológico no tecido subcutâneo. - Dê aos coelhos doses incrementais de PTZ por via intravenosa de 1 mg/kg a 10 mg/kg em incrementos de 1 mg/kg a cada 10 minutos. Anote no início de cada dose para indicar qual animal está sendo injetado e a concentração da medicação.
NOTA: Isso permite avaliações dos efeitos agudos e aditivos da administração ptz. Alternativamente, para avaliar melhor os efeitos crônicos da baixa dose PTZ, o coelho recebe doses repetidas em cada baixa concentração de dose, 7 doses a 2 mg/kg, 3 doses a 5 mg/kg, depois 3 doses a 10 mg/kg, cada dose é separada por 10 minutos. - Após cada dose, monitore cuidadosamente o vídeo-EEG-ECG-capnografia-oximetria para quaisquer anormalidades elétricas e respiratórias neuro-cardíacas e evidências visuais de atividade epileptiforme. Observe essas alterações em tempo real e durante a pós-análise.
NOTA: A atividade de apreensão geralmente começa dentro dos 60 s da administração ptz.
5.Conclusão de Experimentos de Não Sobrevivência.
- Se o coelho não experimentou morte súbita durante o experimento PTZ, administre 1mL de 390 mg/mL de pentobarbital de sódio para cada 4,54 kg de peso corporal (ou 1,5 mL para todos os coelhos), seguido por uma descarga de 1 mL de soro fisiológico normal. Monitore o ECG para garantir que o coelho sondo uma parada cardíaca.
- Uma vez que o coelho experimenta parada cardíaca, realize rapidamente uma necropsia para isolar recentemente vários órgãos, incluindo coração, pulmões, fígado, cérebro, músculo esquelético e qualquer outro tecido necessário para análises moleculares/bioquímicas subsequentes.
- Descarte o coelho de acordo com as políticas institucionais.
6. Análise do ECG
- Use software de análise ECG comercialmente disponível para inspecionar visualmente o ECG e identificar períodos de taquicardia, bradicardia, batidas ectópicas e outras arritmias(Figura 6). Para reduzir a quantidade de dados para revisão, crie um tachograma, que aumentará a facilidade com que períodos de taquicardia, bradicardia ou irregularidades do intervalo RR podem ser identificados.
NOTA: Anormalidades do ECG (por exemplo, prolongamentoQT c) e arritmias são identificadas manualmente pela revisão do ECG por anormalidades na taxa (por exemplo, brady-/táquia-arritmias), ritmo (por exemplo, complexos atrial/ventricular prematuros), condução (por exemplo, bloco atrio-ventricular) e forma de onda (por exemplo, taquicardia atrial/ventricular não-sinusal e fibrilação.) As arritmias podem ser detectadas revendo o tachograma por irregularidades no intervalo RR. A taquicardia pode ser identificada por seções do tachograma em que a frequência cardíaca está acima de 300 batimentos por minuto. Bradycardia é identificada quando a frequência cardíaca é inferior a 120 batidas por minuto no tachograma. - Utilizando software de análise ECG comercialmente disponível, realize medições padrão de ECG (frequência cardíaca, intervalos de ciclo cardíaco) na linha de base e mediante provocação (por exemplo, investigador manipulando o animal, administração de agentes de teste e alterações induzidas por convulsão do ECG).
7. Análise do vídeo-EEG
- Role visualmente o rastreamento de vídeo e EEG usando software comercialmente disponível para identificar o sinal de linha de base (Figura 7) e a presença de descargas de EEG esperadas, como eixos de sono(Figura 8) e ondas de vértice(Figura 9).
NOTA: Embora os dados eletrográficos de largura de banda completa sejam adquiridos sem filtros, os dados devem ser exibidos com o filtro de baixa frequência (ou seja, filtro de passagem alta) definido em 1 Hz, e com base no teoremadeNyquist, o filtro de alta frequência (ou seja, filtro de passagem baixa) é definido em 120 Hz para evitar a falta de qualquer sinal. Os filtros podem ser ajustados para permitir uma melhor visualização e redução de ruído (por exemplo, 1-59 Hz) ao revisar a atividade de EEG de menor frequência (<25 Hz). - Além das formas de onda de capnografia, use artefato de movimento do nariz no EEG para determinar a presença versus ausência de respiração. Isso também pode ser correlacionado com os movimentos do nariz vistos na gravação de vídeo.
- Visualmente role através do vídeo e rastreamento EEG usando software comercialmente disponível para distinguir movimentos epilépticos vs. não epilépticos (por exemplo, conscientes) por pelo menos 1 min após cada dose de PTZ(Figura 10). Procure por descargas epilépticas intericais e para alterações de EEG antes, durante e depois das convulsões. Uma convulsão pode ser identificada clinicamente observando a presença de mioclônicos da cabeça e do corpo inteiro, clonus ou um estado tônico com uma correlação de EEG. As alterações do EEG podem incluir picos de EEG, polipes e descargas rítmicas.
NOTA: Os movimentos em que o EEG é obscurecido por artefato muscular ou ondas de epieptogenicidade indeterminante devem ser revistos por um neurologista para confirmação. Pode ser vantajoso focar o vídeo em um coelho para ver seu comportamento, bem como suas gravações de EEG e ECG, mais de perto(Figura 5B). - Marque o vídeo-EEG para convulsões com base no tipo e gravidade das manifestações motoras, que normalmente ocorrem dentro de 1 minuto após a injeção de PTZ(Tabela 1).
- Após um experimento de estimulação fótica, analise os leads occipitais do EEG para a presença e ausência do ritmo de condução occipital, criando um gráfico de análise espectral em software de análise EEG comercialmente disponível. O ritmo de condução occipital criará um pico na análise espectral que corresponde à frequência do estimulador fótico(Figura 11).
NOTA: A estimulação fótica pode produzir picos de frequência harmônica, além do pico da frequência fundamental.
7. Análise da função respiratória
- Revise a saída do monitor de sinais vitais(Figura 4I) e exporte o sinal para análise posterior.
- Note a mudança no padrão respiratório durante uma convulsão e após uma convulsão, especialmente o ponto de tempo quando a apneia começa.
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Representative Results
O método descrito acima é capaz de detectar anormalidades no sistema de condução elétrica do cérebro e do coração, bem como distúrbios respiratórios. Um software de aquisição de dados é usado para avaliar a morfologia do ECG e detectar quaisquer frequências cardíacas anormais, distúrbios de condução ou ritmos ECG (batidas ectópicas atrial/ventriculares e brady-/tchy-arritmias)(Figura 6). Além de visualizar a morfologia do ECG, os traços são analisados para quantificar o intervalo de RR, frequência cardíaca, intervalo de RP, duração P, intervalo QRS, intervalo QT, QTc, intervalo JT epico T para intervalofinal T. A análise desses dados mostra que as arritmias taquiquias/brady-arrhythmias são prontamente detectadas.
Além de analisar os dados do ECG, os dados do EEG também são analisados. O EEG da linha de base foi coletado e analisado por meio da análise espectral(Figura 7). Esses dados mostram que os condutores occipitais têm uma amplitude maior do que os condutores frontais e que a frequência dominante em todos os leads está na faixa delta. Ser capaz de gravar EEGs de coelhos com uma alta relação sinal/ruído é importante para detectar descargas epilépformes e realizar uma análise mais aprofundada na gravação. Ondas que têm morfologia semelhante e frequência aos fusos de sono humano são mostradas na Figura 8. Ondas de vértices originárias do centro da cabeça são mostradas na Figura 9. Além das alterações normais do EEG, vários movimentos conscientes de coelho não epilépticos durante gravações de linha de base também são observados, a fim de distingui-los das descargas epilépticas(Figura 10). Gravações em vídeo-EEG dos movimentos mostrados, bem como outros, estão disponíveis no Filme Suplementar 1-11.
Vários métodos foram implementados para tentar induzir convulsões. O primeiro método utilizou estimulação fótica a 1-60 Hz com os olhos abertos e fechados(Figura 4E). Como a posição dos olhos no coelho é lateral e não anterior como os humanos, os espelhos são empregados para direcionar a luz para os olhos do coelho usando uma única fonte de luz. A análise do EEG do experimento de estimulação fótica em 3 Hz mostra uma forte resposta de condução occipital na frequência esperada de 3 Hz(Figura 11). Além da estimulação fótica, os coelhos são injetados com pentilenotetrazol (PTZ, BLOQUEADOR GABAA) através de um cateter na veia marginal esquerda(Figura 4G). A injeção de PTZ causa diferentes graus de atividade convulsão dentro de 1 min e está associada a distintas formas de onda EEG. Algumas formas de onda representativas, que incluem rajadas de, grandes rajadas de de amplitude, ondas de polispique, ondas de polispique de baixa tensão, rajadas de gama rítmica e silêncio eletrocerebral (ECS) são mostradas na Figura 12, Figura 13, Figura 14, Figura 15, Figura 16, Figura 17.
Para identificar uma convulsão são utilizados vários critérios. O vídeo é revisado para identificar possíveis manifestações motoras de apreensão. Em seguida, para confirmar que a atividade motora foi resultado de atividade epiléptica, o sinal EEG é avaliado para um pico de EEG correlacionado temporalmente, polispique, onda acentuada ou descarga rítmica. Em caso de dúvida, o vídeo-EEG é revisado por um segundo investigador e/ou um epiléptólogo para verificação. O início da convulsão é definido como a primeira instância de descargas rítmicas de EEG (início da convulsão EEG) e atividade motora (início da convulsão clínica). EEG e convulsão clínica terminam quando a cessação de picos rítmicos de EEG e atividade motora, são observadas, respectivamente. Além de várias morfologias de ondas EEG, os coelhos progrediram através de convulsões motoras cada vez mais generalizadas e cada vez mais prolongadas. Uma escala de apreensão foi criada porque nem a escala de apreensão de Racine, nem suas versões modificadas, eram aplicáveis a coelhos contidos(Tabela 1). Vídeos de atividade representativa de convulsão motora são exibidos em Filme Suplementar 17, Filme Suplementar 18, Filme Suplementar 19, Filme Suplementar 20, Filme Suplementar 21, Filme Suplementar 22.
O método aqui apresentado também é capaz de determinar a cascata multissiá-sistema de eventos que precedem a morte súbita mediada pela convulsão(Figura 18). Várias patologias incluem: silêncio eletrocerebral (ECS), parada respiratória (apneia), brady-/taqui-arritmias e parada cardíaca (asstole.) Durante os experimentos, um coelho teve morte súbita depois de ter uma convulsão farmacologicamente induzida. Neste coelho, houve uma sequência que começou com parada respiratória, depois ECS, bloco atrioventricular, várias taquiarritmias não sustentadas, bradicardia, e, finalmente, asstole.
Figura 1: Visão geral do protocolo experimental. Para fornecer uma visão geral dos principais passos deste protocolo, uma figura foi criada. Esta figura descreve que o equipamento de gravação deve ser preparado, seguido pela conexão do equipamento ao coelho e garantia de que o sinal de alta qualidade seja observado. Após esta etapa, o experimento pretendido pode ser realizado, os órgãos podem ser adquiridos e os dados de video-EEG-ECG-capnografia-oximetria analisados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Equipamento experimental. Diagrama de configuração experimental, que inclui um computador, luz infravermelha, microfone, câmera de vídeo, monitor de sinais vitais, caixa de cabeça de 64 pinos, amplificador, digitalizador, 8 eletrodos (5 EEG, 3 ECG) + terra para cada animal que está conectado à caixa de cabeça. Os leads são codificados por cores de acordo com o seguinte: 4 EEG azul, 1 referência EEG preto, 3 ECG vermelho, 1 solo verde. A caixa de contenção que segura os coelhos não é mostrada. Esta configuração permite que até 7 coelhos sejam gravados simultaneamente. A linha amarela representa o tubo de capnografia e conecta a máscara facial ao monitor de sinais vitais. A linha azul representa o fio de oximetria que está conectado ao monitor de sinais vitais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Imagem de eletrodos EEG e ECG. (A) Eletrodos ECG dobrados e eletrodos EEG retos. (B) Como enganchar o eletrodo ECG no tecido subcutâneo do coelho, de modo que ele seja através e através. Abreviaturas (LL: Membro esquerdo, RA: Braço direito, RL: Membro direito, LA: Braço esquerdo, RF: Frontal direito, LF: Frontal esquerdo, Cz: Centro, RO: Occipital direito, LO: Occipital esquerdo). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Coelho conectado ao equipamento. (A) Localização de eletrodos ECG, Braço Esquerdo é indicado por um ponto amarelo. Braço Direito é indicado por um ponto branco. Perna esquerda é indicada por um ponto vermelho. O solo anterior à perna direita é indicado por um ponto verde. (B) Coelho em contenção com eletrodos ECG e EEG ligados. (C) Coelho juvenil em um conterrâmola com modificações apropriadas para acomodar um coelho menor, incluindo um reforço sob o coelho, espuma de pescoço e tubo de PVC cortado. (D) Coelho em contenção com localização de eletrodos EEG. O frontal direito é indicado por um ponto laranja. Frontal esquerdo é indicado por um ponto vermelho. Occipital direito é indicado por um ponto amarelo. O Occipital esquerdo é indicado por um ponto azul. A referência é indicada por um ponto preto. (E) Coelho em contentor com estimulador fótico e configuração de cabine de espelho. A fonte de luz é indicada por um ponto branco. (F) Veia de ouvido marginal após a orelha do coelho ter sido raspada e limpa com álcool. (G) Coelho com angiocateter firmemente preso na veia marginal esquerda. O local do plugue de injeção é indicado com um ponto azul. (H) Coelho com máscara facial presa à tubulação de capnografia por uma peça T que contém uma válvula unidirecional. (I) Diagrama da máscara facial e t-peça conectada à tubulação de capnografia. Durante a inspiração, o ar da sala é capaz de entrar na peça T através de uma válvula unidirecional (arqueiro verde). Durante o vencimento, o CO2 deixa a peça T entrando na tubulação de capnografia (seta amarela.) Devido à pequena quantidade de espaço morto, muito pouco CO2 é retido na peça T e é geralmente menos de 5 mmHg. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Vídeo de coelho simultâneo-EEG-ECG-Capnografia-Oximetria. (A) Gravação simultânea de vídeo-EEG-ECG de 3 coelhos. (B) Ampliada em vista da gravação simultânea de vídeo-EEG-ECG do Rabbit #2. (LL: Membro esquerdo, RA: Braço direito, LA: Braço esquerdo) (C) Registro simultâneo de capnografia (amarela) e plethysmografia (azul). As medidas que mostram CO2inspirado, CO2da maré final, taxa respiratória, taxa de pulso e oximetria de pulso estão incluídas na figura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Coelho ECG. (A) ECG de linha de base. Os leads são mostrados na configuração padrão bipolar de chumbo do membro do plano frontal e na configuração unipolar (RA: Braço direito, LL: Membro esquerdo, LA: Braço esquerdo) com o chumbo Cz na cabeça como referência. (B) Complexos ventriculares prematuros. (C) Sinus bradycardia. (D)Taquicardia sinusa. (E) Rastreamento de ECG de coelho de linha de base com início de onda P, pico de onda P, ponta de onda P, início de onda QRS, pico de onda QRS, extremidade de onda QRS, altura do segmento ST, pico de onda T, extremidade de onda T rotulada. (F) Medições de ECG. Todas as medidas são em milissegundos, exceto para a frequência cardíaca, que está em batidas por minuto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: EEG de linha de base e análise espectral. (A) Rastreamento de EEG durante a gravação da linha de base. (B) A análise espectral do EEG mostra que a atividade da onda delta é a frequência dominante em todos os leads. Delta (δ: até 4 Hz) Theta (φ: 4-8 Hz) ondas Alfa (α: 8 -15 Hz) ondas Beta (β: 15-32 Hz) ondas Gamma (γ: ≥ 32 Hz) ondas. Y Axis é Log Power Spectral Density 10*log10(μV2/Hz). Os dados eletrográficos de largura de banda total foram adquiridos sem filtros, mas os dados foram exibidos com filtro de baixa frequência (=filtro de passe alto) definido em 1 Hz e filtro de alta frequência (=filtro de passagem baixa) definido a 120 Hz. Gravações de vídeo-EEG-ECG são mostradas em Filmes Suplementares 1 e 2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Rastreamento e eg do eixo de sono e análise espectral. (A) Rastreamento EEG durante os fusos de sono. (B) A análise espectral do EEG mostra a presença de uma onda adicional de 12-15 Hz, que é semelhante à frequência associada aos fusos de sono em humanos. Delta (δ: até 4 Hz) Theta (φ: 4-8 Hz) ondas Alfa (α: 8 -15 Hz) ondas Beta (β: 15-32 Hz) ondas Gamma (γ: ≥ 32 Hz) ondas. Y Axis é Log Power Spectral Density 10*log10(μV2/Hz). (C) Montagens múltiplas de EEG de um fuso do sono demonstram que elas surgem do centro da cabeça (Cz), o que é consistente com os achados humanos. Dados eletrográficos de largura de banda total foram adquiridos sem filtros, mas os dados foram exibidos com filtro de baixa frequência (=filtro de passe alto) definido em 1 Hz e filtro de alta frequência (=filtro de passagem baixa) definido a 59 Hz.Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: Rastreamento de ondas de vértice e análise espectral. (A) Rastreamento EEG de múltiplas ondas de vértices. (B) A análise espectral das ondas de vértices não mostra uma diferença considerável na frequência das ondas de vértices. Embora isso seja esperado porque visualmente a frequência é inferior a 1 Hz. (C) Múltiplas montagens de EEG de ondas de vértices mostram que elas surgem do centro da cabeça, o que é consistente com os achados humanos. Dados eletrográficos de largura de banda total foram adquiridos sem filtros, mas os dados foram exibidos com filtro de baixa frequência (=filtro de passe alto) definido em 1 Hz e filtro de alta frequência (=filtro de passagem baixa) definido a 59 Hz. Y Axis é Log Power Spectral Density 10*log10(μV2/Hz). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10: Artefatos EEG causados pelo movimento do coelho. (A) EEG durante a saccade do olho direito. (B) EEG durante um piscar de olhos esquerdo. (C) EEG durante o movimento rítmico do nariz que está associado com a presença da respiração. (D) EEG durante o movimento de lambida. (E) EEG durante um episódio do coelho estendendo a cabeça para baixo. (F) EEG durante movimentos conscientes complexos de todo o corpo. Vídeo-EEG desses movimentos estão disponíveis em Filmes Suplementares 3-11. Dados eletrográficos de largura de banda total foram adquiridos sem filtros, mas os dados foram exibidos com filtro de baixa frequência (=filtro de passe alto) definido em 1 Hz e filtro de alta frequência (=filtro de passagem baixa) definido a 59 Hz.Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 11: EEG durante a estimulação fótica. (A) Rastreamento de EEG durante a estimulação fótica de 3 Hz com os olhos do coelho abertos. (B) Análise espectral de estimulação fótica de 3 Hz com picos a 3 Hz vistos nos leads occipitais, mas não nos condutores frontais. Dados eletrográficos de largura de banda total foram adquiridos sem filtros, mas os dados foram exibidos com filtro de baixa frequência (=filtro de passe alto) definido em 1 Hz e filtro de alta frequência (=filtro de passagem baixa) definido a 59 Hz. Y Axis é Log Power Spectral Density 10*log10(μV2/Hz). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 12: Rastreamento espectral do EEG e análise espectral das explosões de teta. As rajadas de são vistas intermitentemente em todos os leads do EEG. A frequência dessas ondas é em torno de 4-6 Hz. Delta (δ: até 4 Hz) Theta (φ: 4-8 Hz) ondas Alfa (α: 8 -15 Hz) ondas Beta (β: 15-32 Hz) ondas Gamma (γ: ≥ 32 Hz) ondas. Y Axis é Log Power Spectral Density 10*log10(μV2/Hz). Dados eletrográficos de largura de banda total foram adquiridos sem filtros, mas os dados foram exibidos com filtro de baixa frequência (=filtro de passe alto) definido em 1 Hz e filtro de alta frequência (=filtro de passagem baixa) definido a 59 Hz. Y Axis é Log Power Spectral Density 10*log10(μV2/Hz). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 13: Rastreamento e espectral do EEG e análise espectral de grandes rajadas de de amplitude. Grandes explosões de de amplitude são semelhantes em aparência e frequência às ondas, mas com uma amplitude maior. A rápida mudança na amplitude faz com que algumas dessas ondas pareçam mais nítidas. Delta (δ: até 4 Hz) Theta (φ: 4-8 Hz) ondas Alfa (α: 8 -15 Hz) ondas Beta (β: 15-32 Hz) ondas Gamma (γ: ≥ 32 Hz) ondas. Y Axis é Log Power Spectral Density 10*log10(μV2/Hz). Dados eletrográficos de largura de banda total foram adquiridos sem filtros, mas os dados foram exibidos com filtro de baixa frequência (=filtro de passe alto) definido em 1 Hz e filtro de alta frequência (=filtro de passagem baixa) definido a 59 Hz. Y Axis é Log Power Spectral Density 10*log10(μV2/Hz). A gravação de Vídeo-EEG-ECG é mostrada no Filme Suplementar 12. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 14: Rastreamento e espectral do EEG e análise espectral das ondas de poliespique. Ondas de polispique são vistas intermitentemente e simultaneamente em todas as pistas. Na análise espectral, há múltiplos picos harmônicos com uma frequência fundamental em torno de 6 Hz. Delta (δ: até 4 Hz) Theta (φ: 4-8 Hz) ondas Alfa (α: 8 -15 Hz) ondas Beta (β: 15-32 Hz) ondas Gamma (γ: ≥ 32 Hz) Y Axis é Log Power Spectral Density 10*log10(μV2/Hz). Dados eletrográficos de largura de banda total foram adquiridos sem filtros, mas os dados foram exibidos com filtro de baixa frequência (=filtro de passe alto) definido em 1 Hz e filtro de alta frequência (=filtro de passagem baixa) definido a 59 Hz. Y Axis é Log Power Spectral Density 10*log10(μV2/Hz). A gravação de Vídeo-EEG-ECG é mostrada no Filme Suplementar 13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 15: Rastreamento e espectral e análise espectral de ondas de polispique de baixa tensão. Ondas de polispike de baixa tensão são semelhantes às ondas de polispike, mas têm uma amplitude menor. A análise espectral é semelhante à dos poliespes. Delta (δ: até 4 Hz) Theta (φ: 4-8 Hz) ondas Alfa (α: 8 -15 Hz) ondas Beta (β: 15-32 Hz) ondas Gamma (γ: ≥ 32 Hz) ondas. Y Axis é Log Power Spectral Density 10*log10(μV2/Hz). Dados eletrográficos de largura de banda total foram adquiridos sem filtros, mas os dados foram exibidos com filtro de baixa frequência (=filtro de passe alto) definido em 1 Hz e filtro de alta frequência (=filtro de passagem baixa) definido a 59 Hz. Y Axis é Log Power Spectral Density 10*log10(μV2/Hz). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 16: Rastreamento e espectral do EEG e análise espectral de rajadas gama rítmica. Explosões gama rítmica em um padrão de estouro são vistas mais claramente nos leads anteriores. Na análise de frequência há um pico adicional visto em torno de 50-55 Hz nos leads anteriores. Delta (δ: até 4 Hz) Theta (φ: 4-8 Hz) ondas Alfa (α: 8 -15 Hz) ondas Beta (β: 15-32 Hz) ondas Gamma (γ: ≥ 32 Hz) ondas. Y Axis é Log Power Spectral Density 10*log10(μV2/Hz). Os dados eletrográficos de largura de banda total foram adquiridos sem filtros, mas foram exibidos com filtro de baixa frequência (=filtro de passagem alta) definido em 1 Hz e filtro de alta frequência (=filtro de passagem baixa) definido a 120 Hz. A gravação de vídeo-EEG-ECG é mostrada em Filme Suplementar 14. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 17: Rastreamento e espectral do rastreamento espectral da supressão de EEG generalizada pós-ictal. Supressão de EEG pós-parto generalizada com o histograma de frequência correspondente. Delta (δ: até 4 Hz) Theta (φ: 4-8 Hz) ondas Alfa (α: 8 -15 Hz) ondas Beta (β: 15-32 Hz) ondas Gamma (γ: ≥ 32 Hz) ondas. Y Axis é Log Power Spectral Density 10*log10(μV2/Hz). Dados eletrográficos de largura de banda total foram adquiridos sem filtros, mas os dados foram exibidos com filtro de baixa frequência (=filtro de passe alto) definido em 1 Hz e filtro de alta frequência (=filtro de passagem baixa) definido a 59 Hz. Y Axis é Log Power Spectral Density 10*log10(μV2/Hz). A gravação de Vídeo-EEG-ECG é mostrada no Filme Suplementar 15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 18: Sequência de morte súbita após convulsão. Um coelho teve morte súbita durante o protocolo PTZ e a sequência da morte é detalhada. As manifestações eletroencefalográficas são indicadas em verde. O tempo zero é o fim clínico da convulsão. Isso é seguido pelo silêncio eletrocerebral pós-ictal (ECS.) Os dados respiratórios são mostrados em vermelho e observam o aparecimento da apneia. As informações eletrocardiográficas são mostradas em tons de azul. Este coelho experimentou bloqueio cardíaco, múltiplas taquiarritmias, bradicardia, e, finalmente, asstole, que é indicado pela estrela negra. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1: Balança de convulsão para coelhos contidos. O aumento da gravidade da convulsão está associado à atividade motor epiléptica cada vez mais sustentada e mais generalizada. Exemplos de vídeo estão disponíveis em Filmes Suplementares 17-22. Clique aqui para baixar esta Tabela.
Filme Suplementar 1: Gravação de vídeo de coelho de linha de base-EEG-ECG com luzes acesas. Depois que o coelho é colocado no conterrâneo, o coelho fica mais relaxado e gravações de linha de base podem ser feitas. O vídeo mostra que o coelho não está se movendo durante esta gravação. Clique aqui para baixar este Filme.
Filme Suplementar 2: Gravação de vídeo de coelho de linha de base-EEG-ECG com luzes apagadas. Para que o experimento de estimulação fótica seja realizado, as luzes da sala devem ser desligadas. Desligar as luzes na sala não afeta significativamente a gravação de EEG ou ECG. É importante ressaltar que a câmera de vídeo tem uma luz infravermelha para que o coelho possa ser visto no escuro. Clique aqui para baixar este Filme.
Filme suplementar 3: Artefato muscular do movimento do olho esquerdo. O método descrito neste artigo é capaz de discernir entre artefato muscular e descargas epilépformas. Embora esta onda de amplitude grande periódica possa ser confundida com uma convulsão, ela ocorre simultaneamente com o movimento do olho esquerdo e, portanto, é mais provável que seja causada por atividade muscular. Clique aqui para baixar este Filme.
Filme suplementar 4: Artefato muscular de um piscar de olhos esquerdo. A gravação de vídeo-EEG é capaz de detectar um piscar de olhos no EEG e também determinar que ele ocorre simultaneamente com o piscar de olhos visto em vídeo. O piscar o olho é lateralizado para os condutores EEG laterais esquerdos. Clique aqui para baixar este Filme.
Filme suplementar 5: Artefato muscular do músculo da mandíbula. O vídeo-EEG é capaz de detectar movimento de pequenos músculos da cabeça e pescoço. O vídeo é inestimável para determinar que esse movimento é devido ao músculo em vez de descargas epilépticas do cérebro. Como esperado, o sinal associado a esse movimento surge dos condutores occipitais. Clique aqui para baixar este Filme.
Filme suplementar 6: Artefato muscular de lamber. O rastreamento do EEG mostra grandes ondas rítmicas afiadas que podem ser consistentes com a atividade convulsiva. O vídeo demonstra que essas ondas são causadas por movimentos da língua e não são descargas epilépticas. Como esperado, o sinal associado a esse movimento decorre das pistas occipitais. Clique aqui para baixar este Filme.
Filme suplementar 7: Artefato muscular do movimento bucal. Novas ondas vistas na faixa delta estão associadas ao movimento da boca. É importante ressaltar que isso pode ser distinguido da desaceleração intermitente secundária à encefalopatia pela visualização do movimento bucal quando as ondas aparecem. Clique aqui para baixar este Filme.
Filme suplementar 8: Artefato muscular da virada da cabeça. Uma grande, lenta e transitória diminuição da amplitude observada nos fios frontais está associada à virada da cabeça do coelho. É importante notar que não há descargas epilépticas anteriores ao movimento. Clique aqui para baixar este Filme.
Filme suplementar 9: Artefato muscular da extensão da cabeça. Um grande, lento e transitório aumento de amplitude é visto em todas as pistas quando o coelho está levantando a cabeça. Não há descargas epilépticas que precedem o movimento. Clique aqui para baixar este Filme.
Filme suplementar 10: Artefato muscular da flexão da cabeça. Uma diminuição muito grande da amplitude em todos os leads é vista quando o coelho estende a cabeça para baixo. Não há descargas epilépticas que precedem o movimento. Clique aqui para baixar este Filme.
Filme suplementar 11: Artefato muscular de movimento complexo. Enquanto no contidor, o coelho faz um movimento complexo envolvendo sua cabeça e todo o seu corpo. Isso ocorreu durante a gravação da linha de base, antes de qualquer medicação indutora de convulsões. Este movimento que ocorreu rapidamente foi registrado como uma alta amplitude e alta frequência estourada no EEG. Além disso, as ondas afiadas rítmicas vistas nos fios frontais são devido ao movimento do nariz, que pode ser visto como síncronos com as ondas no vídeo. Clique aqui para baixar este Filme.
Filme suplementar 12: Vídeo-EEG de grandes amplitudes theta estoura. Após a injeção de PTZ, alguns coelhos apresentaram uma desaceleração intermitente do EEG em todas as pistas. Essas ondas anormais não eram geralmente associadas ao movimento. Embora essas rajadas de ondas na faixa não sejam típicas da atividade convulsiva, elas estão associadas à encefalopatia em humanos. Clique aqui para baixar este Filme.
Filme Suplementar 13: Vídeo-EEG de poliespes. Ondas agudas podem ser vistas imediatamente após a injeção, durante uma convulsão ou durante o período pós-natal. Esses achados são semelhantes aos encontrados em humanos e estão associados à atividade convulsiva. Durante os poliespes, a orelha direita também é notada como contração, uma manifestação física da convulsão. Clique aqui para baixar este Filme.
Filme suplementar 14: Vídeo-EEG de explosão gama rítmica. Rajadas de alta frequência, como as mostradas no vídeo, ocorrem frequentemente no período pós-natal e ocasionalmente após doses de sub-retenção de PTZ. A causa fisiológica dessas explosões gama de alta frequência é desconhecida. Clique aqui para baixar este Filme.
Filme suplementar 15: Video-EEG de supressão de EEG generalizada pós-ictal. No período pós-parto, especialmente após uma convulsão tônica-clonic generalizada, muitas vezes há supressão do EEG em todas as pistas. Grandes deflexões de amplitude durante o período pós-parto são mostrados como causados por artefato muscular de empurrões mioclônicos. Clique aqui para baixar este Filme.
Filme Suplementar 16: Vídeo-EEG de silêncio eletrocerebral. Este vídeo demonstra a alta relação sinal/ruído deste método. Com atividade mínima de EEG, não há sinal de apreciação do EEG. Essa especificidade é importante na hora de determinar a hora da morte cerebral. Além disso, deve-se notar que muitas vezes há função cardíaca residual após a morte cerebral ter ocorrido. Clique aqui para baixar este Filme.
Filme Suplementar 17: Vídeo-EEG da escala de convulsão estágio 0. A Escala de Apreensão é projetada para avaliar a gravidade das convulsões motoras, determinando a propagação e duração da convulsão. No estágio 0, não há atividade de convulsão visível, embora possa haver descargas epilépticas vistas no EEG. Clique aqui para baixar este Filme.
Filme Suplementar 18: Vídeo-EEG da escala de convulsão estágio 1. A fase 1 da Escala de Apreensão é identificada pela presença de uma breve convulsão parcial. Geralmente convulsões parciais são limitadas à cabeça, em vez de qualquer outra parte do corpo. Isso pode se manifestar como empurrões de cabeça única, interruptores de ouvido único ou outra atividade motora breve e não rítmica associada a descargas epilépticas no EEG. Clique aqui para baixar este Filme.
Filme Suplementar 19: Vídeo-EEG da escala de convulsão estágio 2. O estágio 2 da Escala de Apreensão é identificado por uma apreensão generalizada não sustentada. Frequentemente todo o corpo será submetido a um empurrão mioclônico. Isso é distinguido dos estágios posteriores pela falta de ritmismo. Clique aqui para baixar este Filme.
Filme Suplementar 20: Vídeo-EEG da escala de convulsão estágio 3. O estágio 3 da Escala de Apreensão é identificado por uma convulsão rítmica sustentada que se limita à cabeça em termos de manifestações motoras. O coelho mostrado tem contração rítmica das orelhas, e pálpebras. O coelho experimenta um breve corpo inteiro mioclônico, mas não progride para empurrões rítmicos de corpo inteiro. Clique aqui para baixar este Filme.
Filme Suplementar 21: Vídeo-EEG da escala de convulsão estágio 4. A fase 4 da Escala de Apreensão é identificada por uma convulsão rítmica sustentada que envolveu todo o corpo. Como pode ser visto no vídeo, o corpo do coelho está envolvido no mioclonus enquanto há relativamente pouco movimento das orelhas, olhos e cabeça. Clique aqui para baixar este Filme.
Filme Suplementar 22: Vídeo-EEG da escala de convulsão estágio 5. A etapa final da Escala de Apreensão se identificada pela presença das fases tônica e clonica da apreensão. Inicialmente há movimento desorganizado de todo o corpo. Isso é seguido pela fase tônica, depois pela fase clonica da convulsão até que a convulsão se resolva. Ocasionalmente, coelhos experimentam morte súbita após esta fase, mas raramente morrem após uma convulsão de uma menor gravidade. Clique aqui para baixar este Filme.
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Discussion
Esta configuração experimental facilita gravações e análises simultâneas de vídeo e EEG-EEG-ECG-oximetria-capnografia em coelhos, particularmente em modelos de doenças cardíacas e/ou neuronais. Os resultados deste artigo mostram que este método é capaz de detectar convulsões e arritmias e diferenciá-las de artefatos eletrográficos. Os resultados esperados foram obtidos ao dar aos coelhos um provulsivo, o que induziu convulsões. Os dados obtidos a partir das gravações de vídeo-EEG puderam ser ainda mais analisados para diferenciar movimentos voluntários versus gravidade crescente de convulsões motoras e anormalidades eletroencefalográficas, incluindo resposta de condução fótica, encefalopatia e descargas epilépformas. Vários tipos de descargas epilépformas foram ainda caracterizadas e correlacionadas com a atividade motora. A análise do ECG demonstrou um método que produziu uma alta relação sinal-ruído e permitiu a identificação e quantificação de cada correlação elétrica do ciclo cardíaco. Este método também foi capaz de detectar a presença de anormalidades cardíacas, incluindo complexos ventriculares prematuros, bradicardia, bloqueio cardíaco, taquicardia, taqui-arritmias e asstole. O desenvolvimento de um método robusto para investigar melhor as interações neuro-cardíacas de doenças multissiáticas proporciona um importante avanço tecnológico necessário para melhor compreender essas doenças. Além disso, o monitoramento da função respiratória ao longo do tempo facilita uma melhor compreensão da insuficiência respiratória após convulsões e sua contribuição para a morte súbita.
Esta configuração também fornece um sistema robusto para estudos de medicamentos, como testes de segurança cardíaca. Projetos de pesquisa que empregam essas técnicas são capazes de investigar a interação entre as manifestações neuronais, cardíacas e respiratórias em tempo real. Embora muitos estudos tenham sido realizados em corações de roedores, os resultados no coração do coelho são melhores para estudos translacionais, já que a expressão do canal de íons, as propriedades potenciais de ação e as medidas de ECG são semelhantes aos humanos. Como esta é uma configuração de vídeo EEG-ECG clinicamente utilizada, no futuro o mesmo desenho pode ser aplicado a grandes mamíferos, como porcos, cães ou ovelhas. Além disso, esta configuração de gravação pode ser usada para monitoramento intracraniano de EEG no coelho em movimento livre, o que permite gravações mais extensas em vários estados fisiológicos, em torno de eventos neuro-cardíacos espontâneos e morte súbita anterior. Esses métodos serão inestimáveis para elucidar o mecanismo da SUDEP e para encontrar novas terapias voltadas para o tratamento de doenças do cérebro e do coração.
O protocolo apresentado neste artigo tem muitas etapas críticas que devem ser seguidas para produzir dados com alta relação sinal/ruído. É importante que antes do experimento começar, o coelho deve ser fixado no conterrante para limitar grandes movimentos corporais que podem resultar em lesão espinhal. Todos os eletrodos são verificados para a qualidade do sinal. Se todos os eletrodos estiverem barulhentos, o eletrodo de referência pode ser substituído para melhorar o sinal. Se os eletrodos únicos são barulhentos, então esse eletrodo deve ser empurrado mais fundo na pele ou removido e reimplantado. Durante o experimento, o movimento dos coelhos pode fazer com que eletrodos sejam deslocados. O mais rápido possível, tente substituir os eletrodos sem obstruir a visão da câmera para que os dados ainda possam ser coletados a partir do experimento.
Uma vantagem da metodologia descrita neste estudo é que facilita o pesquisador a triagem de um grande número de animais, e é rentável. Há limitações deste protocolo. Embora poucos estudos tenham sido realizados para investigar especificamente o impacto fisiológico da contenção nos coelhos, descobrimos que os coelhos toleravam a contenção extremamente bem. Muitos estudos do sistema auditivo têm sido realizados em coelhos acordados em restrições leves. Nessas condições, os coelhos ficam quietos por horas sem qualquer sinal de estresse ou desconforto39. Depois de serem colocados no cabisso, os coelhos raramente tentam escapar do contidor. Eles exibem uma frequência cardíaca que está perto da linha de base e muitas vezes adormece, como observado pela presença de fusos de sono no EEG. Coelhos não exibem frequência visual, cardíaca ou qualquer outra manifestação que sugira que estão estressados.
Uma direção futura é desenvolver um sistema para gravação telemétrica de EEG e ECG. Isso permitiria uma análise mais detalhada durante vários estados fisiológicos, a detecção de convulsões espontâneas e a cascata de alterações neuro-cardíacas que precedem a morte inesperada súbita na epilepsia (SUDEP.) Devido às restrições tecnológicas e à relativa falta de literatura sobre EEG em coelhos, o método apresentado foi desenvolvido primeiro. Para adaptar este método a coelhos em movimento livre, seria necessário monitoramento contínuo de vídeo, implantes de EEG intra-cranianos e eletrodos ECG subcutâneos. No entanto, a capnografia respiratória crônica não seria viável. Devido ao regulamento institucional (IACUC), a metodologia é para gravações de ≤5 horas no contento. Em roedores, é comum avaliar o limiar, a dinâmica e os tipos de convulsões utilizando medidas provocativas, como febril, auditiva, eletro-choque máximo, hiperventilação, privação do sono e convulsões induzidas por drogas16,40,41,42,43. Este protocolo permitiria testar qualquer uma das medidas provocativas mencionadas anteriormente.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores reconhecem que este estudo foi apoiado por subsídios da American Heart Association, American Epilepsy Society e SUNY Upstate Department of Pharmacology.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Sodium Chloride Irrigation, USP - Flexible Container | PFIZER (HOSPIRA) | 7983-09 | Dilutant |
| 10cc Luer Lock syringe with 20G x 1" Needle | Sur-Vet | SS-10L2025 | Used as a flush after drug injection |
| 4x4 gauze sponges | Fisher Scientific | 22-415-469 | Rolled in a tube to splint ear with angiocatheter |
| Apple Sauce | Kirkland | 897971 | Vehicle for oral medications |
| Computer | Dell | Optiplex 5040 | Acquisition computer |
| E-4031 | Tocris | 1808 | Agent known to prolong the QT interval |
| ECG Electrode | RhythmLink | RLSND116-2.5 | 13mm 35-degree bent (0.4 mm diameter) subdermal pin electrodes |
| EEG Electrode | RhythmLink | RLSP513 | 5-twist 13mm straight (0.4mm diameter) subdermal pin electrodes |
| EEGLAB (2020) | Swartz Center for Computational Neuroscience | Open Access | Can perform spectral analysis of EEG |
| Ethernet-to-ethernet adapter | Linksys | USB3G16 | Adapter for connecting the camera to the computer |
| Euthanasia-III Solution | Med-Pharmex | ANADA 200-280 | Contains pentobarbital sodium and phenytoin sodium, controlled substance |
| Foam padding | Generic | N/A | Reduces pressure applied to the neck of small rabbits by the restrainer in order to prevent the adverse cardiorespiratory effects of neck compression |
| Heparin Lock Flush | Medline | EMZ50051240 | To maintain patency of angiocatheter |
| IR Light | Bosch | EX12LED-3BD-8W | Facilitates recordings in the dark |
| LabChart Pro (2019, Version 8.1.16) | ADInstruments | N/A | ECG Analysis |
| JELCO PROTECTIV Safety I.V. Catheters, 25 gauge | Smiths Medical | 3060 | Used to catherize marginal ear vein |
| MATLAB (R2019b, Update 5) | MathWorks | N/A | Required to run EEGLAB |
| Microphone | Sony Stereo | ECM-D570P | Recording of audible manifestions of seizures |
| Micropore Medical Tape, Paper, White | 3M | 1530-1 | Used to secure wires and create ear splint |
| Natus NeuroWorks | Natus | LC101-8 | Acquisition and review software |
| Pentylenetetrazol (1 - 10 mg/kg always in 1mL volume) | Sigma-Aldrich | 88580 | Dilutions prepared in saline |
| Photic Stimulator | Grass | PS22 | Stimulator to control frequency, delay, duration, intensity of the light pulses |
| Plastic wire organizer / bundler | 12Vwire.com | LM-12-100-BLK | Bundle wires to cut down on noise |
| PS 22 Photic Stimulator | Grass Instruments | BZA641035 | Strobe light with adjustable flash frequency, delay, and intensity |
| PVC pipe | Generic | N/A | Prevents small rabbits from kicking their hind legs and causing spinal injury |
| Quantum Amplifier | Natus | 13926 | Amplifier / digitizer |
| Quantum HeadBox Amplifier | Natus | 22134 | 64-pin breakout box |
| Rabbit Restrainer | Plas-Labs | 501-TC | Various size rabbit restrainers are available. 6" x 18" x 6" in this study. |
| Rubber pad (booster) | Generic | N/A | Raises small rabbits up in the restrainer to prevent neck compression |
| SpO2 ear clip | NONIN | 61000 | PureSAT/SpO2 |
| SpO2 sensor adapter | NONIN | 13931 | XPOD PureSAT/SpO2 |
| SRG-X120 1080p PTZ Camera with HDMI, IP & 3G-SDI Output | Sony | SRG-X120 | Impela Camera |
| Terumo Sur-Vet Tuberculin Syringe 1cc 25G X 5/8" Regular Luer | Sur-Vet | 13882 | Used to inject intravenous medications |
| Veterinary Injection Plug Luer Lock | Sur-Vet | SRIP2V | Injection plug for inserting the needle for intravenous medication |
| Webcol Alcohol Prep, Sterile, Large, 2-ply | Covidien | 5110 | To prepare ear vein before catheterization |
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